TW200521236A - Method for generating non-human mammalian chimeric embryo - Google Patents

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200521236 玖、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一去除透明帶（zona pellucida)之非人類1-細胞 期胚至桑椹胚(morula)在微量離心管（Eppendorf vial)中與新鮮或 剛解凍之細胞混合培養液共同培養（coculture)以得到非人類之哺 乳動物叙合胚之方法。 【先前技術】 最前基因轉殖動物（transgenic animal)之建立係利用分子生物 學方法將外源基因顯微注射（microinjection)入原核胚（pronucleus embryo)，使該基因與胚胎細胞之基因組整合；基因轉殖動物之建 立可幫助了解特定基因於動物體内所扮演之功能。最早建立成功 的基因轉殖動物是小鼠，由於建立基因轉殖小鼠（transgenic mouse) 比建立其他大型基因轉殖哺乳動物要省時、省力，因此基因轉殖 小鼠於生命科學研究領域已成為最廣泛的應用。 目前建立基因轉殖小鼠普遍之方式係為DNA胚原核顯微注 射（pronucleus microinjection)，其缺點是外源構築DNA序列係以 隨機多點或單點方式插入染色體DNA，因此同一 DNA序列通常 必須有3〜5種以上基因轉殖小鼠系才較有把握確定其功能。此法 產製相對較簡單，惟後續配種、維持及研究，勞心又勞力，因此 部分此#研究逐漸轉成以胚幹細胞(enabryonic stem，ES，cell)做基 因定位（gene targeting)，經選殖確認後做轉殖小鼠；台灣目前部 分研究亦朝此方向發展。此法只要有一頭具性腺遺傳（germline transmission)基因定位轉殖公小鼠即可在配種後充分做後績相關 研九’此在大多數DNA序列於活體内（/w wvo)分時(temporal)及分 區（spatial)生理意義的瞭解及作用機制的探討已經証實極有效 200521236 率，未來亦不易被取代。本法在選殖及確認DNA染色體同源互 換（homologous recombination)的胚幹細胞純群（subclone)雖然耗 時’但技術已相當成熟，以之所產製的嵌合小鼠也不難得到；目 前最大的瓶頸反而是嵌合小鼠性腺遺傳機率高低不一，或者為零 (通常花半年左右時間確定），此問題所造成的時間落後性一直困 擾全世界所有研究人員，台灣目前部份研究室（例如中研院生醫 所、分生所、陽明大學微免所、神經所以及台大醫技系等）亦面臨 同樣問題。顯然具性腺遺傳能力嵌合小鼠的獲得最具關鍵。新 近，RNAi (RNA interference)技術發展快速，有部分取代以胚幹 細胞做基因定位趨勢（曾及傅，2003)。 嵌合胚（chimeric embryo，胚含有非本身細胞者稱之）、嵌合 小鼠的獲得，目前普遍以顯微注射法（miCIOinjecti〇n)及聚合法 (aggregation)為主要產製技術（Bradley，1987; Wood W a/·, 1993a; Hogan ei α/·，1994; Nagy ei α/·，2003;李，1992 ;李等，2003)， 共同培養法（coculture) (Wood ei α/·，1993b; Suzuki α/·，1994; Ueda ei “/·，1995b; Shimada ei α/·，1999)採用者較少。 顯微注射法以直接將「新鮮」胚幹細胞打入3·5天囊胚腔為 主流。此法發展成熟，產製嵌合小鼠結果穩定；惟需要昂貴顯微 操作系統（最便宜者約新台幣1〇〇萬）及設備，且操作者需長時間 訓練。使用此法，技術純熟者平均每小時僅能完成3〇〜4〇個囊胚 注射（Bradley，1987; Hogan ei α/·，1994),施打速率有系統侷限， 因此通常付費委由專門單位執行。此法雖可有效得到嵌合小鼠， 惟具性腺遺傳能力嵌合小鼠比率變異極大，需花時間配種確認。 另一種做法係直接將新鮮胚幹細胞打入2.5天8'細胞期胚，此法 效果不一；或與3.5天囊胚顯微注射相當（papai〇ann〇u and J〇hns〇n， 1993; 2000)，或可提高具性腺遺傳能力嵌合小鼠比率（T〇kunaga 200521230 and Tsunoda，1992)，或使原來不具性腺遺傳能力胚幹細胞所得嵌 合小鼠具性腺遺傳能力（Tokunaga and Tsunoda，1992)，惟8-細胞 期胚顯微注射技術面相對較囊胚者困難，採用者極少。 聚合法及共同培養法則較為簡單，原理係利用去除透明帶胚 及胚幹細胞極粘特性，使之互粘後一起發育成嵌合胚。不需要昂 責儀器及設備，操作者也不需要長時間訓練，主要缺點是後續嵌 合小鼠及性腺遺傳能力重複性變異較大。 •聚合法主要做法：配種後去除透明帶2.5天8»細胞〜桑椹胚二 個一組（Bradley，1987, Wood ei W·，1993a; Shimada ei α/·，1999)或 單獨一個胚（Khillan and Bao，1997 ; Kondoh α/·，I999)，在細 菌用培養皿上凹洞與「新鮮」胚幹細胞聚合培養i〜4小時，洗出 喪合胚、隔夜培養後，胚移置。本法前者最主要的缺點是必須使 用兩個胚（性染色鱧為XX或χγ)為一組，此於近交品系小氣（自 然配種每頭平均所得有效胚僅為4〜5個）明顯不利；本法後者（一 個胚）效果明顯較差（Khillan and Bao, 1997; Kondoh ei α/·，1999)。 共同培養法以去除透明帶2.5天8-細胞〜桑椹胚直接在細菌 用培養皿（Wood ei a/·，1993b; Shimada w α/·，1999)或微滴（droplet,

UedaeM/·，1995b)與胚’幹細胞隨機共同培養^5小時，洗出後合 胚、隔夜培養後，胚移置。本法最主要的缺點是結果明顯較上述 其他方法差（Suzuki ei α/·，1994; Ueda ei a/·，1995b)。 胚幹細胞和4rx胚聚合或顯微注射，胚移置後，可以「剖腹 產」得到由此胚幹細胞所形成之小鼠（Embryonic stem cell-derived mouse) ’且此小鼠具正常生殖遺傳能力（Nagy以“厂，1993; Ueda以 aL, 1995a; Wang et al.9 1997; Eggan et aL, 2001; Amano et al., 2001;SchWenketal.，2003)。已發表報告顯示，胚幹細胞和如胚 聚合或顯微注射，胚移置後，得到由此胚幹細胞所形成之小鼠比 200521236 率約5% ; Egganeia/ (2〇〇1)以F1雜交小鼠胚幹細胞顯微注射入 4Π囊胚，將之推升為14.8% (51/344)。 、_胚幹細胞和4n胚組合，目前以二個胚在細菌用培養jdl上凹 5 聚 δ 法（Nagy α/，1993; Nagy and Rossant，1993; Ueda W α/·， a)或囊胚顯微注射法(Wang ei α/·，1997; Eggan fl/·，2001; Aman〇etal”2〇〇i)為之；前者缺點有如上述，後者則因體外培養 •5i 〇·5天所得有效4n囊胚約僅50± 10%。兩者在產製效率上明 顯仍有極大改善空間。 美國專利第5,449,620與第6,281，408號係揭露兩種關於產製 I合胚、喪合小鼠之技術，前者係盟上凹洞聚合法，後者則以微 孔盤（microwell plate)共同培養；惟兩者都需二個胚一組一組處 jrm 、回收’相當耗費時間與人力，亦不利於量產。 、綜前所述，雖然目前有多種產製嵌合胚、嵌合小鼠之技術， “、、而其多半具有無法突破之瓶頸，例如：需要昂貴儀器及設備、操 必須經過長期訓練以具備純熟的操作技巧，或是操作過程過 於繁項無法大量產製等缺點；因此，若能研究開發一套克服前述 缺•點之產製嵌合胚、嵌合動物之技術將可為本研究領域帶來相當 大之助益。 【發明内容】 有別於習知嵌合胚、嵌合動物製造技術之缺失，本發明係提 2種產製非人類之哺乳動物嵌合胚的方法，其步驟係包括··取 于田胞’取得去除透明帶（zona pellucida)之非人類1-細胞期胚至 、樓胚(m〇rula);將前述細胞與前述去除透明帶（zona pellucida) 之非人類1 -細胞期胚至桑椹胚（morula)於微量離心管（Eppendorf al)中混合培養液共同培養（cocuhure) —段時間以得到非人類「胚 、、田胞」聚合體（embry0-eeiiaggregate);以及繼續培養非人類「胚 200521236 •細胞」聚合體以獲得非人類欲合胚（chimeric embryo)。 前述之產製非人類之哺乳動物嵌合胚的方法，係可進一 步包括以下步驟：將前述之非人類嵌合胚經由胚移置（embryo transfer)入非人類受胚動物（recjpient)體内；以及使前述非人類後 合胚於前述非人類受胚動物體内發育至妊娠滿期而得到非人類 德:合動物（chimera)或得到由非人類胚幹細胞所形成之動物 (embryonic stem cell-derived animal)。本發明之另一目的係提供一 種產製非人類之嵌合哺乳動物的方法，其步驟係包括：取得細 胞；取得去除透明、帶（zona peiiucida)之非人類K細施期胚至桑椹 胚（morula)，將前述細胞與前述去除透明帶（zona pellucida)之非人 類1-細胞期胚至桑椹B(morula)於微量離心管（Eppend〇rf vial)中 混合培養液共同培養(coculture)一段時間以得到非人類r胚_細胞」 聚合體（embry〇-ceii aggregate);繼續培養非人類厂胚_細胞」聚合 體以獲得非人類嵌合胚（chimeric embryo);將前述之非人類欲合 胚經由胚移置（embryo transfer)入非人類受胚動物（recipient)體 内；以及使前述非人類嵌合胚於前述非人類受胚動物艘内發育至 扭娠滿期而得到非人類喪合動物（chimera)或得到由非人類胚幹細 胞所形成之動物（embryonic stem cell-derived animal)。 利用本發明之產製非人類之哺乳動物嵌合胚的方法係可成 功地將别述非人類欲合胚成功埋植（implantation)入非人類受胚動 物’並於妊娠滿期時，可自然分娩或剖腹產得到非人類嵌合動物 (chimera)或得到由非人類胚幹細胞所形成之動物（embry〇nic stem cell-derived animal) ° 前述在微量離心管中共同培養時，係可視實際操作需要而使 用合適的培養液’包括’例如，但不限於：STO、KSOM、 KSOM-AA、CZB或M16培養液等；亦可依照需要，於培養液中 200521236 添加有合適濃度之血清（serum)或化學粘著劑，例如：凝集素 (lectins) 〇 前述在「胚_細胞」聚合艘、丧合胚培養所用之培養液，係可 視實際操作需要而使用合適的培養液，包括，例如，但不限於： STO、KSOM、KSOM-AA、CZB或M16培養液等；亦可依照需 要，於培養液令添加有合適濃度之血清。 前述之方法所使用之細胞可為所有種類細胞株（cell line)細 胞或非株化初代細胞(primary cell);可以是經純化（purified)或未 經純化處理之細胞；亦可以是遺傳物質（DNA或RNA)未經改變或 經過改變之細胞，例如：基因隨機插入(random insertion)、基因 定位（gene targeting)等改變者0 前述之去除透明帶1-細胞期胚〜桑椹胚可以是正常染色體 二套（2n)或多套，例如：四套（4n)或八套（8n)者。 前述之取得去除透明帶之非人類1-細胞期胚至桑椹胚之方 式係包括活體内（//2 Wvo)發育、活體外（/w vz7ro)培養系統或混合活 艘内發育和活艘外培養系統所得。 前述之方法所使用之細胞及去除透明帶之非人類丨_細胞期胚 至桑椹胚之來源係為同種（species)或不同種非人類之哺乳動物。 前述方法所述之胚移置入非人類受胚動物體内非人類受胚 動物之體内係包括移置入非人類受胚動物之輸卵管、子宮或子宮 角。 前述方法所使用之微量離心管係可為任何規格管狀產品，其 材質為可供滅菌處理（例如，但不限於，高壓滅菌、射線照射、 酒精滅菌、紫外線滅菌、乾熱滅菌等）、其容量不拘。 刖述之哺乳動物，，係指韋氏醫學桌上辭典407 (Webster，s 200521236

Medical Desk Dictionary 407) ( 1986)所定義之較高等脊椎動物 (higher vertebrate)，包括哺乳動物綱（Mammalia class)之任何 組員，本發明之方法係可使用於除人類以外之前述定義之哺乳動 物0 【實施方式】 本發明係使用專利申請人研究室所自行建立、表現綠色勞光 之小鼠胚幹細胞，其係已經過確定系統有效（即，可有效量產、製 造欲合胚)（李等，2003)。選擇綠色螢光蛋白Γ在於其可於活體表現 並且可連續多天直接觀察、照像、記錄等便利性。以綠色螢光蛋 白為標幟，將可從表現綠色螢光胚幹細胞開始，共同培養、嵌合 胚、胚移置、喪合小鼠檢測、回交（backcross)測試是否具性腺遣 傳能力等所有研究過程，做最好且準確的監控。 以下實施例係用於進一步闞述本發明之優點，並非用於限制 本發明之申請專利範圍。 實施例一：利用本發明之方法產製小鼠嵌合胚 小鼠來源及飼巷環请 小鼠主要來自台大動物中心，少數來自國科會國家實驗動物 繁殖及研究中心。小鼠飼養及超數排卵、外科手術皆按照2001 年「中華民國實驗動物學會」所出版之「實驗動物管理使用指南」 進行。 小鼠飼養在本所傳統乾淨(elean conventional)等級嚷裔類動 物房，各動物室（約1〇平方公尺）空氣、正壓、光照、溫度完食獨 立控制。每一個別動物室正壓及新鮮空氣由HEPA及壓力釋放器 維持。05:00〜19:00以40 W日光燈4管自動控制光照週期 11 2005,21236 (14L:10D)。分離式冷氣、葉片式自動控溫加熱器維持動物室溫度 (18〜26°C)及相對濕度。小鼠養在高壓滅菌標準小氣範，使用進: 小鼠飼料、墊料，瓶裝高壓滅菌自來水充分供應；每星期更換丨〜之 次0 胚及細敝焙卷條件 本研究建立小鼠胚幹細胞株培養條件如李（1992 ; 1999)所 示，所使用之ESC培養液成分係經小量修改，如表1所示。小鼠 胚在C〇2培養箱培養為KSOM-AA培養液（表2) (Erbach e/ a/， 1994; Biggers 以 α/·，2000) ; C〇2 培養箱外操作時以 ksom-AA 培 養液添加20·85毫莫耳濃度HEPES (Sigma Η 6147)為之。STO _ 培養液成分及STO飼養層細胞（feeder cell)製備如李（1992 ; 1999) 所示。 表1·小鼠胚幹細胞株建立前後所用之ESC培養液d，e 成分 廠牌及編號 濃度 劑量 DMEM (4,500 毫克葡萄糖/ Sigma D 6780, D 7777 升） 1 瓶 (pack) 非必須胺基酸 Sigma Μ 7145 1.0% 13.2毫升 B- 乙基硫醇 -mercaptoethanol) ( β Sigma Μ 6250 0.1毫莫耳濃度 (mM)a 13·2毫升 白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor)5 Chemicon LIF2010 StemCell Tech. 02740 106單位 (units) 盤尼西林-鏈 (penicillin-streptomycin) 黴 素 Gibco Cat· No. 15070-014 1.0% 13.2毫升 碳酸氩鈉(NaHC03) Gibco Cat. No. 11810-025 33.88毫莫耳濃度 3.7克 胎牛血清（Fetal serum，FBS) bovine HyClone限定及測試之批次 或胚幹細胞等級 20.0 %c 260.0毫升 二次水(ddH20) 1，000·0 毫 升 12 200521236 猫瓶預 1，299·6毫 ________ 升 a製備0.1毫莫耳濃度之Β-乙基硫醇：將10微升(al)B-乙基硫酵溶於η.3毫升5 "" 磷酸鹽衝溶液(PBS)。 b可視STO飼養層細胞情況良好與否而決定是否省略 e —般培養可為15%。 d利用5N鹽酸（HC1)或5N氩氧化納（NaOH)調整pH值至7.卜滲透壓（osmdarity) 應為320 ± 15mOsm/公斤水。過濾除菌(filtersterilize) (0.25微米）後保存於 4°C，使用前溫熱至約30°C。 e 1 %L·麵胺後(L-glutamine) (Gibco Cat· No. 25030-081; 200 毫莫耳滚度，29.2 毫克/毫升） 應每2-3星期補充一次。 表2·小鼠胚培養所用之KSOM-AA培養液 成分 廠牌及編號 濃度(毫莫耳濃度） 份量(克/升) 氣化鈉(NaCl) Sigma S 5886 95.00 5.553 氣化鉀(KC1) Sigma P 5405 2.50 0.186 磷酸氩鉀(kh2po4) Sigma P 5655 0.35 0.048 水合硫酸鎂 Sigma M 7774 0.20 0.049 (MgS04 · 7H20) 乳酸納（sodium Sigma L 7900 (60% 10.00 1.870毫升 lactate) syrup) 葡萄糖(glucose) Sigma G 6152 0.20 0.036 盤尼西林(penicillin) Sigma P 4687 100單位/毫升 0.060 鍵擻素(streptomycin) Sigma S 1277 0.050 丙 8¾ 酸納（sodium Sigma P 4562 0.20 0.022 pyruvate) 碳酸氩鈉(NaHC03) Sigma S 5761 25.00 2.100 水合氣化鈣(CaCl2 · Sigma C 7902 1.71 0.252 2H20) L- 麵胺酸 Gibco Cat. No. 1.00 5.000毫升 (L-glutamine) 25030-081 13 200521236 EDTA · 2Na · 2H20 Sigma E 6635 0.01 0.004 牛血清蛋白(BSA)(Fr. V) Sigma A 3311 1.000 MEMNEAA Sigma M 7145 5 MEM EAA Sigma M 5550 10 二次水 984.13毫升 aKSOM培養基係可以相似於M16母液(stock)成分之母液來製備。利用〇.5N Μ酸（HC1) 或〇·5 N氩氧化鈉（NaOH)調整pH值至7.0，滲透壓（osmolarity)應為275 ± 15 mOsm/ 公斤水。過濾除菌(filtersterilize)(0.25微米）後保存於4°C最多十天 純化表現綠色螢光之小鼠胚幹細胞ESC 26GJ9012-8-2 繼代後培養1.5 ± 0.5天，長滿在含STO飼養層細胞 (feeder cell) 35 毫米（mm)培養皿的小鼠胚幹細胞ESC •26GJ9012-8-2【（源自超數排卵（superovulation)、體表毛色為白色 (albino, cc)之純系（inbred) BALB/c母小鼠，和艘表毛色主要為白 色（cc)或淡粟鼠色（light chinchilla，cceh)之純系129/SvJ公小鼠（購 自美國 The Jackson Laboratory)自然配種後 3·5 天（days post coitum，dpc)囊胚）】（李等，2003)，以 〇·25% 胰蛋白酶(trypsin) 解離成單細胞懸浮液（第一 A圖），第一 B囷係為與第一 A圊同一 視野之綠色螢光表現圖，其中第一 A圖之右下尺規為50微米（// m)，第一 B囷之右下尺規為1〇〇微米，由第一 B圖可發現表現綠 色螢光之胚幹細胞比例欠佳。取約二分之一細胞懸浮液置入一盤 含ESC培養液之空白60毫米培養皿，於37°C、5%C02靜置約 80分鐘。未貼附之上層細胞懸浮液（大多為活力欠佳或死亡之細 胞）吸掉後，加約2毫升（mL) ESC培養液輕輕洗下剛貼上細胞 (>85%為胚幹細胞），於顯微鏡底下觀察，其結果如第二A圖與 第二B圖所示（兩圖為同一視野，其中第二A圖之右下尺規為50 200521236 微米，第二B圖之右下尺規為100微米），發現表現綠色螢光之 胚幹細胞之比率已經明顯提升。將該些細胞置入一盤空白60毫 米培養皿第二次靜置約20分鐘。回收上層未貼附細胞懸浮液（大 多為活力佳胚幹細胞）後，173 X g、離心3分鐘二次，以STO 培養液調整細胞浪度約為4·0± 1·0 X l〇V毫升。本法胚幹細胞純 化效果佳，平均可達約97%。另外，剛解凍小鼠胚幹細胞株ESC 26GJ9012-8-2,以連續二次靜置法（100分鐘及30分鐘），亦可得 到純化效果佳，並表現綠色螢光之胚幹細胞（如第三A圖與第三B 圖所示，其冲第三A圖之右下尺規為100微米，第三B圖之右下 尺規為200微米）。 去透明帶胚輿純化胚鈐細胞在微量離心營（Eppendorf vial)共同培 鲞 體表毛色為白色（albino, cc)之遠交品系（outbred) ICR母小鼠 超數排卵後，和體表毛色主要為野鼠色（agouti)之B6CBAF1公小 鼠自然配種。取配種後2.5天4〜8-細胞期胚，以acidified Tyrode 或pronase溶液去除透明帶後，移入KSOM-AA培養液備用。 取高壓滅菌乾燥後1.5毫升微量離心管，加入0.8毫升純化 後小鼠胚幹細胞ESC 26GJ9012-8-2 (濃度約為4·0± 1·0 X 1〇5/ 毫升），室溫靜置5分鐘後，從液面直下加入已去除透明帶胚，移 入37°C、5% C02培養箱靜置共同培養約2± 1小時。在微量離 心管共同培養時，胚幹細胞濃度高、時間久，則胚粘上細胞的機 率、數目及二個或以上胚互粘機會上升；反之，則下降。同一微 量離心管内’去除透明帶胚數越多則二個或以上胚互粘機會加 大。 - 嵌合胚隔夜培卷德路t 去透明帶胚與純化小鼠胚幹細胞ESC 26GJ9012-8-2在1.5 15 200521236 毫升微量離心管靜置共同培養約2小時後，從微量離心管底部回 收「胚-細胞」聚合體（embryo-cell aggregate)(胚回收率> 90%，胚 粘著細胞比率〜90%);用直徑約200微米口吸管（mouth pipette)， 以吸放方式將聚合體上粘著鬆散之細胞去除後，其係如第四A囷 (右下尺規為100微米）所示，全部有14個胚，其中含四個具 透明帶正常胚（8細胞期胚二個、桑椹胚二個）為對照胚、單個胚五 個、二個胚粘在一起三個、三個胚粘在一起二個。另外，與第四 A圖同一視野.之第四b圊（右下尺規為100微米）係可清楚觀察 到聚合艘表面有粘著之綠色螢光胚幹細胞。，將該聚合體移入 KSOM-AA培養液微滴（dr〇plet)(上層覆以輕級礦物油），放進37 °C、5% C02培養箱開始隔夜培養。 隔夜培養後，「胚-細胞j聚合體有超過80%可正常發育下 去，期間，原來在「胚-細胞」聚合體表面的綠色胚幹細胞，則隨 胚發月成桑椹胚過程混成嵌合胚，如第五A圖（右下尺規為1〇〇 微米）所示’十個「胚·細胞」聚合鱧隔夜培養後，原來在「胚_ 細胞」聚合體表面的綠色胚幹細胞，已隨胚發育成桑椹胚過程轉 移入胚内混成嵌合胚。四個含透明帶對照胚已發育成三個早期囊 胚及一個桑椹胚。第五B圖（右下尺規為1〇〇微米）與第五A圖 係同一視野。此嵌合桑椹胚繼續隔夜培養可發育成嵌合囊胚，而 綠色胚幹細胞主要分布在内細胞群（inner eell mass)，係如第六a 圖與第六B囷（兩囷係為同一視野，右下尺規均為1〇〇微米），其 中四個正常對照胚已發育為孵化中囊胚。 嵌合胚移置 「胚-細胞」聚合體在KS〇M-AA培養液微滴隔夜培養成嵌合 桑椹胚或嵌合囊胚後，移置入白色ICR配種後〇 5或2 5天假孕 母小鼠輸卵管或子宮角，平均約19或17天後分娩。第七A圖與 200521236 係顯示十二個嵌合囊胚（本圖胚來自ICRX B6CBAF1)移置入白 色ICR配種後〇·5天假孕母小鼠輸卵管後’自然分挽所得二頭欲 合小鼠，第七B囷顯示該三頭嵌合小鼠食身表現綠色螢光（分娩 後第五天），此顯示本發明之方法具高度嵌合比率。 嵌合小鼠性腺it傳能力 將第七圖中一頭體表正常並表現綠色螢光雄性後合小鼠自 然配種回交ICR，C57BL/6母小鼠，分娩〆胎產^ 14頭小鼠’其 中9頭表現綠色螢光（第八A圖與第八0圖），結果顯不該欲合 小鼠具性腺遺傳能力。 ^ 去透明帶4n胚與純化胚幹細胞在微量離」2管（EPP叫一rf via〖)先 同培卷 第九A圖（右下尺規為100微米）係顯示去透明帶4n胚 與純化小鼠胚幹細胞ESC 26GJ9012-8-2 (P15)在1.5毫升之微 量離心管（Eppendorfvial)靜置共同培養約2小時後，從微量離 。g底4回收所得之「胚-細胞」聚合體（embry0-ceii aggregate)， 表面顯示有粘著之綠色榮光胚幹細胞，全部有19個胚，其中含

四個具透明帶4η 4細胞期胚四個為對照胚、單個胚八個、二/ :粘在：起二個、三個胚粘在一起一個。第九Β圖（右下尺彡 …1〇〇微米）係與第九Α圖為同_視野之螢光觀察圓。 個4第「十么圖（右下尺規為1〇0微米）係顯示第九A囷之] 個4η胚'細胞」聚合體隔夜培 =:色_胞，已隨胚發育：二=: 混成嵌合胚。四個含透明帶& ㈣八胚i 個胚由三個胚粘在一起發育:、、一已發育成四個桑椹胚、_ 育而成、六個胚由單個胚發育二個胚由二個祕在一心 微⑽第十A圖為同一:野 17 200521236、 第十一 A圖（右下尺規為100微米）係顯示第十A圊之嵌 合4n桑椹胚繼續隔夜培養一晚後，可發育成嵌合囊胚，而綠色 胚幹細胞主要分布在内細胞群（inner eell mass)。四個4n對照胚 已發育為孵化中囊胚。第十一 B圖（右下尺規為1〇〇微米）係 與第十一 A圖為同一視野之螢光觀察圖。 本實施例證實，去透明帶4n胚與純化ESC 26GJ9012-8-2 胚幹細胞在微量離心管（Eppendorf vial)共同培養亦得有嵌合 胚，且該嵌合胚經過胚移置後「自然分挽」（目前由他人所發表 之報告皆以剖腹產為之）得有由此胚幹細胞所形成之小鼠 (embryonic stem cell-derived mouse)(可重複得到），並表現表現 綠色螢光，回交配種顯示該嵌合小鼠具性腺遺傳能力並表現綠 色螢光。 綠色螢光觀察與照相 本發明之實驗操作係以Zeiss Axiovert 35倒立顯微鏡螢光系 統做綠色螢光細胞與胚之觀察及照相，光源為OSRAM HBO 50 W/AC，200 V高壓水銀弧光燈。EGFP最佳激發波長為488-490奈 米（nm)，最佳發散波長為507-509奈米（綠色光最佳波長範圍約 520-530 奈米）:、；所用螢光濾片組（filter set 09, Cat· No· 487909)含 BP 450-490 激發（光源）濾片（exciter filter)、FT 510 分光片 (dichromatic beam splitter)及 LP 520 阻光遽片（barrier filter)。觀 察勞光時，使用 UVG_50 (Spectronics Co·，Westbury，NY，USA)紫 外光護目鏡。 顯微鏡照相時，使用 Kodak Ektachrome P1600 color reversal film，ASA 值設定為 400 或 800 或 Kodak Ektachrome 400 底片。 單眼照像機本體為Contax 167/MT，自動曝光時間可補償到最久 (+2，可使用防震系統避免震動）；或Zeiss MC100照像系統。通 200521236 常在晚上無散光（光害）時攝影，樣本置於培養孤或蓋玻片上，並 覆以無顏色生理溶液。 綠色螢光小鼠照相時，底片同上。以UVP公司 (http://www.uvp.com ; Upland，cA，USA)長波（365 奈米）紫外光燈 (視光強度可同時使用數台）為光源（通過藍色玻璃）。照像機本體為

Nikon F-401 ’ 鏡頭為 Nikon AF MICRO NIKKOR (55 毫米， 1:2.8) ’使用黃色吸收濾片（黃色的互補色藍色被吸收掉，52〇奈 米以上光波通過）為阻光濾片。照相時，使用腳架、光圏調最大、 光源拉進小鼠（必要時可麻醉）、曝光時間拉長。 第一圖至第十一圓係由幻燈片掃描成圖檔後，以Ph〇t〇sh〇p 6·〇·1影像軟體進行影像亮度、對比及色調潤飾（不做基本改變）。 綜前所述，本發明係綜合習知技術優點、避開缺點，發展一 套利用去除透明帶2·5天2η 8-細胞〜桑椹胚、4η 3-細胞〜桑椹胚直 接在1.5毫升之「微量離心管（Eppendorf yial)」與新鮮或「剛解 /東」並表現綠色勞光蛋白之小鼠胚幹細胞隨機共同培養，選擇微 量離心管乃因其具有尖底、廣口、可高壓滅菌、隨手可得且便宜 之優點，選擇剛解凍之小鼠胚幹細胞則可以避開例行、昂貴且花 時間的培養工作。本發明產製非人類嵌合胚之方法係可以極有效 率（一次可處理100〜200個胚）、便宜、可大規模單人操作方式， 以便提高產製嵌合胚、具性腺遺傳能力嵌合小鼠及由胚幹細胞所 形成之小鼠（ES cell-derived mouse)技術。 S前習知各種利用小鼠胚幹細胞產製嵌合胚、嵌合小鼠及由 胳幹細胞所形成之小鼠技術已可常規化操作，惟各具優缺點。本 發明係利用既存便宜材料及各實驗室都有之立體顯微鏡所發展 出之新操作技術，具使用設備便宜、操作簡單（約新台幣5〜10萬 元立體顯微鏡配合口吸管即可，不須使用昂貴顯微操作系統一約 200521236 新台幣100萬元），快速省時（每批可以處理數以百計胚）、省技術 人力（約一個月訓練即可成功操作，顯微操作最少需三個月以上訓 練才有機會上手）、省胚（不必用二個胚聚合成一嵌合胚）、省錢（微 量離心管一個約新台幣一元）等特色。此外，本法亦適用於小鼠以 外其他之非人類哺乳種動物以產製嵌合胚，顯示本發明具有廣泛 的產業應用面。 雖然本發明已以實施例揭露如上，然其並非用以限定本發 明，任何熟悉此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍内，當可 -作各種之更動與潤飾，因此，本發明之保護範圍，當4後附之申 請專利範圍所界定者為準。 【圖式簡單說明】 第一 A圖係顯示小鼠胚幹細胞£50 26019012-8-2經0.25% 胰蛋白酶解離成懸浮之單細胞。 第一 B圖係為與第一 A圖同視野之螢光觀察圖。 第二A圖係顯示懸浮之小鼠胚幹細胞ESC 26GJ9012-8-2經 一次靜置約80分鐘所得之表現螢光之胚幹細胞。 第二B圖係為與第二A圖同視野之螢光觀察圖。 第三A圖係為剛解凍小鼠胚幹細胞株ESC26GJ9012-8-2,以 連續二次靜置法，所得之表現螢光之胚幹'細胞。 第三B圖係為與第三A圖同視野之螢光觀察圖。 -η 第四Α圖係顯示去透明帶胚與純化小鼠胚幹細胞ESC 26GJ9012-8-2在1.5毫升微量離心管靜置共同培養約2小時 後，從微量離心管底部回收之「胚-細胞」聚合體。 第四B圖係為與第四A圖同視野之螢光觀察圖。 第五A圖係顯示經隔夜培養後之「胚-細胞」聚合體發育成 200521236 嵌合胚。 第五B圖係為與第五A圖同視野之螢光觀察圖。 第六A圖係為第五A圖之嵌合桑椹胚經過繼續隔夜培養後發 育成嵌合囊胚。 第六B圖係為與第六A圖同視野之螢光觀察圖。 第七A圖係顯示嵌合囊胚移置入白色ICR假孕母小鼠輸卵管 後，自然分娩所得之三頭嵌合小鼠。 第七B圖係為第七A圖小鼠之螢光觀察圖。 第八A圖係顯示綠色螢光雄性嵌合小鼠自然配種回交ICR， C57BL/6母小鼠後，母小鼠所產下之14頭小鼠其中9頭表現表現 綠色螢光。 第八B圖係為第八A圖小鼠之螢光觀察圖。 第九A圖係顯示去透明帶4n胚與純化小鼠胚幹細胞ESC 26GJ9012-8-2在1.5毫升微量離心管靜置共同培養約2小時 後，從微量離心管底部回收之「胚-細胞」聚合體。 第九B圖係為與第九A圖同視野之螢光觀察圖。 第十A圖係顯示經隔夜培養後之4n「胚-細胞」聚合體成為 4n欲合胚。 第十B圖係為與第十A圖同視野之螢光觀察圖。 第十一 A囷係顯示4n桑椹胚繼續隔夜培養後發育成嵌合囊 胚。 第十一 B圖係為與第十一 Λ圖同視野之螢光觀察圖。 【主要元件符號】 無 21 200521236 參考文獻 中華民國實驗動物學會。2001。實驗動物管理使用指南。臺北。 李坤雄。1992。小鼠胚幹細胞株之建立》中畜會誌21:267-282。 李坤雄。1999。小鼠胚幹細胞培養。蔡嘉寅，莊榮輝編：生物技術方法， 卷三，鄭登貴，劉麗飛主編：細胞組織培養與轉殖，pp 2^“，台灣大學 生物技術研究中心，臺北。 李坤雄’ 2003。螢光小鼠之產製。黃木秋編：動物基因轉殖技術與實驗， ρρ· 131-143。動物基因轉殖與疫苗發展技術教學資源中心主編，教育部顧 問室補助出版。 曾英傑，傅淑玲。2003。基因轉殖技術與RNAi效應、rcAS-TVA系統。 黃木秋編:動物基因轉殖技術與實驗，ρρ· 71-88。動物基因轉殖與疫苗發 展技術教學資源中心主編，教育部顧問室補助出版。 李坤雄，杜清富，吳信志，徐維荃。2003。由小鼠胚幹細胞株產製表現綠 色螢光且具高性腺遺傳能力嵌合小鼠。中畜會誌32:143-154。

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Claims (1)

1. 200521236 拾、申請專利範圍： 1·一種產製非人類之哺乳動物嵌合胚（chimeric embry〇)的方法，其 步驟係包括： 取得細胞； 取得去除透明帶（zona pellucida)之非人類1-細胞期胚至桑 椹胚（morula); 將前述細胞與前述去除透明帶（zona pellucida)之非人類1-細胞期胚至桑椹胚（morula)於微量離心管（Eppendorf vial)中混 合培養液共同培養（coculture)τ段時間以得到非人類「胚-細 胞」聚合體（embryo-cell aggregate);以及 繼續培養非人類「胚-細胞」聚合體以獲得非人類嵌合胚 (chimeric embryo) ° 2·如申請專利範圍第1項所述之產製非人類之哺乳動物嵌合胚的 方法，其係可進一步包括以下步驟： 將前述之非人類喪合胚經由胚移置（embryo transfer)入 非人類受胚動物（recipient)體内；以及 使前述非人類嵌合胚於前述非人類受胚動物體内發育至 姓娠滿期而得到非人類欲合動物（chimera)或得到由非人類胚 幹細胞所形成之動物（embryonic stem cell-derived animal)。 3·如申請專利範圍第1項所述之產製非人類之哺乳動物嵌合胚 的方法’其中前述於微量離心管共同培養階段所使用之培養液 係包括·· STO、KSOM、KSOM-AA、CZB 或 Μ16 培養液等。 4·如申請專利範圍第3項所述之產製非人類之哺乳動物嵌合胚 的方法，其中前述培養液係可進一步添加血清或化學粘著劑。 5·如申請專利範圍第4項所述之產製非人類之哺乳動物嵌合胚 的方法，其中前述之化學粘著劑係為凝集素(卜(^113)。 27 200521236 6·如申請專利範圍帛1項所述之產製非人類之哺乳動物嵌合胚 的方法，其中前述於非人类貝「胚·細胞」聚合禮或非人類嵌合胚 培養階段所使用培養液係包括：ST〇、KS〇M、KS〇M-AA、CZB 或M16培養液等。 7·如申請專職^帛6項所述之產製非人類之哺乳動物喪合胚 的方法，其中刖述之培養液係可進一步添加血清。 8·如申請專祕圍帛1項所叙產製非人類之哺仙㈣合胚 的方法，其中前述之細胞為細胞株(cellline)細胞或非株化初代 細胞(primary cell) 〇 9·如申請專利範圍帛1項所述之產製非人類之哺乳動物後合胚鲁 的方法，其中刖述之細胞為經純化（pUrificati〇n)或未經純化處 理者。 10·如申清專利範圍第1項所述之產製非人類之哺乳動物佚合胚 的方法’其中刖述之細胞為遺傳物質未經改變。或經過改變者。 11·如申請專利範圍第1項所述之產製非人類之哺乳動物嵌合胚 的方法，其中前述之去除透明帶之非人類1-細胞期胚至桑椹胚 係包括二套或多套染色體。 12·如申請專利範圍第1項所述之產製非人類之哺乳動物嵌合胚 的方法’其中别述之取得去除透明帶之非人類1 -細胞期胚至桑 椹胚之方式係包括：活想内（Μ 發育、活體外⑽v/的)培養 系統或混合活體内發育和活體外培養系統所得。 13. 如申請專利範圍第1項所述之產製非人類之哺乳動物嵌合胚 的方法，其中前述之細胞及去除透明帶之非人類I細胞期胚至 桑椹胚之來源係為非人類之哺乳動物。 14. 如申請專利範圍第1項所述之產製非人類之哺乳動物嵌合胚 的方法，其中前述之細胞及去除透明帶之非人類1 ·細胞期胚至 28 200521236 i 桑椹胚之來源係可為同種（species)或不同種動物。 15·如申請專利範圍第1項所述之產製非人類之哺乳動物嵌合胚 的方法，其中前述之微量離心管係可為任何規格管狀品，其材 質為可供滅菌處理，其容量不拘。 16·如申請專利範圍第2項所述之產製非人類之哺乳動物嵌合胚 的方法，其中前述之非人類受胚動物之體内係包括：輸卵管、 子宮或子宮角。 17· —種產製非人類之嵌合哺乳動物的方法，其步驟係包括： 取得細胞； 取得去除透明帶（zona pellucida)之非人類1-細胞期胚至桑 椹胚（morula); 將前述細胞與前述去除透明帶（zona pellucida)之非人類1_ 細胞期胚至桑椹胚（morula)於微量離心管中混合培養液共同培 養（coculture) —段時間以得到非人類「胚-細胞」聚合體 (embryo-cell aggregate)； 繼績培養非人類「胚-細胞j聚合體以獲得非人類嵌合胚 (chimeric embryo)； 將前述之非人類喪合胚經由胚移置入（embryo transfer)非 人類受胚動物（recipient)體内；以及 使前述非人類喪合胚於前述非人類受胚動物體内發育至 扭娠滿期而得到非人類嵌合動物（chimera)或得到由非人類胚 幹細胞所形成之動物（embryonic stem cell-defived animal)。 18. 如申請專利範圍第17項所述之產製非人類之嵌合哺乳動物 的方法，其中前述於微量離心管共同培養階段所使用之培養液 係包括：STO、KSOM、KSOM-AA、CZB 或 M16 培養液等。 19. 如申請專利範圍第18項所述之產製非人類之嵌合哺乳動物 29 200521236 的方法，其中前述培養液係可進一步添加血清或化學粘著劑。 20. 如申請專利範圍第19項所述之產製非人類之嵌合哺乳動物 的方法，其中前述之化學粘著劑係為凝集素（lectins)。 21. 如申請專利範圍第17項所述之產製非人類之嵌合哺乳動物 的方法，其中前述於非人類「胚-細胞」聚合體或非人類嵌合胚 培養階段所使用培養液係包括：STO、KSOM、KSOM-AA、CZB 或M16培養液等。 22. 如申請專利範圍第21項所述之產製非人類之嵌合哺乳動物 的、方法，其中前述之培養液係可進一步添加血清。 23. 如申請專利範圍第17項所述之產製非人類之嵌合哺乳動物 的方法，其中前述之細胞為細胞株(cellline)細胞或非株化初代 細胞（primary cell) 〇 24. 如申請專利範圍第17項所述之產製非人類之嵌合哺乳動物 的方法，其中前述之細胞為經純化（purification)或未經純化處 理者。 25. 如申請專利範圍第17項所述之產製非人類之嵌合哺乳動物 的方法，其中前述之細胞為遺傳物質未經改變或經過改變者。 26. 如申請專利範圍第17項所述之產製非人類之嵌合哺乳動物的 方法，其中前述之去除透明帶之非人類1-細胞期胚至桑椹胚係 包括二套或多套染色體。 27. 如申請專利範圍第17項所述之產製非人類之嵌合哺乳動物的 方法，其中前述之取得去除透明帶之非人類1-細胞期胚至桑椹 胚之方式係包括··活體内（/w 發育、活體外（z>z ν/iro)培養系 統或混合活體内發育和活體外培養系統所得。 28. 如申請專利範圍第17項所述之產製非人類之嵌合哺乳動物的 方法，其中前述之細胞及去除透明帶之非人類1-細胞期胚至桑 200521236 椹胚之來源係為非人類之哺乳動物。 29·如申請專利範圍第17項所述之產製非人類之嵌合哺乳動物 的方法，其中前述之細胞及去除透明帶之非人類1-細胞期胚至 桑椹胚之來源係可為同種（species)或不同種動物。 30.如申請專利範圍第17項所述之產製非人類之嵌合哺乳動物的 方法，其中前述之非人類受胚動物之體内係包括：輸卵管、子宮 或子宮角。

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