TW200526958A - Materials and methods relating to breast cancer classification - Google Patents

Description

200526958 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於有關乳癌分類之材料及方法。特定言之， 本發明係關於乳癌之預後的測定。 【先前技術】 已對使用基因表現資㈣供生物分類（特別是在腫瘤學 及醫學領域）產生了強烈興趣。此研究之一令人激動的態樣 已在定義癌症之臨床相關亞型方面（其先前為更傳統之光 顯微鏡研究所不能理解）表現出了能力。儘管具有此潛力， 在可實現使用基因表現資料以供臨床診斷之前仍不得不解 決許多問題。例如，需要實麵算法，其除提供正確分類 以外，亦可精確敎預測之置信度。若該分類會影響隨後 治療過程則此特別重要—若供給此資訊，則然後治療醫師 可權衡預測置信度與料干預之潛在發病率以作出精明的 臨床選擇。 諾丁漢預後指數（刪）為-基於腫瘤尺寸、組織學等級及 淋巴結狀態之分類系統’其在歐洲及英國廣泛用於將預後 指派給乳房腫瘤（1_5)。儘管其具有效用，吾人承認習知組 :病理學參數(諸如腫瘤等級)及細胞形態學之使用亦與特 疋侷限性相關聯。即使在標準化嘗試後（6)，許多此等變數 (舉例而言，等級）仍經受顯著之觀察者間的變化性。標 二可達到值2與8之間。當正在量測之參數係於值⑺之連續 範圍内記分時（諸如NPI)，經常難以定義合適截止點。 因此，該指數視一系列主觀標準而定，此在所指派之預 96471 200526958 後方面可導致觀察者之間產生差異。 NPI為一值標度；一具有比另一病人更低之Νρι值的病人 、有比該另一病人之預後更佳的預後。通常使用諸如 二特別蚪間標度之存活機會及/或在一特別時間標度（雖 然不必與存活之時間標度相同）内之遠距離轉移之機會的 因子來疋義預後。因此，通常而言，隨Νρι值增加病人前景 減少。 〃 在測定病人治療之類型及程度時，測定病人預後為一重 要因子。當一未來治療程式可與預後相關聯時，所指派之 預後的準確度因此而變得關鍵。例如，ν扣，t %er等人（1〇) 已識別70個基因之”預後識別簽名”（pES)，其能預測乳房腫 瘤之無病存活（DFS)狀態。 【發明内容】 本發明者研究一組乳房腫瘤之表現資料，但最初不能識 別其表現與NPI相關聯之一組基因。發明者假定在亞型之間 基因表現方面可存在顯著差異（”亞型間差異，，），其潛在地遮 掩了亞型内變化之更微細樣式（”亞型内差異，，）。已提議，乳 癌内在基因表現變化之顯著比例可歸因於屬於區別性"分 子亞型”（諸如ER+及ER-(其中ER為”雌激素受體，，）（8_9，14)) 之不同腫瘤。 使用非監督聚類技術將資料集分離為個別分子子範疇 (er+、Er-、ErBB冲各個分子亞型作為獨立資料集來處 理。各個亞型内之腫瘤經獨立分析以定義其表現水平與NPI 相關聯的一組基因。 96471 200526958 臨床醫師通常將NPI標度劃分為三個種類：，，良好，，預後、 中等’預後及π不良”預後。定義種類邊界之值視臨床醫師而 變化。一典型邊界組之實例為：良好預後Νρι<3·4 ;中等預 後3·4 = <ΝΡΙ=<5·4 ;且不良預後ΝΡΙ>5.4。熟習此項技術者 將明白此等邊界可變化。 本發明者已識別出一組62個基因，其差別表現於具有不 同預後之腫瘤中，舉例而言，差別表現於具有高Νρι(且因 此具有不良預後）之腫瘤與相比較之具有低Νρι(且因此具 有良好預後）之腫瘤。 雖然該基因組係於根據其^^〗對樣品進行分類後而得以 識別，但是亦已發現使用此等基因之表現水平來對腫瘤樣 品進行分類與預後之其它量測相關聯（舉例而言，無病存 活）。 因此’對可獲得該樣品之病人的預後及治療而言，腫瘤 樣品内此等基因之表現水平具有顯著醫學含義。尤其可使 用其作為該病人之預後的指標來分類腫瘤樣品。 NPI#示度上自3.8變化至4·6之值可用作”良好”與"不良，，預 後之間的截止點，且使用各個截止值來識別該相同組之62 個差別表現基因。 此指示出，雖然ΝΡΙ覆蓋了自2至8之值的連續譜，但來自 具有62個基因之組的基因表現水平能夠將腫瘤樣品分類為 離散種類。因此，顯示出基於組織病理學參數之連續Νρι 值的樣品可在分子水平上分離為離散種類。 此外，使用⑴本發明之方法及（ii)臨床技術（通常為組織 96471 200526958 病理學技術）對指派給乳房腫瘤病人之預後所作的比較揭 示出·基於諸如DFS及Kaplan-Meier存活曲線之病人資料， 本發明之方法可提供比組織病理學技術更精確之預後。 該等62個基因在表S6中得以識別。下列描述將使用術語 表現輪廊’’。此意謂樣品内一組基因之表現水平。除非本 文另有規定’否則該基因組將包括表S6中所識別之某些或 全部62個基因。 本文所識別之62個基因與van，t Veer等人（10)之PES中所 識別的基因僅重疊一個基因（dc134hs· 6879)。該PES為 231個R0setta基因（1〇)之擴展基因組的前7〇個基因（該等基 因在可顯示不同疾病自由存活率的群之間展現出了最顯著 的表現差異）。對表S6之62個基因及該等231個Rosetta基因 而言具有8個共同基因，該等8個基因在表si3中列出。 表S6中兩個基因高度表現在低1^>1腫瘤方面陰性基因”) ’而60個基因則高度表現在高NPI腫瘤方面（”陽性基因”）。 因此，最通常地，本發明提供了一種獲得一組差別表現 基因之方法。—本發明亦提供了用以分類及/或將預後指派給 一礼房腫瘤樣品之方法及檢定。本發明可識別一組基因， 且提供使用一乳房腫瘤樣品内某些或全部彼等基因的表現 水平以將一預後指派給可獲得該樣品之病人。 在第一態樣中，本發明提供了一種測定乳癌病人之預後 的方法，該方法包括基於一組基因（下文稱作”預後組在該 病人之乳房腫瘤内的表現水平將一預後指派給該病人，其 中该預後組包括來自表S 6之複數個基因。 96471 -9- 200526958 本發明進一步提供使用該預後組以測定乳癌病人之預 後。較佳地，本發明提供了使用一表現輪廓以測定乳房腫 C病人之預後’ 5亥表現輪廓代表該預後組之基因在腫瘤内 的表現水平。 預後’'意欲具有其最通常意義，且可為定量或定性。其 可表現為通常術語，諸如”良好，，或”不良，，預後，及/或表現 為可旎床結果之術語，諸如無病存活（DFS)之持續時間、 定義時間段之存活可能性及/或定義時間段内遠距離轉移 之可旎性。預後之定量量測通常將具有概率性。另外或其 匕且特別對於向開業醫生或開業醫生之間傳達該預後而 。4預後可表現為預後之另一指標之術語，諸如NPI標度。 通# 將可此以習知治療攝生法來治療具有”良好預後，， 腫瘤之病人。可能以替代或更積極攝生法來治療具有，，不良 預後腫瘤之病人。該”不良預後"病人通常將不必等待習知 治療攝生法失敗而進入更積極的攝生法。此外，對病症之 可能臨床過程瞭解可使病人得以為將來準備現實計劃，此 是癌症治療之重要社會態樣。 為避免疑問，術語”測定”不必暗含預後中之絕對確定 性。相反，腫瘤内預後組之表現水平通常將指示該病人之 可能預後。 該等表現水平通常將以數字代表。因此，表現輪廓通常 將包括一組數字，各個數字代表該預後組之一個基因之表 現水平。 一種根據本發明之第一態樣之方法可包括步驟： 96471 -10- 200526958 提供一表現輪廓 現水平，且 其代表該預後組之基因在腫瘤内之表 基於該表現輪廓將—預後指派給該病人。 舌亥提供步驟可向枯自 ZS fL· 匕括自一預先存在之資料集來提取關於該 預後組之基因之表現水平的資訊，其亦可包括其它表現水 平(舉例而言’代表該腫瘤内其它基因之表現水平的資料 或者’其可包括以實驗方式測定該等表現水平。 該測定步驟可包括步驟·· 〇)自病人獲得一乳房腫瘤樣品； ⑻量測該預後組之基因在該樣品内的表現水平。 表見尺平之里測（且尤其是以表現輪廓作為其代表） 可為絕對術語或相對於某些其它因子，諸如（但不限於）該樣 品内或-樣品群間的另一基因之表現或一基因群(較佳為 ㈣後組之外的基因’但可能包括該預後組之基因）之表現 欠:之平均值、中值或模式。例如，基因表現可作為樣品 内複數们基因之平均表現的倍數或分數來量測或代表。較 佳地，該表現以表現輪廊代表為正或負以指示相對於平均 值的表現之增加或減少。 在-非較佳實施例中，以一組數值之形式的表現輪廓資 訊被轉換為該預後組之基因之排列表，其中該等基因以表 見K平之順序排列，隨後將該等個別基因之排列順序用作 分析參數（而非該基因之表現水平）。 較佳地，步驟（b)包括以能夠結合至可指示該預後組基因 表現之表現產物的複數個結合組員來接觸獲自該樣品之該 96471 -11 - 200526958 等表現產物，其中可量測此結合。 通常，該等結合組員能夠不僅偵測-表現產物之存在而 且能夠㈣其相對豐度（意即’可得到產物之量）。該表現輪 廓可，用能夠結合至該預後組之表現產物的結合組員而得 二測定^舉例而言mRNA，其對應於cdna或cRna或表現之 夕肽藉由軚s己該表現產物或該結合組員，可識別該等表 現產物之相對量或比例且測定該預後組之表現輪廓。該等 結合組員可為互補核酸序列或特定抗體。 &派一預後之步驟可藉由以下步驟進行：比較測試之表 f輪廊與其它先前獲得之與已知預後相關聯之輪廓及/或 :個(或多個)先前測定之表示-個(或多個)特別預後之特 ㈣”標準”輪廓。一特別預後之標準輪廓可由來自彼預後 之複數個腫瘤的表現輪廓產生。 該比較通常將藉由或借助於電腦執行。 進Γί地’將該表現輪廓與具有不同已知預後之已知或標 y 佳為標準輪廓）進行比較。待指派給該病人之預後 或標準輪靡之預後，其中測試之表現輪廓最接近地 t地’該比較係藉由被分類為兩個不同預後（舉例Λ 鱼良好及’’不良”、或高及低刪（較佳地截止點介於3. ^6之間）)之已知或標轉廊（較佳為標準輪廟）來進行。 μ寺已知或標準輪廓將已由已知預後之樣品產生，立可D 方式敎-藉由除去該樣品後該病人之實際_ 3精由其它預後技術，舉例而言組織病理學技術，爲 96471 -12- 200526958 例而言使用NPI標度。 該比較可涉及可歸因於該預後之置信度水平的評定，其 基於統計技術。該等標準輪廓對可獲得其之特別材料及^ =而言，微陣列)而言通常係特定的。若採用—新‘

•或方法（舉例而言，一新型微陣列），則已知預後之標 準輪廓較佳再次使用該預後組而得以獲得。 T 八根據本發明之第一態樣之方法可包括將乳房腫瘤之樣品 分類為(例如)具有高NPI或低NPI，或分類為具有良好 良預後。 —如先前所提及，指派—預後之步驟可藉由以下步驟钱 行比車又來自測5式之乳房腫瘤樣品的表現輪廓與先前獲判 之輪廓及/或一先前測定之"標準"輪廓，其表示一特別二 之特徵’例如-”良好”及/或"不良"預後及/或至少—個Np 值及/或刪值之至少—個範圍。該等先前獲得之輪庵可竹 為輪廓之資料庫而儲存。 車乂侄地，該貝料庫包括表示一特別預後之特徵的基因表 現輪廓。該等基因表現輪廓較佳由與本發明之第一態樣之 =後組相同的預後組（表S6之基因之亞組）或一充分重疊該 弟一態樣之預後組以便為該等表現水平之比較提供統計方 面顯著之基礎的預後組（潛在地，為一與以上不同之亞組） 之表現水平產生。電腦可經程式化以報告測試之輪廓與標 準輪廓之間的統計相似性，使得可指派一預後。 有利地，使用一基因表現輪廓以指派一預後可減少或甚 至可消除用以將一預後指派給一腫瘤樣品的臨床程序之主 96471 -13- 200526958 觀本性。由於該方法需要較佳定量地在分子水平來評定表 現產物，所以該方法提供一更客觀且因此潛在地更可信之 用以指派一預後之方式。如早些所提及，該預後組能夠將 乳癌腫瘤樣品分離為離散種類且因此減少4或消除臨床預 後指派之主觀分析。此外，可將置信度指派給該預後，使 得可做出關於病人治療的精明的選擇，此視該預後之"力" 而定。 在相似預後之獨立樣品之間，該預後組之表現輪廓可稍 稍不同。然而，本發明者已意識到，當組合使用時能組成 該預後組之特別基因的表現輪廓提供了—腫瘤樣品内之表 現樣式（表現輪廓），該樣式表示腫瘤之預後的特徵。 本1明者已舍現’ 5亥預後組能夠將腫瘤樣品分解為高 及低NPI類。高NPI意謂較佳至少3 4、 至少4.0之刪。高NPI可為至少41、至少42、至少43、至 / 4.4、至少4_5或至少4.6。高NPI與低NPI之間的較佳截止 值為3.8-4.6之間。 在歷史上，NPI之"良好，，、，，中等"及"不良/差”種類可使用 大的臨床研究而得以敎’I中屬於此等不同群之病人在 整個存活過程中顯示出統計方面㈣之差異。❹，良好 預後之病人可具有約83%之+生六, 、3、jw/。之十年存活率，”中等，，預後之病人 可具有約5 2 %之十年存活粜，曰”¥ 千仔，古羊且差或，，不良，，預後之病人可 具有約13%之十年存活率（4)。 洋。之，忒預後組似乎最強烈地與雌激素受體陽性腫瘤 96471 -14- 200526958 (ER+)内之腫瘤預後（如NPI所反映）相關聯。 在乳癌治療中，將乳房腫瘤分類為雌激素受體陽性（ER+) 及陰性（ER-)亞型為一重要區別。ER-腫瘤通常比其ER+對應 物臨床上更積極，且ER+腫瘤係使用諸如他莫西芬 (tamoxifen)(2 1)之抗激素療法而按常規治療。可使用組織學 技術（舉例而言，使用特定用於受體之抗體）或使用基因表現

技術將乳房腫瘤分類為ER+或ER-。目前，腫瘤之ER狀態係 藉由免疫組織化學（IHC)或使用ER之一抗體進行免疫印跡 而按常規測定。 本發明之第一態樣較佳包括測定腫瘤樣品之ER狀態之 步驟。可使用基因表現分析或藉由使用組織病理學技術來 測定該ER狀態。較佳地，本發明之第一態樣進一步包括作 為一初始步驟之測定腫瘤樣品之ER狀態，且僅當該狀態為 ER+時才繼續進行。

較佳地，該腫瘤樣品之ER狀態係使用基因表現輪廓而得 以測定，如吾人之同在申請中之申請案PCT/GB03/000755 中所描述。基因表現輪廓能夠以高置信度將乳房腫瘤分類 為ER+或ER-。然而，亦存在第三乳癌種類，其不能以顯著 統計確定性低置信度π腫瘤）被分類為ER+或ER-。ERBB2 + 之向上調節常常與低置信度腫瘤相關聯。較佳地，僅有以 高置信度識別之ER+腫瘤（較佳被分類為ER+，其具有如使 用PCT/GB03/000755之方法而測定之大於0.4的量值預測力） 係使用根據本發明之第一態樣之方法而進行分析。 將一預後指派給乳房腫瘤樣品之步驟可包括使用統計及 96471 -15 - 200526958 /或概率性技術，諸如加權表決（WV)(13)、一有監督的學習 技術。在wv中，可執行二進位分類。意即，可使用該技術 以將-樣品指派、给兩類中之—類。將在該乳房腫瘤樣品之 預後組中各《因之表現水平與^_彼基因之表現水 平之平均值進行比較。好均值可⑽如）由具有—指派預後 之表現輪廓（舉例而言’"已知"預後之表現輪廊的資 來計算。 該表現水平與該等類間平均基因表現之差異被加權，且 其對應於一特別類之彼基因的一 ”投票"及與另一類相抵之 彼基因的一相等但負的投票。對一特別腫瘤而言，為各個 ，而將全部基因之投票（正及負）合計在—起，從而為各個類 得出總言十。將該腫瘤指派給具有最高（正）總計之类員。然後可 將該取勝類之取勝餘量表達為預測力。 j現水平之差異係使用—公式而得以加權，該公式包括 该寺兩類中之各類的基因表現水平之平均及標準偏差。通 常’各個類之平均及標準偏差由具有或代表一特別預後（舉 例而言，高NPI及低NPI)之表現輪廓來計算。 士另:卜或其它，指派一預後之步驟可包括使用分級群集， 知·別疋右已使用不同材料及/或由用以測定具有"已知，，預後 之表現輪廓或已與該樣品表現輪廓進行比較之標準輪廊來 測定表現輪廓的方法來測定該腫瘤樣品内表現水平。 可使用既定的留-交叉確認（L〇〇cv)檢定來確認經指派 之預後（芩見實例）。可使用電腦執行步驟（C)。 在分級群集中，各個表現輪廊可代表為一個由⑽基因組 96471 -16 - 200526958 成之向量，其中（g卜g2.....辟）代表該等基因之表現水平。 然後將各個向量與該分析中各個其它輪廓之向量比較，且 將彼此具有最高相關性之兩個向量配對，直至已經將該分 析中盡可能多的輪廊配對。 存在此項技術中已知之許多方式來計算該相關性，諸如 Pearson之相關係數（22)。在下一步驟巾，然後自各個配對 獲知σ成向里（在平均連接群集中此通常為兩個輪廓之 平均），然I重複該配對過程。&繼續進行直至已將全部向 量配對在-起，從而組裝_可代表全部輪扉之”樹”。此過 ^為”分級”過程，因為吾人可自底部（個別輪廊德始並構 ^在本毛明中，個別輪廓構造至較佳兩個合成向量，其 中各個向量代表—類（意即，良好或不良預後）。對-未知類 之新穎樣品而纟，將該樣品與標準輪廓/樣品群集。”未知” 樣品之類別將基於在配對迭代循環之末端處其所屬之群集 /向量而得以測定。 ^ 目或夕個&知或所指派之預後的表現輪廓意謂 已才曰派有或e獲得—預後之表現輪摩。該預後可已唾自 =表現資料計算出來；自執行於源樣品之臨床技術(舉例 二=織病理學技術)獲得；或基於可獲得該表現輪廊之 '丙IV、病症進展/結果而得以追湖性地指派。該第三 因為可基於該病人之隨後結果、由該病人之… =來指派-精確預後⑼於獲得該樣品之時間點在此 W性指派中’事後認識之❹提供了準確度。在此 毛月之方法可用以評定治療乳癌病人之功效。可在治 96471 -17- 200526958 療前及/或治療之早期階段指派該病人之預後並將該預後 與在治療後（或在治療之後階段）指派給該病人之預後進行 比較。治療前及/或後之預後較佳係使用根據本發明之方法 來指派。若該治療包括若干階段，則該表現輪廓可在各個 階段後得以測定，以繪製該治療之進展。治療後之一經改 良預後指示了一成功或至少部分成功之治療。該治療可為 化學療法。 本發明之方法可包括在治療前及治療後比較乳房腫瘤樣 口口内預後組之表現水平，以偵測能指示一改良預後或惡化 預後的表現輪廓之改變。 該方法可包括偵測在表S6中指示為”向上調節，，之預後組 内基因的向下調節及/或在表S6中指示為，，向下調節，，之預後 組内基因的向上調節。比較標準值（舉例而言，具有不同預 後之樣品範圍的平均表現水平）及/或比較先前值（例如，能 指不’’不良"預後或表示此之特徵的標準輪廓），該等基因可 呈向下凋節/向上調節。”向上調節”基因的向下調節及/或，， 向下凋節基—因的向上調節指示出一良好或中等預後。調節 (in regulation)改變之程度可指示出治療之功效。 本發明者已發現表現輪廓中朝向良好預後腫瘤的改變指 不出成功治療。顯示出表現輪廓之此改變的腫瘤具有最佳 預後（舉例而言，最佳存活率、最佳無病存活率）。^將前治 療階段及後治療階段之腫瘤表現輪廓與具有已知預後之標 準輪廊進行比較。 因此，該方法可包括將乳房腫瘤之表現輪麻指派給良好 96471 -18- 200526958 或不良預後類（或者高NPI類或低NPI類），及將第二表現輪 廓（在較晚治療階段自該腫瘤而測定）指派給良好或不良預 後類（或者高NPI類或低NPI類），及偵測類改變，其中自不 良預後至良好預後（或高NPI至低NPI)之改變指示出一有效 治療。另外或其它，指派良好或不良預後類（或者高NPi類 或低NPI類）之統計置信度水平的改變可指示出治療之功

效。指派一可指示不良預後之類的置信度的減少可暗示成 功或至少部分成功之治療。 才疋治療功效之方法可包括測定腫瘤之ER狀態之步 驟。然而，該等評定功效之方法對評定⑽十、ERjERBB2_ 腫瘤之治療功效頗為有效，意即不管該腫瘤之Er狀態如何c 表現輪廓代表腫瘤内一群基因之表現水平。各個表現輪 廓之基因不需要相同但在各個表現輪廓之基因之間應具有 足夠之重登以容許對該等表現輪麼進行比較及群聚。

可使用此項技術中已知之標準程序為偵測目的而對結合 組貝進行標記。或者，可在隔離測試樣品後對表現產物進 行標記。一較佳偵測方法為使用一螢光標記，其可藉由一 測光表來摘測。替代谓測方法包括電訊號傳輸。例如， Motor〇la(Pasadena，Calif〇rnia>_s〇r(電子感測器）系統 具=兩個探針一個能自由浮動之”俘獲探針”及—個連接 ，至可加倍以作為電極表面之固體表面的”訊號傳輸探針 :。兩個探針均充當表現產物之結合組員。當結合發生時， 將兩個极針彼此緊密接近從而導致產生可㈣到之 號。 屯5札 96471 -19- 200526958 然而，存在大量近來出現之較新技術，其利用，，無標記，, 技術以仏疋里，例如彼等藉由Xagr〇s(M〇誠也 California)而產生之技術。引子及/或經擴增之核酸可缺乏 任何標記。可藉由量測由於兩個引子對接至一目標表現產 物及藉由聚合酶之隨後擴展而產生之電阻改變來評定定 量。 如以上所討論，該等結合組員可為寡核苷酸引子以用於 PCR(舉例而5 ’多重pCR)從而特定地擴增遺傳識別符 (genetic identifier)之表現產物之數目。然後將在凝膠上分 析該等產物。然而，較佳地，該結合組員為一固定至載體 之單一核酸探針或抗體。然後將該等表現產物通過該載 體，藉此使其接觸該結合組員。該載體可為玻璃表面，舉 例而言顯微鏡載物片；串珠（Lynx);或光導纖維。在串珠 之it況中可將各個結合組員固定至一個別串珠且然後將 其接觸溶液中的表現產物。 在此項技術中存在用以測定特別基因組之表現輪廓的各 種方法且此寺方法可應用於本發明。例如，基於串珠之 研九（Lynx)或勿子條形碼（gurr〇med)為已知技術。在此等情 況中，各個結合組員被附著至可個別讀取且可自由浮動之 串珠或”條形碼”以放鬆與表現產物之接觸。該等結合組員 至該等表現產物（目標）之結合係於溶液中達成，隨後使該等 已標記串珠或條形碼穿過一設備（舉例而言，一流動血細胞 计數為）且進行讀取。 一種測定表現輪廓之進一步已知方法為由nlumina(San 96471 -20- 200526958

Diego ’ California)開發之測試裝備，即光導纖維。在此情 況中，各個結合組員被附著至光導纖維電纜之末端處的一 特定”地址”。該表現產物至該結合組員之結合可引發由該 光導纖維電纜之另一端處的設備來讀取之螢光改變。 本發明者已經成功使用一核酸微陣列，其包括固定至一 載體之複數個核酸序列。藉由將代表表現基因之核酸序列 (舉例而言，cDNA)通過該微陣列，其能夠自一具有特別預 後之腫瘤樣品（尤其是一具有良好預後之腫瘤樣品或一具 有不良預後之腫瘤樣品或一具有高NPI之腫瘤樣品或一具 有低NPI之腫瘤樣品）產生表現產物之結合輪廓特徵。 在第二態樣中，本發明提供裝置（較佳為一微陣列）以用 於將預後指派給乳房腫瘤樣品，該裝置包括一附著有複 數個結合組員之載體，各個結合組員能夠特定結合至該預 後組之基因之表現產物。較佳地，附著至該載體之該等結 合組員能夠特定及獨立地結合至具有至少5個基因、更佳至 / 10個基因或至少15個基因及最佳至少2〇或3〇個基因（識 別於表S6中X之表現產物。附著至該載體之該等結合組員能 夠特定地結合至具有20至3〇個基因（識別於表“中）之表現 產物。 在貝施例中，能夠特定及獨立地結合至表S6中所識別 之全部基因的表現產物之結合組員被附著至該載體。該載 體可僅已經附著至能夠特定及獨立地結合至表S6所識別之 基因的表現產物或其中一預後組之表現產物的結合組員。 該衣置較佳包括能夠特定結合至來自該預後組之表現產 96471 -21- 200526958

物或其複數個基因的結合組員，且其可包括能夠特定結合 至U13 3 A微陣列上所代表之基因的不完全亞組之表現產物 的結合組員（雖然其亦可包括U133 A微陣列上所未代表之其 它基因的結合組員）。據信，U133 A微陣列代表約143 97個區 別性基因。因此，該裝置較佳包括U133 A微陣列上之不多 於14396個基因的結合組員。該裝置可包括能夠特定結合至 U133A微陣列上之不多於90%的基因之表現產物的結合組 員。該裝置可包括能夠特定結合至U133A微陣列上之不多 於80%或70%或5 0%或40%或30%或20%或10%或5%的基因 之表現產物的結合組員。

另外或其它，該載體可容納不多於14000、或不多於 10000、或不多於5000、或不多於3000、或不多於1000、或 不多於5 00、或不多於400、或不多於3 00、或不多於200、 或不多於100、或不多於90、或不多於80、或不多於70、或 不多於60、或不多於50、或不多於40、或不多於30、或不 多於20、或不多於10、或不多於5個不同基因之結合組員。 較佳地，該等結合組員為核酸序列，且該裝置為一核酸 微陣列。 列出了表S6之基因，其中其單基因登記號（accession number)對應於單基因資料庫之建置160。因此可自國家衛 生 研究院 （NIH) 之 單基因 資料庫 (http:" www. neb i.nlm.nih. go v/entrez/query.fcgi?db=imi gene) 來擷取各個基因之序列。 此夕卜，對於全部該等基因而言，Affymetrix(Santa Clara， 96471 -22- 200526958

California)(迎w.affymetrix.com)福供撰针如夕實例，包括 當用於載體上時能夠偵測該基因之表現的該等探針（意 即，呈券核苷酸序列之形式的結合組員）之序列。使用目標 基因之單基因ID，該等探針詳情可自Affymetdx網站之 U133A部分存取。 若將來該表所列出之單基因ID中的一個將被合併為一新 ID、或分成兩個或兩個以上⑴(舉例而言，在資料庫之新建 置中）、或完全刪除，則如本發明者所希望，該基因之序列 係可藉由存取單基因之建置丨6〇而得以擷取。 通常，高密度核酸序列（通常為cDNA或募核苷酸）被固定 至載體之很小的離散區域或點上。該載體經常為一蓋玻片 面或一薄膜過濾器，其塗佈有一基材（意即一 ”晶片"）。該等 核酸序列通常藉由-機器人系統而被傳遞（或印刷）至該經 塗佈之載體上，且然後使其不動或固定至該載體。 广較佳實施例中，€自該樣品之表現產物通常使用一 螢光標記物而得以標記出來，㈣後使其與該較不動之 核酸序列接觸。雜交之後，使用備測器(諸如高解析度雷射 掃描儀Μ貞測該等螢光標示物。在_替代方法中，可以非勞 光標記物（舉例而言，生物素）來標記該等表現產㉟。雜交之 後’然後以能結合/鍵結至第一非營光標記物（舉例而言，結 合至生物素的經螢光標記之鏈酶親和素）之螢光染料對該 微陣列進行”染色”。然而，如以上所討論 可為無標記。 該等表現產物 藉由使用數位成像軟體分析自 各個離散點發射之訊號來 96471 -23 - 200526958 獲得一能指示基因表現之一樣式（表現樣式或輪廓）的結合 輪廓。然後可將貫驗樣品之基因表現樣式與標準輪廊（音 即，來自一具有（例如）已知良好或不良預後或已&Νρι值或 NPI值之已知範圍的組織樣品的表現輪廓）之樣式進行比較 以供差別分析。 該標準可獲自一個或多個表現輪廓，其先前經判斷是以 一特別預後（舉例而言"差”或"良好"預後）為特徵及/或表示 一特別NPI範圍（諸如高及/或低NPI)i特徵及/或表示一個 或多個NPI值或值之一或多個範圍之特徵。該標準可獲自一 個或多個表現輪廓，其先前經判斷表示一特別或值之 範圍（或預後標度上之其它定義值）之特徵。該標準可包括表 示-^常樣品之特徵的表現輪廓。此等/此標準表現輪射 作為資料庫之一部分而被可擷取地儲存於資料載體上。 大多數微陣列利用一個或兩個螢光團。對於兩色陣列而 言，最通常使用之螢光團為Cy3(綠色通道激發）及(红色 料激發）。微陣列影像分析之目的係自各個表現產物提取 雜交訊號。對;^單色陣列而言，訊號係作為給定目標^ 對強度來量測（基本上對於雜交為單—樣品之陣列而言）。董: 於兩色陣列而t，訊號係作為具有不同螢光標記物的兩種 表現產物（舉例而言，樣品及對照（對照可另外通稱為參 之比率來量測。 一根據本發明之裝隸佳包括複數_散點，各個點包含 一個或多個募核《且各個點代表—選自表％之基因之表 現產物的不同結合組員。在一實施例中，該微陣列將包^ 96471 • 24 - 200526958 表S6所提供之各個基因的點。各個點將包括複數個相同寡 杉苷其均能夠結合至其所代表之表S6之基因的表現產 物^舉例而言，mRNA或cDNA)。各個基因較佳由複數個不

同养核苷駄代表，對於該基因而言較佳為Af^metrix U133A 探針組。 一在本毛明之第二愍樣中，提供了一套組以將一預後指派 、。礼癌病人，該套組包括能夠特定結合至該預後組之基因 表見產物的複數個結合組員及一偵測試劑。該套組可包 括一資料分析工具，較佳呈電腦程式之形式。該資料分析 工具#乂佳包括一經調適以辨別腫瘤之表現輪廓與差異預後 的演算法。較佳地，該演算法經調適以辨別"良好"預後與，， 差”預後，最佳辨別高NPI與低刪腫瘤。f亥演算法較佳為如 以上所描述之加權表決演算法。 在貝施例中，a亥套組包括本發明之第二態樣之裝置。 該套組可包括具有已知預後之乳房腫瘤樣品之表現輪靡 (如以上所討論），及/或表示-特別預後之特徵的基因表現 輪廓（如以上_所时論），其較佳健存於一資料載體或其它記 憶體設備上。料輪廓可⑽得时析或料成群，、例: I计异之平均表現水平及/或基因加權。 較佳地，該套組中該一袖+ # a > , 、 Τ ^個或该等多個結合組員（抗體結合 域或核酸序列，舉例而言寡核皆酸)被固定至-個或多個： 體’舉例而言’用於微陣列或光導纖維檢定之單—載體或 諸如串珠之多個載體。该測構件較佳為一用於標記測試樣 品之表現產物的標記物（放射性或染料’舉例而言營光卜該 96471 -25- 200526958 套組亦可包括用於測試及分析測試表現產物之結合輪廓的 試劑。 或者’該等結合組員可為能夠結合至表S6中所識別之基 因^表現產物的核普酸引子，使得可在PCR中將其擴增。 /等引子可進步包括偵測構件’意即可用以識別經擴增 之序列及其相對;^其它經擴增之序列之豐度的標記物。 該乳房腔瘤樣品可作為切除乳房活組織檢查或細針抽吸 物而獲得。 藉由自大量腫瘤樣品產生該預後組之大量表現輪廓（其 均具有-已指派之預後（較佳基於預後標度）），可生成良好 及不良預後之輪廟庫。表現輪廓之數目越大，越容易形成 可在預後檢定中用作標準之可#特徵性表現輪廓標準（意 P 〇括統a十變化）。目此，標準輪廓可為自複數個個別表 現輪廓設計出及在統計變化内設計出以代表（例如）"良好" 或”差，，預後或高NPI或低NPI的輪廓。 在第四怨樣t，提供了一種產生乳房腫瘤樣品之核酸表 現輪廓的方法，其包括步驟 (a) 自該乳房腫瘤樣品隔離表現產物； (b) 識別該基因預後組之表現水平；且 (c) 自該等表現水平產生該乳房腫瘤樣品之表現輪廓。 可將。亥表現輪廓添加至基因表現輪廓資料庫。該方法進 ν L括將该表現輪廓與第二表現輪廓（或複數個第二表 現輪廓）進行比較之步驟。可使用大體上相同之預後組自一 第二乳房腫瘤樣品（或多個樣品）產生該（等）第二 96471 -26 - 200526958 廓，其中一預後已經被指派給該（等）第二樣品或已為其測 定。該（等）第二表現輪廓可為一個（或多個）表現一特別預後 (例如”良好"預後或”差"預後、或高NPI或低NPI、或至少一 個特別刚值或NPI值之至少一個範圍）之特徵的標準輪廊。 較佳地，該預後呈預後量測之形式，較佳為臨床可接受 之預後分類系統，諸如NPI。再次，可自基因表現資料預測 »亥預後，该基因表現資料獲自臨床技術（諸如組織病理學技 術），或是基於捐獻可獲得該第二輪廓之樣品的病人之疾病 結果而追溯性地指派給該第二表現輪廓。 已知該預後組後，可設計出許多方法來測定一特別測試 樣αα内基因之表現樣式或輪廓。例如，可使用標準分子生 物學技術自該樣品隔離表現核酸（RNA、mRNA)。然後可使 用特定用於PCR中之表現序列的核丨子來擴增對應於表 S6中所給出&遺傳識別符之基因組員的表現核酸序列。若 該經隔離之表現核酸*mRNA，則可使用標準方法將此轉 換為cDNA以用於pcr反應。 。亥等引子可便利地將一標記物引入該經擴增之核酸，使 仔可識別其。理論上，該標記物能夠指示擴增事件後存在 的核酸序狀相對量或比例，此反映原始測試樣品中存在 的相對量或_。例如，若該標記物為螢光或放射性標記 :’則訊號強度將指示表現序列的相對量/比例甚或絕對 量：各個遺傳識別符之表現產物之相對量或比例將為該測 试樣品產生一特別表現輪廓。 根據本發明之第四態樣的方法可包括步驟： 96471 -27- 200526958 (a) 自第一乳房腫瘤樣品隔離表現產物；以能夠特定及獨 立地結合至該預後組之表現產物的複數個結合組員來接觸 該等表現產物；且自該腫瘤樣品内該預後組之表現水平產 生第一表現輪廓； (b) 自已知預後（如先前所定義）之第二乳房腫瘤樣品隔離 表現產物；以能夠特定及獨立地結合至步驟（a)之預後組之 表現產物的複數個結合組員來接觸該等表現產物，以便產 生一乳房腫瘤樣品之可比較第二表現輪廓； (c) 比較第一及第二表現輪廓以測定該第一乳房腫瘤樣品 之預後。 在本發明之第五態樣中，提供了一表現輪廓資料庫，其 包括乳房腫瘤樣品之複數個基因表現輪廓，其中該等基因 表現輪廓獲自該基因預後組之表現水平，該資料庫可擷取 也保存於資料載體上。該資料庫較佳藉由根據本發明之 第四態樣之方法產生。 該等表現輪廓較佳為核酸表現輪廓。該核酸表現輪廓之 測定可計算機化，且可在特定先前設定之參數内進行以避 免假陽性或假陰性。 該資料庫可包括表示一特別預後（諸如良好或不良預後） 之特徵或表示一特別預後值（較佳^?1值（舉例而言高Νρι、 低NPI或特定定性值或值範圍））之特徵的表現輪廓。可根據 源腫瘤之ER狀態（意即ER+或對該等表現輪廓進行分 類。然後可處理及分析該資料庫，使得其最終將包含⑴對 應於該資料庫中各個表現輪廓之數字資料；（ii)充當特別預 96471 -28- 200526958 後指派（舉例而言’良好或不良預後、或值或值範圍，較佳 來自NPI)之典範輪庵的"標準"輪廓；及（出)代表個別輪庵至 該"標準”輪廓之所觀察的統計變化的資料。 然後電腦可能夠提供一具有特別預後（舉例而言，良好預 後及/或不良預後及/或高NPI及/或低Νρι)之乳房腫瘤樣品 之表現輪廓標準特徵。如較早所陳述，然後可使用已測定 之表現輪廓以將一預後指派給該乳房組織樣品，此較佳使 用區別演算法，最佳為加權表決演算法，如以上所描述。 所測試之基因表現水平之數目越大，表現輪麼之分類越 可#。已知微陣列及基因晶片技術容許利用大量結合組 員口此更佳方法將為使用可代表表S6中之全部基因的 結合組員。然而，熟習者將理解，可省略此等基因之比例， 且仍以可罪及統計精確之方式進行該方法。 本發明之任何態樣中的預後組可包括或由來自表S6之全 部或大體上全部基因，或全部或大體上全部之該等陽性基 因及/或全部該等陰性基因組成。在本發明之態樣間，該基 因預後組可獨立地在含量及數目上變化。 孩預後組可包括表S6之至少5個、1〇個、2〇個、3〇個、40 個、50個、60個或全部基因。 較佳地，該預後組包括或由來自表S6之約6〇個或約5〇個 或約40個或約3〇個或約2〇個或約1〇個或約5個基因組成。來 自表S6之陽性基因較佳選自㈣中陽性基因之清單的上面 邰刀車乂佳上面一半，因為該等基因係按重要性之順序排 列0 96471 -29- 200526958 δ玄預後組可包括來自表s 6之一個或兩個陰性基因或可由 來自表S6之兩個陰性基因組成。 运擇基因之數目及精選品以便提供一預後組，其至少能 夠區別具有良好預後之腫瘤與具有不良預後之腫瘤（或具 有高NPI之腫瘤及具有低NPI之腫瘤）。 該預後組可包括表S6之不多於60個基因。該預後組可包 括表S6之不多於50個基因。該預後組可包括表86之不多於 40個基因。該預後組可包括表之不多於個基因。該預 後組可包括表S6之不多於20個基因。該預後組可包括表S6 之不多於10個基因。該預後組可包括表％之不多於5個基 因。 该預後組可包括或基本上由表S6之5至60個基因組成。該 預後組可包括或基本上由表S6之10至40個基因組成。該預 後組可包括或基本上由表86之10至3〇個基因組成。該預後 組可包括或基本上由表S6之10至20個基因、或表S6之20至 30個基因、或表S6之較佳3〇至4〇個基因組成。 該預後組c較佳約1 〇個或約2 0個或約3 0個基因）可選自表 S6之前約40個、或約30個、或約20個基因。約1〇個基因可 選自表S6之前約15個基因。該等約1〇個基因可為表S6之前 10個基因。 該預後組可包括或基本上由選自由以下數目之基因組成 之群的約40個或約30個或約20個或約1〇個基因組成：表S6 之前約40個或約30個或約2〇個或約1〇個陽性基因及視情況 表S6之一個或兩個陰性基因。該預後組可包括或由以下數 96471 -30- 200526958 目之基因組成之群的約30個基因組成：表S6之前約3〇個或 約40個陽性基因、及視情況表s6之一個或兩個陰性基因。 該預後組中與U133A微陣列相同之基因之數目較佳如以 上所描述而受到侷限。 術語”約”較佳意謂所陳述之基因的數目加上或減去較大 為10%的所陳述之基因的數目。 5亥預後組之供應容許診斷工具（舉例而言，核酸微陣列） 定做且用以預測、診斷或將腫瘤分亞型。此等診斷工具可 進一步與一經程式化之電腦聯合使用，以測定使用該診斷 工具（舉例而言微陣列）而獲得之表現輪廓，且如以上所討論 將其與一標準’’表現輪廓或”已知”預後之表現輪廓之資料 庫進行比較。在此情況下，該電腦不僅為使用者提供用以 診斷病人腫瘤之存在或類型的資訊，且同時該電腦獲得可 藉由其測定該”標準”表現輪廓的進一步表現輪廓且因此可 更新其擁有的資料庫。 因此本發明首次容許製造包含對應於該預後組之探針的 專門化晶片C微陣列）。該陣列之精確物理結構可變化，且自 附著至一個2維固體基材之寡核普酸探針變化至已經以獨 特標記物（舉例而言，，，條形碼”）而被個別地”標記，，之自由浮 動探針。 可以直接或間接方式來查詢具有已知預後之表現輪廓的 資料庫。直接方式為，將病人之表現輪廓與該資料庫中 其它個別表現輪廓進行直接比較以測定哪一個輪廓（及因 此哪一個預後）傳遞最佳匹配。或者，該查詢可更，，間接，，完 96471 -31 - 200526958 成，例如，可將該病人表現輪廓與該資料庫中用於一特別 預後指派（舉例而言” 1良"）或一預後值或值範圍（較佳來 自NPI，舉例而言，高NPI)之"標準"輪廊進行簡單比較。間 接研究之優勢為，"標準"輪靡因其代表許多個別輪廊之集 a而將王小得多的資料密集型且可儲存於相對便宜的資料 載體或其它記憶體設備上（舉例而言，電腦系統），然後其可 根據本發明形成該套組之部分（意即，與該等微陣列相關 聯）。 在直接研究中，資料載體可能將為具有大得多的標度（舉 例而言電腦伺服||)之資料載體，因為將不得不健存許多個 別輪扉。 藉由將病人表現輪靡與標準輪廊（間接研究）及總體中預 測定之統計變化進行比較，亦將可能傳遞關於病人表現輪 廓如何接近地匹配該I，標準"典範輪廓之”置信度值"，如以上 所冴_。此值將提供給臨床醫師關於該預後之可信賴性及 (例如）是否應重複該分析的有價值資訊。 士以上所提及’亦可能將病人表現輪廓儲存於該資料庫 上，且任何時候均可使用此等表現輪廓以更新該資料庫。 在第六態樣中，本發明提供了—種方法以用於識別差別 表現於-腫瘤群内之-組基因，該方法包括自該群之複數 個腫瘤中的各個提供一表現輪摩；根據腫瘤之分子亞型對 該等輪廉進行分類，且分析一亞型内之表現輪靡以識別該 組基因（其中該等基因差別表現於彼亞型中）。 此方法與Wt Veer等人（1 〇)之方法區別在於 96471 -32- 200526958 等人中偶發淋巴結陰性乳房腫瘤之初始選擇涉及藉由臨床 分析分亞型，而非以分子水平分亞型。 當然，本發明之此態樣及隨後態樣與前述態樣緊密相 關。除非本文清楚地另有規定，否則所揭示之前述態樣的 較佳特性因此亦可應用於此態樣及隨後態樣。 在本發明之第六、第七及第八態樣之情形中，術語，，表現 輪廓’’並不侷限於該預後組之基因。相反，其通常係指該群 之腫瘤内基因的表現水平，包括（但不必僅僅）差別表現於一 分子亞型内之基因的表現水平。 藉由本發明之第六態樣而獲得之該組基因（下文中為，，區 別組”）的差別表現可指示該群之腫瘤的一特別I型或遺傳 型或表示其之特徵。該方法較佳包括使該區別組之差別表 現與-特別表型及/或遺傳型相關聯。具有不同但已知表型 及/或遺傳型之大量樣品中的該區別組之表現輪廊可經測 疋以在該區別組之一特別基因表現輪廓與-特別表型及/ 或遺傳型之間確立相關性。 特現可表示被指派給腫瘤之臨床參數或醫學類的 作為治療或診斷腫瘤病人之部分，舉例而言預後 (褚如ΝΡΙ值或ΝΡΙ類）之量、 將腫广样 ）里/則。該區別組之差別表現可容許 將一腫瘤樣品指派給至少 本發明之第…則固不同逍傳型或表型類之-。 不知月之弟，、怨樣之方法 ^ ^ Λ ^ ^ 步包括用以將一類指派 現可f + # /、中该區別組之基因之差別表 兄了表不5亥類之特徵，該 ^ ^ ^ m k r 、^驟包括提供該區別組之樣品 η的表現水平，且基於哕笙 亥專表現水平將一類指派給該腫瘤。 96471 ' 33 · 200526958 指派該類之步驟可包括使用統計技術，諸如（但不限於） 加權表决支撐向量機或分級群集，如先前所討論。較佳 Λ方夬匕括識別该腫瘤樣品之分子亞型及使用對該亞 型特定之區別組的步驟。 另外或’、匕，本發明之第六態樣之方法可包括測定一腫 瘤樣品内«職之表現水平、自該等表現水平測定一表 現輪廓及將該輪廓添加至資料庫的步驟。該腫瘤樣品之分 子亞型亦杈佳被識別，且較佳被添加至該資料庫。 可表示特別類之特徵的標準輪廓可獲自已知類之至少 兩们表現輪廓，其中該等表現輪廓獲自該區別組之基因。 該標準輪廓較佳對類及分子亞型特定。另外或其它，將已 知類（及視情況，亞型）之表現輪廓添加至該資料庫。 另外或其它，第六態樣之方法可進一步包括用以核對治 療過程中該腫瘤之類的改變。在—實施例中，自治療不同 階段（舉例而言’治療起始及治療結束）之腫瘤提供表現輪 廓，且比較其以測定類的改變，彡中該等表現輪廓獲自該 區別組基因之表現水平。較佳將該等表現輪廓與標準及/或 已知輪廓進行比較以測定該類。 較佳使用能直接量測腫瘤樣品内基因表現產物之水平的 技術(諸如，組織病理學(舉例而言，免疫學)技術或基因表 現技術）來執行根據分子亞型之分類。最佳為基因表現技 術'然而’亦可使用能夠精確區別分子亞型之臨床技術。 該等腫瘤較佳為乳房腫瘤且該分子亞型較佳對應於該腫 瘤之ER(雌激素受體）狀態（舉例而言ER+)。然而，可將該方 96471 -34- 200526958 法應用於其它群之腫瘤Γ兴 巴戶⑷以 ，肺腫瘤、即巢腫瘤及淋 =及/或其它分子㈣舉例心擴散ab細胞淋巴瘤中 的：：心類：物及活⑽細胞類似物)。對表現輪庵之類進 订執彳于以測疋差別表現之基 — u妁刀析較佳包括微陣列之顯 者刀析（SAM，文獻12)，其可識別在進行比較的樣品之間 表現水平顯著變化之基因。較佳地，該分析涉及統計分析， 例如使用加權表決、主擋而|她 叉筏向里機及/或分級群集（稍後可見此 等技術之解釋）。 在本發明之第七態樣中，提供了藉由本發明之第六態樣 而獲得之該組基因。 在本毛明之第八悲樣中，提供了使用該區別組以將一腫 瘤樣品指派給一特別類。 現在將藉由實例並參考隨附圖式來說明本發明之態樣及 貫施例。對於熟習此項技術者而言，進一步態樣及實施例 將顯而易見。本文中所提及之全部文獻均以引用之方式併 入本文中。 【實施方式】 材料及方法 乳房組織及臨床資訊 人類乳房組織在NCC博物館及倫理委員會適當批准後自 NCC組織博物館獲得。腫瘤狀態之組織學證實及雌激素受 體（EH)及ERBB2免疫組織化學狀態由新加坡綜合醫院之病 理學部門提供（參見臨床資訊之補充資訊）。樣品包含至少 50%腫瘤含量。NPI狀態按如下計算：腫瘤尺寸（cm)*〇.2 + 96471 -35- 200526958 等級+淋巴結點（陰性結=1個點；陽性結，1至3個陽性=2個 點；陽性結，4個或4個以上=3個點）。因為Stanford資料集 中腫瘤尺寸係使用CAT系統而得以定義，所以吾人為各個 CAT等級指派一大約值（意即Tl=2 cm，T2 = 3.5，T3 = 5， Τ4 = 3·5)。 樣品製備及微陣列雜交

使用Trizol試劑自組織提取RNA，且對該RNA進行處理以 根據製造者指令使用U133A基因晶片進行Affymetrix基因 晶片雜交。 資料處理及分析

使用Genedata Refiner對原始基因晶片掃描進行質量控制 且藉由除去在全部基因中不存在表現之基因來對該等原始 基因晶片掃描進行過濾（意即ΠΑ”呼叫）。表現值經受log2轉 換，且藉由由各個樣品來對全部剩餘基因進行中值定心而 得以規格化。使用Genedata Expressionist或習知電子表格應 用來執行資料分析。未監督之資料集（圖1，a-b)包含能在全 部經良好量屬之樣品間顯示出>1.5之標準偏差（SD)的基 因。用於基因選擇之變化過濾器的較小變化亦會產生非常 類似之結果（P. Tan，未出版之資料）。自分析中除去相同基 因之雙重複探針，從而留下用於每個基因之一個探針。平 均連接分級群集係使用CLUSTER而得以執行，且藉由使用 TREEVIEW而得以顯示。實施微陣歹U之重要性分析 (SAM)(12)以識別經差別調節之基因。”錯誤發現率’’對於圖 lc而言為0.1%，且對於圖2而言為15%。可如在Golub等人 96471 -36- 200526958 (13)(補充資訊）中計算加權表決（WV)、留一交叉確認 (LOOCV)檢定及預測力（PS)。使用SPSS產生Kaplan-Meier 存活曲線，且對數秩測試用於計算存活曲線之間的差異之 統計顯著性。藉由卡方分析來測定基因表現與臨床變數之 間的統計關聯性。 力口權表決（WV)及留一交叉確認（LOOCV)檢定之描述

濤("酽厂）··加權表決演算法利用一訊雜比（S2N)度量 以執行二進位分類。屬於一預估組之各個基因被指派一”投 票π，其表現為待分類之樣品内基因表現水平之間的加權差 異及平均類之平均表現水平。加權係使用相關性度量而得 以測定： σι (μ及σ指示兩類中之各類的基因表現 水平之平均及標準偏差）。一特別類指派之最終投票藉由對 由在類區分中所使用之各個基因所得到的加權投票進行加

PS 二卩丽 -1^LOSE 和來計算。”預測力”（PS)被定義為： 其中Fwy

及 Vlose 分別為取勝及失敗類之投票總數。PS反映取勝之相 對餘量，且因此提供了預測確定性之定量反映。 穸一爻X確認fXOOCF) ··吾人使用標準留一交叉確認 (L00CV)研究來評定訓練組之分類精確度。在L00CV中， 最初’’省去π該訓練組中一個樣品，且對剩餘樣品執行分類 器操作（舉例而言，基因選擇及分類器訓練）。然後使用經訓 練之演算法來分類該”省去”樣品，且然後對該訓練組中全 部樣品重此過程。 結果及討論 96471 -37- 200526958 使用未監督群集定義乳癌之分子亞型 已經提議’乳癌中内在基因表現變化之顯著比例可歸因 於屬於區別性，，分子亞型”（舉例而言，ER+及ER_腫瘤）（8-9， 14)之不同腫瘤。在其中腫瘤經處理而不管亞型的初始分析 中’吾人不可使人信服地識別與NPI關聯之表現簽名。吾人 假定此可能歸因於亞型間基因表現方面的驚人差異（亞型 間差異）’其潛在地遮蔽亞型内更微細之變化樣式（亞型内 差異）。為避開此問題，吾人實施一方法學，其中各個分子 亞型係作為獨立資料集而得以處理。簡言之，首先使用多 種未監督之群集技術以根據其各自之”分子亞型"種類來廣 泛隔離一組乳房腫瘤表現輪廓。其次，然後獨立分析各個 亞型内之腫瘤以定義可能與NP][或其組份元素關聯之表現 簽名。 使用Affymetdx U133A基因晶片，吾人產生了可獲自吾 人本地最主要之中國病人人口的98個偶發乳房腫瘤之表現 輪廓。資料規格化及預處理後，吾人應用一標準偏差過濾 器以識別367；個基因之組，其在腫瘤系列間展現出高的基因 表現變化程度，且使用此基因組以使用未監督分級群集基 於其總體相似性使該等腫瘤表現輪廓成群。該等乳房腫瘤 自身隔離為3個主要亞群，其分別稱為ER+、及 ERBB2 + (圖la)。此隔離樣式係使用主要組份分析（pCA)而 得以證實，該PCA為一獨立分析技術（圖lb)，其傳遞高度相 似之結果。為穩固地識別此等成群，吾人使用SAM(丨2)以 識別差別表現於該等亞型之間的基因。在〇 · 1 %之FDR( ”錯誤 96471 -38- 200526958 發現率π)時，吾人識別了以亞型特定方式而被顯著調節之 409個基因（圖lc)。 表S5之清單代表藉由SAM而得以識別為在各個分子亞型 (ER+、ER-、ERBB2+)中受顯著調節之頂部50個基因。該等 基因藉由其S2N相關性比率（其反映在不同群中所觀察到的 表現擾動之程度）而得以排列等級。 在此等基因與其它研究（文獻8-11)所報告之相似清單之 間存在良好重疊。 該409個基因之組的大約69%展現出ER+亞群内的增加表 現，包括雌激素受體基因ESR1及經雌激素調節之基因（諸如 LIV1、TFF1及MYB)(補充資訊）。與其它研究相一致，在此 亞型中亦觀察到GATA3、HNF3a、膜聯蛋白A9及XBP1之高 表現水平（8-9，11)。ER-亞群與基部乳房上皮標示物（角蛋 白5及17)、基底膜蛋白質ladinin 1、絲胺酸蛋白酶KLK5(其 已經與差疾病預後相關聯（15))及絲胺酸蛋白酶抑制因子 maspin(—種他莫西芬誘導之基因，先前已經報告其表現於 與ER( 1 6)相反之樣式）之高表現相關聯。最後’ ERBB2+亞 型與ERBB2受體及物理連接至17q基因座之其它基因（諸如 GRB7及PMNT(14))的高表現水平相關聯，此暗示存在DNA 擴增。然而，特定在ERBB2 +亞型中展現增加之表現的大多 數基因並不受限於17q基因座而是發現於整個基因體中’諸 如S100約結合族（S l〇〇A8、A9)之成員。總體而言，吾人之 結果可確認及證實先前報告，即大多數乳癌腫瘤的確可基 於其整體基因表現輪廓而被細分為區別性分子亞型。 96471 -39- 200526958

與ER+腫瘤内NPI相關聯之預後組之識別 吾人集中在屬於ER+分子亞型之34個腫瘤，且嘗試識別 此亞型内表現可能與NPI狀態關聯之基因。傳統上，通常藉 由NPI將乳癌病人分層為3個主要群一’’良好’’預後（NPI <3.4)、丨丨中等”預後（仰13.4-5.4)及丨丨差，’預後（阶1>5.4)(2)。 其它研究已經為可定義此等群（17)之截止值而提議了稍稍 不同之值，此可反映出不同計分病理學家之間變化性的效 果。為避免在測定合適NPI截止值時產生任何潛在偏差，吾 人進行一移動臨限值分析，其中藉由一可自2.3-7.8穩定增 加之NPI臨限值將ER+腫瘤劃分為一系列二進位群。在各個 臨限值處，識別能在兩個群之間顯示表現之顯著變化的基 因。吾人發現，使用3.8至4.6之NPI截止值產生了 一具有62

個差別表現基因之基因組（圖2a)，其大部分在ER+樣品中以 高NPI而展現出增加之表現（圖2b)。吾人將此62個組員之基 因組稱作ΠNPI表現簽名n4NPI-ES，其顯示於表S6中。屬於 該NPI表現簽名之基因與牽涉於腫瘤發生之廣泛種類的細 胞功能相關牖，該等細胞功能包括DNA複寫及細胞分裂 (APRT、MCM4、KNSL 1、CDC2)、細胞訊號傳輸（向化性 激動素配位子1、Met、ShC)、細胞凋零（生存蛋白質 (survivin)、CD27結合蛋白質）及細胞黏附（大的圓盤同系物 (discs-large homolog) 7、tetr asp an 1)。在個別 NPI 組份（腫瘤 尺寸、腫瘤等級、淋巴結狀態）中，腫瘤等級似乎代表NPI-ES 之分子組成的主要貢獻者（補充資訊）。 藉由NPI-ES而對腫瘤之分類定義兩個離散分子群 96471 -40- 200526958

使用分子輪廓以進行腫瘤分類之一個經提議之優勢為能 夠以數學方式量化該分類之置信度水平（11)，若該分類會 影響隨後治療過程則其尤為重要。在此情景中，治療醫師 接著可權衡預測之置信度水平與特定干涉之潛在發病。值 得注意的是，雖然吾人之資料集内ER+樣品與標準NPI值 (2-8)之連續譜相關聯，但是使用NPI-ES進行群集分析似乎 將該等ER+腫瘤分離為兩個明顯離散之群（圖2b)，此提高了 能展現基於組織病理學參數之連續值的樣品仍然可在分子 水平上分離為離散種類的可能性。 為更佳定義NPI-ES能確信地辨別此等兩類之能力，吾人 使用加權表決（13)(—種受監督之學習演算法）以辨別能展

現NPI-ES之高及低表現之腫瘤，且使用確定的留一交叉確 認（LOOCV)檢定來測試受訓練演算法之分類準確度。除分 類準確度以外，亦如Golub等人（13)所描述計算定量度量（預 測力，PS)以提供預測置信度之分析（圖2c)。該WV分析顯示 NPI-ES能傳遞91%之LOOCV分類準確度，其具有3個錯誤分 類。在被錯誤分類之3個樣品中，2個與低預測力（PS<0.3) 相關聯，且因此代表”低置信度”或’’非確定”分類。實際上， 在與’’高置信度’’分類（PS>0.3)相關聯之（34個中之）29個ER+ 腫瘤中，僅有一個樣品被錯誤分類。此等結果暗示，可使 用NPI-ES以高置信度將吾人之資料集中大多數ER+腫瘤分 類為離散群。 使用全部腫瘤衍生NPI表現簽名，而不管是否為亞型 吾人使用兩步方法學定義NPI-ES。最初，使用未監督之 96471 -41 - 200526958 群集以根據其各自’’分子亞型”（意即ER+、ER-、ERBB2+) 來群集腫瘤。為可能與NPI相關聯的表現簽名分析各個亞型 内之腫瘤）。此處，吾人顯示執行第一步（定義區別性分子亞 型）在NPI-ES之識別方面頗為重要。 吾人組裝了一由全部79個腫瘤（而不管是否為分子亞型） 組成之資料集，且執行了 一移動NPI臨限值分析以定義一” 合適ΠΝΡΙ臨限值，如上所述（參見圖2a)。吾人發現，使用4 之NPI臨限值產生了總共44個差別表現之基因。在此44個基 因之組中，16個（35%)亦屬於NPI-ES(其獲自ER+樣品）。 吾人使用加權表決（WV)及交叉確認（LOOCV)檢定來分 析此44個基因之組確信地將該等腫瘤樣品分類為離散群之 能力。如在圖4中所見，比較圖2c，低置信度（PS<0.3，紅 色區域）樣品之數目以及錯誤分類比率（對該44個基因之組 而言為9%)均顯著減少。此結果指示該44個基因之組（基於 全部79個腫瘤）在預測腫瘤之NPI狀態方面不如NPI-ES對 ER+腫瘤有效。 在圖4中，—樣品按照其NPI值（X軸）而得以分類，加權表決 用以分類樣品，且各個樣品之預測力（Y軸）基於Golub等人 (13)而得以計算。認為預測力<0.3之樣品分類是”非確定π或 ’’低置信度灰色區域）。比較圖2c，觀察到較高數目的”非 確定低PS)樣品及錯誤分類樣品。 在預測一獨立資料集内的NPI狀態方面，獲自全部腫瘤 (而不管亞型）之44個基因之組亦不如NPI-ES有效。將 Rosetta資料集用作盲目測試組，吾人將該44個基因之組應 96471 -42- 200526958 用至Rosetta資料集中所發現之49個ER+腫瘤，且使用學生 之t測試來測定能表現該44個基因之組的高水平且擁有一 高NPI的ER+腫瘤之間的關聯的重要性。吾人獲得了該44個 基因之組的為0.29之p值，此與NPI-ES的為0.0004之p值相比 較顯著性差很多。

有趣的是，NPI-ES儘管獲自ER+腫瘤之分析，但是即使 當應用於Rosetta資料集中全部78個腫瘤時仍勝過該44個基 因之組。為說明此點’將該等78個Rosetta腫瘤分別劃分為 ΝΡΙ<3·4(良好預後）及>3·4(中等預後）之兩個群。然後使用 加權表決以由NPI-ES或該44個基因之組來分類該等Rosetta 腫瘤。如表S3中可見，NPI-ES傳遞80%之分類準確度，相 比較該44個基因之組傳遞70%分類準確度。 與組織學等級（1&2對比3)關聯之基因

因為經典NPI為一獲自腫瘤等級、腫瘤尺寸及淋巴結狀態 之複合度量，所以吾人定義了此等個別元素中之各個元素 對NPI-ES之分子組成所作的貢獻。使用SAM以識別與三個 組織病理學變數中之各個變數相關聯之基因，吾人不能夠 令人信服地識別其表現與腫瘤尺寸或淋巴結狀態顯著關聯 的基因。相反，在組織學等級之情況中，發現顯著大量之 基因差別表現於等級1或2與等級3腫瘤之間，且此等級關聯 基因組内之基因顯示與NPI-ES之實質重疊（66%)(表S6)。此 等結果暗示，能展現不同組織學等級之腫瘤可在生物學方 面區別開，且腫瘤等級為NPI表現簽名之關鍵貢獻者，而剩 餘的兩個參數（腫瘤尺寸及淋巴結狀態）則傳遞相對較少之 96471 -43- 200526958 貢獻。

NPI-ES在多個獨立乳癌表現資料集的應用 為在一系列盲目，，測試組，，中測試NPI-ES預測NPI狀態及 疾病預後兩者之能力，吾人使用可公開得到之兩個獨立乳 癌資料集。第一資料集（稱為Rosetta資料集）由使用基於寡 核苷酸之微陣列來測繪的Μ個淋巴結陰性乳房腫瘤組成’ 且亦包含各個病人的”無病存活，，（DFS)之持續時間（自起始 腫瘤診斷至出現一新的遠距離轉移之時間）（1〇)。重要的 是，若干研究先前已經顯示即使在結點陰性乳癌中NPI仍具 有預後價值（18、19)。第二資料集由使用cDNA微陣列來測 繪之78個乳房癌與全部病人存活資訊組成（稱為Stanford資 料集）（14)。此等資料集之可獲得性容許吾人獨立測試 NPI-ES之預測能力，因為Rosetta及Stanford資料集在多個方 面與吾人之資料不同，包括I)病人人口，II)樣品處理協定’ III)計分病理學家及IV)陣列技術及探針組之選擇（在 Rosetta及Stanford資料集中為兩色且吾人之資料集中為單 色）。 — 乾邊身^存襄··在藉由S AM分析而識別之能定義 ER+、ER-及ERBB2 +亞型的409個基因中’在Rosetta微陣列 上發現了 276個基因（67%)。吾人將此基因組應用至該等78 個Rosetta腫瘤輪廓，且識別了屬於ER+分子亞型之49個腫 瘤（參見圖5)。為將NPI-ES應用至此等腫瘤，吾人測定來自 62個基因之屬於NPIES的46個亦存在於該Rosetta微陣列 上。因為該Rosetta資料集係基於一不同於吾人之陣列技 96471 -44- 200526958 術，所以不可能直接應用在吾人資料集上發展起來的受訓 練加權表決模型來分類該等Rosetta腫瘤。

然而，遵循Ramaswamy等人（20)中所描述之用以比較不 同陣列技術間的基因組之策略，吾人使用分級群集以使用 46個基因之重疊NPI-ES組來將該等49個ER+Rosetta腫瘤分 群。該群集分析將該等49個ER+ Rosetta腫瘤劃分為2個群， 其分別由24個及25個能展現NPI-ES之’’高”及”低”表現水平 的腫瘤組成（見圖6)。

吾人比較此等兩個亞群内之腫瘤以測定其是否與其NPI 值差異相關聯。使用兩種區別性統計研究，其中該等腫瘤 NPI值作為連續梯度（學生之T測試）或作為兩個離散群（卡 方分析，使用為3.4之經典NPI截止點）來處理，可展現 NPI-ES之高表現的腫瘤與可表現NPI-ES之低水平的腫瘤相 比較一貫顯示出具有顯著更高的NPI值（對於連續分析 ρ=0·0004，對於二進位分析ρ=0·0087)(表la)。此分析指示 即使在藉由一不同陣列技術而產生之獨立資料集内NPI-ES 之表現仍與ER+腫瘤内經典NPI狀態顯著關聯。

為比較NPI-ES之預後力與經典NPI系統分級，可執行優勢 率計算（表lb)。表現NPI-ES之高水平的ER+腫瘤的病人與表 現NPI-ES之低水平的腫瘤相比較具有對於遠距離轉移而言 五年内為10·3之優勢率（95% CI 2_4至44.0，ρ<0·001)。比較 起來，具有>3.4(’’中等’’預後）之經典ΝΡΙ指數之ER+腫瘤的 病人與<3.4(”良好”預後）之ΝΡΙ指數的ER+腫瘤相比較具有 對於遠距離轉移而言為6.1之較低優勢率（95% CI 96471 -45 - 200526958 1.6-23.4，p=0.06)。吾人亦使用Kaplan-Meier存活分析比較 NPI-ES及NPI之預後效能（圖3)。與其它研究相一致，具有 低NPI(<3.4)之腫瘤的病人與高ΝΡΙ(>3·4)的病人相比較展 現出更佳DFS(p=0.007，圖3a)。當藉由NPI-ES重新分層此 相同人口時，具有能展現NPI-ES之高表現之腫瘤的病人與 具有能表現NPI-ES之低水平的腫瘤的病人相比較展現出更

佳無復發存活（ρ=〇·〇〇〇7)。總體而言，此資料暗示，對於ER+ 腫瘤而言，ΝΡΙ表現簽名之預後力可勝過經典ΝΡΙ分級系統。 #存使用一相似研究以測試Standford資料集 上之NPI-ES(參見圖7)。在用以定義ER+、ER-及ERBB2 +亞 型之SAM_409基因組中，在Stanford微陣列上發現136個基 因（http://genome-www5.stanford.edu/MicroArray/SMD/)，且 使用此等基因以群集該等Stanford腫瘤從而識別屬於該 ER+分子亞型之46個腫瘤（來自丟棄6個腫瘤之類似正常腫 瘤亞群之後的72個腫瘤，該亞群很可能由於污染非惡性組

織之存在而引起）。 然後使用NPI-ES(在Stanford微陣列上31個配對）將此等 46個腫瘤群集（參見圖8)為”高NPI-ES”（13個腫瘤）及”低 NPI-ESπ群（33個腫瘤）。再次，學生之t測試揭示高及低表現 NPI-ES亞群與經典NPI狀態（表la)之間的顯著關聯性 (p = 0.001)。另外，在低NPI-ES表現腫瘤之病人與高NPI-ES 表現腫瘤之病人相比較中，KM存活分析亦證明顯著 (p = 0.0493)總體存活優勢（圖3d)。 有趣的是，在能表現NPI-ES之高水平之ER+腫瘤與Sorlie 96471 -46- 200526958 等人（14)中所識別之’’魯米那（Luminal)Cn分子亞型之間似 乎存在強烈相關性，儘管屬於NPI-ES之62個基因中沒有一 個已被報告為表現於後者中。有趣的是，Sodie等人（文獻 14)先前報告了基於500個基因之一’’内在’’組的’’魯米那Cff亞 型之識別。在π魯米那Cn腫瘤與能表現NPI-ES之高水平之腫 瘤之間似乎具有一強烈重疊（96%)，儘管如以上所提及屬於 NPI-ES之62個基因中沒有一個發現於此”内在'组中。此說 明於表S 11中。 NPI-ES之預後力可與先前描述之乳癌的”預後簽名”相比 較 在Van Veei*等人（10)之相同研究中，作者亦識別了 一能預 測乳房腫瘤之DFS狀態的70個基因之’’預後”表現簽名 (PES)。有趣的是，在屬於NPI-ES與PES之基因之間存在最 小重疊，因為在該兩者之間僅發現一個共同基因。為比較 NPI-ES及PES對Rosetta ER+腫瘤之預後效能，吾人使用KM 存活分析以比較藉由NPI-ES(圖3b)或PES(圖3c)而得以分層 的病人之 DRS。由 PES(p=0.0001)與 NPI-ES(p = 0.0007)進行 比較觀察到稍稍較佳的效能。然而，與該PES關聯之邊際改 良出人意外，因為該PES之識別係直接基於此等相同腫瘤之 表現輪廓及臨床資訊。因此，該等Rosetta腫瘤對該PES而 言並非’’盲目lf，而在NPI-ES之情況中，該等Rosetta腫瘤代 表一真實獨立測試組。實際上，當將PES及NPI-ES應用於 Stanford ER+腫瘤時，對5年内復發而言兩個分子簽名均傳 遞高度相似之優勢率（PES為3.9對比NPI-ES為4.17)(表 96471 -47- 200526958 lc)。因此’此等結果暗示，ΝΡΙ-ES與PES之預後力為相對 可比較。 ΝΡΙ-ES分子簽名之表現預測化學療法反應 在此分析中，吾人在化學療法之前及之後檢查配對之乳 房腫瘤樣品内的ΝΡΙ-ES分子簽名之表現，且將此簽名之表 現與最終臨床反應相關聯。 利用一公開可獲得之乳癌資料集（"Stanford，，），其由20對 樣品組成，其在14週阿黴素治療（8)”之前”及”之後”獲得。 在ΝΡΙ-ES中發現之62個基因中，31個基因亦在Stanford微陣 列上發現，且該3 1個基因之組的表現在該等配對樣品中檢 查〇 在該等20個”之前”樣品中，1〇個樣品展現npi-ES表現之 高水平（H)，且10個展現低表現水平（L)。如圖1 〇中所示，在 該等前10個樣品中’ 6個在化學療法後保持高表現水平 (H->H ’以紅色描繪），而4個在治療後展現低表現水平 (H->L，以黃色描繪）。然後將各個群之死亡數字（5年之後） 製表，如表S12中所示。 然後執行Kaplan-Meier無復發存活分析，且將其顯示於圖 11中。吾人發現，與其它群相比較腫瘤具有最佳存 活結果（ρ = 0·022)，而腫瘤則具有最差預後。此結果 暗示，高表現ΝΡΙ-ES腫瘤内ΝΡΙ-ES之向下調節可作為化學 療法反應之標示物。 總之，吾人已經識別一可潛在充當NPI之分子替代品的62 個基因之表現簽名。精由顯示其可預測由不同中心產生之 96471 -48 - 200526958 兩個獨立腫瘤組的NPI狀態及疾病預後兩者，獲得了 NPI-ES 之可靠性的置信度。一個自此研究出現的引人興趣之概念 為，在組織病理學水平上顯示明顯連續變數之樣品仍然可 在分子水平上分離為離散種類。此可在癌症組織病理學方 面提出一主要挑戰，即當正在計分之參數具有連續本性時 定義臨床上合適之截止值的困難。藉由承認在可完全評定 NPI-ES之臨床效用之前需要執行更多工作，吾人作出結 論。首先，NPI-ES之預測力顯然需要進行測試以抗衡遠遠 更大之腫瘤群。 其次，儘管吾人已經證明NPI-ES在ER+分子亞型中的適 用性，但是NPI-ES之表現似乎又未與其它分子亞型（ER-、 ERBB2 + )所關聯之NPI值（補充資訊）相關聯。 樣品資料 表S 14顯示具有差異NPI值之樣品間基因預後組（或 NPI-ES)的表現資料。該資料特定用於Affymetrix U133A基 因晶片，且已完成了資料預處理。該預後組之該等基因表 現輪廓可用作訓練資料以建構一預測模型（舉例而言，WV 及SVM)，然後其可指派一未知腫瘤之NPI類。 該資料係製表而定界的，且具有下列格式： 行··

第1行：預後組基因之探針_ID 第2行：基因名稱 第3及其它行：基因表現資料 列： 96471 -49- 200526958 第1列··樣品ID(35個樣品） 第2列：NPI指數 第3及其它列：基因表現資料 該基因表現資料係如”樣品製備及微陣列雜交”及”資料 預處理π(參見材料及方法部分）中所描述而得到。詳言之， 原始基因表現資料值藉由用以量測該微陣列之儀器（通常 為一微陣列掃描儀，舉例而言Affymetrix)來計算。 表S 15顯示平均（μ)及標準偏差（σ)參數以用於各類中預後 組之各個基因的加權表決演算法。此等資料可用以指派給 定該預後組基因之一組表現水平的未知乳房腫瘤樣品之預 後。該資料對應用於來自Affymetrix U13 3 Α基因晶片之表現 資料的加權表決技術而言具有特定性。 文獻 1. Elston' C. W.#iL 0. Ellis. Pathological prognostic factors in breast cancer: I. The value of histological grade in breast cancer -Experience from a large study with long- term follow-up. Histopathology 19, 403-410, 1991. 2. Galea、Μ· H·、R· W. Blarney、C. W· Elston與I· 0· Ellis· The

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20. Ramaswamy、S.、Κ· N· Ross、E· S. Lander與T· R· Golub· A molecular signature of metastasis in primary solid tumours. Nat Genet 33, 49-54, 2003. 21. Travassoli、F· A·與 Schnitt S. J· (1992) Pathology of the Breast In (Elsevier). 22. Eisen MB、Spellman PT、Brown PO、Botstein D. (1998) Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc Natl Acad Sci USA. 95(25), 14863-14868. 表la)Rosetta及StanfordER+腫瘤内NPI-ES表現及NPI狀 態之關聯。第一行代表能表現NPI-ES之高或低水平之腫瘤 的數目。 學生之t測試(連續） 卡方(二進位） Rosetta 平均(偏差） Ρ=0·0004 低(<3.4) Ρ=0.0087 高(24*) 3.1±0.4 13 11 低(25) 2·3 土 0.6 22 3 Stanford Ρ=0·001 高(13) _ 5·3±0·5 低(33) 4·5 土 0.6 *圓括號内數字代表樣品之數目。 表1 b)作為基於經典NPI分級及NPI-ES表現之Rosetta ER+ 腫瘤内首次事件的五年内遠距離轉移的優勢率 96471 •54- 200526958 ER+腫瘤 優勢率* 無遠距離 轉移>5年 <5年 (95% CI) NPI (p=0.06) 6.08(1.58-23.39) 低(<3·4) 27 8 高(>=3·4) 5 9 NPI-ES(p<0.001) 10.27(2.40-43.94) 低 22 3 高 10 14 *優勢率係使用標準2乘2表格計算得出。CI代表”置信度 區間π。 表lc)作為基於PES表現及NPI-ES表現之Stanford ER+腫 瘤内首次事件的五年内復發之優勢率。一個樣品不擁有復 發資訊，且已自分析移除（剩餘45個ER+腫瘤）。 ER+腫瘤 優勢率 無 復發 (95% CI) PES(p=0.053) 3.90(0.94-16.25) 低 26 8 高 5 6 NPI-ES(p=0.040) 4.17(1.05-16.48) 低 25 7 高 6 7 96471 -55- 200526958 表si.乳房腫瘤之組織病理學 年齡 尺寸 (mm) 等級 結 NPI ER PR 亞型 LVI DCIS ER+ 2000220 52 60 3 34 之 30 7.2 陽性 陰性 管狀 是 最小 980278 64 40 3 20 之 14 6.8 陽性 陰性 管狀/ Micropap 是 最小 2000597 57 40 2 12之0 3.8 陽性 陰性 管狀 可能 廣泛 2000609 62 70 2 17 之 17 6.4 陽性 陽性 管狀 是 無 20020071 58 28 3 16之0 4.56 陽性 陽性 管狀 否 無 20020160 86 120 3 10之0 6.4 陽性 陽性 小葉片狀 否 無 2000787 57 60 3 9之0 5.2 陽性 陽性 管狀 是 無 2000818 52 10 2 11之0 3.2 陽性 陰性 管狀 否 最小 20020051 38 50 3 25之1 6 陽性 陽性 管狀 否 無 20020056 71 20 1 17之2 3.4 陽性 陰性 管狀 否 最小 980197 55 30 3 4之2 5.6 陽性 陽性 管狀 是 最小 980261 60 15 2 9之0 3.3 陽性 陰性 管狀 否 最小 980391 56 20 2 7之0 3.4 陽性 陽性 管狀 否 無 2000768 39 40 3 17之0 4.8 陽性 陽性 管狀 否 最小 2000779 48 55 3 14之0 5.1 陽性 陰性 管狀 否 無 990123 54 55 3 11之7 7.1 陽性 陽性 管狀 否 無 2000422 51 63 3 7之3 6.26 陽性 陽性 管狀 否 最小 2000683 72 35 2 17之0 3.7 陽性 陽性 管狀 否 最小 2000775 51 25 2 12之0 3.5 陽性 陰性 管狀 否 最小 2000804 39 40 3 21之5 6.8 陽性 陽性 管狀 是 最小 980346 52 20 3 4之0 4.4 陽性 陽性 管狀 可能 最小 980383 64 30 2 16之0 3.6 陽性 陽性 管狀 否 最小 990082 49 34 2 16之3 4.68 陽性 陽性 管狀 否 最小 980177 75 26 2 13之6 5.52 陽性 陽性 管狀 是 無 980178 69 32 3 15之2 5.74 陽性 陰性 管狀 否 最小 980403 73 30 3 9之0 4.6 陽性 陽性 管狀 可能 最小 980434 73 30 3 16之0 4.6 陽性 陽性 管狀 否 最小 990075 66 25 3 21之5 6.5 陽性 陽性 管狀 是 無 990113 70 90 3 15 之 11 7.8 陽性 陽性 管狀 否 最小 990107 50 40 1 18之1 3.8 陽性 陰性 混和盆狀 (tub-mixed) 是 最小 96471 -56- 200526958 980208 42 25 3 20之5 6.5 陽性 陽性 管狀 否 無 980220 40 37 2 5之0 3.74 陽性 陽性 管狀 是 最小 980221 33 65 3 13之1 6.3 陽性 陽性 管狀 否 無 990375 38 15 1 10之0 2.3 陽性 陰性 管狀 否 廣泛 ER- 980193 49 25 3 23之3 5.5 陰性 陰性 管狀 否 最小 980216 65 45 2 20之5 5.9 陰性 陰性 管狀 否 無 980256 46 36 3 12之1 5.72 陰性 陰性 管狀 否 無 980285 49 40 3 7之1 5.8 陰性 陰性 管狀 是 最小 980338 55 30 3 7之0 4.6 陰性 陰性 管狀 否 無 980353 58 45 3 25之0 4.9 陰性 陰性 化生 否 無 980411 69 30 2 9之0 3.6 陰性 陰性 管狀 否 無 980441 66 30 3 14之4 6.6 陰性 陰性 管狀 是 無 990174 55 45 2 24之3 5.9 陰性 陰性 管狀 是 最小 2000320 67 20 3 21 之20 6.4 陰性 陰性 管狀 是 無 2000500 44 75 3 6之6 7.5 陰性 陰性 管狀 是 無 980247 35 45 3 19之1 5.9 陰性 陰性 管狀 是 最小 990299 58 55 3 17之7 7.1 陰性 陰性 管狀 可能 最小 2000593 60 41 3 15之0 4.82 陰性 陰性 管狀 否 無 2000638 60 40 1 15之0 2.8 陽性 陰性 小葉片狀 否 無 2000731 68 51 3 29之1 6.02 陽性 陰性 管狀 否 最小 2000880 55 15 2 26之0 3.3 陰性 陰性 管狀 否 無 ERBB2 980194 58 50 3 32 之 25 7 陰性 陰性 管狀 是 無 980214 49 60 2 13之5 6.2 陽性 陰性 管狀 否 廣泛 980238 62 -20 3 21之7 6.4 陰性 陰性 管狀 否 廣泛 980288 45 60 3 15 之 13 7.2 陽性 陰性 管狀 是 廣泛 980335 33 3 3 7之3 5.06 陰性 陰性 管狀 是 廣泛 980373 77 30 3 14之0 4.6 陰性 陰性 管狀 否 最小 980380 56 6之0 陰性 陰性 980395 68 30 3 10之1 5.6 陰性 陰性 管狀 是 無 980396 66 35 3 12 之 10 6.7 陰性 陰性 管狀 是 廣泛 990115 38 28 3 10之9 6.56 陽性 陽性 管狀 是 廣泛 990134 43 40 3 19之0 4.8 陰性 陰性 管狀 否 無 990148 60 40 2 19之6 5.8 陽性 陰性 管狀 是 最小 990223 52 5 3 21之1 5.1 陽性 陰性 管狀 否 廣泛

96471 -57- 200526958 2000104 59 陽性 陰性 管狀 2000171 50 25 2 9之0 3.5 陰性 陰性 管狀 否 無 2000209 58 50 3 7之0 5 陽性 陰性 管狀 否 益 2000210 50 40 3 6之3 5.8 陰性 陰性 管狀 是 無 2000237 43 47 3 40 之 23 6.94 陽性 陽性 管狀 是 最小 2000287 53 40 3 8之0 4.8 陰性 陰性 管狀 可能 無 2000399 44 40 2 8之0 3.8 陰性 陰性 管狀 否 最小 2000641 47 60 3 24 之 16 5.2 陰性 陰性 管狀 是 最小 2000652 56 25 3 21之6 6.5 陰性 陰性 管狀 否 最小 2000675 78 55 3 16 之 16 7.1 陰性 陰性 管狀 是 最小 2000709 45 30 3 16之0 4.6 陰性 陰性 管狀 否 無 2000759 57 7 3 12之0 4.14 陰性 陰性 管狀 否 廣泛 2000813 60 23 3 17 之 16 6.46 陰性 陰性 管狀 是 廣泛 2000829 51 45 2 10 之 10 5.9 陰性 陰性 管狀 是 廣泛 20020090 60 45 3 27 之 19 6.9 陰性 陰性 管狀 是 最小 *此清單包含此研究使用之98個腫瘤中的79個腫瘤之臨 床資訊。剩餘19個腫瘤之臨床資訊不完整且不包括於此清 單中。僅使用具有完整臨床資訊之79個樣品以用於隨後 NPI-ES 分析。 表S3，NPI-ES傳遞80%之分類準確度，與可傳遞70%之分 類準確度的44個基因之組相比較。 表S3: 78個Rosetta腫瘤上之NPI-ES或44個基因之組的分 類準確度 NPI 分類（<3·4 或 >3.4) 錯誤分類數目（準確度） 44個基因 23(70%) NPI-ES 15(80%) 96471 -58- 200526958 表S5 : ER+、ER-及ERBB2 +分子亞型中前50個經顯著調 節之基因的清單 此清單代表由SAM識別為在各個分子亞型（ER+、ER-、 ERBB2+)内經顯著調節之前50個基因。該等基因藉由其S2N 相關性比率而按順序排列，該比率反映不同群之間所觀察 到的表現擾動之程度。在此等基因與由其它研究（文獻 8-11)(正文）所報告之相似清單之間存在良好重疊。 基因描述 單基因 染色體 ER+分子亞型 雌激素受體1 Hs.1657 Chr:6q25.1 GATA結合蛋白質3 Hs. 169946 Chr:10pl5 膜聯蛋白A9 Hs.279928 Chr:lq21 KIAA0882蛋白質 - Hs.90419 Chr:4q31.1 碳酸酐酶XII Hs.5338 Chr:15q22 細胞色素P450，亞族IIB(魯米那誘導）， 多肽6 Hs.1360 Chr:19ql3.2 動力蛋白，基因絲、輕中間多肽1 Hs.406050 Chr.lp35.1 Sema域，免疫球蛋白域(Ig)，短基本域， 經分泌，（semaphorin)3B Hs.82222 Chr:3p21.3 N-乙醯基轉移酶1(芳基胺N-乙醯基轉 移酶） Hs.155956 Chr:8p23.1-p21.3 絲胺酸(或半胱胺酸)蛋白酶抑制因子， 進化枝Α(α-1抗蛋白酶，抗胰蛋白酶）， 組員5 Hs.76353 Chr:14q32.1 細胞色素c氧化酶亞單位Vic Hs.351875 Chr:8q22-q23 人類mRNA ; cDNADKFZp564F05(來自 純系 DKFZp564F053)，mRNA序列 Hs.71968 — LIV-1蛋白質，經雌激素調節 Hs.79136 Chr:18ql2.1 肌鈣蛋白T1，骨骼，慢 Hs.73980 Chr:19ql3.4 假想蛋白質FLJ20151 Hs.279916 Chr:15q21.3 Calsyntenin 2 Hs.12079 Chr:3q23-q24 B細胞CLL/淋巴瘤2 Hs.79241 Chr:18q21.3 胍基乙酸酯N-曱基轉移酶 Hs.81131 Chr:19pl3.3 與微管關聯之蛋白質r Hs.101174 Chr:17q21.1 假想蛋白質FLJ12910 Hs.15929 Chr:6q25.1 包含WW域之蛋白質1 Hs.355977 Chr:8q21 UDP-葡萄糖神經醯胺葡糠基轉移酶 Hs.432605 Chr:9q31 GREB1蛋白質 Hs.193914 Chr:2p25.1 96471 -59- 200526958 RNB6 " — Hs.241471 Chr:14q32.32 人類類胰島素生長因子1受體mRNA，3, 序列，mRNA序列 Hs.405998 — 白細胞間介素6訊號轉換器（gpl30,製瘤 素Μ受體） Hs.82065 Chr:5qll LAG 1長壽保證同系物2(S.壓縮啤酒釀 母） Hs.285976 Chr:lq21.2 鈣黏附素，EGF LAG七渡G型受體2(火 烈鳥同系物，果蠅） Hs.57652 Chr:lp21 成對基本胺基酸裂開系統4 Hs.170414 Chr:15q26 G-蛋白質訊號11之因子 1 Hs.65756 Chr:16pl3.3 UDP-葡萄糖神經醯胺葡糖基轉移酶 Hs.432605 Chr:9q31 NPD009蛋白質 Hs.283675 Chr:16pl3.2 V-myb成髓細胞血症病毒致癌基因同系 物（鳥類） Hs.1334 Chr:6q22-q23 白細胞間介素6訊號轉換器（gpl30,製瘤 素Μ受體） Hs.82065 Chr:5qll 圓盤，大(果蠅）同系物5 Hs.170290 Chr:10q23 人類mRNA ; cDNADKFZp434E082 (來 自純系 DKFZp434E082)，mRNA序列 Hs.432587 — 細胞色素P450，亞族IIB(魯米那誘導）， 多肽7 Hs.330780 Chr:19ql3.2 HSPC009蛋白質 Hs.16059 Chr:17q21 KIAA1025蛋白質 Hs.4084 Chr:12q24.22 蛋白質酪胺酸磷酸酶類型IVA，組員2 Hs.82911 Chr:lp35 CGI-49蛋白質 __ Hs.238126 Chr:lq44 染色體20開啟讀取框架35__ Hs.256086 Chr:20ql3.11 佛波醇-12-十四烷酸酯-13-乙酸誘導之 蛋白質1 __ Hs.96 Chr:18q21.31 KIAA0876蛋白質 _一 Hs.301011 Chr:19pl3.3 假想蛋白質FLJ20152 ___- Hs.82273 Chr:5pl5.1 假想蛋白質FU22318 ___ Hs.22753 Chr:5q35.3 三葉草因子1(乳癌，雌激素誘導之序列 表現於其中） __一^ Hs.350470 Chr:21q22.3 聚合酶(受DNA指導），δ4 ____ Hs.82520 Chr:llql3 推定脯胺酸4-羥化酶 ___ Hs.348198 Chr:3p21.31 GDNF族受體αΐ ____— Hs.105445 Chr:10q26 ERBB2+分子亞型 ____ 氣化物通道，經鈣活化，族組員色__^ Hs.241551 Chr:lp31-p22 v-erb-b2成紅細胞白血病病毒致癌暴因 同系物2，獲自致癌基因同系物（鳥類） 之神經/成膠質細胞瘤 ___一- Hs.323910 Chr:17qll.2-ql2 經生長因子受體結合之蛋白質7 ____ Hs.86859 Chr:17q21.1 96471 -60- 200526958 雙專一性磷酸酶6 Hs.180383 Chr:12q22-q23 包含3之START域 Hs.77628 Chr:17qll.ql2 瞬時受體電位陽離子通道，亞族V，組 員6 Hs.302740 Chr:7q33-q34 S100鈣結合蛋白質A8(鈣粒蛋白A) Hs.100000 Chr:lq21 蛋白質磷酸酶1，調節（抑制因子）亞單位 1A Hs.76780 Chr:12ql3.13 成纖維細胞生長因子受體4 Hs.165950 Chr:5q35.1-qter SRY(性決定區域Y)-盒11 Hs.32964 Chr:2p25 未知蛋白質[人類]，mRNA序列 Hs.106642 — 分裂1之類轉導蛋白強化因子(E(spl)同 系物，果蠅） Hs.28935 Chr:9q21.32 假想基因MGC9753 Hs.91668 Chr:17q21.1 促分裂素活化之蛋白質激酶激酶激酶5 Hs.151988 Chr:6q22.33 KIAA1102蛋白質 Hs.202949 Chr:4pl3 脂肪酸羥化酶 Hs.249163 Chr:16q23 轉錄因子ΑΡ-2β(活化強化因子結合蛋 白質2β) Hs.33102 Chr:6pl2 S100鈣結合蛋白質Α9(鈣粒蛋白Β) Hs.112405 Chr:lq21 脂肪酸輔酶Α連接酶，長鏈2 Hs.154890 Chr:4q34-q35 假想蛋白質FLJ22671 Hs.193745 Chr:2q37.3 犬尿胺酸3-單加氧酶（犬尿胺酸3-羥化 酶） Hs.107318 Chr:lq42-q44 KIAA0644基因產物 Hs.21572 Chr:7pl5.1 天冬胺酸β-羥化酶 Hs.283664 Chr:8ql2.1 電子傳遞黃素蛋白，α多肽(戊二酸酸尿 II) Hs.169919 Chr:15q23-q25 分泌白細胞蛋白酶抑制因子（抗白細胞 蛋白酶） Hs.251754 Chr:20ql2 異檸檬酸脫氫酶1(NADP+)，可溶 Hs.11223 Chr:2q33.3 苯乙醇胺Ν-甲基轉移酶 Hs.1892 Chr:17q21-q22 假想蛋白質FLJ14146 ' Hs.103395 Chr:lq42.11 墨角藻糖基乳糠3(半乳糖苷3(4)-L-墨角 藻糖基乳糖，包括Lewis血型） Hs.169238 Chr:19pl3.3 角蛋白，頭髮，鹼性，1 Hs.32952 Chr:12ql3 包含2之PDZ域 Hs.173035 Chr:5pl3.3 精胺基琥拍酸合成酶 Hs.160786 Chr:9q34.1 特定顆粒蛋白質(28 kDa) Hs.54431 Chr:6pl2.3 人類 cDNA ·· FLJ21521 fis，純系 COL05880，mRNA序列 、” Hs.306777 — 犬尿胺酸酶(L-犬尿胺酸水解酿、 Hs.169139 Chr:2q22.1 假想蛋白質FLJ20539 一 Hs.118552 Chr:llql2.1 脯胺酸脫氫酶(氧化酶)1 .........— Hs.343874 Chr:22qll.21 96471 -61 - 200526958

v-mycf|細胞組織增生病毒相關之致癌 基因，成神經細胞瘤所得（鳥類） Hs.25960 Chr:2p24.1 整合素，β6 Hs.57664 Chr:2q24.2 假想蛋白質MGC3077 ' Hs.433404 Chr:7pl5-pl4 解偶聯I白質2(線粒^體，質子載體) Hs.80658 Chr:llql3 肌球蛋白X Hs.61638 Chr:5pl5.1-pl4.3 角蛋白7 ' '~ Hs.23881 Chr:12ql2-q21 類固醇硫酸酯(微粒體），芳基硫酸酯酶 C，同工酶S Hs.79876 Chr:Xp22.32 包含1之甲酸精同源2域 Hs.95231 Chr:16q22 ATP結合盒，亞族C(CFTR/MRP)組員3 Hs.90786 Chr:17q22 軟骨素βΐ，4N-乙醯基胺基半乳糖基轉 移酶 Hs.11260 Chr:8p21.3 ΚΙΑΑ0485蛋白質 ' Hs.89121 類 Kraken Hs.301947 Chr:22ql3 膠原質，XIII型，ocl Hs.211933 Chr:10q22 ER-分子亞型 角蛋白16(病灶非表 皮松解掌疏角皮症） Hs.432448 Chr:17ql2-q21 γ-胺基丁酸(GABA)A受體，pi Hs.70725 Chr:5q33-q34 TONDU "" " Hs.9030 Chr:Xq26.3 角蛋白6B Hs.432677 Chr:12ql2-ql3 絲胺酸(或半胱胺酸)蛋白酶抑制因子， 進化枝B(卵清蛋白），組員5 Hs.55279 Chr:18q21.3 角蛋白5(單純性大皰性表皮鬆懈症， Dowling-Meara/Kobner/Weber-Cockayne 類型） Hs.433845 Chr:12ql2-ql3 SRY(性決定區域Y)-盒1〇 Hs.44317 Chr:22ql3.1 黑色素瘤抑制活性 Hs.279651 Chr:19ql3.32-ql3.33 基質金屬蛋白酶7(基質分解素，子宮） Hs.2256 Chr:llq21-q22 分泌型捲曲相闢（frizzled-related)之蛋 白質1 Hs.7306 Chr:8pl2-pll.l B細胞CLL/淋巴瘤11A(鋅指蛋白質） Hs.130881 Chr:2pl5 人類 cDNA FLJ11796 fis，純系 HEMBA1006158，高度類似於人類轉錄 因子類叉頭7(FKHL7)基因，mRNA序列 Hs.284186 — 溶質載體族6(神經遞質轉運蛋白），組員 14 Hs.162211 Chr:Xq23-q24 Desmuslin Hs.10587 Chr:15q26.3 据齒狀同系物1 Hs.271977 Chr:2ql3-q21 核糖體蛋白質，大P2 Hs.153179 Chr:llpl5.5-pl5.4 包含三部分模體之29 Hs.82237 Chr:llq22-q23 類調鈣蛋白之皮膚蛋白質 Hs.180142 Chr:10pl5.1 橋粒芯膠蛋白2 Hs.239727 Chr:18ql2.1 96471 -62- 200526958 ropporin、rhophilin關聯之蛋白質 Hs.194093 Chr:3q21.1 晶狀體蛋白，ocB Hs.391270 Chr:llq22.3-q23.1 包含三部分模體之2 Hs.12372 Chr:4q31.23 表皮生長因子受體（成紅細胞白血病病 毒(v-erb-b)致癌基因同系物，鳥類） Hs.77432 Chr:7pl2 富白胺酸酸性核内蛋白類似物 Hs.71331 Chr:lq21.2 鉀通道，亞族K，組員5 Hs.127007 Chr:6p21 激肽釋放酶5 Hs.50915 Chr:19ql3.3-ql3.4 前膠原C-肽鏈内切酶強化因子2 Hs.8944 Chr:3q21-q24 假想蛋白質[人類]，mRNA序列 Hs.66762 — LIM域，僅4 Hs.3844 Chr:lp22.3 角蛋白17 Hs.2785 Chr:17ql2-q21 橋粒芯糖蛋白3 (天疱瘡尋常抗原） Hs.1925 Chr:18ql2.1-ql2.2 角蛋白6A Hs.367762 Chr:12ql2-ql3 唾液酸轉移酶8 Α(α-Ν-乙醯基神經胺酸 Hs.82527 Chr:12pl2.1- 酉旨：α-2,8-唾液酸轉移酶，GD3合酶） pll.2 類Kruppel因子5(腸内） Hs.84728 Chr:13q21.32 Rho鳥嘌呤核苷酸交換因子(GEF)4 Hs.6066 Chr:2q22 激肽釋放酶6(甘油磷酸鈣，酶） Hs.79361 Chr:19ql3.3 前列腺素-内過氧化物合酶2(前列腺素 G/Η合酶及環加氧酶） Hs.196384 Chr:lq25.2-q25.3 染色體20開啟讀取框架42 Hs,180479 Chr:20pl2.3 糖蛋白M6B Hs.5422 Chr:Xp22.2 尿苷磷酸化酶 Hs.77573 Chr:7 Ladinin 1 Hs.18141 Chr:lq25.1-q32.3 多形態腺瘤基因類似物1 Hs.75825 Chr:6q24-q25 橋粒芯膠蛋白3 Hs.41690 Chr:18ql2.1 人類 cDNA FLJ30869 fis，純系 FEBRA2004224，mRNA序列 Hs.349611 — 類似於HRAS之抑制因子 Hs.36761 Chr:3q29 半胱胺酸及富步胺酸蛋白質2 Hs.10526 Chr:12q21.1 瘙癢病反應蛋白質1 Hs.7122 Chr:4q31-q32 澱粉樣蛋白β(Α4)前驅體蛋白質結合， 族A，組員2(Χ11類似物） Hs.26468 Chr:15qll-ql2 急沖同系物類似物（小鼠） Hs.105940 Chr:llq21 轉化生長因子，α Hs.170009 Chr:2pl3

表S6 :屬於ΝΡΙ-ES之基因（62個基因） DC 13蛋白質為可在Rosetta 70個基因之”預後π簽名 (PES，見正文）中配對的ΝΡΙ-ES之唯一基因，其中42個存在 於 AffymetrixU133A晶片内。 96471 -63 - 200526958 基因描述 單基因 生物過程(GO) 陽性基因（60)(高度表現於 高NPI腫瘤中） _ 腺苷酸轉磷酸核糖基酶 Hs.28914 9116//核苷新陳代謝//擴展：自 電子注釋推斷；Pribosyltran ; 5 e-44 MCM4微染色體保持缺乏 4(S.壓縮啤酒釀母） Hs. 154443 6260//DNA複寫//預測/計算 核酸外切酶1 Hs.47504 6310//DNA重組//實驗證據 //6281//DNA修復//實驗證據 //6298//錯誤配對修復//預測/計 算 類似於金屬硫蛋白1H之蛋 白質[人類]，mRNA序列 Hg.367850 — 人類，純系IMAGE : 5270727，mRNA，mRNA序 列 Hs.319215 — DC 13蛋白質 Hs.6879 — HSPC037蛋白質 Hs.433180 — H2A組蛋白族，組員Z Hs.119192 — 圓盤，大同系物7(果蠅） Hs.77695 7267//細胞一細胞訊號//擴展： 未知；GKAP ; 2.1 e-05 RNA解螺旋酶相關之蛋白 質[人類]’ mRNA序列 Hs.381097 — 驅動蛋白類似物1 Hs.8878 7067//有絲分裂//實驗證據 ///7052//有絲分裂紡錘體總成// 實驗證據 染色體20開啟讀取框架1 Hs.9329 7067//有絲分裂//預測/計算 ///8283//細胞增殖//預測/計算 KIAA0095基因產物 Hs.155314 — 解螺旋酶，淋巴特定 Hs.203963 — 相似盒HB9 Hs.37035 6959//體液免疫反應//實驗證據 ///6357//自Pol II促進子之轉錄 調節//預測/計算///73 45//胚胎 發生及形態發生//實驗證據 染色體X(獨特）9879上的 DNA片段表現序列 X Hs.18212 — MAD2有絲分裂阻止缺乏類 似物1(酵，菌） Hs.79078 7067//有絲分裂//預測/計算 ///7093//有絲分裂檢測點//實驗 證據

96471 -64- 200526958 真核翻譯起始因子4E結合 蛋白質1 Hs.433317 6445//翻譯之調節//預測/計算 組織蛋白酶C Hs.10029 6508//蛋白質水解及肽分解//未 記錄///6955//免疫反應//實驗證 據 H2B組蛋白族，組員J Hs.249216 — 蛋白質降解體(前體，類巨蛋 白質（macropain))亞單位，β 類型，8(大的多功能蛋白酶 7)) Hs. 180062 6508//蛋白質水解及肽分解//未 記錄 假想蛋白質FLJ20105 Hs.89306 — 染色體10開啟讀取框架3 Hs.14559 — 不典型骨髓蛋白質ΒΜ039 Hs.283532 — 富小鼠基因群集之可能直向 同源基因，C8基因 Hs.30114 — 細胞分裂循環2，G1至S及G2 至Μ Hs.334562 74//細胞循環之調節//未記錄 ///7089//有絲分裂細胞循環之 起始對照點//未記錄 金屬硫蛋白2Α Hs.118786 6878//銅内穩態//預測/計算 類比蛋白質（geminin)，DNA 複寫抑制因子 Hs.234896 7050//細胞循環停止//預測/計 算///8156//DNA複寫之陰性調 節//預測/計算 低密度脂蛋白受體相關之蛋 白質8，載脂蛋白，受體 Hs.54481 7165//訊號轉換//預測/計算 ///6629//脂類代謝//預測/計算 血液學及神經學表現之1 Hs.109706 — H1組蛋白族，組員2 Hs.7644 — nudix(核苷二磷酸連接之部 分X)類型模體1- Hs.388 6979//對氧化性壓力之反應//預 測/計算///62 81 //DN A修復//未 記錄 金屬硫蛋白IX Hs.374950 — H2B組蛋白族，組員T Hs.247817 — Tetraspan 1 Hs.38972 8283//細胞增殖//未記錄 ///8583//神秘細胞命運差異 〇611811果蠅)//預測/計算//7155// 細胞黏附//未記錄///6928//細胞 運動//未記錄 金屬硫蛋白1H Hs.2667 — H3組蛋白族，組員K Hs.70937 --- 核糖核苷酸還原酶Μ 2多肽 Hs.75319 — -65- 96471 200526958 包含桿狀病毒IAP重複之 5(生存蛋白質） Hs.1578 86//G2/有絲分裂細胞循環之M 轉換//實驗證據///7048//腫瘤發 生//預測/計算///6916//抗細胞 凋零//實驗證據 F盒，僅蛋白質5 Hs.272027 6508//蛋白質水解及肽分解//預 測/計算 絲胺酸（或半胱胺酸)蛋白酶 抑制因子，進化枝Α(α-1抗蛋 白酶，抗胰蛋白酶），組員1 Hs.297681 — 與溶菌酶關聯之蛋白質橫跨 膜4β Hs.296398 — 向化性激動素(C-X3-C模體） Hs.80420 7165//訊號轉換//實驗證據 ///6954//炎症反應//未記錄 ///6935//趨化性//實驗證據 ///6955//免疫反應//未記錄 ///7155//細胞黏附//實驗證據 ///7267//細胞一細胞訊號//實驗 證據 CD27-結合(Siva)蛋白質 Hs.112058 8624//由細胞外訊號之細胞凋 零之誘導//預測/計算///6952// 防禦反應//預測/計算 LGN蛋白質 Hs.278338 7186//G-蛋白質偶合之受體蛋 白質訊號路徑//預測/計算 小鼠乳房腫瘤病毒受體同系 物1 Hs.18686 — 叉頭盒Ml Hs.239 6366//自Pol II促進子轉錄//實 驗證據///6979//對氧化性壓力 之反應//實驗證據 Met原癌基因（肝細胞生長因 子受體） Hs.316752 7048//腫瘤發生//實驗證據 //8283//細胞增殖//預測/計算 ///7165//訊號轉換//預測/計算 丁醯蛋白，亞族3，組員A2 Hs.87497 — SBBI26蛋白質 Hs.26481 — 小氣She SH2-域結合蛋白質 1之可能直向同源基因 、 Hs.123253 — H3組蛋白族，組員B Hs.143042 — 三葉草因子3(腸内） Hs.82961 6952//防禦反應//預測/計算 ///7586//消化//預測/計算 免疫球蛋白λ基因座 Hs.405944 — DNA複寫因子 Hs.122908 — -66- 96471 200526958

FDR，>—2倍改變）。此等基因之45個（66%)亦屬於分類

人類CDNAFLJ30781 fis，純 系 FEBRA2000874，mRNA 序列 Hs.301663 — 向化性激動素（C-C模體）配 位子18(肺部及活化調節） Hs.16530 7165//訊號轉換//實驗證據 ///7154//細胞通訊//預測/計算 ///6935//向化//實驗證據 ///695 5//免疫反應//預測/計算 ///6960//抗微生物體液反應 (sensu無脊椎動物)//預測/計算 ///9607//對生物刺激之反應//預 測/計算///7267//細胞-細胞訊號 //實驗證據 免疫球蛋白K常量 Hs.406565 — Ty 4同系物1之抑制因子（s. 壓縮啤酒釀母） ’ Hs.79058 6355//轉錄調節，DNA-依賴// 預測/計算///6357//自Pol II促進 子之轉錄//預測/計算///63 3 8// 染色質模型//預測/計算 父方表現之10 Hs.137476 — 陰性基因（2)(高度表現於低 NPI腫瘤中），BTG族，組員2 Hs.75462 828 5//細胞增殖之陰性調節//預 測/計算///6281 //DNA修復//預 測/計算///6976//DNA損壞反 應，p53之活化//預測/計算 細胞色素P450，亞族ιντ , 多肽8 ' Hs.268554 6118//電子傳輸//擴展：未知； p450 ; 1.9e-142///6693//前列腺 素代謝//預測/計算 表S7 ·行SAM以識別與等級顯著關聯之68個基因（14%之 96471 -67 - 200526958

H2A組蛋白族，組員Z YES DNA複寫因子 YES MCM4微染色體保持缺乏4(S·壓縮啤酒釀母） YES 圓盤，大同系物7(果蠅） YES ZW10相互作用因子 MAD2有絲分裂阻止缺乏類似物1(酵母菌） YES 金屬硫蛋白1H類似蛋白[人類]，mRNA序列 YES 染色體10開啟讀取框架3 YES 核糖核苷酸還原酶Μ 2多肽 YES 細胞分裂週期2，G1至S及G2至Μ YES 叉頭盒Ml YES 不典型骨髓蛋白質BM039 YES 解螺旋酶，淋巴特定 YES RNA解螺旋酶相關之蛋白質[人類]，mRNA序列 YES 金屬硫蛋白IX YES 人類，純系IMAGE:5270727，mRNA，mRNA序列 YES 金屬硫蛋白2A YES 金屬硫蛋白1H YES KIAA0095基因產物 YES 包含桿狀病毒IAP重複之5(生存蛋白質） YES 類比蛋白質（geminin)，DNA複寫抑制因子 YES Zeste同系物2之強化因子（果蠅） 組織蛋白酶C YES nudix(核苷二磷酸連接之部分X)類型模體1 YES 假想蛋白質FLJ10719 向化性激動素(C-X3-C模體）配位子1 YES Tetraspan 1 YES 早期細胞凋亡蛋白酵素(proapoptotic caspase)調適因子或蛋白質 免疫球蛋白λ基因座 YES Η2Β組蛋白族，組員J YES 三葉草因子3(腸内） YES CD27-結合(Siva)蛋白質 YES 局部異構酶(DNA)II a 170kDa 免疫球膽白λ接合3 真核翻譯起始因子4Ε結合蛋白質1 YES Η3組蛋白族，組員Κ YES

96471 -68- 200526958 向化性激動素(C-C模體）配位子18(肺部及活化調節） YES 溶菌酶關聯之蛋白質橫跨膜4β YES 小鼠乳房腫瘤病毒受體同系物1 YES LGN蛋白質 YES 免疫球蛋白□常量 YES 羧肽酶Β1(組織） met原癌基因（肝細胞生長因子受體） YES H2B組蛋白族，組員T YES RAB38，組員RAS致癌基因族 H1組蛋白族，組員2 YES 來自EUROIMAGE 2021883之假想蛋白質 載脂蛋白BmRNA編輯酵素，催化多肽類似物3B H3組蛋白族，組員B YES 免疫球蛋白重常量y3(G3m標示物） 類似於bK246H3.1(類似於免疫球蛋白λ的多肽1，前B細胞特定） 免疫球蛋白λ輕鏈[人類]，mRNA序列 免疫球蛋白□輕鏈變數區域[人類]，mRNA序列 絲胺酸（或半胱胺酸)蛋白酶抑制因子，進化枝Α(α-1抗蛋白酶， 抗胰蛋白酶），組員1 YES 蛋白脂質蛋白質1(髓鞘蛋白編碼基因缺陷病，痙攣截癱2，不複 雜） 鈉通道，非電壓門控之1，β(徵候群） Η4組蛋白族，組員Η 多配體蛋白聚糖2(硫酸類肝素蛋白多糖1，細胞表面關聯，纖維 多糖） 神經菌毛素(NRP)及tolloid(TTL)類似物2 等級3腫瘤中向下調節之基因 假想蛋白質FLJ22418 魯米那A 魯米那C 低 NPI-ES 30 0 高 NH-ES 2 10 -69- 96471 200526958 表Sll :具有高及低ΝΡΙ-ES表現之魯米那A及魯米那C腫 瘤的相關性（魯米那腫瘤係基於Sorlie等人之結果（2001)而 得以識別） 表S12 :然後將各個群死亡數字（5年後）製表，如下：

H->H H->L L->L L->H 總數 6 4 10 N/A 死亡 4 0 3 N/A AWD* 1 0 2 N/A AWD* :帶病活著 表S13 :預後組與Rosetta 231基因之間重疊的基因 登記# 相關性 基因名稱 描述 NM_020188 -0.40007 DC13 DC13蛋白質 NMJ)01168 -0.33813 BIRC5 包含桿狀病毒IAP重複之5(生 存蛋白質） NM 一006763 0.345013 BTG2 BTG族，組員2 NM—012177 -0.32571 FBX05 F盒僅蛋白質5 NM一013296 -0.30129 HSU54999 LGN蛋白質 Contig41413一RC -0.30837 RRM2 核糖核苷酸還原酶M2多肽 NM—018455 -0.33103 BM039 不典型骨髓蛋白質BM039 NM—002358 -0.30251 MAD2L1 MAD2(有絲分裂阻止缺乏，酵 母菌，同系物)類似物1 96471 70- 200526958 画 S14:)inn埘^lfJNPI{t;t_snl<5ssllIis銥薛(^NPI-ES) N 嫌緬瓣韋 UID NAME 2GQ0220 980278 2SG597 2GG06S 2002G071 20020160 20QG787 200081 8 20020051 2002005^ 9801VO7 必80261VO803VD1 2000768 200077VPVDVD0H23 2000 办 22 2000683 2000775 200080办 9803 办 6VOQ03CD3 990082 980177 980178 980403 980434 990075 990113 990107 980208 980220 980221 990375 ΝΡΙ 7·2 6.8 3.8σ»·4 浴·56 ^ ^U12UJNJσ>u>、 5.6 3·3 3.4 5·1 7,1 6·26ί^- η 3·5 6·8 办-4 3·6 办σνοοmultocn」必 办cn 4·ίησ>υΊ川，Q>LJ,00 6·5 3.7办 ⑦u)2,3 f 2§853—at = H2A^_5FisMΜ" -0.1454 1.29 to.2888 -P1469 0·3389 1.274 0-3970%—HQ25 0.7639 ~0·7213 1.395 -0·S183 -0·1454 1·481 1.149 1,102 1·105 -0·9016 -0·2015 0·6147 0·9351 0.3702 -0·78 0.7502 -0·1024 1.684 Ρ4969 0.5195 ~Ρ319 0·1196 0.7886 -0·002354 *0·2928 -0.072仍 201236丨 slat = BTG 澈，聲»2 = -0.006272 0 · 5032 0.9142 丨0.1329 0 · 7774 0 · 2717 — 0·3218 P9 -0·4893 2·126 -0.2778 1·747 1 - 955 Ρ1703 -PG9297 -Ρ8116 Ρ2803 1.573 -0-4571 CK2552 P52S 0.8867 0·5263 0.278 0·6472 1.15Β 0Η387 —0·09749 0.415(^Η,328 0.443 办 1.355 0.3473 0.866 2014slslat 4y 4 画漸？ 2,¾產画屮(S. _諮#適疆#、0.6097 1.482 -0.S74 1.187 1.81801.9257 0·2263 0.4099o_7sg 0·603 -0.8021 P4711 0·8151 1.052 Ρ8867 Ρ6619 —ο· 70003 *0 .α\52 2 1.6 二，372 -0·8661 -1,684 1.396 0.4893 1.347 -0.3128 -0.5101 -0·09044 Ρ4318ί 2·904 P447S -0·391 7 0.01991 S1487lat 諮藥脚瓜躍。 0.07473 -0·138 -0.7108 10-2718 0.6703 1·105 0_9386 *Ρ274 3 I 0.9838 -0.77S9 0.2844 -1·244 -Ρ8704 2.864 -1.201 1·285 0·546 -Ρ9224 1·085 0.1034 ,0,2643 -1_447 -1·158 1.502 Ρ4309 0.9151 -P65S2 Γ012 -0.6763 ‘1.624 1.46 -Ρ292 -Ρ01074 -Ρ688 201890—at 歲離琪 _摄__ 驛 Μ2^萍 7399 Ο · 9706 -ρ 3813 ? 1577 ρ 621 Ρ8083Ι Ο ,74S6 —α1·399 96471 -71 - 200526958 0.274cn 3bVD 2·225 4·768 0,8987 2·563 2s362lslat 丨p'4871 丨一·972 1.54办 1 1.1οοσ\ -0· 0S55 203510—at —丨2.481 0.4437 -3.992 •2.182 —3·493 丨2-429 -0·52<ηνο ,0.762•l.s 丨一·078 2.707 丨ο,2308 -1·办18 丨0.1188 0.5393 -1.519 4.702 — 0·02002 丨 0.155 丨 0·27 办一 丨 0_765σ\ 丨0.2613 2·903 -1.03办 1·438 1.036 -Ρ8522 PS64 0.1556 -0.1722 1·08 0.6807 0.294CTIMgm 丨 0·8345 1·333ο. 09134 丨Ο , 4979 -Ο · 4036met_il_s (串罃菡许一屮滩II) 0.652σ\_fo办 1.427 -2.922 0.8314 -1.178 -2·988 -3.039 —0。5372 丨 1.026 ΓΗ-2·892 -2.466 0.4109 0·7607 -2.821 2.2S6 丄，419 —0·4761 0·82办 0.04571 0.743 0.8446 -Ρ009848 -3·205 1.153 -0·6422 2·755 9 i.7857 丨0.5155 2021slat KIAA0095tMIa陳蓉 -1.796 办 I —1.711 0·679 il.065 1.582 -Γ575 -0.9S11 P02638 1.178 0.9636 rs ⑺ —1.106 2·364 2·902 1.597 2-523 2.11 -1·Β44 -0·00351 1,418 202580丨 xlat xa^Ml *0 · 6508 Ο 6023 丨 3.15201.4569 -2.362 0.1443 Ρ08023 丨 0.4678 Ρ5005 0·957 0·422 丨 3·办一办 0·35σι办 0.2VO76 Ρ2955 —plls 0.1o57cn0.120VD丨 Ρ427 0·719 202833—sfat粱薄賻(妈ig»隳)§11>驟苕堑团$ 丨一·537 -1·016(a —l^mnl·驟， — 0.8S83 丨 0·νο27 办 _1·361 1.912 CK555S Ρ6537 0·6001<Λ •0.4871 0.6170^ 丨3-458 -3,411 丨Ο.7238 丨f735 P190S 0.7446 0.1633 丨 0.519 0.667VX)0u)2a>办 2.314 二_991 -1·6ο3 ◦ •2826 丨 0.00772U? 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10.3577 广 0S 丨0.112办 1.176 217755 art 0.8Β06 rH _f 079 —0 丨0.6689 丨Η 丨3.685 -1.842 21 办 7603 0.2901 0.32:7办 21521办 8 , 0.79 —2·903 0.2801 217165 -3 丨一 xfiurr 1· -3 丨一 at 丨丨一 丨0 — 2 x—o)tMo 丨ϋ6_势#^«翁.谢緬Ν1 办 51 丨 2.227 σΝσν2^ 072 办In 315 丨一.109 丨一.2600 0,^835 —0.6899 1·83 办 丨 P8228 -1.369 -0 · 5914，1 · 336 0-^527 2.207 0·办VOB3 0.^566 丨0·75办8 丨1.657 1.37办 丨0.45办 丨0.786 0.1189 丨Ikl —0.1253 ·0·2259 Ρ6493 :RNA 载鐮漆 ϋ^ιϋ®ή»·〔Λ邏〕'曰 ΚΝΑ4Φ¥ : 67S 丨一.835 〇_9o58 661 -2.847 004 丨一·165 Ρ07506 -2,92冷洛祺Μήκ碑_ 006 丨0.6827 3.8S 207 —5.152 0·4289 3·οο1σ\ 058 -1_8 丨 Ρ498σ\ 575 -1.786 3.89s „3.171^)^'^Μπ>·λ^0Μ 277 —0·0σ\673 办.293 235 —5.33 -1.0087c^.318 6081 丨0·107 1.506 2S3 0.8081 -1.60Β 丨3·416 -1.S4 b.s783 丨 0.7629 0·2533 5·034 -0.6S9 2.871 1·23(λ Ckl 办VD办 丨3.169 丨一.7002 3·938 i-9318 Γ67办 -1·158 — 0·5 办 73 —1·5 办Vo 丨 1·2νο6 丨一·718 0.0005709 丨一·03νο丨ο_οσ\3 0·6987 一：U083 i.08697 — 0.3062 I0.325VO0CDU)89 ο,办办 98 1·392 -Ρ008794 0·1917 CK153 -Ρ2051 -0.9587 -1·194 το·7617 2.2s 丨 0.22s 0.7153 _3·191 0,2035 丨0.2512 丨 P118CJN 2.792 0.2932 -0·6751 0b69 0.71s 0.6163 1·399 丨 0.317(^0o\u)02 0.0875 0.2253 丨 0.17000oLnu>65 1,898 P5077 丨 0.089 _0·6486 0·209 2·066 3.115 ο·8651 3.404 -2.557 -2·812 2·236 丨ο‘σιο<Γ\ 丨Ikl 二.429 二 S3ονοσιΡ5704 0·05538 1·72 办 2,76νο丨 2.^300 96471 -78- 200526958 •P3947 P6783 -0.3655 -0.25^ 1 0·02172 丨？olnGS 10,0^3^ 21VO办 93—dt -0·642ϊ 1‘6S 0-003738 8 2-026 P0S786 Ρ282 办 1.013 -2.008 21955slslat 6 —f!21s 丨1,184 3.628 3,039 P03131 丨0.6S08 0.9633 丨 1.04VO 219cr\50lat 丨一·205 -1.188 0.8473 8 0·7382 0-1232 0.8186 220085—at 2 ·545 I 丨1 · SS4 2185办2— 丨2k9 0 ·4355 丨0.6S7 21887S丨 丨0·7599 0.70375 丨0·7371 2190S1 PJt 1 0.VD011 丨 1 -S3 0.7572 sβ>Γ1· Ϊ-102 pil 0.6787 0,5-119 CQ&irt fl 镒蝴m^FLJ2205 丨一·405 1·856 -1.826 —00391 0.3461 0·911 1·13 1·107 丨1.113 1·668 0.5107 Ρ2778 0.2186 -Ο · 4108 -Ο · 2544 -1 · 474 =赛 Ef#^1: l.i 2.117 0-4417 0.7085 丨 P0947S 2·603 丨Ρ9118 3.769 0.1243 -0·8211 0,06107 Ρ2847 2.418 l.scri办 b3 丨 0.07838uk 丨 0·7089 3靼 _#n_nh»BM039 1·107 丨 0.527办 丨 Ρ08562 丨0.4948 -0·5828 1.^83 0.2727 丨一•办 21 0.^901 丨 Ο .νοσι办 2 1·2σι9 -Ρ3574 -0·8402 i.2336 2.786 -P567 -0.436 2.663 3.131 -P5802 1.592 丨0.266-2 0.3197 i.9291 2.S01 -0·9848 -1.671 -0.6439 P9707 -P7248 P7535 1·691 丨0.307 — CK4748 -Ρ7022 -0·3944 -Ρ1505 2.926 2,196 — 1·σν»^8 —CK1838 丨 0·σ>26 办 0,1536 丨ΡΜ922 辩咏譴lols疼I»劳菡艏3 P8353 —3·057 1·639 0.01222 0·5653 ο·314νοο·9069 0.75s 0*9998 丨Ο ·01727 i-1458 0.0329 -0·206σΑ-ρ32 0·9562 丨 1,54 私 F 咏{1_11>鹏5 0·1373 0.4371 -CK2461 丨0.5123 2.342 fo.7147 *0.04562 1.172 0·3008 1·113 0.2788 fo.s 办 52 0·99νΔ3 丨 0·3711 0.80006 oG^crl<m丨ο ·浴03012辩咏 IS X (篛靠)9879 嫌緬^^SDNA it 萍 1,636 1.591 0-3603 -0.1915 Ρ8592 -1.293 Ρ2111 2·012 0·1617 1·074 0.2486 1·981 1·841 Γ55 0·5562 -Ρ3898 丨Ο 3224ZKpsshc SH2S都n>_nh»1 ;t£J雜：1亙画識_図 P2368 ·ο·270σ\ιο·36£ 丨0.00424办 0.6165 丨0·5506 0·ιπ996 丨oCDm办办 0.7631 1·2 丨 Ρ3σ>76 ο·3326 1.085 0-σ\533 0·σ\225 0,0067s 丨 2·121 丨 lk3 0.1001 0.403 P6261 -0.5B5 0·νο27 0·办办 7CTI 0·3727 1.4s 0·3νο35 0·027σ\ 丨 0·1069 _0·α\2σ\ 0·7738 0.8823 -Ο·3105 丨Ο - 2223 Ο - 2337 ,1·406 0·6297 1」92 96471 -79- 200526958 10-6154 -0.6666 -1.443 0.9973 1·975 3.076 3,464 2.717 -ρ6921 -0·3206 -0.6188 2·428 2·27 丨一.005 0.98S -0.4835 2*768 2*083 ,0 · 9158 —ο , 3327 —ο * 8196 3 · 488 -1·969 -0·8297 —CK094CTV 220238is—at SBBI _nl·®-0.5356 -1·869 0.2827 0·4126 1-225 Γ143 0.855 -0.50S 7 0.01481 -2·392 丨 0.788VO 0.06984 -1·5 -0.04597 -0.1081 -0·1832 02539 -4·754 -0·8441 -0.2432 1 · 218 i.8203 -4.S9S 1·751 -Ρ1621 Ρ3076 Ρ3174 -0.1157 -Ρ4725 -3·034 -4.34S -3_132 1 ·094 -0.S442 221436jslat --贓、> PS 図辘»Ν£)鸹一LI 画__囡，C8 = -0.0811 1.38s i.414 5 丨 1.59^ 0.7122 1·22 -0·1976 -2.491 0·9193 -2,686 广 Η46 Ρ3385 -Ρ1127 1·256 0.8854 Ρ3978 1.538 —0.148 1 0·1661 2.272 0.9145 0.5171 -2·271 Γ161 1.425 1.627 1·09 1·094 0.0009523 -0·1412 Ρ929 -0·781 3 丨一·46 丨一·893 221521—slat Η3ρδ37_©^0 · 5415 0 · 9347 -0 · 2726 -1.719 2 · 054 0.7876 1,801 -0.146 办 μ·363 -3.6 1.422 1·45 -Ρ04945 0.04416 2.338 2·103 2·45 -1.793 0·377 2.219 Ρ3689 0·1082 -0.27公 1 1·391 1.063 3·74 1·458 1.522 1.135 0.ΙΠ133 2.025 0.00594 卬 Ρ3726 —0.2652 221s39—at i 琪黯徽席辞S414E 離0>_瓜鹏1 i· 07309 2.738 丨1，713 0.629办 丨 P158 1.168 0.05S6 -1.008 ά·1794 -1.094 -0·09421 -0 · 7066 -0 · 399 1 · 699 0.22^ 3.751 P7476 IP6211 丨 P8323 P4994 -P2218 -P5206 0.08783 广一一一 4·2 0·9997 0·104-σ\心-0·9075 -0·376 2 2.4办 丨 0_2S67 P160VO -0.2192 222037iat --AJIM^^IMAGE: 5270727,曰 RNA,曰 RNA^^j-， I 0·3059 1.569 0.3614— 0.8596 1.005 1.397 I 0·742 -2·4 仁μ·32 -3-674 1·354 —1-237 Ρ4627 1·613 0.441 Ρ8522 1-526 丨 Ρ22 办 8 0.9008 1.122 1.145 0.03042 P092S0.326 0.3462 1.7006 丨0.4235 1.052 丨0.2547 丨0 · 4347 0.194VDoosuivo丨oMlng 1 丨 0·58δ 96471 -80- 200526958 表S15 :該預後組基因之表現資料之平均值（μ)及標準偏 差（σ)的加權表決參數 探針jm 基因名稱 低-ΝΡΙ 高-ΝΡΙ 平均值 SD 平均值 SD 213892一s一 at 腺嘌呤轉磷酸核糖基酶 -0.4139 0.419865 0.5261 0.5756 212141 一 at MCM4微染色體保持缺乏 4(S.壓縮啤酒釀母） 0.05549 1.527753 1.012 0.771858 204603_at 核酸外切酶1 -0.7394 0.414899 0.3089 0.546392 21145 6一x一at 類似於金屬硫蛋白1H的 蛋白質[人類]，mRNA序列 -2.313 1.10771 -0.01816 1.061529 22203 7_at 人類，純系 IMAGE:5270727， mRNA，mRNA序列 -0.2248 1.360941 0.8596 0.648812 218447__at DC 13蛋白質 -0.7617 0.497934 0.3587 0.655529 221521_s_at HSPC037蛋白質 -0.04945 1.328055 1.422 1.13546 200853—at H2A組蛋白族，組員2 -0.2015 0.437181 0.7502 0.667011 203764_at 圓盤，大同系物7(果蠅） -0.518 0.626375 0.3234 0.711794 217165_x_at RN A解螺旋酶相關蛋白質 [人類]，mRNA序列 -1.315 1.126665 0.4527 1.042786 2〇4444_at 驅動蛋白類似物1 -0.7489 0.817308 0.6377 0.760632 210052__s__at 染色體20開啟讀取框架1 -0.3447 0.713083 0.7286 0.785951 202188—at KIAA0095基因產物 -1.065 0.858421 1.178 1.616733 220085一 at 解螺旋酶，淋巴特定 -0.6154 1.198542 2.083 1.619802 214614—at 相似盒HB9 -2.666 1.462508 0.2757 1.583945 219061—s_at 染色體X(獨特)9879表現 之序列上的DNA片斷 -0.1915 0.461491 0.6783 0.795975 203362—s—at M AD2有絲分裂阻止缺乏 類似物1(酵母菌） -0.7681 0.74839 0.6176 0.842842 221539—at 真核翻譯起始因子4Ε結合 蛋白質1 -0.6211 0.442172 0.229 1.408505 201487一 at 組織蛋白酶C -0.7759 0.729779 0.4309 0.950128 208546__x_at Η2Β組蛋白族，組員J 0.4872 1.894009 0.9474 1.009994 209040_s at 蛋白質降解體(前體，類巨 蛋白酶(macropain))亞單 位，β型，8(大的多功能蛋 白酶7) -0.7578 1.8346 0.588 1.159099 219650一 at 假想蛋白質FLJ20105 -0.7248 0.85837 0.5107 0.893847 2—18542一 at 染色體10開啟讀取框架3 -0.3654 1.305871 0.7584 0,82541 2195 55一s—at 不典型骨髓蛋白質ΒΜ039 -0.5802 1.164774 1.56 1.763962 221436—s—at 富小鼠基因群集之可能直 向同源基因，C8基因 -0.1481 1.137308 0.9679 1.10724 96471 -81 - 200526958 210559—s—at 細胞分類循環2，G1至S及 G2至Μ -0.2508 0.844298 0.7038 0.805354 212185一x一 at 金屬硫蛋白2Α -1.284 0.725732 0.1074 0.798804 218350_s__at 類比蛋白酶(geminin)， dna複寫抑制因子 -0.9141 0.51298 -0.06399 0.926376 208433_s_at 低密度脂蛋白受體相關蛋 白質8，載脂蛋白e受體 -1.55 1.219961 -0.2532 1.04719 217755一 at 血液學及神經學表現之1 -0.1708 0.614723 0.4835 0.951001 209398_at H1組蛋白族，組員2 -0.02843 1.093238 1.332 1.299819 204766—s—at nudix(核苷二磷酸連接之 部分X)類型模體1 -1.462 1.152307 0.6079 1.516876 208581 一x一 at 金屬硫蛋白IX -1.11 0.696985 0.1739 0.997649 209806一 at H2B組蛋白族，組員T -0.3533 0.961244 0.5906 0.913624 209114—at Tetraspan 1 -0.4002 1.24355 0.923 1.133855 206461—x—at 金屬硫蛋白1H -0.7782 1.051675 0.1177 0.916536 206110一at H3組蛋白族，組員K 1 -0.3704 1.40578 0.3631 1.411458 201890__at 核糖核苷酸還原酶M2多 肽 -0.8654 1.559316 0.3715 1.024143 202095—s一 at 包含桿狀病毒IAP重複之 5(生存蛋白質） -0.3761 1.515513 0.6679 1.21519 218875_s_at F盒僅蛋白質5 -0.5123 0.409105 0.6165 0.900364 202833一 s 一at 絲胺酸(或半胱胺酸)蛋白 酶抑制因子，進化枝Α(α-1 抗蛋白酶，抗騰蛋白酶）， 組員1 -0.7663 1.176481 0.5393 1.901084 208767—s一 at 溶菌酶關聯之蛋白質橫跨 膜4 β -0.5525 0.938047 0.5525 1.011665 203687_at 向化性激動素(C-X3-C模 體）配位子1 -2.375 1.081471 -1.073 1.154088 210792_x_at CD27-結合(Siva)蛋白質 -0.4151 0.800901 0.3786 1.230555 205240_at LGN蛋白質 -1.249 1.72051 1.297 1.446916 212484—at 小鼠乳房腫瘤病毒受體同 系物1 -0.3862 1.394896 0.2132 1.187908 2025 80一x—at 叉頭盒Ml -0.4973 1.022497 0.3564 1.104339 203 510一at met原癌基因（肝細胞生長 因子受體） -2.988 1.352621 -0.736 2.009295 212613—at 丁醯蛋白，亞族3，組員 A2 -1.563 1.383434 0.1766 1.475442 220238_s_at SBBI26蛋白質 -0.8441 1.574483 -0.04597 1.556341 219493_at 小鼠She SH2域結合蛋白 質1之可能直向同源基因 -0.5274 0.594225 0.282 1.007135 214472_at H3組蛋白族，組員B 0.1235 1.581567 0.8844 1.40927 204623—at 三葉草因子3(腸内） 0.2033 1.408904 1.662 1.554202 215214 一 at 免疫球蛋白λ基因座 -0.6629 2.409822 -0.107 2.500735 96471 -82- 200526958 209832_s_at DNA複寫因子 -0.4351 0.674077 0.5995 1.153719 213245_at 人類cDNAFLJ30781 fis， 純系 FEBRA2000874， mRNA序列 -0.02205 0.369593 0.3127 1.16657 209924一 at 向化性激動素(C-C模體） 配位子18(肺部及活化調 節） -0.8797 1.267438 0.003248 1.311969 214768_x__at 免疫球蛋白□常量 -1.158 1.997589 0.1494 2.246666 201483—s—at Ty 4同系物1之抑制因子 (S·壓縮啤酒釀母） -0.0874 0.541135 0.7686 1.030094 212094_at 父方表現之10 -2.245 1.918298 0.03678 2.405576 20123 6—s—at ΒΤϋ族，組員2 1.328 0.70948 0.2717 0.438693 210576_at 細胞色素Ρ450，亞族IVF， 多肽8 3.704 3.447008 -0.6011 0.891116 表L· 1 ·預後組基因之id的查找表格 NPI-ES 探針_ID GenBank 單基因 200853_at NM 一 002106.1 Hs. 119192 201483 一s—at BC002802.1 Hs.79058 201487一at NM—001814.1 Hs.10029 201890一at NMJ01034.1 Hs.753 19 202095—s—at NM—001168.1 Hs.1578 202188一at NM 一 014669.1 Hs.1 553 14 2025 80_x__at NM_021953.1 Hs.239 202833 一s—at NM_000295.1 Hs.297681 2033 62—s—at NM 一 002358.2 Hs.79078 203510—at BG170541 Hs.3 16752 203687—at NM_002996.1 Hs.80420 203764 一 at NM 014750.1 Hs.77695 96471 -83- 200526958 204444 204603 204623 204766 205240 206110 206461 208433 208546 208581 208767 209040 209114 209398 209806 209832 209924 210052 210559 210792 211456 212094 212141 212185 at NM_004523.2 Hs.8878 at NM_003686.1 Hs.47504 at NM_003226.1 Hs.82961 s_at NM_002452.1 Hs.388 at ΝΜ_013296·1 Hs.278338 at ΝΜ_003536·1 Hs.70937 x_at NM 一 005951.1 Hs.2667 s_at NM 一 017522.1 Hs.54481 x_at NM_003524.1 Hs.249216 x_at ΝΜ_005952·1 Hs.374950 s_at AW149681 Hs.296398 s_at U17496.1 Hs.180062 at AF133425.1 Hs.38972 at BC002649.1 Hs.7644 at BC000893.1 Hs.247817 s_at AF321125.1 Hs.122908 at- AB000221.1 Hs. 16530 s_at AF098158.1 Hs.9329 s at D88357.1 Hs.334562 x_at AF033 1 1 1.1 Hs.1 12058 X_at AF333388.1 Hs.367850 at BE858180 Hs.137476 at X74794.1 Hs.154443 x at NM 005953.1 Hs.1 18786

96471 -84- 200526958 212484 212613 213245 213892 214472 214614 214768 215214 217165 217755 218350 218447 218542 218875 219061 219493 219555 219650 220085 220238 221436 221521 221539 222037 at BF974389 Hs.18686 at AI991252 Hs.87497 at AL120173 Hs.301663 S_at AA927724 Hs.28914 at NM__003530.1 Hs.143042 at AI738662 Hs.37035 x_at BG540628 Hs.406565 at H53689 Hs.405944 x_at M10943 Hs.381097 at NM 一 016185.1 Hs.109706 s_at NM 015895.1 Hs.234896 at NM_020188.1 Hs.6879 at NM—018131.1 Hs.14559 s_at NM 一 012177.1 Hs.272027 s_at NM 一 006014.1 Hs.18212 at ΝΜ_024745·1 Hs.123253 s:at NM—018455.1 Hs.283532 at NM—017669.1 Hs.89306 at NMJJ18063.1 Hs.203963 s_at NM—018846.1 Hs.26481 s_at NM 一 031299.1 Hs.30114 s__at BC003 186.1 Hs.433 180 at AB044548.1 Hs.4333 17 at AI859865 Hs.319215

96471 -85- 200526958 20123 6 一 s—at NM 一 006763.1 Hs. 75462 210576—at AF 133298.1 Hs.268554 【圖式簡單說明】 圖1展示了藉由整體表現輪廓之偶發（sporadic)乳房腫瘤 之群集a)使用能展示基因表現中最高變化之最前面376個 基因的98個乳房腫瘤之未監督分級群集，b)使用該376個基 因之組的主組份分析（PC A)。類似分子成群可在如a)中觀察 到，c)使用SAM-409基因組的樣品之分級群集’其由在乳癌 亞型間被顯著調節之基因組成。SAM-409基因組中大約三 分之二的基因在ER+腫瘤中展示增加之表現。 圖2展示了與NPI相關聯之表現簽名（NPI-ES)的識別： a) 使用移動NPI臨限值來測定差別表現基因。可展示顯著 差別表現之基因（y軸）於各個臨限值（X軸）處得以識別。使用 4次傳遞差別調節基因之最高數目的臨限值， b) 使用NPI-ES的ER+樣品之分級群集。紅條指示了低 NPI(<4)之樣品；而藍條指示了高NPI之樣品， c) 使用NPI-ES的ER+腫瘤樣品之分類及預測置信度。樣品 根據其NPI值（X軸）而得以分類。使用加權表決以分類該等 樣品及基於Golub等人（13)計算得出之各個樣品（γ轴）的預 測力。預測力<〇·3之樣品分類被看作，’不確定”或”低置信度，， (灰色區域）。 圖3展示了比較ER+腫瘤上不同分類方案之預後力的 存活分析。綠線代表（aM&NPI、（b)低NPIES表現水平、或 低”預後"簽名（PES)表現水平，而粉線代表高水平。（a)藉由 96471 -86 - 200526958 經典NPI而被分層為”良好”預後（ΝΡΙ<3 ·4χ35個腫瘤）及”中 專’預後（NPI>3 _4)( 14個腫瘤）群之49個Rosetta ER+腫瘤。（b) 藉由NPI-ES而被分層為能表現NPI-ES之高（24個腫瘤）對比 低水平（25個腫瘤）之群的相同49個Rosetta ER+腫瘤。（c)藉 由70個基因”預後”簽名而被分別分層為”良好預後，，群（27個 腫瘤）對比”差預後，，群（22個基因）之相同49個Rosetta ER+腫 瘤。（句藉由NPI-ES而被分層為能表現NPI-ES之高（13個腫 瘤）對比低（33個腫瘤）水平之群的46個Stanford ER+腫瘤。 圖4展示了基於全部腫瘤（而不管亞型）使用44個基因之 組的腫瘤樣品之分類及預測置信度。 圖5展示了來自R0Setta資料集之基因表現資料的分級群 集。頂部）顯示腫瘤間類似性之樹狀圖。彩色編碼條將亞型 指示給對應基因簽名。左側）具有三種區別性基因群集之 276個基因的完全群集。注意某些ERBB2腫瘤似乎與ER+腫 瘤（紅條）隔離，但經仔細檢查與ERBB2+相關之基因的表現 (群集團clustergram之擴增）其被識別為ERBB2+。此歸因於 Rosetta微陣洌擁有比ERBB2亞型高得多的與ER+亞型相關 之基因的數目。 圖6展示了基於NPI-ES之表現水平的Rosetta ER+樣品（49) 之分級群集（62個基因中在Rosetta資料發現了 46個配對）。 該彩色條如圖2b中所定義。 圖7展示了 Stanford乳房腫瘤之群集。頂部）顯示腫瘤間類 似性之樹狀圖。彩色編碼條將亞型指示給對應之基因簽 名。左側）具有三種區別性基因群集之136個基因的完全群 96471 -87- 200526958 集。 圖8展示了使用ΝΡΙ-ES的Stanford46個ER+樣品之分級群 集（62個基因中31個配對）。彩色條如圖2b)所定義。

圖9展示了 ER-及ERBB2+分子亞型中ΝΡΙ-ES表現與NPI 狀態之間的關係。ER-及ERBB2腫瘤之NPI狀態通常高於 ER+腫瘤。不同於ER+腫瘤之情況，吾人不能夠藉由在ER-及ERBB2+亞型之高對比低NPI腫瘤内經差別調節之SAM基 因來識別。並且，ΝΡΙ-ES似乎亦不與其它分子亞型所關聯 之NPI值相關聯。 圖10展示了 20對樣品，其於14週阿黴素治療（Perou等 人，2000)”之前’’及’’之後”獲得。在20個”之前”樣品中，10 個樣品展示出高ΝΡΙ-ES表現水平（H)，且10個展示出低表現 水平（L)。在該等前10個樣品中，6個在化學治療後保持高 表現水平（H->H，以紅色描述），而4個在治療後展示出低表 現水平（H->L，以黃色描述）。

圖11展示出Kaplan-Meier無復發存活分析曲線，其使用捐 獻圖10之20個樣品的病人。 96471 -88-

Claims (1)

1. 200526958 十、申請專利範圍： 1 ·種劂疋乳癌病人之该預後的方法，該方法包括基於該 病人之乳房腫瘤内一預後組基因之表現水平將一預後指 派給該病人，其中該預後組包括來自表S6之至少5個基 因。 2. 如請求項1之方法，其中該預後組包括表％之至少ι〇個、 20個、30個、40個、50個、60個或全部基因。 3. 如請求項丨或2之方法，其進一步包括測定該腫瘤樣品之 雌激素受體（ER)狀態的步驟。 4. 如請求項3之方法，其進一步包括測定該腫瘤樣品之 ErbB2狀態。 5. 如請求項1或2之方法，其包括下列步驟： Ο)自該病人獲得一乳房腫瘤樣品；且 (b)量測該樣品内該預後組之該等基因的該等表現水平。 6·如請求項5之方法，其中步驟（b)包括以複數個結合組員接 觸自該樣品獲得之該等表現產物，該等結合組員能夠結 合至能指宁該預後組之基因之該表現的表現產物，其中 可量測此結合。 7_如請求項6之方法，其中該等結合組員為互補核酸序列或 特定抗體。 8. 如請求項^之$法，其包括將該乳房腫瘤樣品分類為 具有高NPI或低NPI之樣品，或分類為具有良好或不良預 後之樣品。 9. 如％求項1或2之方法，其中該指派一預後之步驟藉由將 96471.doc 200526958 來自該測試乳房腫瘤樣品之該表現輪廓與先前獲得之鈐 廓及/或一先前測定之表示一特別預後的標準輪廓進行比 較。 10.如請求項9之方法，其中該等先前獲得之輪廓係作為輪廓 之一資料庫而得以儲存。 1 11·如請求項丨或2之方法，其進一步包括比較治療前及治療 後該乳房腫瘤樣品内該預後組之該等表現水平，以偵測 能指示一改良預後或惡化預後之該表現輪廓的一改變。 12. —種將一預後指派給一乳房腫瘤樣品之裝置，該裝置包 括一附著有複數個結合組員之載體，各個組員能夠特定 及獨立地結合至一預後組基因中的一個基因之一表現產 物，其中該預後組包括來自表S6之至少5個基因。 13·如請求項12之裝置，其中該預後組包括表％之至少5個、 10個、20個、30個、40個、50個、60個或全部基因。 14·如請求項12或13之裝置，其中該載體已僅附著至能夠特 定及獨立地結合至表S 6中所識別之該等基因之表現產物 的結合組員。 15·如請求項或π之裝置，其包括一核酸微陣列，其中該 等結合組員為核酸序列。 16. —種將一預後指派給一乳癌病人之套組，該套組包括能 夠特定結合至一預後組基因之基因的表現產物的複數個 結合組員及一偵測試劑，其中該預後組包括來自表S6之 至少5個基因。 17·如請求項16之套組，其中該預後組包括表S6之至少1〇 96471.doc -2- 200526958 個、20個、30個、40個、50個、60個或全部基因。 18.如請求項16或17之套組，其進一步包括一資料分析工 具，其中該資料分析工具為一電腦程式。 19·如請求項18之套組，其中該資料分析工具包括一演算 法，該演算法經調適以辨別具有不同預後之腫瘤的該等 表現輪扉。 20_如請求項16或17之套組，其包括來自具有已知預後之乳 房腫瘤樣品的表現輪廓及/或表示一特別預後之特徵的表 現輪廓。 21·如請求項16或17之套組，其包括如請求項12至15中任一 項之裝置。 22·如請求項16或17之套組，其包括能夠結合至該預後組之 該等基因之該等表現產物的核苷酸引子，使得其可於一 PCR中被擴增。 23·種產生一乳房腫瘤樣品之一核酸表現輪廓的方法，其 包括步驟 (a) 自該乳房腫瘤樣品隔離表現產物； (b) 識別一預後組基因之該等表現水平，其中該預後組基 因包括來自表S6之至少5個基因；且 (c) 自該等表現水平產生該乳房腫瘤樣品之一表現輪廓。 24.如請求項23之方法，其中該預後組包括表％之至少1〇 個、20個、30個、40個、50個、60個或全部基因。 25·如請求項23或24之方法，其包括將該表現輪廓添加至一 基因表現輪廓資料庫。 96471.doc 200526958 26.如請求項23或24之方法，其進一步包括將該表現輪廓與 表不一特別預後之特徵的一第二表現輪廓或複數個第二 表現輪廓進行比較。 27·如請求項26之方法，其包括下列步驟： (a) 自一第一乳房腫瘤樣品隔離表現產物；以能夠特定及 獨立地結合至該預後組之表現產物的複數個結合組 員接觸該等表現產物；且自該腫瘤樣品内該預後組之 該等表現水平產生一第一表現輪廓； (b) 自一具有已知預後之第二乳房腫瘤樣品隔離表現產 物；以能夠特定及獨立地結合至步驟（a)之該預後组之 表現產物的複數個結合組員接觸該等表現產物，以便 產生一乳房腫瘤樣品之一可比較的第二表現輪廓； (c) 比較该第一表現輪廓及該第二表現輪廓以測定該第 一乳房腫瘤樣品之該預後。 28. —種表現輪廓資料庫，其包括乳房腫瘤樣品之複數個基 因表現輪廓，其中該等基因表現輪廓獲自一預後組基因 之該等表現水平，其中該預後組基因包括來自表S6之至 少5個基因，該資料庫可擷取地保持於一資料載體上。 29·如請求項28之表現輪廓資料庫，其中該預後組包括表％ 之至少10個、20個、30個、40個、5〇個、6〇個或全部基 因。 30. 如請求項28或29之表現輪廓資料庫，其中該等表現輪廓 為核酸表現輪廓。 31. 如請求項28或29之表現輪廓資料庫，其中該等表現輪廓 96471.doc 200526958 係根據該腫瘤源之er狀態而得以分類。 3 2·種識別於一群腫瘤内差別表現之一組基因的方法，該 方法包括提供一來自該群之複數個腫瘤之各個腫瘤的表 現輪廓，根據腫瘤之分子亞型將該等輪廓分類，及分析 亞型内之表現輪廓以識別一區別基因組，其中該區別 組之該等基因差別表現於彼亞型内。 33.如請求項32之方法，其進一步包括將一類指派給來自一 病人之一腫瘤樣品的步驟，其中該區別組之基因的差別 表現表示該類之特徵，該等步驟包括提供該區別組之該 樣品内之表現水平，及基於該等表現水平將一類指派給 該腫瘤。 士 π求項32或33之方法，其包括測定一腫瘤樣品内該區 別組之該等基因之該等表現水平、自該等表現水平測定 表現輪廓及將該輪廓添加至一資料庫的步驟。 35·如請求項32或33之方法，其中該腫瘤樣品之該分子亞型 亦被識別且添加至該資料庫。 36_如請求項玉2或33之方法，其包括提供來自該腫瘤之不同 治療階段的表現輪廓且該等表現輪廓用以測定預後類之 一改變，其中該等表現輪廓係獲自該區別組之基因的該 寺表現水平。 37.如請求項32或33之方法，其中該等腫瘤為乳房腫瘤且該 分子亞型對應於該腫瘤之ER狀態。 96471.doc 200526958 七、指定代表圖·· (一) 本案指定代表圖為：第（3)圖。 (二) 本代表圖之元件符號簡單說明·· (無元件代表符號） 八、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式： (無） 96471.doc