TW200523368A - Multipotent placental stem cell and methods thereof - Google Patents

Description

200523368 職、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明有關於一種取自產後胎盤的幹細胞，及其取得 與培養之方法。本發明特別關於含有胎盤幹細胞之組合物 及應用胎盤幹細胞的方法。 【先前技術】 Φ 幹細胞具有分化成體内各種細胞的潛力。理論上，幹 細胞可無限制地分裂增殖，以補充它種細胞數量。當幹細 胞分裂時，每個新細胞可維持幹細胞的狀態或成為具有一 更特化功能的他種細胞，例如肌肉細胞、紅血球細胞或腦 細胞。幹細胞通常分為全能型（totipotent)、潛.能型 (pluripotent)與多能型（multipotent)。全能型幹細胞具 、有成 長為身體中所有不同種類細胞的能力，句杠 g 生殖細胞 (germ cell)，例如受精卵便是一個全能型榦 开細胞。潛能型 幹細胞會成長為身體中除了發育胎兒所需 、、田胞種類 W 外的任何細胞。多能型幹細胞則僅可在一如^ 伯疋器官气 定組織中成長為兩種或兩種以上不同的細胞種 ——指 幹細胞，祖代細胞（progenitor cell，或稱母么 相對於 巧：、、、田胞）則無 行細胞自新（self-renew)，並僅能成長為少 、、、决進 歎幾種細脎 ••胚胎幹細胞（embryonic stem cell)愈 巴。 、成人幹ά (adult stem cell)是幹細胞的主要來源。肢 、、、田胞 - Q幹細胞來 由受精卵所發育而成的胚胎。為研究目的 〜自於 可徵求浐、 同意，在諸如體外受精臨床診所進行體外& 切赠者 …使印子發 3 200523368 育成胚胎，並自其中取得胚胎幹細胞以供研究之用。通常 可於受精後第4或第5天取得胚胎’此時’胚胎像一個由 細胞所構成的微小空心球’稱為囊胚（blast〇cyst) °囊胚包 含三種結構，分別是：滋養葉細胞（trophobiast) ’其為一 層環繞著囊胚的細胞；囊胚腔（blastocoel)’其為嚢胚内部 的空腔；以及内細胞群（inner cel1 mass)，其為一群集中在 囊胚之一端、約由3 0個細胞所組成的細胞群。

將這些内細胞群分離出來，並以體外培養方式培養 之，以取得胚胎幹細胞。内細胞群一般生長在一層餵養細 胞（feeder cell)上。這些飯養細胞通常是小鼠胚胎纖維母 細胞（mouse embryonic fibroblasts)，作為内細胞群的附著 層與營養來源。所得到的胚胎幹細胞是潛能型幹細胞，可 成為身體中所有種類的細胞。 成人幹細胞或體幹細胞（s〇matic stem cell)是一種可 在器官或組織之已分化細胞中發現的未分化細胞。成人幹 細胞可自我複製更新（細胞自新），並可分化成器官或組織 中特定的細胞種類。科學界相信每種組織中具有一特定區 域此使成人幹細胞保持長達數年不活動的狀態（即不分 裂）’直到這些細胞因疾病或組織受傷等因素而被活化為 ^每種、、且織中存在的成人幹細胞數目極少，並已在包括 腦月髓、周邊血液、血管、骨骼肌、皮膚、臍帶、脂肪 、、且織、羊膜與肝臟等組織與器官中找到成人幹細胞。 由於幹細胞可做為細胞或組織新生的來源，因此幹細 胞在各種疾病、身體異常狀況以及殘障治療上扮演相當重 4 200523368 要的角色。骨髓中用來形成血球的造血幹細胞 (hematopoietic stem cell, HSCs)是目前唯·--種已被普遍

使用的幹細胞。造血幹細胞被用來治療白血病、淋巴瘤及 數種遺傳性血液疾病。然而，其他幹細胞同樣具有治療他 種疾病的潛力。許多報告曾暗示一些成人幹細胞具有分化 成數種細胞的能力。例如，造血幹細胞可能分化成腦細胞 (神經細胞、寡樹突膠質細胞（oligodendrocytes)與星狀細 胞（astrocyte))( Hao et al·，H. Hematother. Stem Cell Res· 1 2:23-32，2003; Zhao et al·，PNAS 100:2426-243 1, 2003; Bonilla et al·，Eur. J. Neurosci· 1 5 : 5 75 -5 82，2002)、骨胳 肌細胞（Ferrari et al.，Science 279:1528-1530， 1998;

Gussoni et al·，Nature 401:3 90-394，1999)、心肌細胞 (Jackson et al., J. Clin. Invest. 107:1395-1402，2001)以及 肝細胞（Lagasse et al·，Nat. Med. 6:1229-1234, 2000) ° 骨 聽基質細胞（Bone marrow stromal cells)可能分化為心肌 細胞與骨骼肌細胞（Galmiche et al·，Blood 82:66-76，1993; Wakitani et al.，Muscle Nerve 1 8:141 7-1426，1 995)，而腦 幹細胞則可能分化成血球細胞與骨胳肌細胞d a/., Science 283:534-547, 1 999 ； Galli et aLy Nat.

Neurosci. 3 :986-99 1，2000) ° 胚胎幹細胞與成人幹細胞在細胞再生治療的應用上 分別具有其優缺點。成人幹細胞的優點之一在於可培養患 者自身的細胞，放大其細胞數量後，再重新植回患者體 内。使用患者自身的成人幹細胞可避免患者發生免疫系統 (s： 5 200523368 排斥外來細胞的情形，因此可以不需使用免疫抑制藥物。 相反地，若將捐贈者所提供的胚胎幹細胞植入患者體内， 則可能造成患者出現移植排斥的現象。

相反地，胚胎幹細胞可分化成體内所有的細胞種類， 雖然上述内容中提到曾有證據暗示成人幹細胞可能分化 成其他的細胞種類，但通常成人幹細胞僅能分化成自身來 源組織的細胞種類。此外，胚胎幹細胞較成人幹細胞相對 較容易經培養而生長，而成人組織中的成人幹細胞數目稀 少，並難以藉由細胞培養方式來放大其細胞數量。基於上 述理由，因此對於需要大量細胞數目的幹細胞取代治療方 法來說，胚胎幹細胞較具優勢。 胚胎幹細胞通常取自人工受精計畫或捐贈配子 (gamete)中所多出的胚胎。然而，由於胚胎幹細胞與生命 息息相關，因此在其應用上極具爭議性。相對的，成人幹 細胞雖不引起道德上的爭議，但其細胞增殖與分化的能力 低於胚胎幹細胞。此外，通常需要進行侵入性手術方能取 得成人幹細胞。再者，胚胎幹細胞可能產生畸胎瘤（一種 共由三層胚層所構成的良性瘤），而成人幹細胞則無此問 題。 【發明内容】 本發明提供一種取自產後胎盤的幹細胞。本發明之方 向在於提供一種獲得胎盤幹細胞的方法，此方法包括：取 得一產後胎盤；製備胎盤細胞的一單離細胞懸浮液（a 6 200523368 single-cell suspension);培養該胎盤細胞；以及獲得一胎 盤幹細胞。所獲得的該胎盤幹細胞可能為多能型或潛能型 幹細胞，並且該胎盤可以是人類胎盤。

本發明之另一方向在於提供一種培養胎盤幹細胞的 方法，此方法包括：取得一產後胎盤；製備胎盤細胞之一 單離細胞懸浮液；培養該胎盤細胞；獲取一胎盤幹細胞； 以及培養該胎盤幹細胞。所獲得的該胎盤幹細胞可能為多 能型或潛能型幹細胞，並且該胎盤可以是人類胎盤。 本發明之又一方向在於提供一種已分離的胎盤幹細 胞（an isolated placental stem cell)，此胎盤幹細胞具有如 細胞標記等數種特定的特徵。 本發明之更有一方向在於提供一種已分離的多能型 或潛能型胎盤幹細胞之同質細胞群，其具有包括細胞標記 在内的數種特定的特徵。 因此，本發明亦有一方向為提供一種根據某些細胞標 記特徵來取得一胎盤幹細胞的方法。 再者，本發明更有一方向是提供取自產後胎盤的冷凍 保存胎盤幹細胞。 本發明尚有其他方向是提供一種包含胎盤幹細胞之 組合物，及一種包含胎盤幹細胞的藥學組合物。本發明亦 提供一種治療病患的方法，此方法包括對患者施予一有效 劑量之胎盤幹細胞。 【實施方式】 7 200523368 胎兒 細胞 能較 外，‘ 的暫 需進

較佳 文中 知技 實施 用之 以形 cell)

cell) 胞。 能型 種具 物身 種類 本發明提供一種來自產後胎盤的幹細胞。由於胎盤是 的起源且是由胚胎演化出來的一部份，因此胎盤為幹 與生長因子提供了豐富的來源。為此，胎盤幹細胞可 其他成人幹細胞具有更高的細胞增殖與分化能力。此 I台盤疋一個在子宮中用來維持胎兒存活並於產後丟棄 時器官。所以產後取得的胎盤不會造成道德爭議亦不 行侵入性手術來取得細胞。 此處敘述之較佳實施例及使用的術語僅作描述這些 實施例之目的，而非用來限定本發明。該些為特別； 敘述之其他較佳實施例亦為本發明範圍所涵蓋，且習 藝者在閱讀本發明揭露内容後可輕易瞭解本發明並 之。 本發明係有關於取自產後胎盤的幹細胞。于文中所使 用詞「幹細胞（stem Cell)J係指一種能不斷複製増殖 成器官或組織之特殊功能細胞的優勢細胞（master 。幹細胞可進行分裂而產生兩個子代幹細胞，或是產 個子代幹細胞與一個祖代細胞（或稱過渡細胞’ transH ’此袓代細胞隨後會増殖成組織中成熟發育完全之細 文中所使用「幹細胞」之用詞包括多能型幹細胞與潜 幹細胞。 文中之用词「潛月匕型細胞（piurip〇tent cen)」係指一 有完整多分化能力的細胞，即指那些可成長為哺乳動 體中’除了用來發育胎兒所需的細胞以外之任何細胞 的細胞。潛能蜇細胞可進行細胞自新，並且細胞可在 8 200523368 組織中保持休眠或靜狀態。

此處之用詞「多能型細胞（multipotent cell)」係指一 種具有可在一指定器官或組織中成長為兩種或兩種以上 不同種類細胞之能力的細胞。然而，多能型細胞具有成為 潛能型細胞的能力。例如，最初認為造血幹細胞是一種多 能型細胞，即是一種只能發育成數種血球細胞，但無法發 育成腦細胞的一種幹細胞。然而，如前述内容曾提過，近 來有證據顯示造血幹細胞可能是潛能型細胞，因為其可能 分化成包括腦細胞等其他種類的細胞。 此處之用詞「祖代細胞（progenitor cell)」，係指一種 專門用來分化成一特定細胞種類或形成一特定組織種類 的細胞。 此處之用詞「產後胎盤（post-partum placenta)」，係指 產後自子宮内排出且不包含臍帶的胎盤。因此，本發明之 取得胎盤幹細胞的方法不同於習知技術之使用臍帶或臍 帶血的方法（Migliaccio et al.，Blood 96:2717-2722，2000; Rubinstein et al·，New England J Medicine 3 3 9:1 565- 1 577, 1 998; Hariri et al·， U.S. Patent Publication No·: 20030180269)。可自任何哺乳物種中取得該產後胎盤，包 括齧齒類、人類、非人類靈長動物、馬類、犬科動物、貓 科動物、牛亞科動物、豬科動物、羊屬動物、兔類動物及 其他動物種類。在一較佳實施例中，使用之胎盤係由人類 身上取得。 胎盤幹細胞可根據其細胞標記來特徵化。目前已知有 9 200523368

多種不同的細胞標記，該些已知的細胞標記可參考資料 如：Stem Cells : Scientific Progress and Future Research Directions. Department of Health and Human Services. June 2001 · http://www.nih.gov/news/stemcell/scireport.htm。可利 用如免疫化學法（immunochemistry)或流式細胞儀（flow cytometry)等習知方法來偵測細胞標記。流式細胞儀可對 發光細胞或粒子進行快速光線散射與螢光的測量。當細胞 或粒子各自通過一光束時會產生訊號。分別測量每個細胞 或粒子的信號，且其之輸出結果可代表細胞個別累積的流 式分析特徵（cytometric characteristics)。藉由在用來辨識 細胞標記的抗體上標定螢光染料，使其可被流式細胞儀偵 測到。上述方法請參考下列資料：Β ο η n e r e t a 1 ·，R e v. S c i · Instrum 43 :404-409,1972 ； Herzenberg et al., Immunol. Today 2 1 :383-390, 2000 ； Julius et al., PNAS 6 9:1 934-1 938，1972 ; Ormerod (ed.), Flow Cytometry: A Practical Approach, Oxford Univ. Press, 1 997 ; Jaroszeski et al. (eds.), Flow Cytometry Protocols in Methods in Molecular Biology No. 91，Humana Press，1 997； Practical Flow Cytometry，3rd ed.，Wiley-Liss，1 995 o 在本發明一較佳實施例中，一種人類胎盤幹細胞可表 現出至少一種下列細胞標記：CD9、CD13、CD29、CD44、 CD90/Thy小 CD105/SH-2/endoglin、CD166、SH-3、SH-4、 間絲蛋白（vimentin)、HLA-ABC、SSEA-4、TRA-1-60 與 TRA-1 -8 1。在又一較佳實施例中，人類胎盤幹細胞至少對 10 200523368 下列一種細胞標記之測驗為陰性：CD14、CD34、CD45、 AC或CD13 3/2、細胞角質蛋白7 (cytokeratin 7)、溫偉伯 氏因子（von Willebrand factor)、HLA-DR、HLA G、血型 醋蛋白 A(glycophorin A)、胎盤驗性磷酸酶（placental alkaline phosphatase)與β-人類絨毛膜性腺激素（β-human chorionic gonadotropin) 〇

在本發明另一較佳實施例中，胎盤幹細胞至少對下列 一種細胞標記之測驗為陽性：CD9、CD13、CD29、CD44、 CD9 0/Thy-：l、CD105/SH-2/endoglin、CD166、SH-3、SH-4、 間絲蛋白、HLA-ABC、SSEA-4、TRA-1-60 與 TRA-1-81， 並且至少對下列一種細胞標記之測驗為陰性：CD 14、 CD3 4、CD4 5、AC或CD 13 3/2、細胞角質蛋白7、溫偉伯 氏因子、HLA-DR、HLA G、血型醣蛋白 A、胎盤鹼性磷 酸酶與β ·人類絨毛膜性腺激素。 本發明亦可提供一種胎盤幹細胞之均質細胞群。文中 之用詞「均質細胞群（homogeneous population)」係指表現 出實質相同之表現型的一群細胞，例如利用細胞標記來判 斷細胞是否為相同表現型。一群均質細胞群中至少包含約 7 0 °/〇的相同細胞，或至少包含約8 〇 %、9 〇 %、9 2 %、9 6 % 或99 %之實質相同的細胞。 故本發明提供一種藉著分離出具有某些細胞特徵之胎 盤細胞以取得胎盤幹細胞的方法。可由上述產後胎盤取得 之胎盤細胞的該單離細胞懸浮中，或由自胎盤中分離並加 以培養的胎盤細胞中，分離出具有上述這些細胞特徵的胎 11 200523368 盤細胞。並藉著如上述之流式細胞儀並根據細胞特徵來分 離細胞。在本發明之一較佳實施例中，藉著分離具有至少 下列一種特徵之胎盤細胞來取得胎盤幹細胞，該些特徵為： 對細胞標記 CD9、CD13、CD29、CD44、CD90/Thy-l、 CD105/SH-2/endoglin、CD 1 66、SH-3、SH-4、間絲蛋白、 HLA-ABC、SSEA-4、TRA-1-60 與 TR A-1 - 8 1 之測試呈陽 性反應；

對細胞標記 CD14、CD34、CD45、AC 或 CD133/2、細 胞角質蛋白7、溫偉伯氏因子、HLA-DR、HLA G、血型聽 蛋白A、胎盤鹼性磷酸酶與β_人類絨毛膜性腺激素之測試 呈陰性反應；或是 對細胞標記 CD9、CD13、CD29、CD44、CD90/Thy-1、 CD105/SH，2/endoglin、CD166、SH-3、SH-4、間絲蛋白、 HLA-ABC、SSEA-4、TRA-1-60 與 TRA-1-81 呈陽性反應， 並且對細胞標記 CD14、CD34、CD45、AC 或 CD133/2、 細胞角質蛋白7、溫偉伯氏因子、HLA-DR、HLA G、血型 聽蛋白A、胎盤鹼性磷酸酶與β _人類絨毛膜性腺激素呈陰 性反應。 本發明亦提供一種取得胎盤幹細胞的方法。此方法至 少包括步驟：取得一產後胎盤、製備胎盤細胞之一單離細 胞懸浮液、培養該胎盤細胞、以及取得一胎盤幹細胞。產 後胎盤之取得方法可以在徵求同意後自剖腹產手術或正 常分挽過程中取得。並可使用如剪刀等器具將胎盤以機械 性的方式切成小片。再利用如胰蛋白酶（trypsin)、胰凝乳 12 200523368 蛋白酶（chymotrypsin)、溶菌酶（lys〇zyme)、澱粉酶（amylase) 或K蛋白分解酶（Protease Κ)等酵素來分解胎盤以製備 出一單離細胞懸浮液。並以含有如DMEM (Gibco)與10 % 小牛血清（指定批次之Hyclone產品）之標準培養基的培養 液來培養上述過程中所得到的胎盤細胞，並可在培養液中 添加適量的葡萄糖及/或抗生素。在培養液中持續培養的 胎盤細胞中取得胎盤幹細胞。

可根據分化成不同細胞種類之能力來偵測培養過程 中出現的胎盤幹細胞。例如，可測試培養中的細胞其分化 成脂肪細胞（adipocyte)及/或造骨細胞（oste〇blast)的能 力。脂肪細胞是一種負責合成與儲存脂肪的結締組織細胞 (connective tissue cell)，造骨細胞貝ij是負責骨胳生成的主 要細胞’並被認為是源自於骨架組織（s k e 1 e t a 1 t i s s u e s )中 的骨質祖代細胞（osteoprogenitor cell)。 可將該細胞培養在含有10%兔子血清（髓基質骨質原 生細胞中一種已知的脂肪生成作用（adipogenesis)誘導因 子）來誘導進行脂肪細胞分化（Diascro et al·，J. Bone Miner. Res. 13:96-106，1988)。並利用如免疫組織染色法 (immunohistochemistry)與反轉錄聚合酶鏈瑣反應 (RT-PCR)等方法來測定脂肪細胞轉錄因子 PPARY2及/或 CEBPoc的表現量，以偵測脂肪細胞分化情形（PPARy2全名 為 peroxisome proliferator activated receptor gamma 及 CEBPa全名為 CCAAT/enhancer binding protein alpha)。或 是將細胞置於脂肪細胞誘導分化培養液中培養後，加入 13 200523368

Oil Red 0進行染色來顯示細胞中脂質的累積量，以偵測 脂肪細胞的分化情形（Conget and Minguell，J. Cellular Physiology 1 8 1:67-73，1 999)。亦可使用其他誘導與偵測 脂肪細胞分化的方法（請參考 Pittenger et al·，Science 284:143-1 47，1 9 9 9; Tchoukalo va et al., Obesity Research 8:664-672， 2000) °

可將細胞培養在含有如甲異丁基黃嘌呤 (methylisobutylxanthine)、腎上腺皮質酮（dexamethasone) 與胰島素（insulin)等成分之培養液中便可誘導細胞進行 硬骨細胞分化（Student et al., J. Biol. Chem. 255:4745-4750， 1 980)。並藉著測試包括骨橋蛋白 (osteopontin，OP)、骨妈蛋白（osteocalcin，OC)、骨黏連蛋 白（osteonectin，ON)與骨涎蛋白（bone sialoprotein)等造 骨標記的表現來偵測硬骨細胞分化過程。亦可利用 von Kossa染色法與/或用來偵測骨骼中鈣沈積活性之茜素紅染 色法 （alizarin red stain)來偵測骨生成作用 (osteogenesis)(Jaiswal et al., J Cell Biochem. 64:295-3 12, 1997 與 Wan et al·，Chin. J. Traumatol· 5:374-379，2002)。 當然，亦可利用習知方法來誘導本發明之胎盤幹細胞 分化成其他種類之細胞。 本發明還提供一種培養胎盤幹細胞的方法，此方法至 少包含：取得一產後胎盤、製備胎盤細胞之一單離細胞懸 浮液、培養該胎盤細胞、取得一胎盤幹細胞、以及培養該 胎盤幹細胞。並且培養胎盤幹細胞之培養液可與培養胎盤 14 200523368 細胞之一單離細胞懸浮液之培養液相同。

本發明更提供一種含有本發明胎盤幹細胞的組合 物。本發明亦提供一種含有本發明胎盤幹細胞的藥學組合 物。本發明之胎盤幹細胞或其配方可藉由包括非經腸胃道 之注射（如皮下或肌肉内注射）或靜脈滴注等任何傳統方 法對患者用藥。上述治療方式可為單次用藥，或是在一週 期内進行數次用藥。此藥學組合物可包含一或一種以上藥 學可接受的載劑（carrier)。這些載劑必須為「藥學可接受 的」，而與胎盤幹細胞至少某種程度上的相容，且對該藥 劑之用藥者不具傷害性。載劑通常是經過高溫殺菌且不含 致熱源（pyrogen)的水或是生理食鹽水。 可冷凍保存本發明之胎盤幹細胞，其係將細胞冷凍保 存於溶液中，如保存於最終濃度不超過 10 %的二甲基亞 (dimethyl sulfoxide，DMS0)溶液中。亦可將細胞冷床保 存於含有二甲基亞 及/或葡萄聚醣（dextran)的溶液中。 其他冷凍保存細胞的方法亦為習知技藝者所熟知。 本發明提供一種治療患者的方法，此方法包括對一患 者使用一有效治療劑量之本發明胎盤幹細胞。使處之「有 效治療劑量（therapeutically effective amount)」係指能有 效降低疾病症狀的胎盤幹細胞劑量，或是能有效維持或增 加一患者體内從該胎盤幹細胞所衍生出之細胞數目的劑 量。 此處之患者係定義為任何需要接受一胎盤幹細胞之 治療的人類或非人類動物，或是任何在接受過該治療後能 15

200523368 獲得益處的對象，這些對象包括人類或非 八頸動物。欲 受治療的非人類動物包括所有剔養與野士 丹ί生的哺乳動物。 本發明之一較佳實施例中，欲使用之胎般 盤幹細胞的取得 源係與接受治療之動物的物種相同。哺受丨^ 用孔動物種類包括 齒類、人類、非人類靈長動物、馬類、女、# 八竹動物、貓科 物、牛亞科動物、豬科動物、羊屬動物、多 鬼類動物及其 動物種類。 ' 本發明之胎盤幹細胞可用來治療因為# 口席四受傷而需要更 或再生組織之任何種類的外傷傷口。這翻沾& 、頸的外傷狀況包 中樞神經系統傷害（CNS)，如腦部、脊骸 、τ樞神經周 組織至周邊神經系統（PNS)或是身體任何邮^ ^ 1 j崢位的傷害。 類外傷可能是由意外事故或是由正常或不τ^ 中凡不正常的醫療 序所造成，例如手術或血管擴張術所產生的外傷。之類 傷可能與血管破裂或血管阻塞有關，例如中風或靜脈炎 在一些特殊較佳實施例中，將這些細胞用於自體組織或 體組織置換或再生之治療或程序中，包括用於角膜上皮 損治療（corneal epithelial defect)、軟骨修復、顏面磨皮 (facial dermabrasion)、口 鼻黏膜（mucosal membrane)、 膜、腸道内襯組織（intestinal lining)、神經結構（如視 膜、基底膜中的的聽覺神經、嗅覺上皮中的嗅覺神經） 皮膚之燒傷或創傷修復，或是用來重建其他受創或患病 器官或組織，且該些細胞之用途ϋ不僅限於此。此外損 亦可能由特殊情況或疾病所造成，包括心肌梗塞、痛痛 多發性硬化症、中風、低血壓、心跳停土再灌庄損福 接 在 來 馨 動 他 換 括 圍 此 程 外 〇 異 缺 術 鼓 網 之 傷 16 200523368

發炎反應、因老化所造成認知能力退化、放射線傷害、腦 性麻痺、神經退化性疾病、阿茲海默症（A1 z h e i m e r ’ s disease)、帕金森氏症（Parkinson’s diease)、腦脊髓病變 (Leigh’s disease)、愛滋病癡呆綜合症、喪失記憶、肌萎 縮側索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis，ALS)、缺血 性腎臟病、腦部或脊髓損傷、心肺繞道手術、青光眼、視 網膜再灌注損傷、視網膜外傷、先天性代謝疾病、腎上腺 腦白質退化症、纖維囊種、肝醣儲積症、甲狀腺功能低下 症、鐮刀型血球貧血症、皮爾森氏症（Pearson syndrome)、 龐氏症（Pompe’s disease)、苯酮尿症（PKU)、紫質症、楓糖 尿症、高胱胺酸尿症、黏聚聽疾病（mucoplysaccharide no si s)、慢性肉芽腫以及酪胺酸血症、癌症、腫瘤或其他 病理或惡性贅瘤等症狀。 用於治療中的胎盤幹細胞亦可含有一有效劑量之核 酸載體（nucleic acid vector)或生物載體，以指揮患者體内 一指定基因的表現。傳統重組核酸載體的構築與表現方法 均為習知技藝者所熟悉，且該些方法包括記那些載於由 Sambrook 等人所編著之「Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vo 1 s 1-3 (2d ed. 1 989)，Cold Spring Harbor Laboratory Press」中的相關技術。 上述核酸載體可包含在一生物載體内，例如病毒與細 菌，尤以包含在一非致病性或減活微生物中為佳，其包括 減活後的病毒、細菌、寄生蟲以及類病毒粒子。 可利用體外基因治療方法（d νζ·ν〇 gene therapy 17 200523368 protocol)將上述核酸載體或生物載體導入細胞中，此方法 包括自一患者身體中切除細胞或組織、將核酸載體或生物 載體導入切出的細胞或組織中、以及將切出之細胞重新植 回患者體内（請參考 Knoell et al·，Am. J· Health Syst· Pharm. 55:899-904，1998; Raymon et al·，Exp. Neurol. 144:82-91, 1997; Culver et al·， Hum. Gene Ther. 1:399-410, 1 990; Kasid et al.? Proc. Natl. Acad. Sci.

U.S.A. 87··473-477，1 990)。可利用如磷酸鈣媒介轉染法 (calcium phosphate-mediated transfection)來將核酸載體 或生物載體導入切出的細胞或組織中（Wigler et al.，Cell 14:725，1 978; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603，1981; Graham and Van der Eb，Virology 52:456, 1 973)。亦可使用其他方法將核酸載體導入宿主細胞中 中’例如電穿孔法（electroporation)(Neumann et al·，EMBO J· 1 :841-845, 1 982)。 本發明之細胞亦可配合其他藥劑共同使用，例如其他 種類之細胞、生長因子與抗生素。其他藥劑之種類可由席 之技藝者決定。 需明白於實施例或他處内容中所顯示之成分用量、反 應條件等數字或是本申請說明書内容所使用之數字均為 大約數值。因此，除非文中特別注明，本說明書之上述數 子參數均為近似值，其可根據欲求得之本發明結果而加以 變4匕。廿 、 w且’這些參數並非用來限定與本發明申請專利 圍土句蓉 原理，而是應用正常操作技術下所得到之較佳數 18 200523368 雖然上述用來指出本發明之最大範圍之數據範 參數均為近似值，但上述特定較佳實施例中所記述之 值已盡可能地精準。^各個測量實驗均有其標準偏 因此任何數據值必有部分誤差。 須明白到，；^無特別於上下文巾清楚記述其他清 則說明書内容及後附申請專利範圍中所使用之如 ()」以及（and)」與「該（the)」等特定用語均包含 數型態。 除非另行定義，文中所使用之所有專業與科學用 S知技藝者所熟悉之意義相同。此外，任何與所記載 相似或均等之方法及材料皆可應用於本發明方法中。 所述之較佳實施方法與材料僅做示範之用。 於本申請書中所提到之所有參考文獻均全體納 考，以揭露並敘述該文獻所記載之相關方法及/或材 此外文中所讨論之文獻僅揭露本發明申請日前之習 術。並且無任何文獻顯示本發明内容曾為習知技術 露。本發明内容所得到之實際數據會因個別的實施條 與本發明揭露於說明書内容中之數據有所不同。 各種實施本發明之方法技術及/或實驗程序（統稱 法」）包含任何可達成相同目的之習知方法，但不能限 本說明書之特定的方法範例。此外，雖已於説明書之 内容中敘述部分方法，然該些方法係作示範本發明之 並非用來限定本發明内容。 圍及 數據 ί差， ;義， Γ — 其複 與 内容 文中 入參 料。 知枝 所揭 件而 「方 定為 特定 用， ⑧ 19 200523368 以下藉由數個較佳實施例來說明本發明，並非作限定 本發明之用。 較佳實施例1 盘幹細胞之分離與培巷

係先取得由剖腹生產或自然分娩之健康母親捐贈，且 附有經人體試驗委員會認證僅將此胎盤作研究目的用之同 意書的足月胎盤（約懷孕3 8至40週之胎盤）。小心地將此 胎盤切塊’並以填酸鹽緩衝溶液（phosphate-buffered saline， PBS)清洗數次。將收取的產後胎盤組織小塊以剪刀切成更 小的碎片，並以0.25%胰蛋白酶-EDTA(Gibe〇)溶液使組織 碎片於3 7 °C下進行酵素分解1 0分鐘。隨後離心以沈殿細 胞，並以磷酸鹽緩衝溶液清洗細胞一次後，再將細胞懸浮 於含有10 %小牛血清（Hyclone)、100 U/ml盤尼西林（Gibco) 及100 U/ml鏈黴素（Gibco)的DMEM培養液（Gibco)中。於 3 7 °C且含有 5 %二氧化碳之飽和濕度環境下培養該細 胞，並每週更新培養液兩次。當細胞數量覆蓋80 %的培養 皿面積時，以0.25%膜蛋白酶-EDTA(Gibco)溶液來收取細 胞，再以1 : 2至1 : 3的比例將細胞重新分盤。隨後使細 胞於盤中至少成長9天後，即可進行分析試驗。 較佳會施例2 胎盤幹細胞之1旨肪細胞分化與硬骨細胞分化

20 200523368

以脂肪細胞培養液（adipogenic medium)或硬骨細胞培 養液（osteogenic medium)來培養根據較佳實施例1所獲得 之細胞，其中，脂肪細胞培養液中含有0.5 mM甲基異丁 基黃嘌呤、1 μΜ腎上腺皮質酮、10 μΜ騰島素與60 μΜ消 炎痛(indomethacin)(Dennis et al·，J. Bone and Mineral Research 14:700-709，1999)，硬骨細胞培養液含有 〇·ΐμΜ 腎上腺皮質_、10 mM β-構酸甘油酯（β-glycerol phosphate) 與50 μηι抗壞血酸鹽（即維他命C)(Jaiswal et al·，J Cell Biochem. 64:295-3 12，1997)。隨後利用 Oil Red 染色法對 細胞内累積的中性脂肪液泡進行染色以評估脂肪細胞的形 成情況（Conget and Minguell, J. Cellular Physiology 1 8 1:67-73，1 999)。以及利用von Koss a染色法或茜素紅染 色法來偵測細胞中鈣累積情況，以評估硬骨細胞的分化情 形（Jaiswal et al·，J Cell Biochem. 64:295-312，1997 與 Wan et al·，Chin. J· Traumatol. 5:374-379, 2002)。 第1圖顯示骨髓間葉幹細胞以Oil Red染色法偵測脂肪 細胞分化現象（第1 A圖），及使用v ο η K 〇 s s a染色法偵測硬 骨細胞分化現象（第1 B圖）的結果，以作正對照組之用。第 2圖展現本發明之胎盤幹細胞的分化潛力。第2A圖顯示 進行脂肪細胞分化後尚未染色的胎盤幹細胞。第2B圖顯 示經過脂肪細胞分化過程並以 Oil Red染色的胎盤幹細 胞，以偵測細胞内的脂肪累積情況。第2B圖顯示根據本 發明方法所獲得的胎盤幹細胞可分化成脂肪細胞。本發明 21 200523368 之胎盤幹細胞亦可分化成如第2C與第2D圖所示之造骨 細胞。茜素紅染色（第2C圖）與von Kossa染色法（第2D圖） 兩者均可在培養的胎盤幹細胞中染到造骨細胞。因此，根 據較佳實施例1所獲得之胎盤幹細胞具有分化成多種細胞 的能力。 較佳膏施例3

敢盤幹細胞之韓骨細胞分化 軟骨母細胞（chondroblast)是一種當其被基質包圍時， 會分泌軟骨基質並成為軟骨細胞的細胞。使用微量培養技 術來誘導上述較佳實施例1中所獲得的胎盤幹細胞進行軟 骨母細胞分化（Barry et al.，Experimental Cell Research 269:189-200, 2001 and Zuk et al.? Tissue Engineering 7:211-28，2001)。快速地將大約200,000個細胞置於一 15 ml的聚丙烯圓椎刻度試管中，並以含有10 ng/ml轉化生長 因子（TGF)-01 或 TGF-]33(均購自 R&D systems)、0.1 mM 抗 壞血酸-2-構酸鹽（ascorbic acid-2-phosphate，Sigma)、 1χ1 Ο7 Μ腎上腺皮質酮（Sigma)與1 %胰島素-運鐵蛋白-鈉·亞硒酸鹽培養基（Sigma)的培養液中培養3至6小時。 將該些細胞移至24孔盤中後再培養2至3週。隨後以阿 爾襄藍（A1 c i a η B1 u e，ρ Η 1)對細胞進行染色以债測出現在 軟骨與其他結締組織中的蛋白聚醣（proteoglycans)。此 外，將抗-人類第二型膠原蛋白抗體（Santa Cruz 22 200523368

Biotechnology，Inc·)以1 ·· 100之倍率稀釋後，利用免疫細 胞化學方法使細胞與抗體在 4 °C下反應一個晚上來偵測 細胞中的第二型膠原蛋白。隨後，將生物素-抗山羊免疫球 蛋白 G 二次抗體（biotinylated anti-goat IgG secondary antibodies，ABC kit，Vector Labs)以 1 : 5 00 之倍率稀釋後 與上述細胞於室溫下反應45分鐘以進行二次抗體染色。最 後’使用Leica DM IRB倒立式顯微鏡（Leica，Germany)來 觀察細胞。 由第3A圖與第3B圖可確認本發明之胎盤幹細胞具有 形成軟骨的潛力。第3A圖中清楚地顯示一個被阿爾襄藍 染呈藍色的胎盤幹細胞衍生細胞（placental stem cell-derived cell)，其表示該細胞製造出蛋白聚醣。第3B 圖亦顯示一個會受到抗第二型膠原蛋白抗體辨識的胎盤幹 細胞衍生細胞，其表示該細胞會製造第二型膠原蛋白，而 第二型膠原蛋白大多出現在軟骨中，並且對於骨骼或其他 結締組織之正常發育過程來說是必要分子。

較佳實施例4 駘盤幹細胞之表現锹 利用流式細胞儀及/或免疫化學染色法來分析較佳實施 例1中獲得之胎盤幹細胞的細胞標記。分別對根據

Pittenger 等人（Science 284:143-147，1999)、Reyes 等人 (Blood 98:2615-1625，2001)之方法所取得的骨魏細胞，以 23 200523368 及根據Erices等人之方法所取得的臍帶血（Br. J. Haematol 109:235-242，2000)和較佳實施例 1中所獲得之胎盤幹細 胞（MPSC)進行細胞標記比較，並將各細胞之細胞標記比較 結果列於表一中。 表一

細胞標記 Pittenger 等 人 (骨髓） Reyes 等 人 (骨髓） Erices 等 人 (臍帶血） MPSC CD9 (+ ) (+ ) CD13 (+ ) (+ ) (+ ) CD 14 (一） (-) (一） CD29 (+ ) (+ ) (+ ) CD34 (一） (-) (-） (一） CD44 (+ ) (+ ) (+ ) CD45 (一） (-) (一） (-) CD90/Thy-1 (+ ) (+ ) (+ ) CD105/SH2/endoglin (+ ) (+ ) CD117/c-kit (-) (-) AC or CD133/2 (-) CD166 (+ ) (+ ) SH3 (+ ) (+ ) (+ ) SH4 (+ ) (+ ) (+ ) 間絲蛋白 (+ ) 細胞角質蛋白7 (-) 溫偉伯氏因子 (-) (-） (-） HLA-ABC (+ ) (一） (+ ) HLA-DR (-) (-） (-) HLA-G (-） 血型醣蛋白 A ㈠ (一） SSEA-4 (+ ) TRA-1-60 (+ ) TRA-1-81 (+ ) β -人類絨毛性腺激 素 (+ ) 胎盤鹼性磷酸酶 ㈠ 說明書中所引用之參考資料均清楚記載，並於此處將 之全文納入參考。本說明書内的較佳實施例僅作說明本發 24 200523368 明之較佳實施例之用，而非用以限制本發明範圍。習知技 藝者需明白，本發明尚涵蓋多種其他較佳實施例，且說明 書與實施例僅作示範之用，其實際精神與範圍當由後附申 請專利範圍所界定 【囷式簡單說明】

第1圖顯示對照組之骨髓間葉幹細胞之染色結果，作 為正對照組之用，若使用oil Red染色法來偵測脂肪細胞 分化現象，則正對照組之染色結果為為紅色（如第i A圖）， 若使用von Kossa染色法來偵測硬骨細胞分化現象，則正 對照組之染色結果為為棕色（如第1 B圖 第2 ®顯示本發明較佳實施例之胎盤幹細胞之染色結 果，以證明本發明之胎盤幹細胞具有分化成其他種類之細 胞之能力。第2A圖顯示未染色的胎船

巴幻知盤幹細胞，以及第2B 圖顯示以0 i 1 R e d對細胞進行毕多以 丁永邑从偵測出脂肪細胞（圖中 呈紅色之細胞）。第2C圖顯示經茜紊 四京紅染色後的細胞，以

及第2D顯示以von Kossa染色法所仇A 巴所杂色的細胞，第2C與 2D兩圖均顯示在培養的胎盤幹細胎 开、田跑中偵測到骨母細胞（分 別為呈現紅色與棕色）。 第3圖展示本發明較佳實施例 』之胎盤幹細胞具有分化 軟骨母細胞的潛力。第3Α圖顯示緩阶級命 、乂阿爾襄藍染劑（Alcian

Blue dye)染色後呈現藍色的胎盤幹細 肥何化細胞，其暗不 該細胞會表現蛋白聚醣（或稱蛋白多齡、μ 少糖）。第3Β圖顯示一種 25 200523368 可與抗第二型膠原蛋白抗體結合的胎盤幹細胞衍化細胞。 【元件代表符號簡單說明】

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Claims (1)

1. 200523368 蠢、申請專利範圍： 1. 一種取得一胎盤幹細胞之方法，其至少包括： a. 取得一產後胎盤； b. 製備胎盤細胞之一單離細胞懸浮液； c. 培養該胎盤細胞；以及 d. 取得一胎盤幹細胞。 2. 如申請範圍第1項所述之方法，其中該胎盤為人 類胎盤。 3. 如申請範圍第1項所述之方法，其中該單離細胞 懸浮液係利用酵素分解該胎盤所製備而成。 4. 如申請範圍第1項所述之方法，其中該胎盤幹細 胞為多能型。 5. 如申請範圍第1項所述之方法，其中該胎盤幹細 胞為潛能型。 6. 一種培養一胎盤幹細胞之方法，其至少包括： a.取得一產後胎盤； 27 200523368 b ·製備胎盤細胞之一單離細胞懸浮液； c.培養該胎盤細胞； d ·取得一胎盤幹細胞；以及 e.培養該胎盤幹細胞。 為人 7. 如申請範圍第6項所述之方法，其中該胎盤

   8. 如申請範圍第6項所述之方法，其中其中該 細胞懸浮液係利用酵素分解該胎盤所製備而成。 9. 如申請範圍第6項所述之方法，其中該胎盤 胞為多能型。 單離 幹細

   10. 如申請範圍第6項所述之方法，其中該胎盤 胞為潛能型。 幹細 法所 11. 一種利用如申請專利範圍第1項所述之方 取得之多能型胎盤幹細胞。 法所 12. 一種利用如申請專利範圍第1項所述之方 取得之潛能型胎盤幹細胞。 28 200523368 13. 如申請範圍第11或第12項所述之胎盤幹細胞， 其中該胎盤幹細胞為人類胎盤幹細胞。 14. 一種具有至少一下列特徵之已分離胎盤幹細胞：

   a. 對細胞標記 CD9、CD13、CD29、CD44、 CD90/Thy-1、CD 105/SH-2/endoglin、CD166、SH-3、 SH-4、間絲蛋白（vimentin)、HLA-ABC、SSEA-4、 TRA-1-6 0與TRA-1-81之測試呈陽性反應； b. 對細胞標記 CD14、CD34、CD45、AC 或 CD13 3/2、細胞角質蛋白7(cytokeratin 7)、溫偉伯氏因 子（von Willebrand factor)、HLA-DR、HLA G、血型聽 蛋白 A(glycophorin A)、胎盤驗性鱗酸酶（placental alkaline phosphatase)與β-人類絨毛膜性腺激素 (β-human chorionic gonadotropin)之測試呈陰性反 應，或

   c.對細胞標記 CD9、CD13、CD29、CD44、 CD90/Thy-1、CD 105/SH-2/endoglin、CD166、SH-3、 SH-4、間絲蛋白、HLA-ABC、SSEA-4、TRA-1-60 與 TRA-1-81之測試呈陽性反應，且對細胞標記 CD 14、 CD34、CD45、AC或CD133/2、細胞角質蛋白7、溫偉 伯氏因子、HLA-DR、HLA G、血型醣蛋白A、胎盤鹼 性磷酸酶與β -人類絨毛膜性腺激素之測試呈陰性反 應0 29 200523368 1 5 · 如申請範圍第1 4項所述之已分離胎盤幹細胞， 其中該胎盤幹細胞為多能型。 16· 如申請範圍第14項所述之已分離胎盤幹細胞， 其中該胎盤幹細胞為潛能型。

   17. —種具有至少一下列特徵之已分離胎盤幹細胞 均質細胞群： a•對細胞標記 CD9、CD13、CD29、CD44、 CD90/Thy-1、CD 105/SH_2/endoglin、CD166、SH-3、 SH-4、間絲蛋白、HLA-ABC、SSEA-4、TRA-1-60 與 TRA-1-81之測試呈陽性反應； b·對細胞標記 CD14、CD34、CD45、AC 或 CD133/2、細胞角質蛋白7、溫偉伯氏因子、HLA-DR、 HLAG、血型醣蛋白A、胎盤鹼性磷酸酶與β-人類絨毛 膜性腺激素之測試呈陰性反應；或 c.對細胞標記 CD9、CD13、CD29、CD44、 CD90/Thy-1、CD 105/SH-2/endoglin、CD166、SH-3、 SH-4、間絲蛋白、HLA-ABC、SSEA-4、TRA-1-60 與 TRA-1-81呈陽性反應，且對細胞標記CD14、CD34、 CD45、AC或CD 13 3/2、細胞角質蛋白7、溫偉伯氏因 子、HLA-DR、HLA G、血型醣蛋白A、胎盤鹼性磷酸 30

   a·對細胞標記 CD9、CD13、 CD90/Thy-1、CD105/SH-2/endoglin SH-4、間絲蛋白、HLA-ABC、SSEA TRA· 1-81之測試呈陽性反應； 200523368 酶與β-人類絨毛膜性腺激素之測試呈 18· 一種包含如申請專利範圍第 項所述之胎盤幹細胞的組合物。 19. 一種包含如申請專利範圍第 項所述之胎盤幹細胞的藥學組合物。 2 0· 一種包含如申請專利範圍第 項所述之胎盤幹細胞的冷凍保存胎盤幹 21· —種治療一患者之方法，其至 用一治療有效劑量之如申請專利範圍第 項所述之胎盤幹細胞。 22 _ 一種取得一胎盤幹細胞之方法 分離一種具有至少一下列特徵之胎盤幹 b·對細胞標記 CD14、CD34 CD 1 3 3/2、細胞角質蛋白7、溫偉伯J 陰性反應。 1 、 12 、 14 或 17 1 、 12 、 14 或 I7 I 、 12 、 14 或 I7 細胞。 >包括對該患者使 II 、 12 、 14 或 I7 ，該方法至少包括 細胞： CD29 、 CD44 、 、CD166、SH-3、 -4、TRA-1-60 與 、CD45 、 AC 或 ,因子、HLA-DR、 31 200523368 HLAG、血型醣蛋白A、胎盤鹼性磷酸酶與β-人類絨毛 膜性腺激素之測試呈陰性反應；或 c·對細胞標記 CD9、CD13、CD29、CD44、

   CD90/Thy-1、CD105/SH-2/endoglin、CD166、SH-3、 SH-4、間絲蛋白、：HLA-ABC、SSEA-4、TRA-1-60 與 TRA· 1-81之測試呈陽性反應，且對細胞標記CD14、 CD34、CD45、AC或CD133/2、細胞角質蛋白7、溫偉 伯氏因子、HLA-DR、HLA G、血型醣蛋白A、胎盤鹼 性磷酸酶與β -人類絨毛膜性腺激素之測試呈陰性反 應0 23. 如申請範圍第22項所述之方法，其中該胎盤幹 細胞為多能型。 24.如申請範圍第22項所述之方法，其中該胎盤幹 細胞為潛能型。

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