TW200817521A - Stabilized proteins - Google Patents

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TW200817521A
TW200817521A TW096121115A TW96121115A TW200817521A TW 200817521 A TW200817521 A TW 200817521A TW 096121115 A TW096121115 A TW 096121115A TW 96121115 A TW96121115 A TW 96121115A TW 200817521 A TW200817521 A TW 200817521A
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TW
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protein
capped
group
amino acid
capping
Prior art date
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TW096121115A
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Inventor
Stephen K Youngster
Amartya Basu
Original Assignee
Enzon Pharmaceuticals Inc
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Description

200817521 九、發明說明： 本專利申請案主張在2007年4曰9η 〇 士士 千4月20曰申請之美國專 利申請案第1 1/738,012號的權益，盆鏟 ^ 具轉而主張在2006年6 月21曰申請之美國臨時申諳牵 卜 才T月木弟60/8〇5,417號的權益， 其等内容係分別全部以引用方式納入本文中。 【發明所屬之技術領域】 本發明提供蛋白質，如腺苷脫脸硫祕主 ^ 脉甘脫felt酵素，其藉著保護 或加帽一或多個暴露至該蛋白質 反口貝< /合液％境的可氧化半胱 胺酸殘基而使其穩定。 【先前技術】 發明背景 已經使用腺苦脫胺酶（ADA)來治療稱為嚴重混合型免 疫不全症（severe combined immun〇deficiency ，SOD) 或，，氣泡寶寶，，症的酵素缺陷症一段時間。超過^年，如咖
Ph_Ceutical“吏用牛來源的酵素製造可供病患使用的 PEG 化之 ADA 〇 最近’已經致力於以重组爽源 里、丑木，原的酵素（在後文中稱 為”rADA”)置換牛來源的酵素。已經認為重組人類卜㈣八，。 和重組牛（W)兩者皆可代替經過純化的天然牛 ADA。rbADA和rhADA酵辛多少日么/=t m 畔果夕少比目刖使用之天然經過純 化的牛酵素更不穩定。咸相信 丨口 rnAJJA和rbADA兩者皆以 與半胱胺酸降解一致的方式降解：氯 、· 、丨牛胖虱的加入；二硫酚的形 成，隨著pH值增加而增加降解；沉、姆 牛w，，儿焱，特別是當pH值增 加並試樣為濃縮時。在還屌妝能 疋；狀悲下+胱胺酸含有反應性_ 5 200817521 SH基團（硫氫基），其為降解之原因的形式。 口人已經闡述暗不單獨一個暴露的半胱胺酸可能為在 rbADA和rhADA兩者中所看到之降解的原因之證據。從牛 來源中純化的ADA具有極為類似rhADA者的結構··牛α〇A 和rhADA兩者均在—級序列之相同位置有相同數目的半脱 月女咬目岫可用的重組牛ADA含有降解物/雜質（二硫酚）， 其與半胱胺酸反應性一致。天然牛ADA在結構上與重組 牛ADA之差異在於每莫耳α〇α有一莫耳半脱胺酸結合， …、牛ADA對问pH值是穩定的，暗示與結合的 半胱胺酸具有保護基之功能。 儘管前文，提供在使用想要之經活化peg，s時， 用於酵素之最 <圭咖化的值水平是穩定的（即沒有明 :降解的)，ADA及/或rhADA會是有益的。其他具有可 月匕涉及不穩定性之自由半胱胺酸基團（們）的蛋白質和酵素 決了該需求 同樣地獲益於穩定化。本發明解 【發明内容】 發明概述 因此’本發明提供加帽的蛋白質，其包括至 加帽劑加帽的胺基酸#美， 们以 蛋白質在含水介質中時抑制胺 在田该 白質在含水介質中實質上隹 使传經加帽蛋 — 丨貝中貝貝上比相等但未經加帽之蛋白斯审t 二该胺基酸是可氧化的胺基酸，並可以是（貝^ 甲心酉夂。經加帽蛋白質可以是任何感興 200817521 趣的蛋白質’包括（例如）纟苷脫胺酶蛋白質，無掄是天 然或以重組方式表現的’或干擾素，像是（例如;’、：：擾 素、α干擾素矛”干擾素。較佳的是，腺苦脫胺酶是重： 的人類腺苦脫胺酶（例如SEQ ID NOq或重組的牛腺普脫 ，酶（SEQ ID耻4)。該重組的腺苷脫胺酶可視需要缺少藉 著相對應DNA開放讀框之理論轉譯所指示的六_ c'終端 f基。在一非必須的另類觀點中’藉著相對應DNA開： 頃框之理論轉譯所指示@ N'終端黯出現在加帽蛋 中。 、 本發明之經加帽蛋白質是利用加帽劑加帽，該加帽劑 係如氧化的縠胱甘肽、㉝乙醯胺、蛾乙酸、胱胺酸、其他 的一琉紛及其混合物。 〇 人本發明之經加帽蛋白質可視需要與實質上非-抗原性聚 :物共軛以形成聚合物經共軛之經加帽重組表現的蛋白 :：如聚環氧烷，如聚乙二醇，其中該聚環氧烷的尺寸 乾？是從大約2,000到大約100，_道爾呑。聚環氧烷最 好疋經由連接劑（linker)化學與蛋白f共輛，該連接劑包 =例如琥珀醯亞胺基碳酸酯、噻唑啶硫酮、尿烷和基於醯 ^連接劑。聚環氧烷較佳是共價附接在該半胱胺酸_穩定 、重組人類腺苷脫胺酶上Lys的ε胺基基團上，雖然其 曰勺用於共價附接之位置也是此項技術中已熟知的。本發 疋、二加巾目蛋白質較佳包括至少5個聚乙二醇股附接在該 史質上的ε胺基基團上，但可選擇地，可包括大約 個PEG股附接在該蛋白質上Lys的ε胺基基團上。 7 200817521 本發明更提供使在其上具有可氧化胺基酸之蛋白質穩 疋的方法，其包括，在足以加帽反應性胺基酸但實質上不 使重組表現之蛋白質失活的反應條件下，在含水溶液中， 以足量的加帽劑處理含有可氧化胺基酸的蛋白質。反應性 胺基酸可包括半胱胺酸或甲硫胺酸及/或任何其他此項技術 :知的反應性蛋白質。蛋白質可以是任何感興趣的蛋白 質，如上文陳述的。加帽毅（例如）氧化的穀胱甘狀、 碘乙醯胺、碘乙酸、胱胺酸、其他的二硫酚及其混合物， 而較佳的是氧化的穀胱甘肽。氧化的穀胱甘肽較佳以從大 約20到大約100mM之濃度與蛋白質反應，或可選擇地該 氧化的穀胱甘肽以從大約22到大約3〇mM之濃度與蛋白質 反應。 較佳的是，本發明之方法提供反應條件，以包括在從 大約6.5到大肖8.4之pH值下的水溶液。更特定而言，反 應條件包括在從大約7.2到大約7.8之阳值下的水溶液。 在較佳的觀點中，該水溶液包括選自由濃度範圍從2〇 至15〇mM之磷酸鈉、磷酸鉀、THs* Hepes所組成之群組 的緩衝溶液。 本發明之製程更包括在足以形成經加帽蛋白質-聚合物 共軛物的條件下，使經加帽蛋白質在水溶液中與經活^匕聚 合物反應，例如經活化聚乙二醇，如琥拍醯亞胺基碳酸醋_ 經活化聚乙二醇、噻唑啶硫醇_經活化聚乙二醇，及/或形 成尿烷·連接或醯胺-連接的經活化聚乙二醇，其中該聚= 一醇較佳具有從大約2,〇〇〇到大約1〇〇,〇〇〇道爾吞之分子 200817521 里，或更特定而言，其中該聚乙二醇具有從大約4,〇〇〇到 大約45,000道爾吞之分子量。 本發明之製程更包括使在其上有可氧化半胱胺酸之重 組表現之蛋白質穩定的方法，其包括，在適當的原核生物 表現系統中以重組方式表現該蛋白質並從含有足量加帽劑 之細胞萃取培養基甲回收該重組表現的蛋白質，藉此當從 在#亥適當之原核生物細胞表現系統中的原核生物細胞中分 泌後’在該重組表現之蛋白質上的可氧化胺基酸穩定。較 佳的是，該原核生物表現系統是能夠產生重組腺苷脫胺酶 的大腸桿菌表現^统’且該重組表現之蛋白f是腺芽脫胺 酶及/或干擾素。 本發明之製程更包括產生感興趣之可氧化蛋白質之穩 定化衍生物的方法，其包括下列步驟 (a)確認感興趣的可氧化蛋白質，其中當該蛋白質在水 溶液中時，該蛋白質在一或多個胺基酸殘基處是可氧化 的，
(b)確認該感興趣之蛋白質的至少—個可氧化胺基酸， ⑷使該感興趣的可氧化蛋白質與加帽劑反應，該加帽 劑係被選擇以防止該可氧化胺基酸的氧化作用。 該蛋白質1 (例如）腺賴胺酶或干擾素，該可氧化胺基 酸是半胱胺酸或甲硫胺酸且該加帽劑係選自由氧化之穀耽 甘肽、埃乙醯胺、埃乙酸、胱胺酸、其他的二硫盼及^混 合物所組成之群組。 本發明又另 方面包括半胱胺酸-穩定化的重組蛋白 9 200817521 、酵素或類似物，以及製造其等之方法。關於這一點， 二佳的具體事實為半胱胺酸穩定化的rbADA及/或rhADA。 !?::，物共軛物為本發明之具體事實。該聚合物較 佳疋聚環氧燒，例如更佳的是聚乙二醇。該共輕物係藉著 :、工：巾目蛋白質與經活化聚合物反應來製備，該經活化聚 =物包括（例如）琥珀醯亞胺基碳酸酯_經活化聚乙二醇 口 eg )、噻唑啶硫醇_經活化聚乙二醇（“T_pEG”）、及/ f、： $ /成尿燒—連接或醯胺-連接的經活化聚乙二醇。較佳的 是 SC-PEG。 /本發明又另-方面包括使用1聚合物經共軛或未經共 幸厄形式之穩定化酵素來治療的方法。明確地說，本發明之 去匕括對需要其之患者投與有效量的半胱胺酸-穩定化 MDA以便治療SCID*其他與酵素缺陷有關的疾病: 為了本發明之目的，應瞭解，，有效量，，係意指在患者中 (即在哺乳動物或人類中）達到想要之臨床結果（即降低、 減緩、減輕等等或反轉酵素缺陷或SCID疾病）的量。 此外，在說明中為了方便使用單數名詞，並非企圖以 士此限制。因此，（例如）提及包括細胞之組合物時，包 括意指一或多個這類細胞。 【實施方式】 發明之詳細說明 A.總論 概括而論，本發明提供經加帽或經保護之蛋白質，具 有提高的穩定性。特定而言，本發明提供以具有一或多個 200817521 可虱化或反應性半胱胺酸殘基之方式表現的蛋白質，該半 脱胺酸殘基係暴露至蛋白質之溶液環境，使得該蛋白質在 溶液中展現出不穩定性，例如在儲存期間。該蛋白質較佳 是重組產生的ADA酵素。 可根據本發明加帽之可氧化胺基酸殘基的數目將視出 現在感興趣蛋白質中的這類胺基酸殘基之數目，以及豆在 該蛋白質之三級結構中的位置而定。無意受任何理論絲 設限制，咸認為當蛋白質溶解或懸浮於含水介質中時暴露 至该溶液之可氧化胺基酸，就是最有可能引起該蛋白質之 氧化-介導之降解作用的那些。因此，鐘認並將這類胺基酸 加帽會抑制這類胺基酸殘基的氧化，並藉此提供經加帽蛋 白質’其相對於未經加帽蛋白質具有提高的敎性。因此， (例如）可精著鑑認在含水介質中不穩定之感興趣蛋白質 时解產物，並判定相對於可氧化胺基酸之出現之片段瓦 解的位置，判定欲加帽之殘基。欲加帽之殘基的數目可以 V至個’多至穩定化感興趣之蛋白質所需者，例如多至 50個或更多。更特定而言，欲加帽之殘基的數目更典型 的範圍是從1到大約2G個，且更特定而言，從！到大約、10 個胺基酸殘基。 本發明亦提供穩定化其上具有可氧化半耽胺酸之重組 蛋白貝的方法。該方法包括在足以加帽可氧化半胱 胺酸但霄曰質上不使該重組表現之蛋白質失活的反應條件 下、足里之加巾目冑處理含有▼氧化半胱⑮酉曼之重組表現 的蛋白質。 11 200817521 如同一般技藝人士知曉的，在此方面，，處理，，包括允許 以加帽劑處理該重組表現的蛋白質，其藉由使兩個主要反 應劑在適當緩衝之溶液中接觸，其會保護蛋白質之生物活 ι±同犄允许反應性半胱胺酸的選擇性氧化作用發生。”處理，， 可在表現後之重組產製的各種階段發生，但對於本發明的 該方面而言，較佳是在一或多個表現後的純化步驟期間。 例如，可經由陰離子交換層析法在還原劑（如二硫蘇糖醇 (DTT))的存在下，達成從細胞萃取物中之ada蛋白質的 初步純化。隨後，當移除DTT後，可利用足量的加帽劑處 理半-純化的ADA以阻斷反應性半胱胺酸。相同的程序可 在純化的任何步驟或在純化結束並在PEG化之與經過純化 的蛋白質進行。一旦加帽，便不需要還原劑來維持經修飾 之ADA的穩定性。 B.ADA蛋白質 在本發明的某些較佳方面，重組表現的蛋白質是 rhADA或rbADA。更佳的是，轉譯之rhADA在加帽之前 具有SEQIDNO:2之胺基酸序列，且轉譯之rbADA在加帽 之丽具有SEQIDNO:4之胺基酸序列。應注意seqidn〇:2 和4為預測的成熟轉譯序列，並反映N_終端Met殘基的轉 譯後切開。因此，在轉譯之個別成熟ADA蛋白質中，cys 殘基是在位置74處。此外，應注意從牛腸中分離之天然的 牛A D A亦具有在轉澤後從c -終端移除的六個殘基。以沒 有六個C-終端殘基（稱為突變蛋白）或在轉譯後修飾而移除 在經過純化之天然牛ADA中缺少的相同終端殘基之形 12 200817521 式表現rbADA ’為本發明的可選擇特徵。 更應該注意到從牛腸中分離的天然牛ADA具有多形 性。因此，在提及SEQ ID NO:4時，牛ADA多：性包括 (例如）穀胺酿胺在位置198處代替離胺酸，丙胺酸在位 置254處代替蘇胺酸；精胺酸在位置351處代替甘胺酸。 因此，考慮到根據本發明之重組體位置74突變蛋白牛 ADA，亦可在一或多個上文提到的位置處或那些位置的類 似物具有額外的取代·· Gin代替Lys198 ; Ala代替Thr245 ; Arg 代替 Gly351。 此外，rhADA是由具有針對大腸桿菌表現最適化之密 碼子，根據SEQ ID ΝΟ:1的DNA表現，而rbADA則是由 具有針對大腸桿菌表現最適化之密碼子，根據SEQ ID NO:3 的DNA表現。可分別從編碼rhADA或rbADA之基因組或 cDNA製備適當的表現載體，其可視需要在適當的以可操 作式連接的可誘導啟動基因的控制之下。 如同下文舉例說明的，從Mike Hershfield of Duke Medical Center，North Carolina 獲得含有基本 rhADA 核苦 酸序列的載體（pET9d)(稱為HADA1092純種系）。然後為了 在細菌中表現，將HADA1092純種系最優化，並將其插入 在可誘導之啟動基因的控制之下的適當表現載體内，再轉 型至BLR(久DE3)品系内。將該重組純種系被命名為 EN760 〇 同樣的’藉著將 BioCatalytics質體（p2TrcGro-RoADA2-23)轉型至新鮮的大腸桿菌BL21化學勝任細胞 13 200817521 (Novagen，目錄編號 69449-4,批號 N60830,基因型 F· 内，建構重組的rbADA表現純種系。 該純種系含有質體p2TrcGro-RoADA2-23，其具有由Roche 提供的牛ADA基因以及大腸桿菌GroEL/GroES伴但蛋白 (chaperone)操縱子（美國專利第6,366,860號）。將該新穎的 轉型純種系培養在30°C之含有CFB培養基（10克/公升大豆 蛋白脒、5克/公升酵母萃取物、10克/公升氯化鈉）、2%(重 量/體積）凝膠、和20微克/毫升康黴素的培養盤上。藉著 IPTG誘導rbADA的表現。 C·加帽劑和反應條件 納入本發明之方法中的加帽劑包括（但不限於）氧化 之榖胱甘肽（較佳的）、碘乙醯胺、碘乙酸、胱胺酸、和一 般技藝人士已知的其他二硫酚、及其混合物。在本文中描 述之方法的反應期間，所納入之加帽劑的量和濃度，多少 將視所使用的特定加帽劑和技術者的需求而定，但不會接 受過度的實驗。使用氧化之穀胱甘肽作為原型，當與重組 蛋白質（如rhADA)反應時所使用的濃度範圍可從大約25uM 到大約100mM。較佳的是，氧化之穀胱甘肽以從大約5m]vi 到大約25mM之濃度與重組蛋白質反應。 在加帽劑與重組蛋白質反應期間所使用的反應條件更 包括使用具有從大約6 · 5到大約8 · 4，較佳的是從大約7.2 到大約7 · 8之pH值的水溶液。此外，該水溶液較佳包括適 S的緩衝溶液’如石粦酸納、填酸钟、T r i s、和H e p e s及其 混合物，以範圍從l〇到l5〇niM之濃度（建議：可在該緩衝 14 200817521 範圍乂外兔生加帽作用’比1 〇mM更低或比1 $〇mM更高）。 该反應條件更包括允許該反應在不促使該蛋白質降解的溫 度，即k大約4-37°C下進行。可視需要在該溫度範圍之外 進订加帽反應，例如在低於〇_4°C或高於37°C的溫度範圍 下。使該反應進行一段足以達到想要的反應性半胱胺酸之 穩定化的時間。僅僅作為舉例，進行該反應從大約5秒到 大約8小時（例如過夜）的時間。 雖然從較佳的重組蛋白質（即rhADA或)之 觀”沾來龙明本發明，應明瞭亦可使用幾個重組製備並具有 可能涉及不穩定性之自由半胱胺酸基團（們）的蛋白質、酵 素等等（士某些干擾素）進行在本文中描述之製程。例如， 可藉著本發明之方法使^干擾素敎。無意限制， 其他適當的感興趣之蛋白質、多肽和肽包#(但不限於） 血紅蛋白、血清蛋白f，如血液因子，包㈣子观、丽和 K免疫球蛋白、細胞激動素，如介白素，即a.工到m 等等、集落刺激因子，包括粒細胞集落刺激因+、血小板 衍生之生長因子等等。其他在生物學或治療上感興趣的蛋 白質包括胰島素、植物蛋白質，如外源凝集素和！麻蛋白、 腫瘤壞死因子和相關蛋白質、生長因+，如轉型性生長因 :，:象是TGFa〇以及上皮生長因子、激素、生長調節 素、促紅血球生成素、色素激素、下視丘釋放因子、抗利 尿激素、催乳激素、絨毛膜促性腺激素、促印泡激素、甲 狀腺刺激激素、組織血纖維蛋白料原激活子、 物。感興趣的免疫球蛋白包括 15 200817521 及其片段和單鏈構築體。 感興趣的酵素包缸 G括妷水化合物_專一的酵夸 ^ 酵素、氧化還原酶、# /、、蛋白水解 連接酶。無意限於特硅从成主 異構I#和 L-天冬醯胺酶、精:=Τ感興趣之酵素的實例包括 酶、内毒素酶、過氧二酶：酸脫亞胺酶、超氧物歧化 礼化虱酶、胰凝乳蛋白酶、 酸酶、腺茌-德缺仏 細肪酶、尿 -夂轉、駱胺酸酶和膽 之栌皮芥人犏奄 啤τ ^二京虱化St。感興趣 Γ
之反水化ΰ物-專一的酸音白紅 朴 r…、 的酵素包括葡萄糖氧化酶、葡萄糖酶 (glucodase)、半乳糖苦酶、 匍糖細苷月曰酶、葡萄糖醛酸 姆寻寻。 丽述列表僅僅為解釋被考慮使用本發明之方法穩定化 的蛋白質。應瞭解在本文中定義的那些蛋白f、酵素等等， 並非特別提及但具有反應性半胱胺酸者亦意欲被納入本發 明之方法中。 由於本务明之方法的結果，穩定化蛋白質在反應性半 胱胺酸處附接有加帽基團。例如穀胱甘肽或其他加帽基團 經由二硫鍵與rhADA共軛，如： ADA_S-S-穀胱甘肽 在此處，在ADA之一級序列中的一個半胱胺酸與一 为子毅胱甘肽結合’下文以ADA Cys之-SH與穀胱甘肽之 _ S Η反應而顯示： 16 200817521
〇 〇 νη2 這類一硫鍵對氧化降解路徑是穩定的，並因此使 rhADA變得更穩定，尤其是在超過7 4之ρΗ值下。此外， 穩定化蛋白質（如rhADA )之榖胱甘肽-加合物的分子量 會比穩定化之前的形式高大約等於所使用之加帽劑之分子 量的量。若需要’這將容許分離想要的加合物。穩定化加 合物亦具有不同的物化特性，其將容許層析分開和分離。 D.聚合物共輛物 Ο 在本發明的另一個方面，將半胱胺酸加帽或穩定化之 重組蛋白質與適當的聚合物共軛，以便製造聚合物共軛 物。該聚合物共軛較佳是peg化反應，如一般技藝人士已 知的反應。簡言之’使（例如）rhADA和rbADA在足以形 成半胱胺酸加帽或穩定化之聚合物共軛物的條件下，在水 溶液中與活性聚合物反應。關於這一點，可使用各式各樣 的經活化聚乙二醇，包括在例如共同指定之美國專利第 5，122,614 號、5,324,844 號、5,612,460 號和 5,808,096 號（琥 Ϊ白酿亞胺基碳酸酯-經活化聚乙二醇（SC_pEG)和相關的經活 化PEG)、5,349,001號（環狀醯亞胺硫酮經性化PEG)、 5,65 0,234號中描述的那些，以及其他一般技藝人士已知的 那些。前述每一者之揭示係以引用方式納入本文中。亦參 見可獲自Nektar/Shearwater Polymers的經活化聚合物。經 17 200817521
活化PEG可以是直線、分支或U-PEG衍生物，如在美國 專利第 5,605,976 號、5,643,575 號、5,919,455 號和 6，113,906 號（亦以引用方式納入本文中）中描述的那些，或分支衍生 物。應更瞭解除了基於PEG的聚合物之外，亦可使用許多 其他的聚環氧烷。例如，本發明之共軛物可藉著下列方法 來製造，其包括使用在前文提及之’6 14或’096專利中描述 的活化技術，將多-臂PEG-OH或”星狀-PEG”產物（如在NOF Corp.藥物遞送目錄第8版，2006年四月中描述的那些，其 揭示係以引用方式納入本文中）轉變為經適當地活化之聚 合物。明確的說，PEG可具有下式： 或 ί) ^〇-CH2CH2^(〇CH2CH2)u-\c h〇-CH2CH^(〇CH2CH2)/〇
、(ch2ch2〇v 星狀 /(CH2CH2〇)u、 0 、〇、ch2ch2-(〇ch2ch2)u.—ο h〇〜CH2CH2-(〇CH2CH2)u./〇
多-臂 oh2ch2、〇' 0—(CH2CH20)u_-CH2CHr〇 〜(CH2CH2〇)u·—CH2CH2，〇
其中： u’是從大約4到大約455之整數，較佳提供具有總分 子量從大約5,000到大約40,000的聚合物；殘基中最多達 3個終端部分係以甲基或其他低碳數烷基加帽。 在某些較佳的具體事實中，將全部4個PEG臂都轉變 為適當的釋離基，即SC等等，以助於附接至重組蛋白質。 這類化合物在轉變之前包括： 18 200817521 H3c 〜(〇CH2CH2)u.\ Ο,
〇、 (CH2CH20)u·、 〇 /(ch2ch2o)u，、 q L»ri2un2、 ΌΗ H3C、 ch3 、(OCH2CH2)u< ,(ch2ch2o)u、 H3C、(OCH2CH2)u<〇 H3C^(〇CH2CH2)u 〇
〇、 (ch2ch2o)u、 、ch2ch2' ΌΗ 、ch2ch2、 ΌΗ ho—CH2CH2-(〇ch2CH2)u^° H3C、(〇CH2CH2)u,、
0、 (ch2ch2o)u·、
0/(c_20)u.、CH2CH2、OH ch2ch
OH HO- ,(CH2CH20)u“ ho、ch2ch2、(〇ch2ch2)u，0 、CH2CH2 〜(〇CH2CH2)u.\r
s(CH2CH20)u.、 、CH2CH2、〇h ch2ch2、 ΌΗ H3C_(〇CH2CH2)U.—〇 h3o(〇ch2ch2)u，
〇一 (CH2CH2〇)u.-CH2CH2—OH \(CH2CH20)u_—CH3 h3c-(〇ch2ch2)u，一(ch2ch2o)u.-ch3 h3c-(〇ch2ch2)u，
\(CH2CH20)u•—ch2ch2—OH
H3C-(〇CH2CH2)U·—(ch2ch2〇)u.-ch2ch2—〇H h3c-(〇ch2ch2)u一
、(CH2CH2〇)U·—CH2CH2—〇H HO-CH2CH2 - (〇CH2CH2)u·—Ο h3c-(〇ch2ch2)u，
O—(CH2CH2〇)u._CH2CH2—OH 、(ch2ch2〇)u·—ch3 19 200817521
H3C-(OCH2CH2)u，一 Q H〇-CH2CH2-(〇CH2CH2)u 〇一(CH2CH2〇)u._CH2CH2—OH 、(ch2ch2o)u，一 ch3 H3C-(〇CH2CH2)ui—〇 h〇-ch2ch2-(〇ch2ch2)u，
o—(CH2CH2〇)u-CH2CH2—OH
^(CH2CH20)u.-CH2CH2—OH
H〇—CH2CH2-(〇CH2CH2)U·—O. h3o(〇ch2ch2)u， 與 H〇-CH2CH2-(〇CH2CH2)u.—0 h〇-ch2ch2_(och2ch2)u，
〇一(CH2CH2〇)ui-CH2CH2—OH 、(ch2ch2o)u.-ch2ch2-〇h o—(CH2CH2〇)u--CH2CH2—OH \(CH2CH2〇)U.-CH2CH2—OH 在本發明的最佳方面，經活化聚乙二醇是提供與蛋白 質之尿烷連接或醯胺-連接的聚乙二醇。 在另一方面，經活化聚合物可使用基於受阻酯之連接 劑。參見美國臨時申請案第60/844,942號，標題為”具有 以受阻酯為基礎之生物可降解之連接劑的聚環氧烷烴 (Polyalkylene Oxides Having Hindered Ester-Based Biodegradable Linkers)”，其内容係以引用方式納入本文 中。例如，這類化合物的非限制性列表包括： 20 200817521
Ο
其中”u”為從10到大約455之整數。 適當之聚合物之重量會實質上改變。為了本發明之目 的，經常選擇具有範圍從大約2,000到大約100,000之分 子量均重的聚合物。較佳的是從大約4,000到大約45,000 之分子量，而特佳的是5,000到大約12,000。 在美國專利申請案第1 1/328,662號中，描述了以高純 度製備具有終端羧酸之聚合物的方法，其内容係以引用方 式納入本文中。該方法包括首先製備聚環氧烷的第三烷基 21 200817521 酯，接著轉變為其羧酸衍生物。Ρ ΑΟ羧酸之製備之製程的 第一個步驟包括形成中間物，如聚環氧烷羧酸的第三·丁 酯。該中間物係藉著使PAO與鹵乙酸第三-丁酯在鹼（如 弟二-丁醇钟）的存在下反應而形成。一旦已形成第三_丁 酯中間物，便可以超過92%之純度，較佳的是超過97%， 更佳的是超過99%，且最佳是超過99·5%之純度，輕易地 提供聚環氧烷之羧酸衍生物。
ί) 在另一方面，可使用具有終端胺基基團的聚合物來製 造ADA共軛物。在美國專利申請案第11/5〇8,5〇7號和 1 1/537，172號中，描述了以高純度製備含終端胺之聚合物 的方法，其内容分別以引用方式納入本文中。例如，使具 有疊氮化物之聚合物與以膦為基礎之還原劑（如三苯膦）、 或鹼金屬硼氫化物還原劑（如NaBH4)反應。或者，使含 釋離基之聚合物與經保護的胺鹽（如亞胺二碳酸甲基_第三 -丁酯的鉀鹽(KNMeBoc)或亞胺二碳酸二·第三丁酯的鉀鹽 (ΚΒ〇〇2))反應，接著將經保護之胺基團脫保護。藉著這 些製程形成的含終端胺之聚合物的純度超蝴咖，二 較佳是超過99%。 ’ | 口切攸供的分支， 允許二級或三級分支，成盔 成為在具生物活性之分子上，從單 點附接增加聚合物裝載的古^ 戰的方式。應瞭解若需要，可將水溶 座4合物官能化，以便附技 ▲ 、接又功此的交聯基團，而不需過 度的實驗。 在本文中包括的聚合物質 較佳在室溫下是水溶性 22 200817521 的。這類聚合物的非限制性列表包括 -r ^ , κ%氣烷均聚物，如 承乙一紅(PEG)或聚丙二醇、聚氧乙烯化的 聚物、及其嵌段共聚物，其條件為該嵌 八共 A k A 1 I物的水溶付 被、准持。除了 mPEG之外，亦可使用終 聚物。 、為C丨-4烷基的共 最為基於PAO之聚合物的替代，可使 原性物質，如葡聚糖、聚乙烯吼咯咬_、只^非-抗 J 來丙烯醯胺，如
HPMA(經丙基甲基丙晞醯胺）、聚乙婦醇、基於碳水化人物 之聚合物、前述者的共聚物、以及類似物。—般技获二士 會領悟前述之列表只是做為解釋，且所有具有在本文中描 :之性質的聚合物物質是被預期的。為了本發明之目的，田， 實質上或實際上非-抗原的，，意指在此項技術中明瞭在哺乳 動物中為無毒性且不誘發可察覺之免疫反應的所有物質。 E·含有加帽劑之細胞萃取培養基 在本發明的替代方面，係提供穩定化在其上具有反應 性半胱胺酸之重組表現蛋白質的其他方法。在該製程中， 其步2包括在適當之原核生物表現系統中以重組方式表現 蛋白質，並從含有足量之加帽劑的細胞萃取培養基中回收 λ重、、且表現之蛋白負，藉此當從在該適當之原核生物細胞 表現系統中的原核生物細胞中分泌時，實質上使在該重組 表現之蛋白質上的反應性半胱胺酸被穩定化。如同在本發 明之首要觀點中的情況，欲表現之較佳蛋白質為rhADA或 適g的原核生物表現糸統為能夠產生rhADA或 rbADA的大腸桿菌表現系統。 23 200817521 將含有rhADA cDNA的表現載體（pET9d)導入大腸桿 菌表現品系BL21QDE3)内，或相等的表現載體和細菌品系 組合，並在細菌中藉著IPTG誘導容許合成重組蛋白質。 然後在補充有EDTA和想要濃度（在本文中為5_5〇mM) 之加帽劑的ΡΗ7·4之Tris緩衝溶液中溶解細胞，並製備萃 取物’其含有經過表現的rhADA。 實施例 下列的實施例係用以更進一步提供本發明的價值，而 非意欲以任何方式限制本發明的實際範圍。 實施例1 帶有合成型rhADA cDNA的重組細菌純種系之製備 從 Mike Hershfield of Duke Medical Center，North
Carolina獲得含有基本人類腺苷脫胺酶核苷酸（rhADA)序列 的載體（pET9d-HCADA 1092)(稱為 HADA1092 純種系）。為 了細菌表現，依據大腸桿菌K12的標準細菌密碼子使用偏 好’將cDNA岔碼子敢優化’其使用由Grantham R·等人； 1981 為了基因表現力調整之基因組策略中的密碼子目錄 使用偏好（Codon catalogue usage in genome strategy modulated for gene expressivity)，，，Nucleic Acid Rpq Q-r4^_ r47，以及Rathe，R· 1985 從胺基酸序列資料來推衍合成 的募核苷酸探針，理論與實際考量（Synthetic oligonucleotide probes deduced from amino acid sequence data，Theoretical and Practical considerations)”，J. Mol Riol； 181:1 -12描述的密碼子資料庫，兩者之全文均以引用方式 24 200817521 納入本文中。然後對相對應的RNA序列分析髮夾結構之形 成或環的形成，並接受最低自由能量計算，然後以合成方 式插入Ncol和Hindlll側翼位置，以容許選殖到表現載體 pET28a(購自 Novagen)内。將所得的含有人類ADA cDNA 之重組質體命名為pHADApET28a，並將其轉化至大腸桿 菌之BLR(^DE3)品系（Novagen)内，以創造出可存活的 r h A D A表現純種糸。將該重組純種糸（具有在異丙基-β - D _ 硫代吡喃半乳糖苷（IPTG)IPTG-可誘導啟動基因控制之下的 rhADA基因）命名為EN760。編碼rhADA蛋白質的密碼 子最優化之DNA分子係於SEQ ID ΝΟ:1出示。 實施例2 表現rhADA之EN760純種系的發酵 將得自BLRQDE3)培養盤的單一菌落接種在50毫升 試管，於含有康黴素10微克/毫升和四環素12.5微克/毫升 的5毫升LB培養基中。在37°C/250rpm攪拌器中培養該 試管7小時，然後使用250微升培養物來接種含有250毫 升新近完成之LB培養基的1公升燒瓶。在37°C/250rpm 攪拌器中培養該燒瓶過夜。使用過夜培養物（〇D600值4.401) 來接種 BioFlo3000 發酵器（5 公升；North Brunswick Scientific Company，Edison，NJ)，其中含有 4.5 公升完全 的SuperBroth(完成的：康黴素10微克/毫升、四環素12.5 微克/毫升、5毫升/公升甘油、和 1.68毫升/公升 MgS(V7H20)，得到最初的OD6()()為0.2445。使該培養物 生長至22_5之OD_值（EFT 6小時），並以5mM IPTG誘 25 200817521 導以開始生產期。在誘導之後2小時收穫培養物（〇D6Q()值 44) ’ 使用 Beckman Coulter 離心機（7000rpm/4°C /20 分鐘）， 產生濕重282克的細胞。 培養基組成
SuperBroth 之組成（DifcoTMSelectAPSTMSuperBroth，得 自 BD BioSciences，Inc·) 高壓滅菌之組份： 12.0克/公升 24.0克/公升 11.4克/公升 1.7克/公升
U 大豆水解產物 酵母萃取物 碟酸二鉀 磷酸單鉀 過濾的組份（補充物）： 康黴素 10微克/毫升 四環素 12.5微克/毫升 發酵參數：
攪拌：lOOOrpm 溫度：37°C pH 值· 7·0 空氣：1.5/2.0(導入）wm 康黴素：10微克/毫升四環素：12.5微克/毫升 MgS04*7H20: 1.68 毫升 / 公升 實施例3 帶有合成型rbADA cDNA的重組細菌純種系之製備 衍生自牛腸製劑之經過純化的成熟ADA蛋白質是3 5 6 個胺基酸之蛋白質’其缺少N-終端甲硫胺酸和從cDNA序 列推測的敢後6個C_終端殘基（GenBank NP-7763 12，以引 26 200817521 用方式納入本文中）。簡言之，提供BioCatalytics Inc已經 定義之多肽序列，以用於具有對大腸桿菌中表現最優化的 密碼子之新基因的完整基因合成，其使用他們的方法，包 括部份重疊之募核苷酸斷片的化學合成。由美國專利第 6,366,860號詳細描述了 BioCatalytics方法，其完整内容 以引用方式納入本文中。 在數個表現系統中調查牛ADA表現。例如，將側翼 限制位置Ndel和BamHI納入基因的終端。在以限制酵素
Ndel和BamHI消化合成的DNA之後，經由T4 DNA連接
酶將11 00個鹼基的基因連接到亦已經利用這兩個酵素消 化過的質體載體pET-9d(Novagen Corporation)内。根據製 造者的說明書，使用 BTX Electro Cell Manipulates 6〇〇, 藉著電穿孔將重組質體導入大腸桿菌品系BLR(DE3)或 HMS174 (DE3)内。將轉型混合物放在含有康黴素（15微克/ 毫升）的LB瓊脂盤上。這容許選擇含有質體pET-9d/bADA 的菌落（命名為 bADA/pET9d:BLR(DE3)或 bADA/pET9d: HMS174 (DE3))。藉著 DNA 序列分析，利用 ABI Prism 310 基因分析儀’使用Big Dye Terminator，確認ADA變體基 因的核苷酸序列。藉著接種至盤並在LB培養基中藉著標 準方法（像疋在Novagen ρΕΤ系統手冊第9版中描述的那 些）’分析IPTG可誘導的基因表現，而進一步純化經過 分離的菌落。檢查數個誘導參數，包括時間、溫度和誘導 劑濃度。較佳的條件是利用〇_3%乳糖在3 7。〇下誘導12小 時’其容許在宿主細菌的細胞質中以大約20%的總細胞蛋 27 200817521
白質高水平生產ADA °在SDS PAGE分析上確認證實ADA 產物以陳現。 實施例4 藉著貫施例3之表現rbADA的純種系所產生的重組ADA 蛋白質之純化 以3個由Enzon開發的層析方法，進行rbADA的純化。 簡言之，將200克儲存在-80°C下的融解細胞糊（分別獲自
Biocatalytics)再懸浮於 1800 毫升 20mM Bis-Tris，ImM EDTA，ρΗ7·4的緩衝溶液中，並利用丁empest virtis (Sentry™，Microprocessor，Boston，ΜΑ)，以 1200RPM 均質 化1 0秒。使該懸浮液通過不銹鋼篩（開口微米25〇微米，6〇 號，W.S Tyler)以移除大顆粒。使均質的細胞懸浮液在 15,000 psi下微流化3個循環（將組件置於冰浴中κ微流化 器（Micro Fluidizer)，Microfluidics Corp·，110Y 型，Boston， MA)。在微流化結束時，使用200毫升與上述相同的緩衝 溶液潤洗該組件，並將此溶液與以上的懸浮液結合。藉著 在 4°C 下以 7100rpm(12000xg)離心 60 分鐘（Avanti J-201，
Backman Coulter;旋轉子#JLA8.1000)，從細胞溶胞產物中 萃取可溶性蛋白質。小心地收集上清液以避免不想要的混 合。所得的上清液體積為2100毫升，藉著BCA法得知總 蛋白質濃度為13.2毫克/毫升。 為移除在該細胞萃取物中的核苷酸，將3 1毫升1 0% PEI 溶液（終PEI為0.1 5%)加至上述的上清液中，並藉著攪拌10 分鐘徹底混合。將細胞萃取物儲存在4 °C下過夜。藉著在 28 200817521 4 °C 下以 7 1 00rpm( 12000xg)离隹心 60 分鐘（Avanti J-201， Backman Coulter;旋轉子#JLA8.1 000)，從該過夜試樣中移 出沉澱物。同樣的，小心地收集上清液以避免任何不想要 的混合。現在，上清液的體積為1940毫升，藉著BCA法 得知總蛋白質濃度為3.53毫克/毫升。藉著加入pH 2-10的 5-50mM氧化之穀胱甘肽，進行rbADA或rhADA免於半胱 胺酸的氧化之保護。為幫助ADA與第一個管柱結合，在 該細胞萃取物中慢慢地加入10%的PEG4600,並以IN NaOH 和IN HC1慢慢地將該細胞萃取物之pH值調整到6.5。再 度在 4°C下以 7100rpm(12000xg)離心該上清液60分鐘 (Avanti J-201，Backman Coulter;旋轉子 #JLA8.1000)，之 後再裝入下一個管柱中。 將細胞萃取物裝入預先以20mM Tris-Bis，ImM EDTA， ρΗ6·5之緩衝溶液平衡過的Capto Q管柱（目錄#17-53 16-01， GE Healthcare，Piscataway，NJ·以各 350 毫升之床體積包 裝在XK-50管柱中）中。在從管柱中以在平衡緩衝溶液中 的8 0mM NaCl溶析ADA之前，先進行利用60mM和70mM NaCl的溶析以移除不純物。藉著ADA活性、SDS-PAGE 分析、西方墨點法、和RP-HPLC分析溶析曲線。 在Capto Q管柱之後，使用2個忌水性交互作用層析 純化，一個接一個進一步精練蛋白質的純度。第一個HIC 是辛基瓊脂糖 4FF(目錄 #17-0946-02，GE Healthcare， Piscataway，NJ)。以硫酸銨粉直接將得自Capto Q管柱的 ADA溶離份匯集調整到1.5M (NH4)2S04，並將pH值調整 29 200817521 到6.5。將經過過濾的試樣（Nalgene Nunc，目錄#540887, MEMB 0.2PES，Rochester，NY)裝入第一個 HIC 管柱中，其 預先以 1.5M (NH4)2S04，20mM 磷酸鉀，ImM EDTA，ρΗ6·5 平衡過了（床體積150毫升，在ΧΚ-50中，GE Healthcare， Piscataway，NJ)。以硫酸銨梯度溶析ADA蛋白質，並藉著 SDS-PAGE和RP-HPLC測定該溶析的純度曲線。集合在第 一個HIC管柱之溶離份中的ADA蛋白質，調整至1M (NH4)2S04,並直接裝入第二個HIC管柱（床體積150毫升， XK-50，HIC 苯基 HP，目錄 #17-1082-01，Piscataway，NJ) 中，其預先以 1M (NH4)2S04, 20mM KH2P04-K2HP04，ImM EDTA，ρΗ6·5 平衡過了。以在 20mM KH2P04-K2HP04, ImM EDTA，ρΗ6·5中之1M到300mM的硫酸銨梯度溶析ADA 〇 藉著SDS-PAGE和RP-HPLC分析這些溶離份的ADA純度。 將經過純化的 rbADA 或 rhADA 進一步脫鹽，並在
LabScaleTMTFF 系統（Membrane BioMax 5，Bedford，MA)中 濃縮。 實施例5 以氧化之穀胱甘肽處理過的rhADA細胞萃取物之製備 將根據實施例2製備之冷凍細胞融解，並再懸浮於含 有20mM Bis-Tris ImM EDTA在ρΗ7·4下的再懸浮缓衝溶 液中。將融解、再懸浮之細胞均質化，通過250微米不銹 鋼篩過濾，並以15000 psi微流化3個循環，以確保完全 溶解。藉著離心使所得的細胞萃取物澄清，並將一半的上 清液加至25mM氧化之穀胱甘肽（“GSSG”）中（終濃度。以在 30 200817521 200mM Bis-Tris，ρΗ7·4 中的 250mM 母液製造 GSSG)。在 進一步加工之前，以額外的25mM GSSG處理另一半萃取 物（因此GSSG的總濃度為50mM)。然後在4°C下以0.1% 聚乙烯亞胺（“ΡΕΙ”，ρΗ7·4)處理兩個試樣過夜，並離心以移 除核酸和蛋白質沉澱物，並隨後過濾。然後經由陰離子交 換層析進一步加工經澄清的試樣。如下，細胞萃取物製備 的細節係於表1中編輯。
31 200817521 %ψ Η^<7>9 孽驾 J, I< 注意/參數值 Tempest Virtis， Sentry™Microprocessor 開口微米250微米，60號， W.S. Tyler Microfluidics Corp.，110Y 型 Avanti J-201, Beckman Coulter; 旋轉子#几八8.1000 小心倒出以避免混合 GSSG干擾了蛋白質濃度的判定 加工 藉著攪拌融解並再懸浮細胞 以n，000rpm持續10分鐘 通過不銹鋼篩 以15000psi，3個循環，在冰上 7100rpm(12000xg)， 在1公升瓶中在4°C下1小時 在室溫下攪拌，然後儲存在4°C下，過夜 總共：1593 總蛋白質 (mg) 4263 875 718 蛋白質濃度 (mg/ml) 卜 00 〇 ro rn 體積 (ml) 300 500 490 290 200 290 200 1> 7.12 寸 卜^ 寸 1> 缓衝溶液 20mM Bis-Tris lmM EDTA 25mM(50mM)GSSG 以 25mM GSSG 以 50mM GSSG 以 25mM GSSG 以 50mM GSSG τ-Η <N SE 細胞的再懸浮 均質化 蒒過滤 —一 _ _ _ 微流化並以緩衝溶液稀釋 離心 保留的上清液 ^ 5 C； Μ 5 ί Ph 離心 ^ ί (W Ij挺 2 ^ 200817521 藉著 SDS-PAGE確認細胞萃取物經由 PEI處理之澄 清。藉著逆向HPLC確認ADA蛋白質藉由GSSG之保護。 實施例6 在氧化之穀胱甘肽的存在下，使用陰離子交換層析法之 rhADA之純化 使上文獲得的細胞萃取物（100毫升）接受陰離子交換層 析管柱（可以是Q瓊脂糖速流、DEAE瓊脂糖速流、Capto Q 瓊脂糖速流等等，GE Healthcare，Piscataway，NJ)。進行兩 個獨立的層析法，以從25mM-和50mM GSSG-處理之細胞 萃取物中純化rhADA。簡言之，藉著加入IN NaOH，接著 以蒸餾水稀釋，分別將細胞萃取物的pH值和傳導性調整 到6.5和1.5毫秒/公分。使大約100亳升經過調整的細胞 萃取物（以25mM GSSG處理）通過27毫升預先以含有20mM Bis-Tris和 ImM DETA，ρΗ6·5之平衡緩衝溶液平衡過的 DEAE管柱。以2cv(即管柱體積）的平衡緩衝溶液，從管柱 中移除非-專一結合的蛋白質，並以20cv在上述緩衝溶液 中製備之20mM KC1的直線梯度從管柱中溶析出人類 ADA。收集與高峰一致的溶離份，藉著4-20%還原凝膠分 析，並集合含有人類ADA的溶離份。在蛋白質溶析之後， 在加工之前先以NaOH和醋酸洗滌該管柱，並以平衡緩衝 溶液平衡，然後依據相同的方法，從50mM GSSG-處理之 細胞萃取物中純化人類ADA。為了保持經穀胱甘肽-修飾 之物種的完整，在純化步驟期間不使用還原劑。 藉著在標準SDS-PAGE上跑高峰溶離份，確認經由該 33 200817521
層析方法從其他雜質中經穀胱甘肽加帽之rhADA(GS-rhADA)的分離。藉著標準酵素測定確認GS-rhADA的ADA 活性。 實施例7 在氧化之穀胱甘肽的存在下，使用層析法之rbADA之純化 以3個層析方法，進行rbADA的純化。簡言之，將200 克儲存在-80°C下的融解細胞糊（如獲自實施例4，在前）再 懸浮於 1800 毫升 20mM Bis_Tris，ImM EDTA，ρΗ7·4 的緩 衝〉谷液中’並利用 Tempest Virtis (Sentry™，Microprocessor， Boston，ΜΑ)，以1200RPM均質化10秒。使該懸浮液通過 不銹鋼篩（開口微米250微米，60號，W.S Tyler)以移除大 顆粒。使均質的細胞懸浮液在1 5,000 psi下微流化3個循 環（將組件置於冰浴中）（微流化器（Micro Fluidizer)， Microfluidics Corp·，110Y 型，Boston，ΜΑ)。在微流化結束 時’使用200毫升與上述相同的緩衝溶液潤洗該組件，並 將此溶液與以上的懸浮液結合。藉著在 4 °C下以 7100rpm(12000xg)離心 60 分鐘（Avanti J_201，Backman Coulter;旋轉子#JLA8.1000)，從細胞溶胞產物中萃取可溶 性蛋白質。小心地收集上清液以避免不想要的混合。現在 上清液體積為2100毫升，藉著BCA法得知總蛋白質濃度 為H2毫克/毫升。 為移除在該細胞萃取物中的核苷酸，將3 1毫升1 0%ΡΕΙ 溶液（終PEI為〇· 1 5%)加至上述的上清液中，並藉著攪拌1 〇 分鐘徹底混合。接著將細胞萃取物儲存在4°C下過夜。藉 34 200817521 著在 4°C 下以 7100rpm(12000xg)離心 60 分鐘（Avanti J-201， Backman Coulter;旋轉子#JLA8.1000)，從該過夜試樣中移 出沉澱物。同樣的，小心地收集上清液以避免任何不想要 的混合。現在，上清液的體積為1940毫升，藉著BCA法 得知總蛋白質濃度為3,53毫克/毫升。 藉著以25 mM氧化之穀胱甘肽於pH 6.5加帽此胺基 酸，進行半胱胺酸74之保護（即，Cys75，若N-端Met存 在）。為幫助ADA與第一個管柱結合，在該細胞萃取物中 慢慢地加入10°/。的PEG4600，並以IN NaOH慢慢地將該 細胞萃取物之 pH值調整到 6.5。再度在 4 °C下以 7100rpm(12000xg)離心該上清液 60 分鐘（Avanti J-201， Backm an Coulter;旋轉子#JLA8.1000)，之後再裝入下一個 管柱中。 將細胞萃取物裝入預先以20mM Tris_Bis，ImM EDTA， ρΗ6·5之緩衝溶液平衡過的Capto Q管柱（目錄#17-5316-01， GE Healthcare，Piscataway，NJ.以各 350 毫升之床體積包 裝在XK-50管柱中）中。在從管柱中以在平衡緩衝溶液中 的80mM NaCl溶析ADA之前，先進行利用60mM和70mM NaCl的溶析以移除不純物。藉著 ADA活性、SDS-PAGE 分析、西方墨點法、和RP-HPLC分析溶析曲線。 在Capto Q管柱之後，使用2個忌水性交互作用層析 純化，一個接一個進一步精練蛋白質的純度。第一個HIC 是辛基瓊脂糖 4FF(目錄 #17-0946-02，GE Healthcare， Piscataway，NJ)。以硫酸銨粉直接將得自 Capto Q管柱的 35 200817521 ADA溶離份匯集調整到1.5M (NH4)2S04，並將pH值調整 到6.5。將經過過濾、的試樣（Nalgene Nunc，目錄#540887, MEMB 0.2PES，Rochester，NY)裝入第一個 HIC 管柱中，其 預先以 1.5M (NH4)2S04，20mM磷酸鉀，ImM EDTA，ρΗ6·5 平衡過了（床體積150毫升，在ΧΚ-50中，GE Healthcare， Piscataway，NJ)。以硫酸錄梯度溶析ADA蛋白質，並藉著 SDS-PAGE和RP-HPLC測定該溶析的純度曲線。集合在第 一個HIC管柱之溶離份中的 ADA蛋白質，調整至1M (NH4)2S04,並直接裝入第二個HIC管柱（床體積150毫升， XK-50, HIC 笨基 HP，目錄 #17-1082-01，Piscataway，NJ)中， 其預先以 1M (NH4)2S04, 20mM KH2P04-K2HP04, ImM EDTA， ρΗ6·5 平衡過了。以在 20mM KH2P04-K2HP04，ImM EDTA， ρΗ6·5中之1M到300mM的硫酸銨梯度溶析ADA。藉著 SDS-PAGE和RP-HPLC分析這些溶離份的ADA純度。將 經過純化的rbADA進一步脫鹽，並在LabScale™TFF系統 (Membrane BioMax 5，Bedford，MA)中濃縮。 實施例8 藉著質譜分析和逆相HPLC(RP-HPLC)定出部分純化之 rhADA的特徵 藉著陰離子交換層析法（Capto Q管柱，GE Healthcare， Piscataway，NJ)，使用在 20mM Tris-Bis，ImM EDTA(pH6.5) 中之80mM NaCl溶析，部分純化經穀胱甘肽-修飾之重組 人類ADA細胞萃取物。使含有主要產物的溶離份接受液 相層析/質譜分析（“LC/MS”），並分析ADA之穀胱甘肽加合 36 200817521 物的存在。該分析指出主要高聲，構成層析譜總面積的 8 5%，具有40,940Da之質量，其與經穀胱甘肽-修飾之rhADA 的理論質量一致。出現幾個其他的雜質，包括少量未經修 飾之rhADA的組份，並佔層析譜剩下的1 5%。 此外，進行實驗以測定穀胱甘肽濃度對rhADA修飾程 度的影響。將粗製的細胞萃取物分成兩份，其隨後分別以 25mM和50mM穀胱甘肽處理。然後藉著陰離子交換層析 法部分純化每個製劑，並藉著LC/MS分析。LC/MS分析的 結果指出來自每個製劑之主要高峰均具有經與穀胱甘肽-修 飾之rhADA —致的質量，且高峰面積構成層析譜總面積的 83-85%。出現幾個其他的雜質，包括少量未經修飾的 rhADA，佔層析譜剩下的15-17%。結果指出25mM和50mM 穀胱甘肽的處理兩者均有效地將rhADA轉變為經穀胱甘肽 -修飾之rhADA。 實施例9 對於以IAA加帽之半胱胺酸之rhADA的保護效果之確認 進行下列的實驗，以確認以IAA加帽rhADA的保護 效果。在3 7°C下使濃度大約0.6毫克/毫升的rhADA，在 ρΗ7·4的填酸鈉緩衝溶液中與125mM蛾乙醯胺（IAA)反應16 小時。在開始反應的數分鐘内，藉著RP-HPLC使用UV和 質譜分析偵測之試樣的分析，顯示大約70.9%的rhADA以 IAA單衍生化，且17.2%在2個位置被衍生。在37°C下培 養2和1 6小時之後，層析曲線並沒有顯著改變，沒有顯示 有氧化物種形成，指出IAA衍生物對rhADA特有的氧化 37 200817521 降解路徑是穩定的。 當在相同的條件（在37它和ρΗ7·4下16小時）下培養未 利用IΑΑ衍生之rhADΑ的試樣並以類似方式分析時，rhADa 蛋白質降解成氧化物種，達到3 0%的程度。 因此，以IAA加帽保護rhADA免於在37〇c和ρΗ7·4 下發生的氧化降解作用。 實施例1 0 對於以毅胱甘肽加帽半之胱胺酸之rhAD Α的保護效果之確認 作為IAA以外的另一種選擇，決定嘗試使用氧化之榖 胱甘肽（一正常生物組成）之反應性半胱胺酸之衍生。使 /辰度大約0.6耄克/毫升的AADA，在ρΗ7·4的鱗酸鈉緩衝 溶液中與25mM氧化之穀胱甘肽反應。在培養4、8和12 小時之後，藉著RP-HPLC利用UV和質譜分析偵測分析試 樣。僅形成GS-rhADA的單衍生化形式，並在25°C下培養 12小時之後該衍生物仍是穩定的。另外，並未發現單-穀 胱甘肽基化之rhADA化合物的活性與未-衍生化之rhADA 的活性有顯著差異。因此，以氧化之縠胱甘肽加帽rhADA 中之反應性半胱胺酸主要產生單-衍生化物種，其在未_衍 生之rhADA氧化傾向降解的條件下是穩定的，且該衍生物 具有可與rhADA之未·衍生形式相比擬的活性。 實施例11 對GS-rbADA的保護效果之確認 穩定性研究使用在CyS74處以在填酸鈉緩衝溶液（pH7.8) 中濃度約為0.5毫克/毫升之穀胱甘肽加帽的成熟rbADA之 38 200817521 試樣。藉著逆相HPLC(RP-HPLC)利用在220奈米處之UV 偵測和質譜分析偵測（Micr〇mass Q-TOF電噴霧質譜儀）兩 者監視穩定性。HPLC條件如下·· 笞柱· Zorbax 300SB-C8(Agilent，250x4.6 毫米，300 埃孔隙尺寸，5微米顆粒大小） 移動相A : 0 · 1 %在水中之三氟乙酸 移動相B : 0·1 %在乙腈/水（80/20 ;體積/體積）中之 三氟乙酸 移動相B的％ 0 20 5 20 45 80 46 20 60 20 40°C 1.0毫升/分鐘 50微升 在-疋性研究開始的起始時間以及於各個時間點 括在研究開始之後4、8和17天，藉著rp_hplc分析 化合物的純度。應注意到rbADA和Gs_rb 本 梯度： 管柱溫度： 流速： 注射體積： 為2個月之久，且業已遭受-些降解::研 ’、、、 九之目的’在開始之時間點和在25。。下捭養17 天後之間的純度為檢查的相對參數。如在表。^ 7 示，她A在開始時間點的純度為83 7%，而在17天^ 39 200817521 降至6 6 · 1 % ’代表在這段日吝卩卩& B内有17·6%的rbADA已經降 解。藉著層析分離之高峰的質士並八 , , 扪貝瑨分析指出在31.851分鐘溶 析主要的降解物（佔層析譜面藉
一 T曰曲積的3〇·5%)具有比rbADA 咼32Da之質量。該質量改蠻盥 里汉夂與在rbADA上添加兩個氧以 形成在rbADA位置74處之自ώ坐 处 < 目由+胱胺酸的亞磺酸降解物 一致。較小的降解物高峰（1名 平在32.538分鐘處溶析）具有 Γ Ο 與在&ADA上添加1個氧以形成在rbADA位置74處之自 由半胱胺酸的次賴降解物相—致的f量。^rbADA發 現的廣泛降解相反，當儲存在相同條件下時，Gs_rbADA 並未顯示出明顯的降解’在開始的時間點有819%的純度， 而在25°C下17天之後有87.4%的純度。在純度上的明顯 增加，可能是因為在檢查每組4個連續時間點的純度％時， 出現較明顯的層析變異。沒有在rbADA中看到的廣泛氧化 降解的證據，證實將在rbADA中之反應性半胱胺酸加帽保 護該酵素免於該降解路徑。這證明半胱胺酸74確實是發生 在ADA中之氧化降解的來源。 表2·在25°C下在磷酸鈉緩衝溶液（ρΗ7·8)中，rbADA、 GS-rbADA的穩定性 時間點 藉著RP-HPLC測定的純度％ rbADA GS-rbADA 開始 83.7 81.9 4天 83.6 86.1 8天 76.3 82.5 17天 66.1 87.4

Claims (1)

  1. 200817521 十、申請專利範面： 1 · 一種經加帽蛋白質，直包括 的胺基酸縣，其中該經加帽蛋卜;;—個與加帽劑連接 比相等的未經加帽蛋白質更穩定，：：質上在含水介質中 殘基是可氧化的胺基酸，且〜中❹連接之胺基酸 該胺基酸的氧化。 5知劑係選擇以便抑制 帽蛋白質，其中該可 甲硫胺酸殘基、色胺
    Ο 2·如申請專利範圍帛1項之經加 氧化胺基酸係選自由半胱胺酸殘基、 酸殘基 '及其組合所組成之群組。 3·如申請專利範圍第 脫胺酶蛋白質或干擾素。 4·如申請專利範圍第 苷脫胺酶係選自由重組人 酶所組成之群組。 1項之經加帽蛋白質，其為腺普 3項之經加帽蛋白質，其中該腺 類料脫胺酶和重組牛腺普脫胺 5.如申請專利範圍第4項之經加帽蛋白質，其中該重 組人類腺苷脫胺酶在加帽之前包括SE ^ X ^ Z ,而該重 組牛腺苷脫胺酶在加帽之前包括SEQ m n〇:4。 6·如申請專利範圍第5項之經加帽蛋白質，其中該牛 腺苷脫胺酶的六個C_終端殘基未出現。 7·如申請專利範圍第1項之經加帽蛋白質，其中嗲加 帽劑係選自由經氧化之穀胱甘肽、碘乙醯胺、碘/乙酸了^ 胺酸、其他的二硫酚及其混合物所組成之群組。 8·如申請專利範圍第4項之經加帽蛋白質，其與〒^ 上非-抗原性聚合物共軛以形成聚合物經共軛的經加帽^2 41 200817521
    •如申請專利範圍第8項 •阳蛋白質，其中 合物為聚環氧烷 〜〇.如申請專利範圍第9項之經加帽蛋白質，其中該聚 衣羊^之尺寸耗圍是從大約2，_到大約⑽，_道爾吞。 二如申請專利範圍第9項之經加帽蛋白質，其中該聚 %乳烧為聚乙二醇。 取如申請專利範圍帛u項之經加帽蛋白質，其中該 :乙^經由連接麻學與蛋自質⑼，該連接劑係選自 :以琥㈣亞胺基碳酸醋、嗟嗤咬硫_、尿烧、和基於醯 胺的連接劑所組成之群組。 13.如申請專利範圍帛η項之經加帽蛋白質，其中該 聚乙二醇共價附接在該經加帽蛋白質i Ly…胺基基團 上0 14.如申請專利範圍第u項之經加帽蛋白質，其中該 C./蛋白質具有至少5個聚乙二醇股附接在該經加帽蛋白質上 Lys的ε胺基基團上。 15·如申請專利範圍第η項之經加帽蛋白質，其中該 蛋白質具有大約11-18個PEG股附接在該蛋白質上乙”的 ε胺基基團上。 16·—種加帽在其上具有至少一個可氧化胺基酸之蛋白 貝的方法’其包括在足以加帽該可氧化胺基酸但實質上不 會使該蛋白質失活的反應條件下，以足量之加帽劑處理含 有該可氧化胺基酸的蛋白質以提供穩定化蛋白質。 42 200817521 17. 如申請專利範圍第16項之方法，其中該蛋白質為 重組腺苷脫胺酶，其選自由重組人類腺苷脫胺酶和重組牛 腺苷脫胺酶所組成之群組。 18. 如申請專利範圍第17項之方法，其中該重組人類 腺苷脫胺酶在加帽之前包括SEQ ID NO:2 ;而該重組牛腺 苷脫胺酶在加帽之前包括SEQ ID NO:4。 19 ·如申請專利範圍第16項之方法，其中該加帽劑係 選自由氧化之穀胱甘肽、碘乙醯胺、碘乙酸、胱胺酸、其 他的二硫齡及其混合物所組成之群組。 20·如申請專利範圍第19項之方法，其中該加帽劑為 氧化之穀胱甘肽。 21·如申請專利範圍第20項之方法，其中該氧化之穀 胱甘肽以從大約20到大約1 OOmM之濃度與該蛋白質反 應。 22·如申請專利範圍第20項之方法，其中該氧化之穀 胱甘肽以從大約22到大約3OmM之濃度與該蛋白質反應。 23 ·如申明專利範圍第16項之方法，其中該反應條件 包括在pH值從大約6·5到大約8.4的水溶液。 24. 如申請專利範圍帛23項之方法，其中該反應條件 包括在pH值從大約7·2到大約7·8的水溶液。 25. 如申請專利範圍帛23項之方法，其中該水溶液包 括緩衝溶液，其選自由濃度範圍從2〇至15〇mM的磷酸鈉、 磷酸鉀、Tris和Hepes所組成之群組。 26. 如申請專利範圍f 16項之方法，其更包括使該經 43 200817521 加帽蛋白質在該水溶液中，在足以形成經加帽蛋白質-聚合 物共軛物的條件下，與經活化聚合物反應。 27. 如申請專利範圍帛26項之方法，其中該經活化聚 合物是經活化聚乙二醇。 28. 如申請專利範圍第27項之方法，其中該經活化聚 乙二醇係選自由琥珀醯亞胺基碳酸酯·經活化聚乙二醇、噢 唑啶硫酮-經活化聚乙二醇和形成尿烷交聯或醯胺-交聯之 經活化聚乙二醇所組成之群組。 29·如申請專利範圍第27項之方法，其中該聚乙二醇 具有從大約2,0〇〇到大約1〇〇,〇〇〇道爾吞之分子量。 3〇·如申請專利範圍第29項之方法，其中該聚乙二醇 具有從大約4,0〇〇到大約45,000道爾吞之分子量。 3 1 ·如申請專利範圍第1 6項之方法，其中該蛋白質為 干擾素。 3 2.如申晴專利範圍第31項之方法，其中該干擾素係 選自由/3干擾素、α干擾素和7干擾素所組成之群組。 3 3 _種穩定化在其上具有反應性半胱胺酸的重組表現 之蛋白質的方法’其包括在適當的原核生物表現系統中以 重組方式表現蛋白質並從含有足量之加帽劑的細胞萃取培 養基中回收該重組表現的蛋白質，藉此當從在該適當之原 核生物細胞表現系統中的原核生物細胞分泌後，在該重組 表現之蛋白質上的可氧化半胱胺酸被穩定化。 34·如申請專利範圍第33項之方法，其中該原核生物 表現系統為能夠產生重組腺苷脫胺酶的大腸桿菌表現系 44 200817521 統。 35·如申請專利範圍第33項之方法，其中該重組表現 的蛋白質係選自由腺苷脫胺酶和干擾素所組成之群組。 36·如申請專利範圍第35項之方法，其中該重組表現 之腺苷脫胺酶在加帽之前具有SEQIDNO:2或SEQIDN0:4 之胺基酸序列。 37.如申請專利範圍第33項之方法，其中該加帽劑係 選自由氧化之穀胱甘肽、碘乙醯胺、碘乙酸、胱胺酸、其 他的二硫酷及其混合物所組成之群組。 3 8 ·如申請專利範圍第3 7項之方法，其中該加帽劑為 氧化之穀胱甘肽。 3 9 ·如申請專利範圍第3 8項之方法，其中該穀胱甘肽 在該細胞萃取培養基中以從大約2〇到大約1〇〇πιΜ之濃度 存在。 40. 如申請專利範圍第39項之方法，其中該穀胱甘肽 在該細胞萃取培養基中以從大約2〇到大約5〇mM之濃度存 在。 41. 如申請專利範圍第33項之方法，其中該細胞萃取 培養基包括在ρΗ7·4下的20mM Bis-Tris和l.OmM EDTA。 42· —種在哺乳動物中治療腺苷脫胺酶-介導之疾病的 方法’其包括投與有效量的如申請專利範圍第1 5項之聚合 物共軛的經加帽重組表現之腺苷脫胺酶。 43·如申請專利範圍第42項之方法，其中該腺苷脫胺 _ -介導之疾病為嚴重混合型免疫不全（severe combined 45 200817521 immune deficiency) 〇 44· 一種產生感興趣# < 了虱化蛋白質之穩定化衍生物的 方法，包括下列步驟： (a)鑑認感興趣的可惫 乳化蛋白質，其中當該蛋白質在水 溶液中時，該蛋白質在一十 、 或夕個胺基酸殘基處是可氧化 的， ⑻㈣«興趣之蛋白f的至少—個可氧化胺基酸， ⑷使該感興趣之可氧化蛋白質與加帽劑反應，該加帽 劑係選擇以防止該可氧化胺基酸的氧化。 其中該蛋白質為 45·如申請專利範圍第44項之方法 腺苷脫胺酶或干擾素。 其中該可氧化胺 46.如申請專利範圍第44項之方法 基酸為半胱胺酸。 其中該加帽劑係 4 7.如申睛專利範圍第4 4項之方法 ϋ 選自由氧化之穀胱甘肽、碰乙醯胺、碘乙酸、胱胺酸、其 他的一硫齡及其混合物所組成之群組。 48.如申請專利範圍第23項之方法，其中該反應條件 包括在大約ρΗ6·5下的水溶液。 十一、圈式·· 益 46
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