TW200533753A - Blue fluorescent gene, bfgV, and blue fluorescent protein, BfgV - Google Patents

Description

200533753 玖、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明相關於一種單離之藍色螢光蛋白基因心介丨 色螢光蛋白BfgV。 1 【先前技術】 目前螢光蛋白被廣泛應用於分子生物領域上有兩大類 ’一為發光酶（ludferase) ’另外一類為綠色螢光蛋白 (green fluorescent protein，GFP) 〇 由細菌而來的發光酶是屬於氧化還原酵素，它可以利 :氧分子氧化受質’此受質即攜帶光分子（ehr⑽。ph〇re)， 當其被氧化時即處於受激態，而其非輻射性的能量轉移， 即可釋放螢光，而這種現象是由於發光細菌藉由發光酶把 長鍵酸類氧化成脂肪酸所致，並在反應後放出波長為 49〇nm的黃綠色可見冷光，且這過程是需要氧氣及fmnh， 的參與，目前這套冷光系統的開發，配合儀器的使用（冷光 儀）可精確定量螢光的強弱。 而另外一類的綠色螢光蛋白，其配合螢光顯微鏡的使 用亦是目前廣泛應用於分生領域。GFP是由Cubitt等人在 1 992年從水母（Jellyfish; d叫"orea v/.c/or/α)所選殖出來的 ’由水母傘邊的光細胞放出綠色螢光，此一螢光乃是在生 物體内會將能量轉移到GFP而使得GFP躍升為激發態， 繼而散發出綠色螢光。而GFP會產生綠色螢光是因為其胺 基酸序列中的〆小段絲胺酸-酪胺酸·甘胺酸（Ser_Tyr_Gly) 200533753 ’因為距離的靠近而行官讲其門 $ 丁 g月匕基間的乳化環化反應生成一個 具有六個共軛酸雙鍵的化人铷 产 η匕。物，而在395nm處吸收光並釋 放出508nm的可見螢光，由於 田乃、u t p月匕在各種不同生物體 中，如細菌、黏菌、植物乃私％ ^ 伹奶及動物細胞中，經由長波uv光 (3 9 5 n m)如、射後產生綠色普来，田 里九 口此被廣泛應用於分生領域 上之報導蛋白。惟GFP盥卜、十、十代企t 一上述之發先酶一樣，其發射螢光 時’需要消耗氧分+，此條件可能遮蔽其發光的真正時間 之測量，另外亦限制了其在無氧及微氧環境下之應用。 【發明内容】 一本發明相關於一種新的藍色螢光蛋白，其放射光譜與 目前廣泛應用於市面上的綠色螢光蛋白不此藍色營光 蛋曰可作為另一種報導蛋白而應用於分生領域上，另外在 特殊狀下如微氧、或無氧環境中，可取代綠色螢光蛋白 作為最有效率的報導蛋白。 本發明由創傷弧菌（F/心沁CKM-1)中發現一 個監色螢光蛋白基因)’大腸菌或弧菌含攜帶此物丨， 基因的貝月丑幵少貝菌轉換在長波長（395nm)紫外光照射下可發 出監色里光，此基因全長7 1 7個核酸鹽基，可轉譯出分子 量約為25800道爾頓的蛋白，此螢光蛋白之激發料分別 在283:m及352nm，而放射波峰為456麵。本發明相關之 BfgV赏光蛋白之光譜類型與兩種NADpH依存性且含有螢 光特性之酵素有相似性：一種為人類雌二酮1邛去氫 NADPH複合酶（np_HS_NADpH)，另一種為蘋果酸- 200533753 NADPH 複合酶（malic enzyme~NADPH)。亦為 NADPH依存性酵素，其能增強内部所結合的螢“ 亮度，比單獨存在的NADPH之螢光亮度亮約〗〇倍，此你 加能力比上述兩帛NADPH &存性且含有f光特性之酵： 其僅能增高2·4倍來得高。BfgV的螢光特性亦與目前在； 面上廣泛使用在分子生物領域的發光酶、綠色螢光蛋白 發先蛋白（iumazine protein)不同。因此，本發明相關2 =fgv亦可作為另一種報導（標識）蛋白應用在分子生物領域 目前在分子生物研究領域上使用廣泛且較佳的報 二標識蛋白)為綠色營光蛋白，惟此綠色勞光蛋白需要消 :乳分：才能發出螢光’此條件可能遮蔽其發光的真正時 之測里。近年來經過分子生物法改良過的綠色螢光蛋白 ，其蛋白的摺疊、命mm “ 、+ I先形成及螢先強度皆有顯著改善。惟 4些經過改良的绛#絡 ^„ 录色瓦先蛋白仍需要氧分子才能發光，此 亦限制了其在益氧及 良、各 …虱及鏃乳核J兄下之使用。由於NADPH為 &泛存在生物體内夕—括&亦“ ^ 種辅酶，而BfgV能發光的原因在 藍多^紫外光能量激發且增強其結合的NADPH而發射 % ~ 目⑽#別是在微氧及厭氧環境中，檢測生體 ^ ^ 貝之存在，只要照射低能量之紫外 九就可以BfgV為報導蛋白而％〜 物體中A因声規“ 而靦祭欲偵測的分子’其在生

所發射為藍色螢t，π 、存在的位置’此外，由於BfgV 盥{貞、％ 7 *此可與綠色螢光併用，而同時觀察 铃偵測兩種不同分子為 卞在生物細胞内之表現情形。 200533753 本發明相關之單離的藍色螢光蛋 檢測DNA ϋ段的下游，導入欲債 基13 ’將之接於欲 再以長波長紫外線（395nm)照射 胞生物體内後， 產生。 即可觀察藍色螢光的 【實施方式】 顯見於下 列較佳具體 本發明其他的特徵及優點將可明 事實及申請專利範圍。 實例 下列實施例用於 何方式意欲限制本發 明的材料及方法。 Μ則不以任 明之祀圍’但用於指示如何實施本^ 由創傷弧菌中單離出藍 體中，並導入大月一 $先蛋白基因’將之載入， 基，其所使用=:::傷弧菌内後，培養…, 果如第一 @ Α和第為“此項技藝者所熟知之方法1 (395nm)照射大腸# 圖八所不，再以長波長紫外鱗 — %囷以及創傷弧菌後，結果如第一H R 4 弟二圖β所示，即可觀察藍色勞光的產生… 很像桊發明可作之不 者而言均顯然不會偏離本 已敘述特定的較佳具體事 正及變化對於熟習該項技術 的範圍與精神。雖然本發明 必須瞭解的是本發明不應被 200533753 事實上，在實施本發 術者而言顯而易知之 圍之内。 不當地限制於該等特定具體事實上。 明之已述模式方面，對於熟習該項技 不同修正亦被涵蓋於下列申請專利範 【圖式簡單說明】 (一）圖式部分 第一圖A係於培養基上所 所來&夕# # 斤口養έ有載體之大腸菌 丄囷洛照片，其中載體载入(右半部)或沒有載入(， 半部）藍色螢光蛋白基因。 （工 第一圖Β係照射長波异呰 培養含有«之大㈣㈣成之 =卜光後，於培養基上所 右丰邻^之固洛照片’其中載體載入（ 很〉又有載入（左半部）藍色螢光蛋白基因。 菌所形成圖養二上所培養含有載體之編 入（右旬藍色營光蛋白基因，。載體載入（左邊）或沒有载 培養含有照射長波長紫外光後，於培養基上所 俨載入π : 弧菌所形成之單-菌落昭片，其中载 月且載入（左邊）或沒有載 各’、、、月 甲戟 (右邊）監色螢光蛋白基因。

7L 件代表符 號 4 \\\

Claims (1)

1. 200533753 拾、申請專利範圍： 1 · 一種單離之趑 幾邑赏光蛋白基因/^ ]/ c 2 如申晴專利蔚ifi室^ 巳Ιι]弟1項所述之藍色螢疋 厂係單離自創傷弧菡r 史白基因 1努狐囷（[/"的〇 ν/γ/,7ζ 广如申請專利範圍第1項所述之藍色螢光蛋占 6/y,其中該藍色螢井恭 基因 巴蛍九蛋白基因/所轉譯之蛋 為25800道爾頓。 77子量 基因

   BfgV 4 ·如申凊專利範圍第1項所述之藍色螢光蛋白 从？厂具有717個核酸鹽基。 5 · —種單離之藍色螢光蛋白BfgV。 6 ·如申請專利範圍第5項所述之藍色螢光蛋白 刀子里為25800道爾頓。 7 如申請專利範圍第5項所述之藍色螢光蛋白B fgV 其中該藍色螢光蛋白BfgV之激發波峰在283nm和 3：)2nm ’而放射波峰在456nm。

   8 ·如申請專利範圍第5項所述之藍色螢光蛋白BfgV 係單離自創傷弧菌（F/0w〇 v"//7,//6^ CKM-1)。 拾壹、圖式： 如次頁 200533753 柒、 指定代表圖： (一) 本案指定代表圖為：第（一）圖。 (二) 本代表圖之元件代表符號簡單說明： 捌、 本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式