TW200815384A - Combination therapy method for treating hepatitis C virus infection and pharmaceutical compositions for use therein - Google Patents

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200815384 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係㈣-種特定苯并吱喃衍生物與干擾素缸合用 於治療C型肝炎病毒感染之新穎用途。 ” 【先前技術】 C型肝炎係-種可能引起慢性肝炎、肝硬化、肝功能衰 竭、及肝細胞癌之常見感染。感染C型肝炎病毒（HCV)至 少會在85%的病例中引起慢性肝炎。其係肝移植之首要原 因’且在美國每年至少造成1〇，_人死亡（Hepatology， 1997, 26 (增刊 1)，2S-10S)。 在美國，人們使用干擾素（INF)及干擾素與利巴韋林 (ribavirin)之組合來治療由Hcv導致之肝炎。該等治療可 在一些患者中降低HCV-RNA水平及血清酵素回應。其餘 患者對治療無響應。對於有回應者，僅在少量患者中可見 持續的臨床改善；大部分患者在停止治療後會復發。因 此，用於慢性C型肝炎之療法之有效性係不定的且其治癒 率依然很低。而且，治療中常伴隨相當多的副作用。 很明顯，需要新的療法及預防措施來應對由c型肝炎病 毒導致之感染及疾病。 C型肝炎病毒係黃病毒科（jqaviviridae)家族中的一員。 HCV基因組係一正鏈、單鏈線性RNA (Hepat〇1〇gy，1997, 26 (增刊1)，11S-14S)。HCV表現廣泛的遺傳異質性；已確 定至少6種基因型及超過5〇種亞型。 感染HCV後，病毒RNA被轉譯為一種多蛋白。隨後宿主 123152.doc 200815384 肽酶及病毒編碼之蛋白酶將該大約3,000個殘基之多蛋白 解離成單個蛋白質。HCV基因組編碼結構蛋白質（為病毒 裝配所需）及非結構蛋白質（為複製所需）。一些非結構蛋白 質包括：NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、及 NS5B(J. General Virology，2000, 81，1631-1648)。NS5B係一種病毒 複製所必需之RNA依賴性RNA聚合酶。在正鏈RNA病毒 (例如，HCV)中，RNA係唯一的遺傳物質。由於哺乳動物 • 宿主細胞通常缺少RNA依賴性RNA聚合酶活性，因此正鏈 〇 RNA病毒編碼其自身的複製性聚合酶（對於HCV為NS5B)， 其係產生病毒粒子子代所必需者。因此，抑制NS5B活性 為HCV藥物設計提供了一個引人注目之目標。 在2004年5月21日公開（W0 2004/041201)之國際專利申 請案第PCT/US2003/034962號中揭示了用於治療及預防C 型肝炎病毒感染及相關疾病之苯并呋喃化合物（BZF)、組 合物及方法，其所揭示之全部内容以引用的方式併入本文 中0 (\ KJ 【發明内容】 • 根據一態樣，本發明提供一種藉由在需要此治療之患者 中投與5-環丙基- 2- (4-亂-苯基）-6-[(2 -經基-乙基）-甲烧石黃酿 基-胺基]-苯并呋喃-3-甲酸甲醯胺與干擾素之醫療有效組 合以治療HCV感染及與其相關聯之疾病之方法。該組合療 法包括協同投與分開劑量之治療劑，及投與包括組合劑量 之醫藥組合物。 本發明之另一態樣係一種包括可有效治療HCV感染及與 123152.doc 200815384 該等感染相_之疾病之量的上述苯 素之醫藥組合物。 南何生物及干擾 本杳明之又一態樣係一 件，其包括兩種容Γ = 投與治療劑之製造物 醫率上可接’ 述苯并咳喃衍生物、或 二 “連同-種醫藥上可接受之載劑，且另一種 υ έ天…、:的、重組的或 干擾素。 H二修飾之“醫樂上可接受載劑之 【實施方式】

C

本發明係基於人們在藥物研發方面的工作，該等工作證 (4鼠-本基）-6-[(2_羥基-乙基）_甲烷磺醯基_ 胺基]-苯并m甲酸甲醯胺與干擾素作為組合治療投與 時可使C型肝炎患者巾之病毒水平顯著降低。該組合治療 之有效性已在臨床研究中得到證實，其細節將在隨後實例 中闡述。簡而言之，下述組合治療數據證明5-環丙基_2_ (4-氟-苯基）-6俗經基-乙基）_甲烧磺醯基·胺基]-苯并咬 喃-3-甲酸甲醯胺在患有慢性c型肝炎感染之未曾治療的成 年文试者中對多種Hcv基因型具有抗病毒效果。在所有劑 篁組中，5_環丙基_2_(4_氟_苯基）_6_[(2_羥基_乙基）_甲烷磺 醯基-fe基>苯并呋喃_3_甲酸甲醯胺與聚乙二醇化干擾素 之組合在治療14天後使病毒平均減少3.3至3.5 l〇gl〇(與僅 用聚乙二醇化干擾素時為1·7 loglO相比較。相對於僅用聚 乙二醇化干擾素之效果，在給藥期間無病毒回彈現象。未 觀察到劑量限制毒性且雖無安全性數據，但耐受性與自干 擾素治療所預測者一致。 123152.doc 200815384 基於該等結果，吾人相信與目前之標準醫治相比較，5_ 裒丙基2 (4-氟_苯基）_6-[(2-羥基_乙基）-甲烷磺醯基-胺基]_ 苯并吱喃-3-甲酉曼甲醯胺與干擾素之組合可顯著改善治療結 果。 本文所用術語”INF”指，，干擾素，，且本文所用，，pEG_INF，，指 ’’聚乙二醇化干擾素"。本文所用術語”HCV”指”C型肝炎病 毒’’。本文所用術語”BZFs”指闡述於Wlp〇公開案w〇 1201中之本并吱鳴化合物且本文所用術語，，bzf，，指 2 (4-氟-苯基）_6_[(2_羥基_乙基）_甲烷磺醯基·胺基]-苯并 呋喃-3-甲酸甲醯胺，，。 田貝施本發明之組合療法治療活宿主中之Hcv感染及與 該等感染相關之疾病日夺，向易遭受或遭受該感染之宿主投 與治療有效量之BZF及治療有效量之干擾素。 本文所用術語，，組合治療，，指··（a)—種治療，其中將兩種 或以上單一治療或分開劑量之活性組份組合於一種治療方 法中；及（b)—種治療，其中將兩種或以上治療劑調配成可 在一種治療方法中投與之組合劑量。 本文所用術語"活宿主"指活的並可被C型肝炎病毒感染 之有機體，包括哺乳動物，尤其係人類。 本發明之組合治療可以加性超越（additive-plus)量降低 HCV RNA。该療法之一般過程為在觀察到加性超越效應 後繼續該組合治療⑴⑽天，或直至到達下文所述之治療 、’、”沾本文所用之表達’’加性超越量，，表示與實驗結果相對 應之量出人意料地大於將兩種（或以上）單一治療或活性組 123152.doc 200815384 份（例如干擾素及上述苯并呋喃衍生物）相組合所得之理論 加性效應。舉例而言，若兩種活性組份或單一療法之理論 加性效應可將HCV-RNA水平降低50%，則組合治療可減^ 60%，加性超越量為丨.2。在本發明之實踐中，加性超越量 一般為1.2倍或更多倍於理論加性量，較佳地等於或大於 10,更佳地等於或大於1〇〇且最佳等於或大於1〇〇〇。 本文所述組合治療之治療功效可根據治療過程中之病毒 回彈降低量與對應單一治療相比較來量測。本文所用術語 ’病毒回彈’’指在抗病毒治療過程中或之後活宿主中病毒載 量之恢復。當治療過程中所觀察之病毒回彈降低在治療停 止後仍保持時，吾人認為該組合治療具有額外的有益效 應理想丨月况係’不僅病毒回彈降低，且在組合治療過程 中及停止治療後檢測不到病毒水平。 組合治療之期望治療終點係，在停止治療後繼續保持在 治療過程中檢測不到的HCV-RNA水平。本文所用術語 BQL彳日低於疋置水平"。組合治療之潛在治療終點係： 在活宿主中當HCV減少量為BQL達至少10天、較佳至少3〇 天、更佳至少1 80天、最佳至少3〇〇天時。或者，組合治療 之治療終點係：在活宿主中當HCV病毒回彈降低或消除達 至少10天、較佳至少30天、更佳至少180天、最佳至少3〇〇 天時。量測及臨床定量HCV-RNA(及HCV感染）之適宜方法 為業内一般技術者所知。 組合治療可依序實施，即在不同時間及/或以不同頻率 首先以BZF與INF之基本組合中之一種組份治療，隨後以 123152.doc -10- 200815384 另一種治療’或其可同時使用該基本組合中之組份實施。 同時使用二組份治療時，可以同—劑量或以分開劑量投 與。用於同時及依序組合治療二者之劑量可端視該組合治 療組份之吸收、分佈、代謝、及排泄速率以及業内熟習此 項技射所知之其他因素而^。劑量值亦將根據欲減輕病 症的嚴重程度而變化。應進一步理解：對於任一特定受試 者而言，應輯個體需要及組合治療投與人員《組合治療 投與監督人員的專業判斷隨時調整具體劑量方案及排程。 μ施本發明之方㈣’組合治療中第_劑量干擾素係在 投與第一劑量5_環丙基_2-(4_氟-苯基）·6_[(2_羥基-乙基）_甲 烷磺醯基-胺基]苯并呋喃_3_甲酸甲醯胺之前投與。或 者，組合治療中第一劑量干擾素係在投與第一劑量5_環丙 基-2-(4-氟-苯基）-6_[(2·羥基_乙基）_甲烷磺醯基-胺基]-苯并 呋喃-3-甲酸甲醯胺之後投與。另一選擇係，在投與組合治 療中第一劑量干擾素的同時投與第一劑量2_(4_氟-苯基）_6_ [(2 #工基-乙基）_甲院石黃醯基_胺基]_苯并吱喃甲酸甲酿 胺。 本文所述組合治療亦可使用其他生物活性劑實施，該等 生物活性劑包括但不限於由以下組成之群：利巴韋林、蛋 白酶抑制劑、聚合酶抑制劑、小干擾RNA化合物、反義化 合物、核苷酸類似物、核苷類似物、免疫球蛋白、免疫調 即劑、肝保護劑、消炎劑、抗生素、抗病毒劑、及抗感染 化合物。該經改良組合治療亦可包括在投與苯并呋喃衍生 物與干擾素之基本組合之同時或依序投與其他醫藥劑或增 123152.doc -11 - 200815384 ，劑此例如阿昔洛韋(acycl〇vir)、伐昔洛韋伽。心㈨、 顯更昔洛韋（Valgancicl〇vir)或相關化合物。 在^一實施例中，苯并吱喃衍生物與干擾素之基本組合 、、、、良、、且Β /σ療（包括其他HC V聚合酶抑制劑）用於治 療人類HCV。 、 在又-實施例中，本文所述的兩組份基本組合可以經改 良：合治療與其他HCV生命週期抑制劑(例如，hcv細胞 附著或病毒進入抑制劑、HCV轉譯抑制劑、hcv rna轉 錄或複製抑制劑、HCV成熟、裝配或病毒釋放抑制劑，或 諸如HCV核苷酸轉移酶、解旋酶、蛋白酶或聚合酶等HCV 酵素活性抑制劑）一同用於治療人類HCV。 涵蓋於本發明範疇内之組合治療欲包括5_環丙基_2_(4· 氟笨土）6 [(2-羥基-乙基）_甲烷石黃醯基_胺基]_苯并呋喃 甲酸甲酿胺、干擾素與視情況另_種治療劑之任—化學上 ' ^ /、要所達成組合不對兩種基本組份之抗病毒 活性產生不利影響。 本發明之干擾素組份可呈多種形式，包括但不限於干擾 、 干擾素4、干擾素-丫、及諸如此類，以及其他形式 、干擾素μ如聚乙二醇化干擾素。纟文所用術語”干擾 素π意指並包括所有該等形式。 本文所用術語”干擾素，，意指可抑制病毒複製及細胞增 、、’可凋節免疫應答之高度同源的種屬特異性蛋白質家 知。典型的適宜干擾素·α包括但不限於重組干擾素a-2b(例 如可購自 Schenng公司，Kenilw〇nh，NJ2INtr〇n a干擾 123152.doc -12- 200815384 素）、重組干擾素a-2a(例如可構自Hoffmann-La Roche， Nutley，NJ之Roferon干擾素）、重組干擾素a-2C(例如可購 自 Boehringer Ingelheim Pharmaceutical公司，Ridgefield， Conn之BEROFOR A 2干擾素）、干擾素α-ηΐ(天然α干擾素 的經純化混合物，例如可購自Sumitomo, Japan之 SUMIFERON或可購自 Glaxo-Wellcome有限公司，London， Great Britain 之 Wellferon 干擾素 α-nl (INS))、或複合 α 干擾 素（例如彼等闡釋於美國專利第4,897,471號及第4,695,623 號（其全部内容以引用的方式併入本文中，尤其係其實例 7、8或 9)中者及可購自 Amgen公司，Newbury Park，Calif 之特定產品）、或干擾素α-η3(由Interferon Sciences製造並 可以商品名 ALFERON 自 Purdue Frederick公司，Norwalk， Conn.購得之天然干擾素混合物）。較佳地使用干擾素α-2a 或a-2b。由於在所有干擾素中，干擾素a-2b用於治療慢性 C型肝炎感染在全世界具有最廣泛的許可，因此其係最佳 的。干擾素a-2b之生產闡釋於美國專利第4,503,901號中， 該專利之全部揭示内容以引用的方式併入本文中。 本文所用術語”聚乙二醇化干擾素π意指經聚乙二醇修飾 的干擾素（較佳地係干擾素a-2a及干擾素a-2b)之共輛物。 較佳的聚乙二醇-干擾素a-2b偶聯物係PEG.sub· 12000-干擾 素a-2b。本文所用片語"PEG.sub.l2000-IFN α··意指（例如） 根據國際申請案第WO 95/13090號之方法製備之偶聯物且 在干擾素(x-2 a或a-2b胺基與聚乙二醇之間含有胺基甲酸酯 連接且聚乙二醇平均分子量為12000。 123152.doc -13- 200815384 用於本發明實踐中之BZF可與無機及有機酸（例如鹽酸、 石^酸、乙酸、乳酸、或諸如此類）及與無機或有機鹼（例如 氫氧化鈉或氫氧化鉀、六氫吡啶、氫氧化銨、或諸如此 ’）形成有用之鹽。該等醫藥上可接受之鹽可根據熟習此 員技術者所熟悉之程序製備。舉例而言，鈉鹽及鉀鹽可藉 由將笨并呋喃衍生物溶解於乙醇中並添加約當量之氫 氧化鈉或氫氧化鉀使鹽形成而製得。 亦可以其對應的可能的互變異構體形式使用BZF。在某 些情況中，該等互變異構體可藉由熟習此項技術者所知之 η

方法解析成各化合物。 "且泛療法可使用以組合劑量調配之上述或其醫藥 上可接受之鹽連同干擾素與—種醫藥上可接受載劑媒介來 實$。本文所用"醫藥上可接受載劑媒介”包括適宜於所需 特定劑型之任一種或所有溶劑、稀釋劑、或其他液體媒 劑、分散或懸浮助劑、表面活性劑、等渗劑、增稠或乳化 劑、保存劑、固體黏結劑、潤滑劑及諸如此類。Remingt〇n 之Ph_aceutical Sciences(第二十版)’ A R 叫丽i⑽與 kins，祕咖e，MD，細)揭示了多種用於調配醫藥組合 物之載劑及其已知製備技術。任—習用載劑媒介之使用皆 涵盖於本發明料内，除非所述習丨媒介因（例如）產 生任何不期望的生物效應或以有害方式與該醫藥組合物的 任-其他組份互相個而與用於實施本發明之抗病毒化合 物不相容。 之醫藥有機或無機固體 可使用適宜於經腸或非經腸投與 123152.doc -14- 200815384 或液體載劑媒介來補足劑量。明膠、乳糠、搬粉、硬p㉟ 鎂、滑石粉、植物及動物脂肪及油、樹膠、聚伸烷美一 醇、或其他已知藥劑組份皆可適宜作為載劑媒介或賦形 劑。 用於實施本發明之治療劑可使用能有效抑制病毒複製及 減弱HCV感染性之任一投與量及任一投與途徑投藥。本文 所用之表達”能有效抑制病毒複製之量，，指無毒但足以對 • HCV感染提供期望治療、較佳地提供加性超越效應（較佳） 〇 及/或減少在投與組合治療中或之後之病毒回彈（更佳）的一 或多種組合物之量。所需確切量端視受試者之種族、年 齡、及總體狀況、感染嚴重程度、具體抗病毒藥劑、其投 與模式、及諸如此類而因受試者而異。可以以下量給予= 療劑：BZF(5(M〇,〇〇〇 毫克/天）；PECMnf(5_25〇 微克/劑/3 至14天）。一般而言，可用於本發明之干擾素量係業内一 般技術者習用於抗病毒治療且尤其用於治療c型肝炎感染 之量。 ί ) J 用於組合治療之基本組份的分開劑量、或組合劑量（使 - 科）較佳地調配成劑量單元形式以便於投與及保持劑量 一致。本文所用之，，劑量單元形式"指適用於欲治療患者之 抗病毒劑的物理離散單元。各劑量應包括經計算可產生期 望療效之量的活性物質自身、或者其與所選醫藥載劑媒介 及/或補充活性劑（若有）之組合。通常，以包含約25毫克至 約1500毫克活性劑之劑量單元投與避，較佳地在約25〇 毫克至約500毫克範圍内。以包含約〇·5微克/公斤至約2.5 123152.doc •15- 200815384 微克/公斤活性劑之劑量單元投與1>〇7，較佳地在約1〇微克/ 公斤至約1.5微克/公斤範圍内。組合劑量通常包括約25毫 克至約1000毫克BZF及約〇·5微克/公斤至約2·0微克/公斤之 INF ’較佳地分別為約25〇毫克至約5〇〇毫克BZF及約1.〇微 克/公斤至約1.5微克/公斤之inf。 治療組合之組份可製備成多種投與形式，包括錠劑、膜 衣紅丸劑或糖衣藥丸，或可填充於適宜容器（例如膠囊） 中，或（在懸浮液情況下）可填充於瓶内。

U 考思到所療感染之性質及嚴重程度，可經口、經直 腸、非經腸（例如藉由肌内注射、皮下注射、靜脈内輸注 或諸如此類）、腦池内、陰道内、腹膜腔内、局部（例如藉 由粉末、軟膏、或滴劑、或諸如此類）、或藉由吸入（例如 藉由氣溶膠或諸如此類）投與治療劑。BZF與INF無需且通 常不以相同投與途徑遞送。端視投與途徑而定，若為 BZF，則可以約以毫克至1〇〇毫克/公斤受試者體重/天之劑 量水平投與治療劑’每天-次或以上；且若為咖彻， 則以約0.1至3.0微克/公斤受試者體重/天之量投與，每天一 劑或多劑以達成期望治療效果。該等劑 性之平均想重為_斤’且成年女性之平均:重= 公斤。 …天投與⑴次-種或以上本發明治療劑以遞送上 述曰劑量。然而，本文所述組合物之確切投與方案需端視 接受治療之個體宿主或患者之需要、投與治療之類型及主 治醫學專家之判斷而定。舉例而言’可藉由連續輸注或· 123152.doc •16· 200815384 由控釋調配物投與苯并„夫喃衍生物及/或干擾素。 、可方便地將BZF與干擾素封裝為用於投與組合治療之 l物件》亥製造物件包括（例如）包含bzf組份或醫藥上; 接受之鹽與一種醫藥上可接受载劑的小瓶及包含__ 連同一種醫藥上可接受載劑的小瓶，其呈適於同時或依序 共同投與（包括以不等時間間隔投與跡與腳)之形式。

G 寥於本發月之組合治療產生的對病毒rna合成的抑制效 果，吾人預期該等化合物不僅可用於治療病毒感染，而且 亦可用於在易感文忒者中預防病毒感染。用於治療或預防 病毒感染之劑量可實質上相同。 本文所述抗病毒劑之組合亦可用於在細胞、組織或器官 料及其他活體外應时防止或解決病毒錢。舉例而 口在細胞或組織生長培養基及細胞或組織培養組份中包 含本發明之組合物作為添加物可防止病毒感染或污染先前 未經病毒感染之培養物。本發明所述之組合物亦可用於在 適宜治療期 < 後在技術熟練者確定之任何數量處理條件下 攸培養物或其他受病毒感染或污染的生物材料（例如血液） 中除去病毒。 使用組合治療可額外地在組合成份之間產生協同作用及/ 或產生協同治療效果及益處。 下列實例用於更詳細地描述本發明。該等實例包括用於 本發明之苯并呋喃冑生物之適宜合成方法 '然@，該合成 方法僅意在說明而非限制本發明。用於製備示例性苯并呋 喃衍生物之起始物質可購得或可根據下文闡述之一實例或 123152.doc •17- 200815384 另外使用已知的化學程序方使 更也氣備。本發明所用術古五 ” HPLC”指高效液相層析法。 ，· ^ 两 術語"pwg”指磅/平方英吋表 壓0 實例1 5-環丙基·2-(4^·苯基）_H(2,基乙基）·甲燒確酿基胺 基】苯并吱味-3_甲酸甲酿胺之製備 a·環丙基職之製備。根據文獻程序 Chen, C.5 Tetrahedron Lett. 2002, 43, 6987-6990 ^ ^ ^ 基漠化鎖以4克規模製備環丙基韻（產率為56%)。 ,b. 2-(4-氟-苯基）·5_經基_6_硝基_苯并咬喃_3_甲酸乙醋之 製備在氬氣下’將二氯化蝴（1〇6毫升，〇1〇6莫耳）逐滴 添加至化合物21⑷(2G.5克，G.()53莫耳，其可根據前述實 例21，步驟a-d製備）存於無水二氯甲烷（264毫升）之溶液 中。將該反應混合物在室溫下㈣過夜。用冰水終止反應 並以二氣甲院（3x)萃取。合併有機層，經硫酸鎮乾燥、過 濾並蒸發。所得固體在己烷中經超聲處理、過濾並乾燥得 到17.82克（99%)黃色固體產物。 c· 2-(4·氟-苯基）_6_硝基三氟甲烷磺醯基氧基_苯并呋 喃·3-甲酸乙酯之製備。在氬氣下，將N，N•二異丙基乙基 胺（8·8毫升，56毫莫耳）及‘（二甲胺基）吡啶（〇·618克，5〇6 宅莫耳）添加至根據上述步驟a製備之化合物存於無水二氯 甲院（300毫升）中之懸浮液中。在冰/水浴中將反應混合物 冷部至〇°C ’且隨後添加三氟甲烷磺酸酐（9.34毫升，56毫 莫耳）°在環境溫度下將反應攪拌約5小時，且隨後添加額 123152.doc -18 - 200815384 外篁之ν，ν_:異丙基乙基胺（4 4毫升，28毫莫耳）及三氣甲 烧續酸肝（4·67毫升，28毫莫耳）。於室溫下過夜攪掉該反 應，以水稀釋並用二氯甲炫叫萃取。用水㈣與W肥 (ix)洗務有機層、合併、經硫酸鎂乾燥並蒸發。藉由第三_ 丁基甲醚重結晶殘餘物，共產生2〇36克(8作。)期望黃色固 體產物。 ^

Ο d. 5-環丙基_2_(4备苯基）冬確基_苯并呋喃冬甲酸乙酉旨 之製備。將無水甲苯（10·〇毫升）添加至由環丙基硼酸⑺⑺ 克’ 3.14¾莫耳）、氟化鉀二水合物（〇·652克，6%毫莫 耳）、溴化鈉（0.216克，2.16毫莫耳）、四（三苯基膦）鈀（〇) (〇·〇73克，0.0629毫莫耳）、與化合物43(b) (1 〇克，2 〇9毫 莫耳）組成之混合物中。經氣體分散管通氬氣1〇分鐘對所 得溶液進行脫氣。將該反應混合物加熱至回流過夜，以水 稀釋並用乙酸乙酯（3χ)萃取。合併有機層、經硫酸鎮乾 燥、過濾並蒸發。藉由管柱層析（矽膠，幹載入，己烧/乙 酸乙酯梯度）純化粗產物得到0.670克（86%)期望固體產物。 e· 6-胺基-5-環丙基- 2-(4 -氣-苯基）·苯并π夫喃_3_甲酸乙酉旨 之製備。將10%碳載鈀（0.150克）及IN HC1 (7滴）添加至化 合物43(c)(0.665克，1.8毫莫耳）存於乙酸乙酯（7〇_〇毫升）之 >谷液中。在50 psig氫氣下於帕爾搖床（Parr shaker)上過夜 搖動反應混合物。經Celite™過濾反應混合物，並以乙酸 乙酯及甲醇沖洗。經真空濃縮濾液得0.540克（88%)期望固 體產物。 f· 5-環丙基-2-(4-敗-苯基）-6-甲烧石黃酿基胺基-苯并吱 123152.doc •19- 200815384 喃-3_甲酸之製備。將甲烷磺醯基氯（0.270毫升，3.48毫莫 耳）添加至化合物43(d)(0.535克，1.58毫莫耳）溶於二氯曱 烷（6毫升）之冷凍溶液（0°C，冰/水浴）中。在乙醇/冰浴中進 一步冷卻反應混合物，且隨後添加N，N-二異丙基乙基胺 (0.688笔升’ 3_95毫莫耳）。於室溫下過仪撲掉該反應，用 水稀釋並以二氯甲烷（3x)萃取。合併有機層，經硫酸鎂乾 燥並蒸發得到0.653克（86%)之雙（磺醯化）中間產物。 * 在氬氣下，將氫氧化鉀（1·52克，27毫莫耳）添加到雙（確 f、 醯化）中間產物（〇·670克，1.35毫莫耳）溶於乙醇（1〇·〇毫升） 與水（5.0毫升）之溶液中。將反應加熱回流過夜，且隨後經 真空濃縮。將剩餘固體溶於水並以IN HCL酸化該溶液直至 形成沉澱。過濾固體並乾燥得到〇·532克（99%)期望產物。 g· 5-環丙基-2-(4-氟-苯基）-6-甲烷磺醯基胺基-苯并吱 喃-3-甲酸甲醯胺之製備。在氬氣下，將苯並三唑_丨_基氧 奏11比嘻σ定基鱗六氟磷酸鹽（PyB〇p)(L〇2克，ι·97毫莫耳）添 加至由甲胺（12·〇毫升，16.3毫莫耳，2.0 Μ，存於THF 中）、DMF(1 ·〇宅升）、與化合物43(e)(〇.53〇克，1 ·36毫莫 - 耳）組成之混合物中。在室溫下將反應攪拌過夜且隨後經 真空、/辰縮。用水稀釋殘餘物並以乙酸乙酯（Sx)萃取。合併 有機層，用水洗滌、經硫酸鎂乾燥、並經空氣乾燥得到 0.347克（63%)粗產物。藉由反相HpLC(乙腈/水梯度）純化 一部分粗產物（10〇毫克）得到0.050克期望產物。 h· 6-[(2-苄氧基-乙基）_甲烷磺醯基_胺基]_5_環丙基 (4-氟苯基）_苯并吱喃甲酸甲醯胺之製備。在氬氣下， 123152.doc -20- 200815384 將碳酸鉀（0.125克，0.91毫莫耳）及苄基2_溴乙醚（0·1〇5毫 升，0.67莫耳）添加至在上述步驟g中製備之化合物（〇12〇 克’ 0.0003莫耳）溶於乙腈（1.5毫升）之溶液中。將反應混合 物加熱至回流過夜，用水洗滌並以二氯甲烷（3χ)萃取。合 併有機層，經硫酸鎂乾燥並蒸發。藉由再沉澱出乙酸乙酯/ 己院來純化粗產物，且不經進一步純化即將所分離固體用 於下一步驟中。 i·標題化合物之製備。將10%碳載鈀（0·100克）添加至在 上述步驟h中製備之化合物（0.162克，0.41毫莫耳）存於乙 酸乙酯（20¾升）之溶液中。在5〇 psig氫氣下於帕爾搖床上 振動反應混合物過夜。經濾反應混合物，並以 • 乙酸乙醋及甲醇沖洗。真空濃縮濾液，並將粗產物溶於乙 酸乙S旨中並用己烷沉澱。藉由過濾分離固體得到〇 〇83克 期望棕黃色固體產物。 NMR數據：CDC13 中之1H NMR : 7.90-7.85 (m，2H); 7.55 (s5 1H); 7.35 (s, 1H); 7.22-7.16 (m, 2H); 5.74 (brs, 1H); u 4.09-4.03 (m，1H); 3.75 (s，3H); 3.14 (s，3H); 2.99 (d， - J=4.40 Hz5 3H); 2.40-2.30 (m5 1H); 1.95 (m? 1H); 1.10-0.98 (m，2H); 0.88 (m，1H); 0.68 (m，1H);質譜數據： (M+H)+=447。 在上述實例中’ NMR譜係在Varian Mercury VX 300光譜 儀上獲得並以四甲基矽烷（TMS)為參照。化學位移及偶合 常數分別以百萬份數（ppm)及赫茲（Hz)報告。所示多重性 為s =單峰，d=雙重峰，m=：多重峰且卜表示寬信號。質譜數 123152.doc -21 - 200815384 據表示為質量與電荷之比率（m/z)。 實例2 對病毒RNA複製之抑制 實例1之BZF抗病毒活性首先在含有HCV複製子（BB7# 列）的人類肝臟細胞系（Huh-7_Clone Α) Φ & # J甲砰價（參見

Blight KJ等 Science. 2000, 290:1972·4 ; Pietschmann, Τ·等人 2001，73:1252-1264 ;及Lohmann，V.等人，

Lohmann等人，Science.1999，285:110-3 ;

Virol· 75:1437_1449)。HCV複製子係可表現其自身

Vir〇l. 2001

複製所需之 HCV蛋白質的次基因組病毒RNA。該等蛋白質包括非# 蛋白 NS3、NS4A、NS4B、NS5A及 NS5B。該# 制 ° μ吸I子亦含有 一編碼藥物選擇性標記（新徽素磷酸轉移酶）之外源& 、 允許對含有該複製子之細胞進行G41 8(新黴素）選擇 ' 實例1之BZF的抗病毒活性在包含基因型ib 八^ 、13 ’刀離物） HCV複製子之人類肝瘤細胞（Huh-7細胞）中評價。在m 及5% C〇2下，在包含2% FCS且無G418之培養基中用濃度 逐漸升高之化合物處理細胞3天。培養3天後，自含有複製 子之細胞中分離總RN A。使用基於螢光的定量實時聚合酶 鏈反應（RT-PCR)分析（亦稱為TaqMan® RT-PCR，其可測定 細胞内HCV RNA的穩態水平）對HCV、3-磷酸甘油醛脫氫 酶（GAPDH)、及核糖體RNA(rRNA)進行定量。HCV、18S 核糖體、及GAPDH RNA在各樣品中之量係藉由將PCR擴 增指數期之週期數與彼等在相應標準曲線下者相比較而評 估。藉由自純系A細胞中提取總RNA來製備用於構建標準 123152.doc -22- 200815384 曲線之HCV RNA標樣。將RNA樣品送至國家遺傳所 (National Genetics Institute)對HCV RNA進行定量。自純 系A細胞提取之總RNA用O.D.26〇量測法進行定量並用於構 建rRNA及GAPDH之標準曲線。使用MDL LSW Data Analysis™軟體（Microsoft ExcelTM)測定可抑制 50% HCV RNA水平（EC5G)之化合物濃度。HCV或GAPDH RNA在樣品 中之量分別表示為HCV RNA(拷貝數）或GAPDH (奈克）/微 * 克總RNA，並使用rRNA作為總RNA量測之標記物。BZF展 f、 示對細胞内HCV RNA水平之抑制具有劑量依賴性。EC50值 小於1 00 nM。對於組合研究，使用比利斯獨立性零加性模 型（Bliss Independence null model of additivity)(MacSynergyTM II)分析所得數據。 實例3 對病毒RNA_依賴性RNA聚合酶（RdRp)之抑制 使用一種來源於經HCV基因型lb病毒（BB7)感染患者之 共有序列的經純化HCV NS5B蛋白以標準的活體外生物化 U 學分析法對HCV NS5B定向的RdRp活性進行確定及定性。 . (參見 Blight KJ等人，Science. 2000，290:1972-4)。在大腸 桿菌中將NS5B共有序列選殖並表現為經組胺酸標記 (GSHHHHHH)的融合蛋白，其中移除羧基端的21個胺基酸 以增強其溶解性。 除如上文所述在複製子分析中評估其活性外，亦使用該 分析法評估實例1之BZF的抗病毒活性。化合物抑制活性 之量度可表示為IC50值，其代表抑制50% RdRp活性（IC50) 123152.doc -23- 200815384 之化合物濃度。所測試化合物抑制hcv、NS5B蛋白的 以抑活性之分析結果顯示IC5G值<〇·5 μΜ。達成抑制50% RdRp活性所需測試化合物之該低濃度表明，該化合物可 有效抑制藉由病毒RdRp酶進行之RNa合成。 實例4 a· lb期臨床試驗說明 一個為期14天、隨機、雙盲、安慰劑對照、多個漸增劑 里（MAD)之順序組研究包括未曾接受治療之慢性HCy感染 义试者义減者登$己在目標係16例受試者之漸增劑量順序 群組（在各群組中，12例受試者接受BZF且4例接受安慰劑） 中。第一群組評估BZF單一治療之效果與安慰劑之比較。 隨後的群組包括如下受試者：其在第4及第7天接受皮下 投與聚乙二醇化干擾素心几（PEG_内含子；15微克/公斤/ 劑），並自第1天至第Μ天與經口投與之安慰劑或bzf(i〇〇 耄克、250毫克、500毫克或1〇〇〇毫克/12小時，以25毫克 或200毫克膠囊劑之組合）。組合治療群組中64%的患者受 到HCV基因型丨感染。參與研究之各治療組之平均病毒載 量>6.0 l〇gi〇國際單位/毫升hcv RNA。 用於lb期臨床試驗之BZF膠囊劑調配如下： 活性成份： BZF (25毫克，或2〇〇毫克） 非活性組份 微晶纖維素 聚山梨醇酯80 (植物級） 123152.doc -24- 200815384 帕維酮（Povidone) 羥基乙酸澱粉鈉 月桂基硫酸納 二氧化矽膠體 硬脂酸鎂（植物級） #〇E HPMC (羥丙基甲基纖維素，或Hypromellose)膠 囊，不透光棕色 所得膠囊應保存於25°C (771F)或以下；不可冷柬。允許 偏移至 30°C (86°F)。 b· lb期初步臨床結果 •治療14天後，可從4個組合治療組（n==9-11例受試者/ 組）之受試者及15例單獨接受聚乙二醇化干擾素之受 試者得到初步數據。 •在所有組合組中，血漿HCV RNA偏離基線之平均減 少i在第7天為2.1至2.7 loglO且在第14天為3.3至3.5 loglO。與此相比，單獨使用聚乙二醇化干擾素之減 少量在第7天為1.1 l〇g10且在第14天為i 7 1〇gi〇。 •與聚乙一醇化干擾素之已知效果相一致，應答隨 基因型而變化。對於基因型丨，在第14天，組合治療 組偏離基線之平均減少量在2·6至3·2 1〇gl〇範:内^ 而單獨聚乙二醇化干擾素為13 1〇gl()。 •在第14天，在所有組合、组中達成病毒減少_過或等 於2 loglO之受試者佔7〇%至9〇%，相比較單獨聚乙二 醇化干擾素為43%。 123152.doc -25- 200815384 •在第14天，在組合組中接受>250毫克BZF之患者中 3 0%至33%達成低於定量範圍之病毒水平。 •雖然安全數據仍未知，但所觀察之負面事件顯示與使 用聚乙二醇化干擾素所預期之彼等負面結果相一致， 包括常發生的諸如頭痛、發燒或寒戰等流感樣症狀。 表1. BZF:偏離基線之變化（log HCV RNA水平）-治療分析 (MAD研究，所有基因型）

第4天 第7天 第14天 N 平均值A N 平均值A N 平均值Δ 500毫克 14 —1.43 13 -1.30 12 -0.64 PEG-INF 15 -1.03 14 -1.11 14 -1.69 100 毫克+PEG-INF 11 -2.20 10 -2.12 10 -3.31 250 毫克+PEG-INF 9 -2.55 9 -2.47 9 -3.31 500 毫克+PEG-INF 10 -2.58 10 -2.62 10 -3.33 1000 毫克+PEG-INF 11 -2.46 10 -2.66 10 -3.51

表2. BZF:MAD研究，組合群組-基線HCV RNA 基線logHCVRNA水平 劑量組 η 平均值 範圍 1 〇〇 毫克+PEG-INF 11 6.41 5.04-7.29 250 毫克+PEG-INF 9 6.15 4.65-7.02 500 毫克+PEG-INF 10 6.45 5.67-7.22 1000 毫克+PEG-INF 11 6.50 5.64-7.38 僅 PEG-INF 15 6.59 5.80-7.14 合計 56 6.44 4.65-7.38 共計80%具有2 6 log之基線HCV RNA水平。 123152.doc -26- 200815384 表3· HCV-RNA減少量-所有BZF劑量（在第“天偏離基線之變 化，所有基因型） 在治瘙分析中，losHCVRNA之各種不同減少I丄之- η > 1.5 log ...-2 > 3 loff BQL 500毫克 12 1 (8%) 1(8%)^- 0 0 PEG-INF 14 7 (50%) T(43%^- 2 (14%) 2 (14%) 100 毫克+PEG-INF 10 9 (90%) T(70%f-^ 7 (70%) 2 (20%) 250 毫克+PEG-INF 9 8 (89%) 7 (78%)^^ 6 (67%) 3 (33%) 500 毫克+PEG-INF 10 10(100%) 9(90%f^ 6 (60%) 3 (30%) 1000 毫克+PEG-INF 10 9 (90%) 7(70%)^^ 7 (70%) 3 (30%) BQL=低於定量範圍（<50國際單位/毫升） 表4· HCV-RNA減少量-100毫克BZF/PEG-INF(在第14天偏離 基線之變化，所有基因型） 在治療分析中，loglOHCVRNA之各種不同減少量1之受試者％ η > 1.5 log log >3 log BQL 100毫克 12 2 (17%) 0 0 0 PEG-INF 14 7 (50%) 6 (43%) 2 (14%) 2 (14%) 100 毫克+PEG-INF ίο 9 (90%) 7 (70%) 7 (70%) 2 (20%) BQL=低於定量範圍（<50國際單位/毫升） 表5· HCV-RNA減少量-250毫克BZF/PEG-INF(在第14天偏離 Q 基線之變化，所有基因型） 在治療分析中，loglOHCVRNA之各種不同減少詈丄之受試者0/〇 η > 1.5 log >2 log >3 log BQL 250毫克 12 0 0 0 0 PEG-INF 14 7 (50%) 6 (43%) 2 (14%) 2 (14%) 250 毫克+PEG-INF 9 8 (89%) 7 (78%) 6 (67%) 3 (33%) BQL=低於定量範圍（<50國際單位/毫升） 123152.doc 27- 200815384 表6· HCV-RNA減少量-500毫克BZF/PEG-INF(在第14天偏離 基線之變化，所有基因型） 在治療分析中，loglOHCVRNA之各種不同減少量4之受試者°/〇 η >1.5 log log log BQL 500毫克 12 1 (8%) 1 (8%) 0 0 PEG-INF 14 7 (50%) 6 (43%) 2 (14%) 2 (14%) 5〇〇 毫克+PEG-INF 10 10(100%) 9 (90%) 6 (60%) 3 (30%) BQL =低於定量範圍（<50國際單位/毫升） 表7· HCV-RNA減少量-1000毫克BZF/PEG-INF(在第14天偏離

基線之變化，所有基因型） 在治療分析中，loglOHCVRNA之各種不同減少量丄之受試者％ η >1.5 log log >3 log BQL 1000毫克 12 2 (17%) 2 (17%) 1 (8%) 0 PEG-INF 14 7 (50%) 6 (43%) 2 (14%) 2 (14%) 1000 毫克+PEG-INF 10 9 (90%) 7 (70%) 7 (70%) 3 (30%) BQL =低於定量範圍（<50國際單位/毫升） 表8. HCV-RNA減少量-500毫克BZF/PEG-INF(在第14天偏離 基線之變化，基因型1) (J 在治療分析中，loglOHCVRNA之各種不同減少量丄之受試者％ n >1.5 log log log BQL 500毫克 8 1 (13%) 1 (13%) 0 0 PEG-INF 10 4 (40%) 4 (40%) 1 (10%) 1 (10%) 500 毫克+PEG-INF 6 6 (100%) 5 (83%) 2 (33%) 0 BQL =低於定量範圍（<50國際單位/毫升） 雖不希望受限於具體理論，但吾人相信該實例所呈現之 臨床試驗數據欲表明BZF與PEG-INF之組合可對HCV產生 協同治療效果及/或加性超越效果。本文所用之表達’’協同 治療效果”指由組合投與BZF與PEG-INF所引起之效果較單 123152.doc -28- 200815384 獨投與BZF及PEG.所導致效果之代數和更A，此 内-般技術者所知的已建立的增效理論原理相一致。一 雖然已對本發明某些較佳實施例進行了闡釋及例示，作 熟習此項技術者會理解其他實施例。因此，本發明並不限 於所閣釋及例示之具體實施例，而是可經修改或變化而不 背離本發明之精神’且其全部㈣藉由隨时請專利範圍 描述。 【圖式簡單說明】

圖1組合治療臨床數據曲線圖，展示所有基因型偏離基 線之平均變化。 圖2組合治療臨床數據曲線圖，展示減去㈣效果 後所有基因型之平均變化。 圖3組合治療臨床數據曲線圖，展示減去5〇〇毫克bzf效 果後所有基因型之平均變化。 圖4⑽毫克BZF劑量之組合治療臨床數據曲線圖，展示 所有基因型與計算加性效果相比較之平均變化。 圖5 250毫克BZF劑量之組合治療臨床數據曲線圖，展示 所有基因型與計算加性效果相比較之平均變化。 圖6 500¾克BZF劑量之組合治療臨床數據曲線圖，展示 所有基因型與計算加性效果相比較之平均變化。 一圖7 1000毫克BZF劑量之組合治療臨床數據曲線圖，展 示所有基因型與計算加性效果相比較之平均變化。 123152.doc -29-

Claims (1)

1. 200815384 十、申請專利範圍： 1. 一種組合之用途，該組合包括治療有效量之5_環丙基_2_ (4 -氟-苯基）-6-[(2-經基-乙基）-甲燒績酿基-胺基]_苯并吱 喃-3-甲酸甲醢胺及治療有效量之干擾素，該用途係用於 製造一種用以治療患有C型肝炎病毒感染之活宿主之藥 d ’ δ亥組合可以加性超越里降低該活宿主中之hcv_ RNA。 - 2·如請求項1之用途，其中該加性超越量等於或大於丑 f) RNA水平降低之理論加性量的1 ·2倍。 3·如請求項1之用途，其中該加性超越量等於或大於丑 RNA水平降低之理論加性量的1 〇倍。 4·如請求項1之用途，其中該加性超越量等於或大於孖CF_ RNA水平降低之理論加性量的1 〇〇倍。

   如請求項1之用途，其中該加性超越量等於或大於丑 RNA水平降低之理論加性量的1〇〇〇倍。 如請求項1之用途，其中該丑CK_RNA降低至一不可檢測 水平。 如請求項1之用途，其中該組合對^CK_RNA水平產生一 可Ϊ測的協同治療效果。 8· 士明求項1之用途，其中該干擾素係選自由干擾素_α、干 擾素卬、干擾素-γ及聚乙二醇化干擾素組成之群。 9·如：求項8之用途，其中該干擾素係干擾素-α。 月求項1之用途，其中該干擾素係聚乙二醇化 a_2b。 | 强：系- 123152.doc 200815384 11. 12. _ 13. Ο 14. 15. 16 Ο 17. 18. 如請求項1之用途，其進一步包括在該組合中包含至少 一種選自以下之群之補充生物活性劑：利巴韋林、蛋白 酶抑制劑、聚合酶抑制劑、小干擾RNA化合物、反義化 合物、核苷酸類似物、核苷類似物、免疫球蛋白、免疫 調節劑、肝保護劑、消炎劑、抗生素、抗病毒劑、及抗 感染化合物。 如請求項1之用途，其中該活宿主係哺乳動物。 如請求項12之用途，其中該活宿主係人類。 如請求項1之用途，其中將5-環丙基_2_(‘氟-苯基）_6_[(2_ 說基-乙基）-甲烷磺醯基-胺基]-苯并呋喃_3_曱酸甲酿胺調 配用於經口投與。 如請求項1之用途，其中將5-環丙基-2-(4-氟-苯基）_6_[(2_ 羥基-乙基）-甲烷磺醯基-胺基]-苯并呋喃_3_甲酸甲醯胺調 配用於以約25毫克至10,000毫克/天之劑量範圍經口投 與。 如請求項1之用途，其中將5·環丙基_2_(4_氟_苯基）_6_[(2_ 羥基-乙基）-甲烷磺醯基-胺基]_苯并呋喃_3_甲酸甲醯胺及 干擾素與至少一種其他生物活性劑調配以用於投與。 如請求項16之用途，其中該其他生物活性劑係選自由以 下組成之群：利巴韋林、蛋白酶抑制劑、聚合酶抑制 劑、小干擾RNA化合物、反義化合物、核㈣類似物、 :苦類似物、免疫球蛋白、免疫調節劑、肝保護劑、消 炎劑、抗生素、抗病毒劑、及抗感染化合物。 -種組合之用途’該組合包括治療有效量之％環丙基_2_ 123152.doc 200815384 (4-氟-笨基）-6_[(2_羥基_乙基）_甲烷磺醯基-胺基]_苯并呋 $甲k甲醯胺及治療有效量之干擾素，該用途係用於 製造-種用以治療患有C型肝炎病毒感染之活宿主之藥 劑，與相應的單獨5-環丙基_2_(4_氟_苯基）冬阶經基-乙 基）_甲烷磺醯基-胺基]-苯并呋喃甲酸甲醯胺相比較， 該組合能降低病毒反彈。 19.如請求項18之用途，其中該組合能降低或預防原先存在 的或新出現的病毒變型體。 20·如明求項18之用途，其中該病毒回彈係由對5_環丙基_2_ (4氟笨基）-6[(2-羥基-乙基）_甲烷磺醯基_胺基]_苯并呋 口南-3-甲酸甲醯胺治療具有抗性之原先存在的或新出現的 c型肝炎病毒株所導致。 21·如請求項18之用途，其中該組合治療能抑制對5_環丙基_ 2-(4-氟-苯基）-6[(2_羥基_乙基）_甲烷磺醯基-胺基]_苯并 呋喃-3-甲酸甲醯胺治療較不敏感之c型肝炎病毒之出 現。 22. —種用於治療C型肝炎感染之組合物，其包括抗hcv有 效量之5_環丙基-2-(4_氟-苯基）_6_[(2_經基_乙基）甲烷磺 醯基-胺基]-苯并呋喻_3_甲酸甲醯胺及抗11(：¥有效量之干 擾素。 23. 如請求項22之組合物，其中該干擾素係聚乙二醇化干擾 素 _a-2b 〇 24. 如請求項22之組合物，其進一步包括至少一種選自由以 下組成之群之補充生物劑：利巴韋林、蛋白酶抑制劑、 123152.doc 200815384 聚合酶抑制劑、小干擾RNA化合物、反義化合物、核苦 酸類似物、核苷類似物、免疫球蛋白、免疫調節劑、肝 保護劑、消炎劑、抗生素、抗病毒劑、及抗感染化合 物。 25. —種製造物件，其用於投與組合治療以藉由治療有效量 之5-環丙基-2-(4-氟-苯基）-6-[(2-羥基-乙基）-甲烷磺醯基_ 胺基]-苯并呋喃_3_甲酸甲醯胺及干擾素來治療c型肝炎 感染及相關聯疾病，該製造物件包括·· 含有5-環丙基-2-(4-氟-苯基）-6_[(2_羥基_乙基）_甲烷磺醯 基-胺基]-苯并呋喃-3-甲酸甲醯胺或其一醫藥上可接受之 鹽及第一醫藥上可接受載劑媒介之第一容器；及 含有干擾素及第二醫藥上可接受載劑媒介之第二容器。 26·如請求項25之製造物件，其中該第一醫藥上可接受載劑 媒介適於經口投與。

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