TW200416044A

TW200416044A - Humanized anti-lymphotoxin β receptor antibodies

Info

Publication number: TW200416044A
Application number: TW092117964A
Authority: TW
Inventors: Ellen Garber; Kenneth Simon; Jose W Saldanha
Original assignee: Biogen Inc
Priority date: 2002-07-01
Filing date: 2003-07-01
Publication date: 2004-09-01
Also published as: AR040367A1; WO2004002431A2; NZ537965A; CA2491480A1; US20060222644A1; WO2004002431A3; US7429645B2; AU2003248782A1; EP1539793A4; EP1539793A2; JP2005532051A; CN1678625A

Description

200416044 玖、發明說明：相關申諳案本申請案申請對先前提出之美國臨時申請案編號第 60/392993號（申請於2002年7月1日）及美國臨時申請案編號第60/4 17372號（申請於2002年10月9日）的專利範圍優先權。該上述所引用之申請案其全部内容以引用方式併入本文中〇【發明所屬之技術領域】本發明係屬於免疫學和癌症診斷及治療領域。更特定而言係關於能專一對淋巴細胞毒素β受體（LT-p-R)的人類化抗體、產生這些抗體的細胞株、由這些抗體所製成之免疫化學物、及使用這些抗體的診斷方法。本發明亦關於在治療方法中單獨使用該抗體或與化學治療劑組合使用之用途。【先前技術】淋巴細胞毒素β受體（本文以LT-β-ΙΙ稱之）是腫瘤壞死因子家族的成員之一，其在免疫系統發展及免疫系統中之許多細胞（包括濾泡性樹突細胞及多種基質細胞種類）的功能性保留上所佔角色皆已被詳加敘述（Matsumoto et al·， Immunol· Rev. 156: m(1997)。已知乙丁邛氺的接合子包括 1/^1/^2和第二個接合子稱為乙1(}1^(1^111>16以1111111111111巧 8·2 1 (1998)) °吾人已經顯示LT-p-R的活化會誘發某些癌症細胞株在體内的自殺性細胞死亡（pCT/US96/0 1 386)。結合到LT-卜R上之專一性的人類化抗-LT-β-ΙΙ抗體對其個體具 86478 200416044 有最小的免疫抗原性，因此使用該抗體的治療將有益於治療或降低贅生物在個體（如人類）中之的發展、惡化或影響。【發明内容】 9 本發明係提供專一對淋巴細胞毒素β受體（lt_^r)的人類化抗體、產生這些抗體的細胞株、由這些抗體所作成的免疫化學物、及使用這些抗體的診斷方法。本發明亦關於該抗體在治療方法中單獨使用或與化學治療劑組合之用途。特定而言，本發明包含一種能專一地結合到LT-P-R(如人類的LT-P-R)上的人類化抗體。該抗體包含由SEQ ID N〇：工之fe：基殘基2 4到3 4、5 0到5 6及8 9到9 7所界定之輕鏈互補決定區，及/或由SEQ ID N〇：2之胺基酸殘基3 1到35、50 到65及95到102所界定之重鏈互補決定區，並且額外至少一個（如1、2、3或4)下列殘基在其輕鏈中：γ36、S49、丁63 及F87 ;或至少一個（如1、2、3、4、5或6)下列殘基在其重鏈中：Y27、T30、148、A67、L69 及 F91 (Kabat氏編碼原則）。在另一具體實施例中本發明包括一種抗體，該抗體如同上述的抗體能結合到LT-P-R相同的抗原決定位。在一具體實施例中，本發明的人類化抗體包含由SEQ ID N〇·· 6之胺基酸殘基1到107所界定之輕鏈可變區序列及/或由SEQ ID NO: 14之胺基酸殘基1到113所界定之重鏈可變區序列。該人類化抗體亦可能包含與表現第4類型huBHA 10 之CH〇細胞株：”殖株3D9" (ATCC專利寄存編號PTA-4726 ，寄存於20 02年9月27日）所產生之抗體相同的重及/或輕鏈多胜肽序列，如在實例7中所述。含有第4類型huBHAlO的 86478 200416044 殖株3D9是於2002年9月27曰寄存於美國菌種保存中心 (American Type Culture Collection, ATCC, 1080 1 University Boulevard，M_ssas，VA 20110_2209)並授予登錄編號 PΤΑ-4726。此寄存物將依國際承認用於專利程序之微生物寄存的布達佩斯條約加以保存。該寄存之進行僅為了方便熟習此項技術者。在另一具體實施例中，本發明之人類化抗體實質上仍保有其親源抗體（例如KW0 96/22788中所述之小鼠單株抗體 BHA10)的結舍特性。一具體實施例中本發明之人類化抗體是以功能性親合力來與LT-P_R結合，舉例來說’以約} pM 到約10 PM，或者約10 pM到約2〇 pM，或者钓2〇 ?1^到約3〇 PM ’或者約30 PM到約40 PM，或者約4〇 pM到約5〇 pM，或者約50 PM到約60 ΡΜ，或者約60 pM到約7〇 pM，或者約 70 PM到約80 PM ’及或者約8〇 pM到約9〇 pM，其中該功能性親合力是藉BIAC0RE(即使用無標記試劑的表面漿體共振）、或競爭性結合試驗來測定。、在另一具體實施例冲，本發明之人類化抗體是與一細跑毒性部分或毒素（例如惹麻毒素八鍵或假單胞成一免疫毒素型式。本發明之人相儿』 Μ 〇一、不^明之人類化抗體亦可以與化學户療藥物連結（例如阿黴素、、真矣 U長春鹼、放線菌素D、依 M WEtoposide)、順勤、胺歹葉酸及14_經柔 (Doxorubicin))。此外，本發卞 ^ 4β之抗體可做可偵測性# (例如連結上一可偵測部分、不σ 刀像疋例如放射性同位素）。太發明亦包含治療組合，舉例來五。人將其中該連結上細 86478 200416044 胞毒性部份或毒素的本發明人類化抗體用來與連結上化學

素、5FU、長春鹼、放 ^ L-2。或者，該細胞毒性因子可能 [。该化學治療藥物可能包括例如阿黴放線菌素D、依託泊苷（etop〇side)、順翻、胺曱葉酸及μ-羥柔紅莓素（Doxorubicin)。在一具體實施例中，本發明之抗體可以是任合同型及亞型（如 IgM、IgD、IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgAl 及

IgA2)的完整抗體（例如含有二個全長的輕鏈及二個全長的重鏈），或者，其可以是一個完整抗體的抗原結合片段（例如 Fab、F(ab’）2、及 Fv)。

本發明亦包含一種組合物，其包括一種醫藥上可接受的載W ’ 一個分離的核酸’其包含g E Q ID N〇：5之編碼序列 ;一個分離的核酸，其包含SEQ ID NO : 13之編碼序列；一個分離的核酸，其包含由細胞株3D9殖株（ATCC專利寄存編號PTA-4726，寄存於2002年9月27日）所產生抗體之輕鏈的編碼序列；一個分離的核酸，其包含由細胞株3 D 9殖株 (ATCC專利寄存編號pta-4726，寄存於2002年9月27曰）所產生抗肢之重鍵的編碼序列；__個分離的核酸，其包含S E Q 86478 200416044 ID NO : 5之殘基丨-107的編碼序列；一個分離的核酸，其包含SEQ ID NO : 13之殘基1-120的編碼序列。本發明中所包含的亦可以是來自產生人類化抗-LTpR抗體之細胞株的細胞，其包括例如細胞株：3D9殖株（ATCC專利寄存編號PTA-4726)。在一具體實施例中該細胞株產生約從250 mg/L到300 mg/L之該抗體，或是該細胞株產生約從 300 mg/L到3 50 mg/L之該抗體，或是該細胞株產生約從350 mg/L到400 mg/L之該抗體，或是該細胞株產生約從4〇〇 mg/L到450 mg/L之該抗體，或是該細胞株產生約從45〇 mg/L到500 mg/L之該抗體，或是該細胞株產生約從5〇〇 mg/L到550 mg/L之該抗體，或是該細胞株產生約從55〇 mg/L到600 mg/L之該抗體。由該細胞株所產生之該抗體的濃度是以一個供給1 0天之批次培養所獲得之滴定濃度來測定。本發明亦提供一種治療或降低贅生物在一個體（如人類）體内之發展、惡化或影響的方法，其包含對該個體投以一有效量之本發明抗體。該组合物的有效量可以在一個或以上之劑s:中給予。在另一具體實施例中本發明提供一種治療或降低贅生物在一個體（如人類）體内之發展、惡化或影響的方法’其包含對該個體投以一有效量之本發明抗體及細胞毒性因子。該細胞毒性因子可能包括例如：TNF-a、 TNF-β、IL-1、INF-γ、IL-2。或者，該細胞毒性因子可以是一種化學治療藥物。該化學治療藥物包括例如阿徽素、 5FU、長春鹼、放線菌素D、依託泊苷（Etop〇SMe)、順敍、 86478 -10- 200416044 胺甲葉酸、DM1及14-羥索紅莓素（D〇XOrubicin)。本發明亦包含本文所述之該抗體的抗原結合片段。在本發明的一個具體實施例中’該片段是由下列之群中所選出，其包括Fab片段、Fab，片段、F(ab)2片段、及Fv片段。在另一具體實施例中，本發明之該抗體或抗原結合片段是連接在聚乙二醉或白蛋白上在又另具體貫'施例中，本發明之該抗體的恆定區經修飾過以減少至少—種與未經修飾過之抗體有關的恆定區相關生物性效應物功能。又在另一具體實施例中，本發明之該抗體或抗原結合片段包含一個具有一種經改變過之效應物功能的Fc區域。本發明亦提出一種包含3D9 (ATCC登錄編號第p丁A — 號）的融合瘤細胞。在一具體實施例中，本發明之該融合瘤細胞會生產人類化抗體，或其抗原結合部分。在另一具體κ Μ例中’本發明提供一種輕鏈其包含來自單株抗體ΒΗΑ10的互補性決定區（CDRs)及可變區框架胺基酸殘基Y36、S49、及F87 (Kabat氏編碼系統），其中該輕鏈的其他部分是來自人類抗體。又在另一具體實施例中，本發明提供一種重鏈其包含來自單株抗體BHA1〇的互補性決定區（CDRs)及可變區框架胺基酸殘基γ27及T3〇氏編碼系統其中該重鏈的其他部分是來自人類抗體。在又另-具體實施例中，本發明之該人類化抗體包含該重鏈及輕鍵。在一具體實施例中，胞毒素β受體（ltj-r)結本發明之該人類化抗體會與合0 淋巴細 86478 200416044 本發明亦提供一種人類化抗體，其包含.前文定義為SEQ ID NO : 1之該BHA10可變輕鏈序歹ij的CDRs。在另一具體實施例中，本發明提供一種人類化抗體，其包含前文定義為 SEQIDNO: 2之該BHA1 0可變重鏈序歹ij的CDRs。本發明提出一種會專一地與LT-β-ΙΙ結合的人類化抗體或其抗原結合片段’其包含一個包含CDRs的可變區，其中該 CDRs相當於來自小鼠BHA10抗體的CDRs。在一具體實施例中’该片段是一個F a b片段。又另一具體實施例中，本發明提出一種治療或減少病患體内之癌症的方法’其包括投藥給該病患有效劑量之本發明的人類化抗體。本發明亦提出一種治療或減少病患體内之固體腫瘤的方法，其包括投藥給該病患有效劑量之本發明的人類化抗體。在本發明的一個具體實施例中，該固體腫瘤疋遠自下列之群，其包括非小細胞肺癌（NSCLC)、大腸直腸癌（CRC)、乳癌、前列腺癌、腸胃癌、皮膚癌、胃癌、食道癌、及膀胱癌。【實施方式】序列辨識編號本文將在本專利說明書中所提及之核苷酸及胺基酸序列給予下列序列辨識編號： SEQ ID Ν〇· 1-小鼠BHA10輕鏈可變區域（VH)的胺基酸序列。 SEQ ID NO · 2-小亂BHA10重鏈可變區域（VL)的胺基酸序列0 86478 200416044

SEQ ID NO · 〇 , L 〇.3·人類化BHA10輕鏈可變區域（類型卜VL#1) 的核酸序列。 SEQ ID NO : 4_人類化BHA1〇輕鏈可變區域（類型卜的胺基酸序列。 SEQID N〇: 5_人類化BHAi〇輕鏈可變區域（類型2_VL#2) 的核酸序列。 SEQ ID NO : 6_人類化BHA1〇輕鏈可變區域（類型2_vl#2) 的胺基酸序列。 SEQ ID NO : 7_人類化BHA1〇輕鏈可變區域（類型的核酸序列。 SEQ ID NQ·· 8_人類化BHA1〇輕鏈可變區域（類型的胺基酸序列。 SEQIDNO: 9-人類化BHA10重鏈可變區域（類型卜VH#1) 的核酸序列。 SEQ ID NO: 10-人類化BHA10重鏈可變區域（類型的胺基酸序列。 SEQ ID N〇：11-人類化BHA10重鏈可變區域（類型2-VH#2) 的核酸序列。 SEQ ID NO: 12-人類化BHA10重鏈可變區域（類型2-vh#2) 的胺基酸序列。 SEQ ID NO: 13-人類化BHA10重鏈可變區域（類型3-VH#3) 的核酸序列。 SEQ ID NO. 14-人類化BHA10重鏈可變區域（類型3-VH#3) 的胺基酸序列。 86478 200416044 SEQ ID NO: 15-輕鏈#2的胺基酸序列（其包含VL#2再加上輕恆定區域人類K)。 SEQ ID NO : 16-重鏈#3的胺基酸序列（其包含VH#3再加上重恆定區域人類IgGi)。 SEQIDN〇：l7到SEQIDN〇：58-各種引子。 3£卩10>1〇：5 9-輕鏈#2的核酸序列（其包含¥1^2加上輕怪定區域人類κ)再加上起始密碼及訊息序列。 SEQ ID NO: 60-輕鏈#2的胺基酸序列（其包含VL#2加上輕恆定區域人類κ)再加上起始密碼及訊息序列。 SEQ ID NO: 61-重鏈#3的核酸序列（其包含VH#3加上重恒定區域人類IgG 1)再加上起始密碼及訊息序列。 SEQ ID NO: 62-重鏈#3的胺基酸序列（其包含VH#3加上重怪定區域人類IgG 1)再加上起始密碼及訊息序列。定義 "人類化抗體"或”經改造之抗體"一詞（在此可相互交換使用）係指一種抗體，其十該抗體包含至少一個源自非人類親源抗體（傳統上是小鼠）的人類化免疫球蛋白或抗體鏈（即至少一個人類化的輕或重鏈），其保留或大致上保留了該親源抗體的抗原結合特性但是在人類身上較不具免疫抗原性。該π人類化免疫球蛋白鏈”或”人類化抗體鏈"（即，，人類化免疫球蛋白輕鏈’f或π人類化免疫球蛋白重鏈"）一詞係指免疫球蛋白或抗體鍵（即分別為輕或重鍵），其具有可變區，其包含一個大致上來自人類免疫球蛋白或抗體的可變框架區及大致上來自非人類免疫球蛋白或抗體的互補性決定區 86478 -14 - 200416044 (CDRs)(例如至少—個cDR，二個CDR較佳，三個cdr又更佳），亚且尚包含忮定區（例如在輕鏈來說為至少一個恆定區或其部分，而以重鏈來說以三個恆定區較佳）。 ’’區” 一詞可以是指一個抗體鏈或抗體鏈區域的一段或一部分（例如一個重或輕鏈的一段或一部份或一個穩定或可變區域的一段或-部份，如本文所定義），以及更多該鏈或區域的細分部分。舉例來說，輕和重鏈或輕和重鏈可變區域包含位於”框架區域，，或” FRs，，之間的”互補性決定區"或 CDRs"(如本文所定義）。本文所明之互補性決定區（CDRs) 一詞係指胺基酸序列，其同時界定了一個原始免疫球蛋白結合位之天然FV區的結合親和性及專一性，如描述於Kabat等人所著：

Proteins of Immunological Interest, 5th Edition, The United

States Department 〇f Health and Human Services, The Umted States Government Printing 〇出“，199l。本文所謂之框架區（FR) 一詞係指介於CDRs之間的胺基酸序列。該抗體的這些部分係用來保持該CDRs在適當的方位（讓CDRs能與抗原結合）。本文所謂恆定區（CR)一詞係指該抗體分子的部分，其賦與效應物功能。傳統上在非人類(例如小鼠），是以人類的 & <區取代其& &區Q $特定嵌合的或人類化抗體的怪定區傳統上是源自Λ類的免疫料白。t亥重鍵十互$區可以是選自該五種同型之任一：α、δ、ε、” μβ此外，各種亞型的重鍵（例如重鍵的IgG亞型）是與不同的效應物功能有關 86478 -15 - 200416044 ’並且因此藉由選擇所需之重鏈恆定區，便可以產生具所需效應物功能之抗體。較佳的恆定區是γΐ (IgGl)、γ3 (IgG3) 及γ4 (IgG4)。更佳地是γΐ (igGi)同型的區。其輕鏈恆定區可以是κ或λ型，以κ型較佳。在一昇體實施例中該輕鏈恆足區疋人類的冗怪定鏈（Heiteretal· Cell 22: 197-207) 而該重值定鏈為人類的1§(31恆定鏈（EUis〇n et al, (1 982)

Nucleic Acids Res· 10 : 4076-4079)。本文所明之嵌合抗體一詞係指一種抗體，其含有源自一個種類之可變區及含有源自另一個種類的恆定區。大部分傳統上的嵌合抗體包含了人類及小鼠的抗體片段，一般上疋人類的怪定區及小鼠的可變區。免疫球蛋白或抗體可以單元體或多元體的形式存在，例如，以五元體形式存在的IgM抗體及/或以單元體、雙元體或多元體形式存在的IgA抗體。該I，片段II—詞係指_個抗體或抗體鏈的一段或一部份，其含有較一個原始的或完整的抗體或抗體鍵還少的胺錢殘基。吾人可以經由化學性或酵素性處理—個原始或完整的抗體或抗體_來得到該片段。亦可以用重組的方法來取得該片段。代表性的片段包‘ ^，，、㈣…他及/或^片^該”抗原結合片段” -詞係指-個多㈣m為會與抗原結合或與原始抗體競爭（即與其所源自的原始抗體競爭）其抗原結合（即專一性結合）之免疫球蛋白或抗體的片段。原始免疫、、丨上A化竽性切球蛋白所產生的。結合片段和口乃扠匕括 Fab、Fab，、F(ab， 86478 -16- 200416044 、Fabc、FV、單鏈、及單鏈抗體。除了”雙專一性”或，，雙功月匕免疫球蛋白或抗體外，一個免疫球蛋白或抗體被認為是具有其個別的結合位置。一個〃雙專一性，，或〃雙功能抗體〃是一種具有二個不同的重/輕鏈對及二個不同結合位置的人工合成雜合抗體。雙專一性抗體可以經由各種方法來產生’包括將融合瘤融合或連接ab ’片段。可參見例如·· Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79 : 3 1 5-32 1 (1990)，Kostelny et al·，J. Immunol· 148，1547-1553 (1992)。本文所謂免疫抗原性一詞係指當將一個標的蛋白質或治療性基團投藥給一個接受者後引發（體液或細胞）免疫反應之能力程度。本發明是與該人類化抗體的免疫抗原性有關。具降低之免疫抗原性的人類化抗體係指相較於其親源抗體（例如該小鼠抗體）具有較低之免疫抗原性的人類化抗體。大致上保有其親源抗體之結合特性的人類化抗體係指人類化k體’其保有能專一性結合上產生出該人類化抗體所用之親源抗體所辨認之抗原的能力。較佳地該人類化抗體會具有與其親源抗體相同或大致上相同的抗原結合親和性及親和力。理想地，該抗體的親和性不會少於其親源抗體親和性的10%，更佳的不少於約3〇%，而最佳地該親和性不會少於其親源抗體的5〇%。用於試驗抗原結合親和性的方法是在本技術領域中眾所皆知的且包括最大半結合試驗、脱爭试驗、及Scarchard氏分析。適合之抗原結合試驗會說明於本申請書中。 ’’回復突變”是一個在含人類化抗體之編碼的核苷酸序列 86478 -17- 200416044 中的突變，該突變會造成一個同等於在其親源抗體（如供給抗體’例如小鼠抗體）中之胺基酸的胺基酸。為了大致上保留該親源抗體的結合特性，在本發明之抗體的人類化過程中可能會保留某些來自該親源抗體的框架殘基，然而同日寺使該生成抗體的潛在免疫抗原性減至最小。在本發明的一個具體實施例中。該親源抗體是小鼠來源的。舉例來★兒，該回復突變將人類的框架殘基改變成親源小鼠殘基。可能被回復突變之框架殘基的實例包括（但非僅限於此）標準殘基、交界面包覆殘基、靠近結合位之非一般親源殘基、在其π游標區11的殘基（其在該CDRs所在之處形成一個平A ) (Foote & Winter，1992, J. Mol· Biol· 224, 487-499)、以及靠近CDR H3的殘基。本文所謂”保留性改變"係指修改，其為與原本蛋白質相比較下’分別是大致地形態上或抗原性上中立的、在該突變之多胜肽的三級結構上產生最小的改變、或該突變之多胜肚的抗原決定位產生最小的改變。當指本發明之抗體及抗體片段時，保留性改變意指胺基酸取代作用，其並不會使得該抗體不能結合上其受體。熟習本技藝中一般技術者便可以預測哪一個胺基酸可以被取代而仍維持非常大的機率是形態上或抗原性上中立的。此類指引係提供自例如

Berzofsky, (1 985) Science 229 ： 932-940^ Bowie et al. (i99〇) Science 247 ·· 1 306-1 3 1 0。必須考慮之會影響維持形態上或抗原性上中立之機率的因素包括（但非僅限於此）··（ a)取代厭水性胺基酸較不會影響抗原性因為厭水性胺基酸絕大部 86478 -18 - 200416044 分是位於蛋白質的中間；（b)取代物理化學性相似的胺基酸較不會影響其形態因為該所取代的胺基酸結構上相似於其原本之胺基酸；以及（C)修改演化上的保留序列可能會相反地影響其形態，因為此類保留性顯示該胺基酸序列可能具功能上的重要性。一個熟習於本技藝之一般技術者便可以利用已廣為習知的試驗，像是（但非僅限於）微互補修補方法（Was serman et al. (1961) J. Immunol· 87: 290-295; Levine et al· (1967) Meth. Enzymol· 1 1 : 928-936)及透過利用形態依賴之單株抗體（Lewis et al. (1 983) Biochem. 22 : 的結合研究，來達成在蛋白質形態上進行修改。本文所謂”治療性組合物"係指組合物，其會直接或間接地緩和一個疾病的情況。亦即投以該組合物能減輕一個疾病或病症的至少一種症狀。當用於敘述本發明之抗體時，該"專一對”一詞是指本發明之彳几體的可變區辨識並結合到一組的一個或以上之受體 (即能夠藉由在結合親和性上可測得差異性的優勢來區分 β R/、’、他夕胜趾，無論在和此類多胜肚之間可能存在的區域性序列一致性、同.源性、或相似性）。吾人將了解專一的抗體亦可能會與其他蛋白質交互作用（例如金更色葡萄球菌蛋白質A或其他在ELISA技術中的抗體），經由與該抗體之可變區外序列的交互作用，特定而言，是在 =分子的恆定區。用以測定本發明之抗體的結合專一性的師選試驗是在本技藝中已廣為習知並常規地進行。針對此員式驗之70王的δ寸淪，請參jHarl〇w et al· (Eds.)，丁以 86478 -19- 200416044 ：A LABORATORY MANUAL ； Cold Spring Harbor Laboratory ;Cold Spring Harbor，N. Y·，1 988，第 6章。吾人亦預期及提出該能辨識及結合LT - β - R之片段的抗體可專一對lt _ β _尺。本發明之抗體可以利用在本技藝中任何以廣為習知並常規地進行的方法而產生。本文所謂”單株抗體”或”單株抗體組合物”之詞係指一群抗體分子，其包含只有一種種類之能夠與Ι/Γ-β-R的一個特定抗原決定位進行免疫作用或結合的抗原結合位。因此單株抗體組合物傳統上對其所免疫作用之lt-p-r的特定抗原決定位呈現單一的結合親和性。以針對LT-β-ΙΙ之單株抗體、或衍生物、片段、相似物或其同源物的製備來說，任何用來經持續細胞株培養而生產抗體分子的技術皆可以使用。此類技術包括（但非僅限於此）融合瘤技術（見Kohler &

Milstein (1975) Nature 25 6 : 495-497) ; trioma技術；人類 B 細胞融合瘤技術（見 Kozbor，et al· (1983) Immunol Today 4 :72)及EBV融合瘤技術以生產人類單株抗體（見Cole，et al.， 1985於：MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY， Alan R· Liss，Inc.，pp. 77-9 6)。人類單株抗體可以利用於本發明之操作中且可以經由使用人類的融合瘤（見Cole et al. (1983). Proc. Natl. Acad· Sci USA 80 : 2026-2030)或藉由將人類B細胞以Epstein Barr病毒體外轉型來產生（見Cole，et al·，（1 985)於：MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY，Alan R_ Liss，Inc.，pp. 77-9 6)。本發明之喪合並人類化的單株抗體可由在本技藝中已知的重組DNA技術來 86478 -20- 200416044 產生，例如利用說明於下列參考資料中的方法：PCT國際申請案編號第PCT/US86/02269號；歐洲專利申請案編號第 1 84,1 87號；歐洲專利申請案編號第171，496號；歐洲專利申請案編號第173，494號；PC 丁國際公開案編號第WO 86/0 1 533 號；美國專利編號第4,8 1 6,567號；歐洲專利申請案編號第 1 25,023 號；86心“1&1.(1 988)3仏獄 240:1 041-1043; Liu et al. (1 987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 ： 3439-3443 ;Liu et al. (1 987) J. Immunol. 1 39 : 3521-3526 ； Sun et al. r (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 ^ 214-218 ； Nishimura et al. (1987) Cancer Res. 47 ： 999-100 5 ； Wood et al. (198 5) Nature 314： 446-449； Shaw et al. (1 988) J. Natl. Cancer Inst. 80 * 1 553-1 559 ； Morrison (1985) Science 229 * 1202-1207 ;〇i et al· (198 6) BioTechniques 4 : 214 ;美國專利編號第 5,225,539號；Jones et al. (1 986) Nature 321 ： 522-525 ； Verhoeyan et al. (1 988) Science 239 · 1 534；及 Beidler et al· (1 988) J. Immunol. 141 ： 4053-4060 〇本發明係關於會結合人類LT-β-ΙΙ的人類化單株抗體及使用該抗體的診斷方法以及其當作治療藥劑的用法。本發明尚關於編有該人類化抗體之基因碼的核酸序列，及其在重組宿主細胞内的表現。更特定而言，本發明係關於源自會專一性地結合到人類LT-p-R之小鼠BHA10的人類化抗體。小鼠BHA10 (mBHAlO)是從一個以人類之LT-P-R-lg接合蛋白質免疫過之小鼠所分離出來的小鼠IgGl、κ抗體 (Browning et al·，J. Immunol. 154 : 33 (1995))。其分離及抗 86478 -21 - 200416044

腫瘤特性已詳述於Browning et al.，J. Exp. Med. 183 : 8Q ( 1996)。該產生mBHAlO的融合瘤細胞株已根據布達佩斯條約隨本發明之申請書預先寄存於美國菌種保存中心（ATCC) 並授予ATCC登錄編號HB1 1795。（PCT/US96/0丨386)。本申請書亦顯示LT-β受體與各種激活之抗LT-β-ΙΙ抗體交互連結後會活化該LT-β受體（即可以模擬天然之接合子的作用）。 (PCT/US96/0 13 86)。在各種針對表現L丁邛受體的體内腫瘤模型中已顯示受體相繼活化能抑制腫瘤生長。吾人已顯示 LT - β受體會表現在許多癌症細胞上包括例如非小細胞肺癌細胞（NSCLC)、大腸直腸癌細胞（CRC)、乳癌細胞，以及在刖列腺、腸胃、皮膚、胃·、食道、及膀胱之癌症細胞上。腫瘤的非限制實例是激活之抗LT-β-ΙΙ抗體會抑制包括下列之固體腫瘤·· ΗΤ29直腸腺癌、ΗΤ3子宮頸癌、Α375黑色素瘤、MDA-23 1乳癌及初級直腸腫瘤。因此，激活之抗l丁抗體（特定而言是本文所述之人類化抗體）希望是具有使其適用於治療LT-β-ΙΙ活化疾病及/或改變其LT-p-R/LTU^ 3子父互作用之特性’包括例如治療或降低贅生物在一個體（如人類）中之的發展、惡化或影響。本文說明了該mBHA 10單株抗體之人類化過程，包括.所需之模型分析及回復突變，以大致上保留該m]BHA 10單株抗體的結合特性。小鼠可變區之模型分析該CDRs含有最有可能結合抗源以及必須保留在該經改造之抗體中的殘基。CDRs是依據Kabat氏等人所著： 86478 -22- 200416044

Sequence of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition,

The United States Department of Health and Human Services The United States Government Printing Office，1 99 1 以序歹ij 定義之。CDRs是屬於標準分類（Chothia et al.，1 989 Nature， 342，877-883)，此處之關鍵殘基決定該CDR圈環之絕大部分的結構性形態。這些殘基幾乎都被保留在該經改造之抗體内。mBHA 10之輕鏈可變區的多胜肽序列表示如下，其中以下標線標出該CDR並且依據Kabat氏編號系統標上該殘基位置號碼：

1 DIVMTQSQKF MSTSVGDRVS VTCKASQNVG INVAViYQQKP

41 GQSPKSLXSS ASYRYSGVPP RFTGSGSGTD FTLTITNVQS

81 EDLAEYFCQQ YDTYPFTFGS GTKLEIK (SEQ ID ΝΟ;1) mBHA 10之重鏈可變區的多胜肢序列表示如下，其中以下標線標出該CDR並且依據Kabat氏編號系統標上該殘基位置號碼（其中包括粗體的胺基酸52a (pro)、82a (ser)、82b (ser)、82c (leu)並且在位置100沒有胺基酸）：

1 QVQLQQSGPE LVKPGASVRI SCKASGYTFT TYYLHWVKQR aa52a

41 PGQGLEWIGW IYPGNVHAQYN EKFKGKATLT ADKSSSTAYM

aa&2a-82c aalOO 81 QLSSLTSEDSAIY FCARSWEGF+ PYWGQGTTVT VSS (SEQ ID NO :2) 吾人利用FASTA程式比較mBHAlO之可變輕鏈和重鏈與針對小鼠及人類亞群的保留性序列（Johnson，G.，Wu，Τ· T. Kabat式資料庫及其申請案：將指導於Nucleic Acid Researh， 86478 -23 - 200416044 29, 205-206, 2001 ; Wu and Kabat，J· Exp. Med. 132: 211-251 (197 0))。該mBHAlO的可變輕鏈是小鼠κ I的一員，其具有 63 · 7%的相似度於11 3個胺基酸上，而該mBHA1 0的可變重鏈是小鼠亞群lib的一員，其具有73.2。/。的相似度於1 2 7個胺基酸上。該可變輕鏈相當於人類κ ί具有611()/。的相似度於 11 3個胺基酸上。該可變重鏈相當於人類亞群I具有62%的相似度於129個胺基酸上。吾人將本發明之互補性決定區域（CDRs)分類成標準分類。該L1圈環屬於標準分類2 (11個殘基圈環）、l2是分類1 (7 個殘基）而L3是分類丨（9個殘基）。該！^圈環屬於分類1 (5個殘基）允許Leu34。該H2及H3圈環不屬於標準分類。對於這些分類很重要的標準殘基說明於下列表1 : 表1 L1 分類 22(1) 25(A) 29(1) 33(L)71(Y) L2 分類 1 48(1) 51(A) 52(T) 64(G) L3 分類 190(Q)95(P) H1 --—---- 分類 1 24(A) 26(G) 27(F) 29(F) 34(M) 94⑻ H2 無標準分類 ' —— H3 - · 無標準分類 ^-___ 位於5亥可變輕鏈與重鏈間之交界面的殘基已經被定義出 (C h 〇 t h * la et al，1985 J. Mol· Biol·，186，651-663)。這些通常仍被保留在經改造之抗體内。在mBHAlO中數個這些殘基非 *一名史i也丄如、交界面，其為在該可變輕鏈上的絡氨酸36與 86478 200416044 苯丙氨酸87即可變重鏈上的苯丙氨酸91。非一般框架殘基是經由分析Kabat氏資料庫[NCBI，NIH] 1 9 9 9年9月版上所有的小鼠及人類之可變鏈序列來決定的。吾人相信若是mBHA 10專一的差異很靠近該結合位置，這些差異可能導致體細胞的突變，其會促進結合活性。已發現之非一般框架殘基是輕鏈上的Y36、S49、T63及F87;和重鍵上的 Y27、T30、148、A67、L69 及 F91。可變區域之結構的模型吾人將本發明之輕鏈及重鏈與無重複資料庫比對以決定要用於構築該輕鏈及重鏈之三度空間模型的結構性框架。利用BLAS丁發現該輕鏈具有與小鼠Fab片段（12E8) 85〇/〇的序列相似度’而該重鏈具有與小鼠IgGA2 Fab片段（lpLGH) 81%的序列相似度。利用分子模型套裝軟體Sybyl (丁dp〇s Inc·)，分別利用12E8的輕鏈及1PLGH的重鏈建構出該輕鏈及重鏈的二度空間結構。該模型的結構性整合是以該操作平台評估並且經發現其是合理的。經改造之可變區域的設計吾人抓用種系配對以選擇人類接受體框架來"接受，，該 mBHAlO 的 CDRS (Ros〇k et al. j 則〇1.（1996”71 : 2261 1-226 1 8)。吾人利用軟體程式IgjBLAST來搜尋來自 NCBI ’ ENTRZ(美國國家衛生研究院)的種系資料庫及無重複貝料庫。人類接受體框架的選擇是根據序列相似度及可能回復突變來進行。人類框架的最終選擇針對該可變輕鏈（VL)之是來自種系 86478 200416044 序列 Ll/L 15及 J1 (Bentley etal.(1983)Cell32: 181-189; Cox et al. (1 994) Eur· J· Immunol·，24 : 827-83 6及 Heiter et al. (1982) J. Biol. Chem. 257 : 1 5 1 6- 1 522)，而針對該可變重鏈（VH)之是來自種系序列 1-69/J6 (Tomlinson et al. (1 992) J. Mol. Biol.，227 : 776-798及 Manila et al. (1 995) Eur. J. Immunol.，25 : 25 7 8-2 5 82)。該人類的VL及VH框架與小鼠的序列比較分別有2 1個殘基差異。人類框架的回復突變在單株抗體的人類化作用中大部分不可預測的步驟是從其親源抗體（即以本文來說，該親源抗體是小鼠來源的）鑑定需要被保留的關鍵框架殘基，以大致上保留該親源抗體的結合特性，然而同時要將該生成抗體的潛在免疫抗源性減至最低。垂莫重要的是保留靠近於該結合位置的標準殘力 · . 基、交界面包覆殘基及非一般小鼠殘基。此外，需考慮在 ’’游標區”的殘基（其在該CDRs所在之處形成一個平台） (Foote & Winter，1992, J. Mol· Biol· 224, 487,499)以及靠近 CDR H3的殘基。突變回到其親源抗體（即從人類的框架殘基突變回小I的）在此以回復突變稱之。 1:7人已經-做出三種經改造之之可變輕鍵（VL#)及三種經改造之可變重鏈（VH#)。廣泛來說，第一類型含有最多的回復突變而第土類型則含有最少（即最”人類化的”）。本發明意欲人類化的抗體是源自mBHAlO’其以任何組合包含由丁述之可變輕鏈所選出的可變輕鏈（即VL#1、VL#2或VL#3)以及由下述之可變重鏈所選出的可變重鏈（即VH# 1、VH#2或 86478 -26 - 200416044 VH#3)。在ό亥經改造之可變輕鏈中的回復突變·· ▲ 36 F(苯丙氨酸）_>γ(酪氨酸）這是一個包覆殘基。其是在該y變輕鏈構體之VL#1和VL#2上從苯丙氨酸回復突變到氨-欠仁在δ亥可變輕鏈構體之VL#3上仍以苯丙氨酸保留。 μ 49 γ(酪氨馱）->S(絲氨酸）這個位置在靠近cDR處並且在小鼠及人類的框架中皆是非—般的。其是在所有三種之可變輕鏈構體上從酪氨酸回復突變到絲氨酸。 (’系氨1)->τ(蘇氨酸）這個位置在靠近處。其是只有在該可變輕鏈構體之VL#1上從絲氨酸回復突變到蘇氨酸。一 87 Y(酪氨酸）->F(苯丙氨酸）這是一個包覆殘基並且在人類的框&中是非—般的。其是在該可變輕鏈構體之VL#1和 VL#2上諸㈣回復突變到苯丙|酸，但在該可變輕鍵構體之VL#3上仍以酪氨酸保留。在"亥t改造之可變重鏈中的回復突變：卜 (甘氨馱）_>Υ(酪氨酸）這是一個在所有三種上皆被回復突變成小鼠殘基的標準殘基。

(糸氨奴）->τ(蘇氨酸）這個位置在靠近CDR處並且可能會影響其構型。里县A ^ 尘，、疋在所有二種之可變重鏈構體上皆從、、糸氨酸回復突變到酪氨酸。曰（蛋氨馱）~>][(異焭氨酸）這個位置在靠近CDR處。其疋在δ亥可變重鍵構體之VH#i和彻2上從蛋氨酸回復突變 86478 200416044 到異亮氨酸，但在VL#3上則無。 67 V(纈氨酸）->A(内氨酸）這個位置在靠近CDR處並且在人類框架中是非一般的。其是在該可變重鏈構體之VH# 1和 VH#2上從纈氨酸回復突變到内氨酸，但在vl#3上則無。 69 1(異亮氨酸）->L(亮氨酸）這個位置在靠近CDR處並且在人類框架中是非一般的。其是在該可變重鏈構體之VH# 1 上從異免氣酸回復突變到売氰酸，但在VH#2和VL#3上則無。 91 Y(酪氨酸）->F (苯丙氨酸）這是一個包覆殘基。其是在該可變重鍵構體之VH# 1上從路氨酸回復突變到苯丙氨酸，但在VH#2和VH#3上則無。各個不同類型之可變輕鏈及重鏈的胺基酸及核酸序列如下：經改造之可變輕鍵 BHA10的經改造之可變輕鏈-可變輕鏈類型1 (VL#1):

X iSACATTCAGATGACCCAGTCTCCTAGCTCCCTGTCCGCCTCAGTAGGAGACAGGGTCACC $ 0 DIQMTQSPSSL5A SVGDRVT 61 atcacgtgcaaggccagtcagaatgtgggtattaacgttgcctggtatcaacagaaacca X 2 ο I T C KA3QNVGINVA w v q q k p * β X21 GGGAAGGCTCCTAAATCACTGATTTCCTCGGCCTCCTACCGGTACAGTGGAGTCCCTTCT 130 GKAPKSLIS S A S Y R V S G V P 3 181 AGATTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCT 24 0 RFTGSGSGTDFTLTISSLQ? aa63

241 GAAGACTTCGCAACCTATTTCTGTCAGCAATATGACACCTATCCATTCACGTTCGGCCAG 300 EDPATYFC QQYDTYPFT F G Q

301 GGTACCAAGGTGGAGATCAAA 32X G T K V E I K SEQ ID NO : 3-表示上述經改造之VL#1的核酸序列。 SEQ ID NO : 4-表示上述經改造之VL#1的胺基酸序歹ij。 -28- 86478 200416044 B HA 10的經改造之可變輕鏈-可變輕鏈類型2 (VL# 2):

1 GACATTCAGATGACCCAGTCTCCTAGCTCCCTGTCCGCCTCAGTAGGAGACAGGGTCACC bO DIQMTQSP35LSASVGDRVT

Si ATCACCTGCAAGGCCAGTCAG AATGTGGGTATTAATGTAGCCTGGTATCAACAG-\AACCA 12 0 I T C K A S Q N V G I ^ V A W Y Q Q K P &a3 δ

GGGHGGCTCCTAAATCACTGATTTCCTCGGCCTCCTACCGGTACAGTGGAGTCCCTTCC 180 G K A P K S L I S S A S Y R Y S G V P S 1S1 AGATTO\GCGGC\GTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGC\GCCTCCAGCCT 24 0 RFSGSG5GTD FTLTISSLQ?

241 GAAGACTTCGCAACCTATTTCTGTCAGCAATATQACACCTATCCATTCACGTTCGGCCAG 3Q0 EDFATYFC QQYDTYPFT ? G Q aaQ7

301 GGTACCAAGGTGGAGATCAAA 321 G T Κ V £ I K SEQ ID NO : 5-表示上述經改造之VL#2的核酸序列。 SEQ ID NO : 6-表示上述經改造之VL#2的胺基酸序列 BHA10的經改造之可變輕鏈-可變輕鏈類型3 (VL#3):

1 GACATTCAGATGACCCAGTCTCCTAGCTCCCTGTCCGCCTCAGTAGGAGACAGGGTCACC 6 0 DIQMTQSPSSLSASVGDRVT

61 ATCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGGTATTAATGTAGCCTGGTTCCAAOVGAAACCC 120 I T C KASOMVGI NV A. W F Q Q K P

121 GGGAAGGCTCCTAAATC^CTGATTTCCTCGGCCTCCTACCGGTACAGTGGAGTCCCTTCT 180 GKAPKSLI3 S A S Y R Y S G V P S

131 AGATTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCT 240 RFSGSGSGTDFTLTISSLQP

2^1 GAAGACTTCGCAACCTATTACTGTCAGCAATATGACACCTATCCATTCACGTTCGGCCAC 3 0 0 EDFATYVC QQYDTYPFT ? G Q

301 GGTACCAAGGTGGAGATCAAA 321 G T K V E I K SEQ ID NO : 7-表示上述經改造之VL#3的核酸序列。 SEQ ID NO : 8-表示上述經改造之VL#3的胺基酸序列經改造之可變重鏈 BHA10的經改造之可變重鏈-可變重鏈類型1 (VH#1)： -29 - 86478 200416044

1 CAGGTCCAACTGGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCAGTGAAGGTG 60 QVQLVQSGASVKKPGSSVKV

61 TCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACTTTCACAACCTACTATTTGCACTGGGTGAGGCAGGCC 120 SCKASGYTFT τ Y Y L H W V R Q A i&27 aa3 〇

121 CCTGGACAGGGACTTGAGTGGATTGGATGGATTTATCCTGCA-^TGTTCATGCTCAGTAC ISO PGQGLEWIG V/ I Y P G N V H A Q Y

aa4S

IB1 AATGAGAAGTTCAAGGGCAGGGCCACACTGACAGCAGACAAATCCACCAGCACAGCCTAC 240 N g K F ：< G RATLTADKSTSTAY da<>7 aa69

241 ATGGAGCTCAGCAGCCTGAGGTCTGAAGATACTGCGGTCTATTTCTGTGCAAGATCCTGG 3G0 MELSSLRSEDTAVY5*CAR S_W aa31

301 G^GGTTTTCCTTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA 34 8 £ G F P Y WGQGTTVTVSS SEQ ID NO : 9-表示上述經改造之VH#1的核酸序列。 SEQ ID NO: 10-表示上述經改造之VH#1的胺基酸序列 (Kabat氏編碼系統，其包括一個脯氨酸在位置52a、絲氨酸在位置82a、一個絲氨酸在位置82b、一個亮氨酸在位置82c 以及缺失一個胺基酸在位置100)。 BHA10的經改造之可聲重鏈-可變重鏈類型2 (VH#2): ....-......... · - - · ~ _

1 CAGGTCCAACTGGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCAGTGAAGGTG 6 0 QVQLVQS GAEVKK9GSSVKV SI TCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACTTTCACAACCTACTATTTGCACTGGGTGAGGCAGGCC 120 SCKASGYTFT T Y Y 乙 H W V R Q A aa27 aa30

121 CCTGGACAGGGACTTGAGTGGATI'GGATGGATTTATCCTGGAAATGTTCATGCTCAGTAC 130 P G Q G L E W 1 G WIYPGNVHAQY aaid

131 AATGAGAAGTTCAAGGGCAGGGCCACAATCACTGCAGACAAATCCACCAGCACAGCCTAC 2 4 Q N g ：< F EC G R A T I T A D K S T S T A V aa67

241 ATGGAGCTCAGCAGCCTGAGGTCTG；^AGATACTGCGGTCTATTACTGTGCAAGATCCTGG 200 Μ E L S S L R S E D T A V Y Y C ,A R S_W

301 GAAGGTnTCCTTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTOV 34 8 £ G F P Y WGQGTTVTVSS SEQIDNO: 11-表示上述經改造之VH#2的核酸序歹|J。 SEQ ID N〇：12-表示上述經改造之VH#2的胺基酸序列 (Kabat氏編碼系統，其包括一個脯氨酸在位置52a、絲氨酸在位置82a、一個絲氨酸在位置82b、一個亮氨酸在位置82c -30 - 86478 200416044 以及缺失一個胺基酸在位置1 0 0) ° BHA1 0的經改造之可變重鏈-可變重鏈類型3 (VH#3): 1 CAGGTCCAACTGGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCAGTGAAGGTG 6 0 qvqlvqsgaevkkpgssvxv

51 TCCTGCAAGGCTTCTGGCTAC\CTTTCACAACCTACTATTTGCACTGGGTGAGGCAGGCC 120 SCKASGYTFT T Y Y L H W V R Q A *jl27 aa20

121 CCTGGAC^GGGACTTGAGTGGATGGGATGGATTTATCCTGGAAATGTTCATGCTCAGTAC 180 PGQGLSWMG W I Y ? G N V H A Q Y

181 AATGAGAAGTTCAAGGGCAGGGTCACAATCACTGCAGACAAATCCACCAGCACAGCCTAC 2^0 N £ K F K G RVTITADKSTSTAY

241 ATGGAGCTCAGC^.GCCTGAGGTCTGA-ClGATACTGCGGTCTATTACTGTGCAAGATCCTGG 3 00 MELSSLRSEDTAVYVCAR S_W

301 GAAGGTTTTCCTTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA 3 4 8 E G F P v WGQGTTVTVSS SEQIDNO: 13-表示上述經改造之VH#3的核酸序歹1J。 SEQ ID NO: 14-表示上述經改造之VH#3的胺基酸序列 (Kabat氏編碼系統，其包括一個脯氣酸在位置52a、絲氣酸在位置82a、一個絲氨酸在位置82b、一個亮氨酸在位.置82c 以及缺失一個胺基酸在位置1〇〇)。人類化之BHA 1 0抗體是利用上述及尚說明於實例4中之經改造的可變輕鏈及重鏈來建構的。舉例來說，如在貫例4 中所述，該人類化之BHA10抗體類型4(π類型4 huBHAlCT) 是利用含有輕鏈#2的表現載體pKJS49與含有重鏈#3的表現載體pKJS46組合所構築成的。該類型4 huBHAlO之輕鏈及重鏈的胺基酸及核酸序列如下所列：

DlQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKaSONVG INVaWYOOKP GiCAPKSLiSS ASYSXSGVPS RFSGSGSG丁D FTLT l S SLQP EDFATYFCOO YDTYPFTfGO GTKVenC{RTV aaPSVFIFPP SD£QLKSGTA SVVC乙LNMfY PREAKVQWICV DNALQSONSQ ESVTEQOSKD STYSUKTLT LSKaDYEKHK VYACEVTHC1G LSSPV丁KSfN RGECf (S£Q ID NO: 15) 200416044 上述SEQ ID NO : 15-表示該類型4 huBHAlO之輕鏈的胺基酸序列。下標線為CDRs ;粗體字為回復突變Y36、S49 及F87 ;括弧中為人類κ悝定區（Kabat氏編碼系統）。

QVQLVQSGa£ VKKPGSSVKV SCKASGY丁FT 丁yyt-HWVR〇A PGQGLEWMGW

aa27 aaJU rYPGMVHAOY NF-KFKGRVT1 丁aDJCSTSIaY MELSSIRSED TAVYVCARSWEGF 丁VTVSS {ASTICGPSVfP LAPSSKSTSG G丁AALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTfPAVtQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YlCNVNHKPS N丁KVDKKVEP KSCDiCTHTCP PCPAPEILGG PSVfLfPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS REDPEVKFNW YVDGV£VHNA KTKPRE：£QYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKOCVSNKA LPAPiEiCHS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSL丁C LVKGFYPSDI AV£WESNGQP ΕΝΝΥΚπΡΡν ldsogsffly skltvdksrv/ qqgnvfscsv mhealhnhyt QKSLSLSPG} (SEQ ID NO： 16) 上述SEQ ID NO : 16-表示該類型4 huBHAlO之重鏈的胺基酸序列。下標線為CDRs ;粗體字為回復突變Y27及T30 ;.括弧中為人類IgGl怪定區（Kabat氏編碼系統）。如本文所述之包含不同類型之經改造可變輕鏈及可變重鏈的其他人類化抗體皆可以被製成。舉例來說，吾人可以製造一個抗體，其包含人類之恆定輕鏈（非限制實例包括該人類κ怪定區）以及人類之恆定重鏈（非限制實例包括該人類IgGl f互定區）與該經改造之可變輕鏈（VL/H、VL#2或VL#3) 及該經改造之可變重鏈（VH# 1、VH#2或VH#3)。本發明尚預期該經改造之VH及VL序列的等價體及變化體，例如那些含有一個或以上之保留性胺基酸取代基的序列，其大致上不會影響結合。包含這些人類化之可變重及輕序列的人類化LT-β-Κ坑體可以藉該實例中所述之

8647S 200416044 重組方法獲得。另一具體實施例中，本發明之抗體的免疫化學性衍生物員肩此包έ如1)免疫毒素（該抗體及一個細胞毒性基團的連接物）及2)經標記之衍生物（即經放射標記、酵素標記或螢光質標記）’其中該標記係為了辨識包含該經標記之抗體的免疫複合體。該細胞毒性基團可能是一個細胞毒性藥物或細菌或植物來源之酵素學上活化的毒素、或是那些毒素之酵素學上活化的片段。本文.所用之酵素學上活化的毒素及其片段是白喉Α鏈、白喉毒素之無結合涪化片段、外毒素八鏈（來自綠腹桿菌）、篦麻毒蛋白A鏈、相思鬥毒蛋白a鏈、莫迪素 (m〇deCCin) A鏈、…核糠毒素（α-sarcin)、油桐蛋白^抓让^ 、美洲商陸蛋白(PAPI、PAP„、和PAP:S)、山苦瓜抑制劑、"痲瘋樹毒素、考蒂納（C0r tin)、Sapa〇naria 制劑、gelonin、mitogellin、restrict〇ciii、phen〇mycin、及 enomycin。或者，將該抗體連接上小分子抗癌藥物。該單株抗體的連接物是利用各式之雙功能蛋白質聯合藥劑所作成。此類試劑之實例為SPDP、IT、醯亞胺酯類的雙力月匕竹生物例如一甲基己二醯亞胺酉旨（dimethyl adipimidate) 、HC1、活性酯類例如二琥珀醯胺辛二酯、乙醛類例如戊二駿、雙-疊氮化合物例如雙（對-疊氮苯基）己二胺、雙-重氮衍生物例如雙_(對-重氮苯基）_乙二胺、二異氰酸鹽類例如2,6-一異氰酸曱苯、以及雙-活性氟化物例如丨，％二氟-2,4-二硝基苯。該毒素之溶解部分可能會併入該抗體的Fab片段。 86478 -33- 用於/口療癌症之細胞毒 n ^ , y , 眩放射治療品可以藉由將放射性冋位素（例如I、γ、Pr)遠 ”細旳生α # 運接到該抗體上而製成。本文所謂細胞毒性基團，，一詞即咅 w欲包含此類同位素。在另一具體實施例中，五铷并口 w 0人疋將脂小體充滿細胞毒性藥物並且將該脂小體以專一 ,^ 注、、、σ 5生長因子受體·的抗體包覆。由於它有許多受體犄罢 m 茲从从置，因此這個方法能夠傳遞大量的樂物給正確的細胞種類。化學性修飾/ 在一些具體實施例中，太双n口 > t 本發明之抗體即抗體片段可以經化學性修飾以促進所預期之影響。舉例來說，:本發明之抗體及抗體片段的聚乙二醇化可以藉由在該技藝中已知的聚 ^ ^ ^ ^ e ^ ^ T ^.# 4 t ^ t ^ ： Focus on

Growth Factors 3 : 4.10 (i992) J54 3 16 ; ^ Ep 〇 4〇^ 3 84 (分別以引用方式將其全文併入本說明書中）。較佳地，該聚乙二醇化是透過用活潑之聚乙二醇分子（或相似之活潑的水溶性聚合物）的醯化反應或烷化反應來進行。一個用於本發明之抗體及抗體片段聚乙二醇化的較佳水溶性聚合物是聚乙二醇（PEG)。本文所謂，，聚乙二醇，，係指包含任何形式之已被甩於衍生其他蛋白質的PEG，例如單（C1-C10)烷氧 -或芳香氧-聚乙二醇。用於製備本發明之聚乙二醇化抗體及抗體片段的方法一般來說包含下列步驟（a)將該抗體或抗體片段^聚乙二醇，例如一活潑的酯類或PEG的乙醛衍生物，在能讓該抗體或抗體片段便變成接在一個或以上之PEG基團上的條件下 86478 -34- 200416044 反應’以及（b)得到該反應產物。顯而易見地一個在該技龜中熟習一般技術者便能根據已知的變因及所欲結果來選擇最佳的反應條件或醯化反應。 ίχ乙一醇化之抗體及抗體片段一般來說可以用於治療那些可此經投以本文所述之抗體及抗體片段而能緩和或緩解的病況。相較於無聚乙二醇化的抗體及抗體片段，一般來說該聚乙二醇化的抗體及抗體片段具有較長的半生期。該聚乙二醇化之抗體及抗體片段可以單獨、共同、或與其他醫藥組合物組合來使用。在本發明的其他具體實施例中該抗體或其抗原結合片段是利用本技藝中已知的技術將其連接到白蛋白上。在本發明之另一具體實施例'中，抗體或其片段是經修飾過以減少或消除可能的醣化位置。此類經修飾過之抗體通常是以"醣化”抗體稱之。為了要促進抗體或其抗原結合片段的結合親和性，可以改變該抗體的醣化位置，例如以基因突變法（如定點基因突變法）。"醣化位置”係指被真核細胞辨認為用於黏附糖基團之所在位置的胺基酸。該黏附有碳水化6物（如券糖）之胺基酸傳統上是天門冬醯胺（N_連接）、絲氨酸（0-連接）、及蘇氨酸（〇-連接）殘基。為了能分辨在抗體或抗原結合片段中的可能醣化位置，吾人利用例如公開可得之資料庫如生物序列分析中心（Center⑹-Biological Sequence Analysis)所提供之網站來檢測該抗體的序列（參見 http : //www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/來預 /貝j N-連接之 _ 化位置及 hUp : //www cbs.dtu dk/services/ 86478 -35- 200416044

NetOGlyc/來預測〇_連接之醣化位置）。對於改變抗體之醣化位置的額外方法則說明於美國專利編號第6,350,861號及第 5,7 14,350號中。在本發明之又一具體實施例中，抗體或其片段可以是經過改變的’其中該抗體的恆定區是經修飾過，以減少至少一種與未經修飾過之抗體有關的恆定區相關生物性效應物功能。為了要修飾本發明之抗體使得其降低結合到其Fc受體上’吾人可以將該抗體的免疫球蛋白恆定區片段在F c受體（FcR)交互作用必須之特定區域上進行突變（參見例如 Canfield, S.M. and S.L. Morrison (1991) J. Exp. Med. 171 • 1483_1491 ;及 Lund，J· et al. (1991) j· of Immunol. H7 • 2657-2662)。在談抗體之FcR結合能力上的降低作用可能亦降低了其他需倚賴FcR之交互作用的效應物功能，像是調理作用及胞呑作用及抗原相關之細胞性的細胞毒殺作用。用法本發明之抗體及經標記之抗體可使用於各種免疫呈像或免疫試驗方法中來俛測病患體内癌症之發生或監測已診斷為罹患癌症之病患體内此類癌症的狀態。當被使用於監測癌症之狀態時，必須使用定量免疫試驗方法。若是定期地進行此類監測性試驗並比較其結果，便可能可以不論該癖患的腫瘤負載是否已增加或減少而加以斷定。可能會使用之一般的試驗技術包括直接及間接試驗。若該樣本包含癌症細胞，則經標記之抗體會結合到那些細胞上。在沖洗該組織或細胞以去除未結合之經標記抗體後，該組織樣本便 86478 -36- 200416044 。二呈現之經標記的免疫複合物。在間接試驗中該組 =、·田胞樣本是以未標記之單株抗體培養1後該樣本用編早株抗體之經標記的抗體加以處理(例如經標記之抗小鼠的抗體），沖洗，並讀取所呈現之三元複人物 ^針對診斷上之使用，該抗體傳統上會以套組形式分配。這些套組傳統上會包含：經標記或未經標記形式之該抗體在適合的容器中、用於直接試驗之培養的試劑、及或根據該標記之性質的衍化試劑。在另—具體實施例中’本發明之抗體有使用於治療疾病之情形，其中LT|R的活化作用是在治療上有幫助的。此類情形包括但非僅限於治療、防止或減少贅生物之發展、

惡化或影響。：^ ^ ^ ^ X 不必要之細胞分生法，其是藉由投與包含本發明之人類在本發明的一個具體實施例中是針對相關情況來治療哺乳動物（即人類）的方該哺乳動物治療上有效量之組合物，其化lt-p-r抗體。在本發明的另一假具體實施例中是治療有表現lt_p_r之固體腫瘤（即癌症）的哺乳動物（即人類）的方法，其包含投與該哺乳動物會結合至LT-β-ΙΙ的人類化lT_|3_r抗體，其是給予能有效減少該腫瘤體積之量。那些細胞分生被^^卜汉調節之癌症的實例可以藉測量在腫瘤組織庫中所表現之 LT-P-R及/或LT-β-ΙΙ接合子（即LToclp2或LIGHT)訊息的體外量來加以篩選。其中LTj-R及/或LT_p_R接合子（即 LTa 1 β2或LIGHT) sfL息被大ΐ表現的腫瘤組織庫將是候選 86478 -37- 200416044 對象。在本發明中所預期之腫瘤種類包括固體腫瘤，其包非僅限於非小細胞肺癌（NSCLC)、大腸直腸癌、乳癌，以及在前列腺、腸胃、皮膚、胃、食道癌、及膀脱癌上。、二用於治療不必要之細胞分生相關情況(特定而言是腫瘤治療）的本發明之人類化抗體能顯著地抑制腫瘤細胞生長，以所測1之腫瘤體積的減少為例，大於約1〇%、2〇%、川〇/〇或40。/。及最顯著地大於約蕭。可以經由掃描得到該人類化抗體（例如參見於實例1〇之討論）。相來說，基於相對於未治療之癌症細胞所減少之腫瘤體積（例如大於約1〇%、 2〇〇/〇、3 0%、40%或5〇%)，吾人可以選擇針對用於本發明之人類化抗體。本發明亦提供醫藥組合物，其包含本發明之人類化抗體及醫藥可接受之賦形劑。舉例來說，適合的載劑及其調配品說明於i6^ed.5 198〇3

Mack Publishing Co·，edited by 〇si〇 et al•。傳統上吾人於該調配品中使用適當量之醫藥可接受鹽類是用以使該調配品為等張。其載劑的實例包括緩衝溶液像是鹽水、林格氏 (Ringer，s)溶液及葡萄糖溶液。該溶液的？11值較佳地是從約 5到約8,而更佳地是從約7·4到約7·8。額外的載劑包括持續釋放配製品像是固態厭水性聚合物之半滲透基質，其中該_ 基質為經塑形過之顆粒形式，如脂小體、膜衣錠或微粒。習於本技藝之技術者可顯而易見地某些載劑可能又更佳，端視例如投藥之途徑及所投藥之醫藥組合物的漠度。 86478 -38- 200416044 杈藥之達成可藉注射(如靜脈注射、腹腔注、肉注射)或藉其他方法像是輸液來確保能以有达至血流中。匕A虿效形式傳之抗體能以一有效劑量來投藥《治療所-H床狀況(即能消除或減少該病患之腔里）正吊情況下會以非經腸道投藥，可能的話，是在標細胞位置或以靜脈投藥。針對所給之案例的較佳醫藥調配品及於治療上有效劑量組合 ^ 六疋疋取決於習於本技藝者。該藥劑及劑量之組合會端視該狀況的性質（即該癌症二性質）、該特定免疫毒素之特性（若使用之，例如其治療指標）、該病患.及該病患之病史。一個有效劑量是在例二每= 每公斤體重約0.05到约1 00毫克的範圍内。更特定而言，每天每公斤體重約0.05 mg、（M mg、〇.2mg、u mg、〇 4mg 、〇·5 mg、0.6 mg、G.7 mg、G.8 mg、Q 9 mg、丨叫、2 呵、3 mg、4 mg、5 mg、6 mg、7 mg、8 mg、9 mg、1〇叫、15 mg、20 mg、或25 mg。或者每週每公斤體重約〇〇5到約100毫克，更特定而言，約0.05 mg、0.1 mg、0.2 mg、 mg、〇·4 mg、0.5 mg、0.6 mg、〇·7 mg、0.8 mg、0.9 mg、1 mg、2 mg、3 mg、4 mg、5 mg、6 mg、7 mg、8 mg、9 mg 、10 mg、15 mg、20 mg、或25、mg。或者每二週每公斤體重約0.05到約100毫克，更特定而言，約〇·〇5 mg、〇」mg 、〇·2 mg、0.3 mg、0.4 mg、〇·5 mg、0.6 mg、0·7 mg、0·8 mg、0.9 mg、1 mg、2 mg、3 mg、4 mg、5 mg、6 mg、7 mg 、8 mg、9 mg、10 mg、15 mg、20 mg、或 25 mg 〇 86478 -39- 200416044 三週每公斤體重約0.05到約100毫克，更特定而言，約〇〇5 mg、〇_1 mg、0.2mg、0·3 mg、0.4mg、〇 5 mg、

O 0.7 mg、0.8 mg、〇·9 mg、l mg、2 mg、3 mg、4 mg、5 邮、6 mg、7 mg、8 mg、9 mg、10 mg、15 mg、20 mg、或 25 ° 1 王、，~ J兄，更特定言，約 0.05 mg、〇·ι mg、〇·2 mg、〇·3 mg、〇 4 mg、〇 5 、0.6 mg、0.7 mg、0.8 mg、0.9 mg、1 mg、2 mg、3 m 4 mg 20 mg、或 25 mg 4 mg、5 mg、6 mg、7 mg、8 mg、9 mg、1〇 mg、15 叫在另一具體實施例中，腫.瘤細胞是以丨）投藥給病患本發明之人類化抗體及2)化學洽療劑來處理。化學治療劑之實例包括但非僅限於順鉑、紫杉醇、鹽酸伊利替康注射液 (campt〇Sar)、阿黴素((1〇,)、汀1;、雙氟脫氧胞苦（^111(^^11^) 、DM-1(供應自Immun〇gen)、長春鹼、放線菌素d、依託泊苦（etoposide)、胺甲葉酸及14_羥柔紅每素（D〇x〇rubicin)。數種隻因而經一般的技術者加以考慮以決定要投藥給一個體之治療組合及劑量，彡包括例如給藥途徑及該病患之臨床情況。在-個具體實施例中，本發明之抗體是設計為在有化學治療劑或放射線存在時來投藥。在另—具體實施例中’本發明之抗體是針對與化學治療或放射線治療連同俵用來調配並與說明書—同包裝，或針對與化學治療或放射線治療連同使用來販售或推廣。本發明之操作會採用細胞生物學、細胞培養、分子生物干微生物予、重組Dna、蛋白質化學、及免疫學上的既 86478 -40- 200416044 有技術（除非另外説明），其皆為在本技藝之技術中。此類技術皆說明於文獻中。請見例如：Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd edition. (Sambrook, Fritsch and Maniatis，eds·)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989 ;DNA Cloning，卷 I 和 Π (D.N· Glover，ed)，1985 ; Oligonucleotide Synthesis，（M.J· Gait，ed)，1984 ;美國專利編號第 4,683，195 號（Mullis et al·，）； Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames and S.J. Higgins, eds.)? 1984 ； Transcription and Translation (B.D. Hames and S.J. Higgins, eds.), 1984 ；Culture of Animal Cells (R.I. Freshney, ed). Alan R. Liss, Inc., 1987 ； Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press, 1986 - ;V " ' ' .... - j . .〆-. . . . ...：：' . : ' · -, , . . 、. . . ' .，；A Practical Guide to Molecular Cloning (B. Perbal), 1984 > ..； .... .. .：； -, - · * .. ；Methods in Enzymology » 154^ 155 (Wu et al.? eds),

Academic Press, New York ； Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H. Miller and M.P. Calos，eds·)，1987, Cold Spring Harbor Laboratory ； Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer and Walker, eds.), Academic Press, London，1987 ； Handbook of Experiment

Immunology。卷 I-IV (D.M· Weir and C.C. Blackwell，eds·)， 1986 ； Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press，1986 〇 - 下列實例係提供為說明本發明，且不應解釋為其限制。具體實施例實例l-muBHA10可變區之選殖 86478 -41 - 200416044 利用Qiagen RNeasy迷你套組依照製造商建議之操作手冊來從BHA10小鼠融合瘤細胞（ATCC登錄編號第HB-1 1795號）製備總細胞RNA。利用 GIB CO BRL Superscript Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis依照製造商建議之操作手冊，用隨機六元體（random hexamers)當作引子從總細胞RNA中將編有該重鏈及輕鏈之可變區基因碼的cDNA 選殖出。用來PCR擴增該小鼠BHA10免疫球蛋白之重鏈可變區的引子為：5* TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGC CCT TGG CCC C 31 (SEQ ID NO : 17)及 5丨 AGG TSM ARC TGC AGS AGT CWG G 3’（S = C/G，M=A/C，R=A/G，W=A/T)(SEQ ID NO : 18)。含有其訊息序列之BHA10輕鏈可變區是以下列引子來擴增：5, ACT AGT CGA CAT GGG CWT CAA GAT GGA GTC ACA KWY YCW GG 31 (K=G/T，W=A/T，而 Y=C/T) (SEQ ID NO : 19)及 5, GTT AGA TCT CCA GCT TGG TCC C 3' (SEQ ID NO : 20)。接著使用 Clontech’s AdvnTaq DNA聚合酶，將該PCR進行3分鐘在94°C之熱開始，35個循環：於 94°C變性1分鐘，於50t黏接1分鐘，及在68°C延長2分鐘，以及然後在68°C最終的7分鐘延長作用。該PCR產物是利用 Qiagen Qiaquick膠體萃取套組依照製造商建議之操作手. 來膠體純化。利用其Τ0ί>0 TA選殖套組依照製造商建議之操作手冊，將經純化之ΒΗΑ10 PCR產物次選殖進入 Invitrogbi^s pCR2.1-TOPO選殖載體。將該重鏈RT-PCR次殖株標名為PAND138。該輕鏈RT-PCR次殖株貝U標名為 86478 -42- 200416044 pAND 1 45。將來自多個獨立次殖株的嵌入體進行定序。除了在PCR引子中之退化位置的例外中，該獨立之次殖株的嵌入序列為完全相同的。利用以訊息序列來擴增之PCR產物來的cDNA序列所預測之小鼠輕鏈的N-端胺基酸序列完全付合純化之人工BHA1 0輕键得自Edman分解法的N-端胺基酸序列（DIVMTQSQKF)(SEQIDNO: 21)。該針對小鼠重鏈殘基1-1 6所預測之序列符合以Edman分解法所測定之經解塊純化的BHA 1 0重鏈序歹ij ([Q] VQLQQSGPELVKPGA) (SEQ ID NO ： 22) 〇以該可變區序列之BLAST分析確認其免疫球蛋白之相似度。該BHA10重鏈可變區是小鼠亞群π⑻的一員（Tucker et a 1 · S c i e n c e 2 0 6 : 12 9 9 -13 0 3 (ϊ 9 7 9 ))。該 B H A10 輕鏠可變區；是小鼠 κ 亞群 I 的一員（Kabat et al· (1991) Sequence of

Proteins of Immunological Interest. 5th Ed·，U.S· Dept· Health and Human Services)。該 BHA10小鼠可變輕及重區的預測胺基酸序列分別表示於SEQ ID NO: 1及2。實例2-chBHA10之建構及表現利用含該輕鏈及重鏈之小鼠BHA10可變區基因碼的 cDNA來建構用於表現小鼠-人類嵌合體（cllBHA10)之載體其中該muBHAlO可變區是連接在人類IgGi (Ellison et al· (1982) Nucleic Acid Res. 10 : 4071-4079)及 κ恆定區（1^心1·-et al· (1980) Cell 22 : 197-207)上。針對該重鏈嵌合體之建構來說，將來自該BHA10重鏈次殖株pAND138之0·32 kb部分的Pstl-BstEII片段次選殖進入來自5&8重鏈質體pLCB7之 86478 -43- 200416044 去磷酸化的2.82 kb Pstl-BstEII載體片段中（5a8是分子選殖之CD4-專一之mAb-ATCC登錄編號第HB-1 088 1號），以在該 muBHAlO重鏈可變區之5’端加入一個小鼠重鏈訊息序列以及在3’端加入一個剪接提供位。在此稱為pAND146之質體中，該重鏈成熟之N-端視經重組過的以符合純化之人工 BHA10 重鏈的 N-端序列（QVQLQQSGP)(SEQ ID NO : 23)。在該生成質體pAND 146中之重鏈序列以DNA定序加以確認。將來自pAND146之0.43 kb的NotI_HindIII重鏈可變區片段以及來自質體pEAG964(其含有人類IgGl恆定區）之1·21 kb 的 Hindlll-Notl 片段次選殖進 pCEP4(Invitrogen) EBV表現載體衍生之質，體pCH269的Notl位置、中，便產生 pAND147 〇 * ^ - · 針對該輕鏈喪合體之建構來說，勝來自該BHA10輕鏈可變區質體PAND145之0.42 kb的EcoRI片段次選殖進入經直鏈化、去磷酸化之pUC-衍生之選殖載體pNN09的EcoRI位置中。.此步驟在所生成之質體，pAND 149，中加入了兩側之

Notl位置。在該生成質體pAND149中之輕鏈序列以DNA定 « 序加以確認。將奉自pAND149之0·45kb的NotI-BglII輕鏈可變區片段以及來自質體pEAG963(其含有人類κ輕鏈恆定區）之 0.68 kb 的 BclI-Notl 片段次選殖進 pCEP4(Invitr*ogen) EB V 表現載體衍生之質體PCH269的Notl位置中，便產生質體_ PAND151 〇將表現載體（chBHAlO重鏈載體pAND147及chBHAlO輕鏈載體PAND151)共轉染到293-EBNA細胞中，並且針對抗 86478 -44- 200416044 體分泌及專一性對經轉染之細胞加以檢測。空質體轉染之細胞，或以hu5c8( —個分子選殖之CD154-專一的mAb)用之 EBV表現載體及huCBEll(—個LTj-R-專一之mAb(該細胞株已授與ATCC專利寄存編號PTA-3357))共轉染之細胞當作對照組。來自全細胞溶解物及調適培養基之蛋白質A免疫沉澱物的西方墨點分析（用抗人類重鏈及輕鏈抗體呈像）顯示經chBHA 10轉染之細胞合成並有效地分泌抗體重鏈及輕鏈，為相似於經hu5c8或huCBE 11轉染之細胞的程度。用來自經轉染之細胞的調適培養基染色之HT-29細胞（其會表現 Ι/Γ-β-R)的FACS分析顯示該chBHA 10抗體結合及產生著色的型式類似於muBHAlO及huCBEll的型式，然而來自經仿造及hu5c8轉染之細胞的調適培養基則無法在HT-29細胞上 . ,.- ..... - —. .. . . : . .... ..... .；'*< - . . . 染到ϋΓ-β-ΙΙ。將從大量暫時轉染所產生之嵌合的BHA10純% 化並證明其能染到在HT_29細胞上之LT-β-ΙΙ以比huCBEll 約強二倍明顯的Kd，與對muCBEll及muBHAlO所測得之相對親和性一致（Browning et al_，J· Exp· Med· 183 : 867，1996)。實例3-經改造之BHA10可變區的建構該BHA10輕鏈可變區相當於人類κΐ (Heiter et al· (1980) Cell 22 : 197-207)而該重鏈可變區則相當於人類重鏈亞群！ (Ellison et al· (1982) Nucleic Acids Res. 10 ·· 4071-4079)。該人類接受體框架之選擇是利用IgBLAST程式以符合人類-種系序列之同源性來選擇。Sato et al. Mol. Immunol. 3 1 : 371-381 (1994):人類之 L1/L15/J1 (Bentley et al. (1983) Cell 32 ' 181-189 ； Cox et al. (1994) Eur. J.. Immunol. 24 ： 86478 -45- 200416044 827-836及 Heiter et al. (1982) J. Biol.Chem· 257 ·· 1 5 16-1522) 對於该輕鍵’而人類之 I_69/J6 (Tomlinson et al· (1992) J·

Mol· Biol· 227 · 776-798 及 Mattila et al· (1995) Eur. J. Immunol·，25 : 2578-2 582)是對於該重鍵。吾人分別設計了三種型之該可變輕之經改造鏈及可變重之經改造鏈。一般來說第一型對於該小鼠提供序列含有最多的回復突變，然而第三型則包含最少（即最，，人類化的”）。該BHA10可變£域是猎由使用ciontech’s Transformer基因突變及Stratagene’s Quikchange基因突變套缸並依照製造商建議之操作手冊，將獨特位置排除（USE)&Quikchange* 因突變加以組合而作成。利用該chBHAlO可變區質體 PAND146及pAND l.49當作起始模版。用於該框禁 '' ；一； ν'.' s ：1 . ' - 之基因突·變的引子說明如下。吾人使用該人類接受體框架 ..... .. . . ' 的cDNA序列，其具有被引介入以產生限制切位改變之無表型突變，以利於分別經突變的質體。經突變的質體是藉由篩選所引介入之限制切位改變來區分。在所生成之質體中的該可變區域之cDNA序列是藉DNA定序來確認。各種以BHA10為基礎的質體及下述相對應之表現載體皆列於表2 〇选造之可變重錘（VH) 可變重鏈，型1，起初是以USE基因突變來突變，其是利― 用 PAND146模版與框架 2 (FR2)引子 5’ GCA CTG GGT GAG GCA GGC CCC TGG ACA GGG ACT TG 3f (SEQ ID NO ： 24) 刪除一個StuI限制切位並產生質體PKJS030。接著將該質體 86478 -46- 200416044

進行二回之Quikchange基因突變，利用寡引子對y CCC AGG TCC AAC TGG TGC AGT CTG GAG CTG AGG 3f (SEQ ID NO : 25)及其於框架1 (FR1)之互補鏈，和5* GAA GTT CAA GGG CAG GGC CAC ACT GAC AGC AGA CAA ATC

CAC CAG CAC AGC CTA CAT GGA GCT CAG CAG CCT

GAG GTC TGA AGA TAC TGC GGT CTA TTT CTG TGC AAG ATC C 3’（SEQ ID NO : 26)及其於框架 3 (FR3)之互補鏈，各對皆刪除一 PstI切位。該所生成之改造之可變重鏈 (VH#1)質體定名為pKJS036。、可變重鏈，型2，是利用pAND 146模版進行單獨一回之

USE基因突變，利用框架1引子5’ CAG GTC CAA CTG GTG . ... , . - ... ... · .1 .. ... . V ； ' ..... . .. -：： . .·

CAG TCT GGA GCT GAG GTG AAG AAG CCT GGG TCC TCA GTG AAG GTG TCC TGC AAG GC 31 (SEQ ID NO ： 27) 刪除EcoRV及PstI切位；框架2引子5’ GCA CTG GGT GAG GCA GGC CCC TGG ACA GGG ACT TG 3,（SEQ ID NO : 28) 刪除StuI切位；及框架3引子5’ GAA GTT CAA GGG CAG GGC GAC AAT CAC TGC AGA CAA ATC CAC CAG CAC

AGC CTA CAT GGA GCT CAG CAG CCT GAG GTC TGA AGA TAC TGC GGT CTA TTA CTG TGC AAG ATC C 3f (SEQ ID NO : 29)產生一 SacI切位。該所生成之改造之可變重鏈（VH#2)質體定名為pKJS031。

可變重鏈，型3，起初是以USE基因突變來突變，其是利用 PAND146模版與框架 1 (FR1)引子 5’ CAG GTC CAA CTG GTG CAG TCT GGA GCT GAG GTG AAG AAG CCT GGG 86478 -47- 200416044

TCC TCA GTG AAG GTG TCC TGC AAG GC 3f (SEQ ID NO :30)其已刪除EcoRV及PstI切位及框架3引子y GAA GTT

CAA GGG CAG GGT CAC AAT CAC TGC AGA CAA ATC

CAC CAG CAC AGC CTA CAT GGA GCT CAG CAG CCT

GAG GTC TGA AGA TAC TGC GGT CTA TTA CTG TGC AAG ATC C 3,（SEQ ID NO : 31)其產生一個 SacI切位，而產生質體PKJS032。然後利用質體pKJS032當作Quikchange 基因突變的模版，用框架2引子對5’ GGC CCC TGG ACA GGG ACT TGA GTG GAT GGG ATG GAT TTA TCC TGG 31 (SEQ ID NO : 32)及其互補鏈造成一 Hpall切位之喪該 • * * - ·； • . · * · · . . ·；. 所生成之改造之可變重鏈（VH#3)質體.定名為pKJS037。該huBHAlO熏鏈之表現滅體是經由將來自PKJS036、 pKJS03i、或 PKJS037之 0.425 kb的 Notl-Hindlll 重鏈可變區 . J, , ' . ; ' . ' ' ' . . ,： ' .. . ' . 片段和來自質體PEAG964(其含有人類IgGl恆定區）之1.21 kb的Hindlll-Notl片段次選殖入該pCEP4 EB V表現載體衍生之質體PCH274的Notl切位中來作成，而產生重鏈表現載體pKJS044(重鏈#1表現載體）、pKJS045(重鏈#2表現載體）、及pKJS046(重鏈#3表現載體）。改造之可變輕键（VL)

可變輕鏈，型1，起初是以USE基因突變來突變，其是利用 PAND146模版與框架 1引子 5f GAT.GGA GAC ATT CAG ATG ACC CAG TCT CCT AGC TCC CTG TCC GCC TCA GTA GGA GAC AGG GTC ACC ATC ACC TGG AAG GC 3' (SEQ ID NO : 33)，框架 2引子 5’ GTA GCC TGG TTC CAA 86478 -48- 200416044 CAG AAA CCC GGG AAG GCT CCT AAA TCA C 3f (SEQ ID NO : 34)其引介入一個Xmal切位，5’之框架3引子5’ CAG TGG AGT CCC TTC TAG ATT CAC AGG CAG 3f (SEQ ID 1^〇:3 5)其引介入又5&1切位，而該31之框架3引子^(：丁〇八0：€ ATC AGC AGC CTG CAG CCT GAA GAC TTC GCA ACC TAT TTC TGT CAG C 3f (SEQ IDNO : 36)其引介入一個 PstI 切位。該所生成之質體定名為pKJS033。質體pKJS033在框架2含有不希望之突變而因此進行Quikchange基因突變，利用第二個框架 2 引子對 5f GGG TAT TAA TGT AGC CTG GTA TCA ACA GAA ACC AGG GAA GGC TCC 3f (SEQ ID NO ： 37)及其互複鏈，其移除了該Xmal切位並加入一個Bell切位。質體pKJS033亦進行額外一回之Quikchange基因突變'，利

用框架 4引子對 5'CCT ATC CAT TCA CGT TCG GCC AGG , ’ . '* .. - . . GTA CCA AGG TGG AGA TCT AAC AAG GGC G 3,（SEQ ID NO : 3 8)及其互補鏈，其引介入一獨特之ΚρηΙ切位。這些反應生成質體PKJS038。質體pKJS038在框架2有錯誤而因此進行額外一回之Quikchange基因突變，利用第三個框架2 弓I 子對 5’ CCC TGG TTT CTG TTG ATA CCA GGC AAC GTT AAT ACC CAC 3’（SEQ ID NO: 39)及其互補鏈，造成該Bell 切位之喪参。該所生成之改造之可變輕鏈（VL#1)質體定名為 PKJS051。

可變輕鏈型2，起初是於模版質體pAND 149上進行USE基因突變，利用框架1引子Y GAT GGA GAC ATT CAG ATG ACC CAG TCT CCT AGC TCC CTG TCC GCC TCA GTA 86478 -49- 200416044 GGA GAC AGG GTC ACC ATC ACC TGC AAG GC 3f (SEQ ID N〇：40)，才匡架 2引子 5’ GTA GCC TGG TTC CAA CAG AAA CCC GGG AAG GCT CCT AAA TCA C 3f (SEQ ID NO :41)其加入一個Xmal切位，用5’之框架3引子5, CAG TGG AGT CCC TTC TAG ATT CAG CGG CAG TGG ATC 3f (SEQ ID NO : 42)其加入一個Xbal切位，及用該3’之框架3引子5’ CTC ACC ATC AGC AGC CTG CAG CCT GAA GAC TTC GCA ACC TAT TTC TGT CAG C 3,（SEQ ID NO : 43)其引介入一個PstI切位。該所生成之質體定名為pKJS034。質體 • - . pKJS03 4在框架3及框架2中皆含有不希望之突變。該框架3 突變在質體PKJS034中已藉由成功回之Quikchange基、因突；. , . ： v · -. ^ -： .... '·〆：...

變加以改正、其是利用新的3,之框架3引子5, GCT GAC AGA ... ,、 - ：：；. .. ：.·： ^. - ·. ... ： , ...：： .，V ：' ； V； '·；" :: :V..

AAT AGG TTG CGA AGT CTT CAG GCT GGA GGC TGC ..., .. .... . .. , . . .:

TGA TGG 3’（SEQ ID NO ·· 44)及其互補鏈，其移除了該PstI

切位；及新的5’之框架3引子5’ GGT ACA GTG GAG TCC CTT CCA GAT TCA GCG GCA GTG GAT CTG GG 3f (SEQ * · . ID NO : 45)及其互補鏈，其移除了該Xbal切位。然後在質體pKJS03 4上之框架2錯誤是藉由另一回之基因突變加以改正，利用該引子對 5* GGG TAT TAA TGT AGC CTG GTA TCA ACA GAA ACC AGG GAA GGC TCC 3* (SEQ ID NO-: 46)及其互補鏈，其移除了該Xmal切位並加入一個Bell切位。質體pKJS034然後進行最後一回之Quikehange基因突變，利用才匡架 4 弓| 子對 5，CCT ATC CAT TCA CGT TCG GCC AGG GTA CCA AGG TGG AGA TCT AAC AAG GGC G 3f 86478 -50- 200416044 (SEQ ID NO ·· 47)及其互補鏈，其引介入一個ΚρηΙ切位。該所生成之改造之可變輕鏈（VL#2)質體定名為pKJS039。

可變輕鏈型3，起初是於模版質體pAND 149上進行USE基因突變，利用框架1引子5f GAT GGA GAC ATT CAG ATG ACC CAG TCT CCT AGC TCC CTG TCC GCC TCA GTA GGA GAC AGG GTC ACC ATC ACC TGC AAG GC 3f (SEQ ID NO : 48)，框架 2引子 51 GTA GCC TGG TTC CAA CAG

AAA CCC GGG AAG GGT CCT AAA TCA C 3f (SEQ ID NO * · .

·· 49)其併入一個Xmal切位，該5’之框架3引子5’ CAG TGG AGT CCC TTC TAG ATT CAG CGG CAG TGG ATC 3! (SEQ ID NO: 5 0)其併入一個Xbal切位，及該31之框架3引子5’ CTC

ACC ATC AGC AGC CTG CAG CCT GAA GAC TTC GCA , .... - ' ; .： / ; . ' ·；' .' ...: ACC TAT TAC TGT CAG CAA TAT G 3f (SEQ ID NO ： 51) • .... , · . 其併入一個PstI切位，生成pKJS035。將質體pKJS035進行單獨一回之Quikchange基因突變，利用框架4引子對VCCT ATC CAT TCA CGT TCG GCC AGG GTA CCA AGG TGG AGA TCT AAC AAG GGC G 3f (SEQ ID NO ·· 52)及其互補鏈，其併入一個新的Kpnl切位。該所生成之改造之可變輕鏈（VL#3)質體定名為pKJS040。該huBHAlO輕鏈之表現載體是經由將來自pKJS051、-pKJS039、或 pKJS040之 0.453 kb 的 Notl-Bglll輕鏈可變區片段和來自質體pEAG963(其含有人類κ輕鏈恆定區）之0.678 kb的BclI-Notl片段次選殖入該pCEP4 EBV表現載體衍生之質體PCH274的Notl切位中來作成，而產生輕鏈表現載體 86478 -51 - 200416044 pKJS048(輕鏈#1表現載體）、pKJS049(輕鏈#2表現載體）、及pKJS0 5 0(輕鏈#3表現載體）。實例4-經改造之人類化BHA10抗體（型1、2、3及4)之建構及表現各種上述之表現載體皆已相互配對並列表及說明於表2 並且共-轉染到293-EBNA細胞中。型1之huBHAlO包含 pKJS44(重鏈#1表現載體）與pKJS48(輕鏈#1表現載體）之配對；型2之huBHAlO包含pKJS45(重鏈#2表現載體）與pKJS49 (輕鏈#2表現載體）之配對；型3之huBHAlO包含pKJS46(重鏈#3表現載體）與pKJS50(輕鏈#3表現載體）之配對；而型4 之huBHAlO包含pKJS46(重鏈#3表現載體)與pKJS49(輕辞: #2表現載體）之配對。該載體皆被共-轉染到293-EBNA細胞中並直檢測這些經轉染之細胞的抗體分泌及專一性。調適 . :‘ ·. . ' , ' . 培養基的西方墨點分析（用抗人類重鏈及輕鏈抗體來偵測）顯示經huBHA1 0轉染之細胞會合成並有效地分泌抗體重鏈及輕鏈，以相似於經chBHA 10轉染之細胞的程度。用來自經轉染之細胞的調適培養基染色之HT-29細胞（其會表現 LT-β-ΙΙ)的FACS分析顯示該型3之huBHAlO mAb比型2之 huBHAlO mAb(其相似於chBHAlO)結合較不佳（圖3)。混合並對照共-轉染作用認為該降低作用可歸因於型3的可變輕鏈（圖2)，其與型2之可變輕鏈（VL#2)的不同處在於二個框架殘基：殘基36及87。於是便藉由pKJS46(重鏈#3表現載體）與pKJS49(輕鏈#2表現載體）來建構型4之huBHAlO。將293-EBNA細胞以chBHAlO及huBHAlO型1_4之共轉染 86478 -52- 200416044 作用放大並收集其調適培養基。從蛋白質A-瓊脂糖凝膠將抗體純化並檢測所純化之mAb的活性。其結合到該淋巴細胞毒素-β受體上之測定是藉由FACS分析在該細胞株HT-29 上之以蛋白質A純化之抗體。實例5-於A375細胞上之IL-8激活作用將A3 75細胞以105/ml平鋪於96-孔盤中，其中該盤子是含有經水溶性抗體或是有被抓在經山羊抗-人類IgG Fc (Jackson ImmunoResearch Laboratories)塗覆之小孑L 上的抗體。將該培養盤培養隔夜。將來自用各種BHA10轉染之 293-E細胞的蛋白質-A純化之抗體以所示濃度加以檢驗，如示於圖1。將經蛋白質-A純化之hu-CBEll用來當作正對照 . .. ' ... · . . ； ' ，乂',' 組。IL-8於A375細胞上之激活作用農示於圖1。’其生物活性 ,·； V：·：. /；-：' 沾排名為chBHA 1 0 =型4之huBHAl 0 =型2之huBHAl 0>型3乏 - '. . ： .，. huBHAlO。因為型4之huBHAlO是比型2之huBHAlO更為人類化，因此其被選用來生成穩定之CHO細胞株。實例6-用於型4 huBHAlO之穩定CHO表現載體的建構將用於huBHAlO型4(輕鏈#2表現載體：pKJS049 ;重鏈#3

表現載體：PKJS046)之EBV表現載體共-轉染到293-EBNA 細胞中並且檢測這些經轉染之細胞的抗體分泌。其調適培 • · 養基的西方墨點分析確認經轉染之細胞會合成並有效地分泌重鏈及輕鏈。該EBV載體含有外源之51及3’ UTR以及一個内含子分開該免疫球蛋白的可變區及恆定區，如此對於該穩定之CHO表現載體所預期為cDNA。因此，該cDNA是以 RT-PCR來選殖。

86478 -53- 200416044 利用Qiagen RNeasy迷你套組依照製造商建議之操作手冊來從暫時性共轉染之表現huBHA 1 0的細胞製備總細胞 RNA。利用 Amersham-Pharmacia First Strand cDNA Synthesis 套組依照製造商建議之操作手冊，以RT-PCR使用5，CGG ATC CTC AAC CGG GAG ACA GGG AGA GGC T 3f (SEQ ID NO: 53)來起始該重鏈及 5f CGG ATC CCT AAC ACT CTC CCC TGT TGA A 3’（SEQ ID NO : 54)來起始該輕鏈而將編有該重鏈及輕鏈之可變區基因碼的cDNA從總細胞RNA中選殖出。針對該huBHAlO免疫球蛋白重鏈cDNA之PCR擴增，所用之引子為·· 5, GCT AGC GGA TCC ACC ATG GAC TGG ACC TGG 3’（SEQ ID NO : 5 5)(以直接在該起始之蛋氨酸的 5,加入一 BamHI切位发一個ACC，以增加一個Kozak訊號）； 1 . ；

及 51 CGG ATC CTt AAC CGG GAG ACA GGG AGA GGC T 3’（SEQ ID NO : 56)(以廣泛地去除該重鏈C-端之賴氨酸殘基並在該終止密碼的3f直接加入一個BamHI切位）。針對該 huBHAlO免疫球蛋白輕鏈cDNA之PCR擴增，所用之引子為：5* CCC TTA GGA TCC ACC ATG GGC TTC AAG ATG GAG 3’（SEQ ID NO: 57)(以直接在該起始之蛋氨酸的5’加入一個BamHI切位及一個ACC，以增加一個Kozak訊號）及5’ CGG ATC CCT AAC ACT CTC CCC TGT TGA A 3f (SEQ ID NO ·· 58)(以在該終止密碼的3’直接加入一個BamHI切位）。利用 Advantage Taq DNA聚合酶（Clontech)，將該 PCR進行 2.5分鐘在95t之熱開始，10個循環：於94°C變性〇·5分鐘，於55°C黏接0.75分鐘，及在68°C延長1分鐘，以及然後在68°C 86478 -54- 200416044 最終的5分鐘延長作用。使用10 μΐ來自該起始反應作為樣本及pfu DNA聚合酶（Stratagene)來進行第二次擴增：於94°C 變性0.5分鐘，於50°C黏接0.75分鐘，及在72°C延長1分鐘，以及然後在72 °C最終的10分鐘延長作用。該PCR產物是利用Qiagen Qiaquick膠體萃取套組依照製造商建議之操作手冊來膠體純化。將經純化之PCR產物次選殖進入Invitrogen's pCR4-TOPO選殖載體，依照製造商建議之用於TOPO選殖的操作手冊。將來自多個獨立次殖株的嵌入體進行定序。將該序列已確認之輕鏈cDNA次殖株標名為pKJS072。將該序列已確認之重鏈cDNA次殖株標名為pKJS071。將來自pKJS072之726 bp的BamHI輕鏈cDNA片段次選殖 ..… ..... .' . . . ί:'，..· — ,. - :.+.. 進入經去磷酸化之來自該hu5c8輕鏈表現载pXLC2之6.19 . , ..· :. ...... kb的BamHI載體片段中以製成該含neo之huBHAlO輕鏈表 .. . — ' · - * - - · . 現載體pKJS077(.圖3)。這個質體含有該BHA10型4的輕鏈及新黴素耐受基因。該輕鏈表現盒含有該人類CMV速發早期啟動子和第一個内含子（其含有一小段缺失）以及該人類生長贺爾蒙之多聚腺苷酸化序列。相似地，將來自PKJS071之1404 bp的BamHI重鏈cDNA片段次選殖進入經去磷酸化之BamHI直鏈化的pV80中以製成該含dhfi·之huBHAlO重鏈載體pKJS078(圖5)。這個質體含有該BHA10型4的重鏈及dhfr基因。該重鏈表現盒含有該人類 CMV速發早期啟動子和第一個内含子（其含有一小段缺失）以及該人類生長贺爾蒙之多聚腺苷酸化序列。該dhfr表現盒含有SV40早期啟動子及SV.40多聚腺苷酸化序列。 86478 -55- 200416044 將表現載體共-轉染到COS細胞中並且檢測這些經轉染之細胞的抗體分泌及專一性（空的載體或M92載體當作負對照組）。其調適培養基的西方墨點分析（以抗人類重鏈及輕鏈抗體來呈像）顯示經轉染之細胞會合成並有效地分泌重鏈及輕鏈，並且在FACS分析中來自經huBHA 10轉染之細胞的調適培養基能染到表現LT-β-ΙΙ的HT-29細胞。實例7-表現型4之huBHAlO的CHO細胞株：將針對型4之huBHAlO的表現質體pKJS077及pKJS078轉染至CHO細胞中。實例8-抗體親和性之測量： • ... . ' t 經由以含有5 mM EDTA之PBS處理30分鐘接著劇烈攬動，將HT29細胞收集下來。將細胞分配在圓底，之96-孔盤中，以2.5 X 105細胞/孔、將來自以各種BHA10轉染之293-E細胞 :, ..... . . 的上清液以所示之於總體積100 μΐ中的稀釋率加入該孔中，並以4°C培養1小時。以FACS缓衝溶液（含5% FBS之PBS) 沖洗該細胞二遍並且用1 : 100稀釋之PE-連接的人類抗重鏈及輕鏈抗體（Jackson ImmunoResearch Laboratories)培養 1 小時。然後將該細胞用FACS緩衝溶液沖洗3次並重新懸浮於100 μΐ之含1.0%仲曱醛的PBS中。然後將樣本移到該 FACS裝置中以進行分析。將來自以各種ΒΗΑ10轉染之293- E細胞之經蛋白質A純化的抗體以所示濃度加以檢測，如示於圖2。使用該經蛋白質A純化的CBE11和5c8(抗-CD40L抗體）研究標準分別當作正及負對照組。其結合活性的排名為 (：1^11八10 =型4之111^11八10 =型2之111^11八10>型3之11118^1八10。 86478 -56- 200416044 實例9-於WiDr細胞上之細胞毒性：

一個使用WiDr直腸癌細胞與水溶液之抗體在經抗-人類IgG Fc塗覆之小孔的細胞毒性試驗顯示本發明之抗 lt^-r抗體會在癌症細胞增加細胞毒性。將WiDr在存在8〇單位/ml之huIFN_y下以6 X l〇4/ml鋪於96_孔盤中，其中該盤子是含有經水溶性抗體或是有被抓在經山羊抗·人類IgG

Fe (Jackson ImmunoResearch Laboratories)塗覆之小孔上的抗體。將該培養盤培養5天。將MTT加入4小時並且將該所生成之沉澱物藉由以配於1〇 mM HC1之10% SDS培養隔夜來加以溶解，·並且以微量盤讀值儀讀取其〇D值。實例10_huBHA10之先處理減緩WiDr腫瘤細胞的生長：將6週大之裸鼠以腹腔注射100 Ug之抗LFA3抗體（1E6)、

\ - J . .· . .::V ... f : . ., loo ug抗LT}R抗體（即改造之huBHA1〇)、或無注射組）。然後將該動物以皮下注射1><106個界][1>直腸腺癌細胞。母週以100 ug之抗體再處理該已被經改造ha 10處理的小鼠，而該ιηΒΗΑ 10動物則僅在第14天再處理。每週測篁其腫瘤大小以及計算該腫瘤的體積。當該動物的腫瘤達到2·0 cm3(直徑16 mm)之體積時便將其犧牲，而其死亡則註記於存活表中。吾人預期以改造之huBHA10的再處理能減緩該WiDr腫瘤在裸鼠體内的發展。貫例11-在攜有WiDr腫瘤的裸鼠上減緩預長之WiDr腫瘤的· 生長及增加存活率：將1 〇6個WiDr細胞在裸鼠皮下預長10天。該小鼠以皮下注射方式每週接受PBS或改造之huBHAi0或是隔週接受 86478 -57- 200416044 mBHAl 0。從長度及寬度計算該腫瘤的重量，而具有超過 2000 mg之膻瘤的動物便被犧牲，其於犧牲時的腫瘤重量仍併入統計平均中。腫瘤之重量是利用該方程式加以計算： (寬度χ寬度χ長度）/2-腫瘤重量（以mg計）。吾人預期本發明之改造的huBHA 10抗體能在體内減緩預長之腫瘤的發展。此外，如上所述來生長及處理腫瘤並且測量該動物的存活百分比。吾人預期本發明之改造的hHBHA 10抗體能在有預長之腫瘤的小鼠體内引起延長的存活率。表2 說明 VH#1 (pKJS036); 可變重鏈型1(包含回復突變Y27、T30、Ί48、A67、 L69及F91> VH#2 (pKJS031) 可變重鏈型2(包含回復突變γ27、T30、148及A67) VH#3 (pKJS037) 可變重鏈·型3(包含回復突變Y27及T30)… VL#1 (pKJS051) 可變輕鏈-型1(包含回復突變Y36、S49、T63及F87) VL#2 (pKJS039) 可變輕鏈-型2(包含回復突變Y36、S49及F87) VL#3 (pKJS040) 可變輕鏈-型3(包含回復突變S49) 重鏈 #1 (pKJS044) 重鏈·型1(包含VH#1及重恆定鏈人類igGl) 重鏈#2 (pKJS045) 重鏈-型2(包含VH#2及重恆定鏈人類igGl) 重鏈#3 (pKJS046) 重鏈-型3(包含VH#3及重恆定鏈人類igGl) 輕鏈 #1 (pKJS048) 輕鏈-型1(包含VL#1及輕恆定鏈人類κ) 輕鏈#2 (pKJS049) 輕鏈-型2(包含VL#2及輕恆定鏈人類κ) 輕鏈#3 (pKJS050) 輕鏈-型3(包含VL#3及輕恆定鏈人類0 _ 型 1 之huBHAlO 型1之111^1^10其包含重鏈#1及輕鏈#1 型 2 之huBHAlO 型2之huBHAlO其包含重鏈#2及輕鏈#2 型 3 之huBHAlO 型3之huBHAlO其包含重鏈#3及輕鏈#3 型 4 之huBHAlO 型4之huBHAlO其包含重鏈#3及輕鏈#2 pKJS077 輕鏈#2 pKJS078 重鏈#3 -58- 200416044 那些I於本技藝之技術者 4入此u 士政 ”，、貝而易見地，在該多胜肽、組合物及本發明之方法中丄々 4、」進订各種修改及變化而不悖離本發明之精神或範圍。因此， ^ α本說明書希望本發明涵蓋此發明之修改及變化其限制停件悚仵為其所伴隨之所附申請專利範圍之範圍及其對等。本文所引又所引用之所有公開案及專利申清案，以及出現於圖示及序列表外幻表之文件，對所有目的皆為相同之延伸如同其個別所所註吓。己之，因此以引用方式將其全文併入本說明書中。【圖式簡單說明】圖！顯示不同類型之huBHA10(類型2_4)對於在Α375細胞進行。實心方塊：嵌合的BHA10;空心圓圈：類實心圓圈：類型· 對照）。 _ * . ... * 圖2顯示純化的huBHAlO抗體類·型2_4結合至町29細胞的 FACS分析結果。FACS分析是依實例8中所述來進行。實心方塊：嵌合的BHA10 ;空心圓圈：類型2.;實心圓圈：類型 3 ;空心菱形：類型4 ;空心三角：huCBEll(正對照）；十字 :M92(抗-CD40L抗體）（負對照）。圖3以圖示說明PKJS077的質體圖譜。此質體含有輕鏈#2 及新黴素耐受基因。該輕鏈表現盒含有該人類CMV速發早— 期啟動子和第一個内含子（其含有一小段缺失）以及該人類生長贺爾蒙之多聚腺苷酸化序列。圖4(A)顯示編有該輕鏈#2之基因碼的核酸序列（可變區_ 86478 -59- 200416044 單下標線；恆定區-雙下標線）（SEQ ID N〇：59)而圖4(B)顯示其對應之胺基酸序列（可變區-單下標線；恆定區-雙下標線）（SEQ ID NO : 60)。圖5以圖示說明pKJS078的質體圖譜。此質體含有重鏈#3 及DHFR基因。該重鏈表現盒含有該人類CMV速發早期啟動子和第一個内含子（其含有一小段缺失）以及該人類生長賀爾蒙之多聚腺苷酸化序列。該DHFR表現盒含有SV40早期啟動子及SV多聚腺苷酸化序列。圖6(A)顯示編有該重鏈#3之基因碼的核酸序列（可變區-單下標線；恆定區雙下標線）（SEQ ID NO : 61)而圖6(B)顯示其對應之胺基酸序列（可變區-單下標線；恆定區-雙下標 . . · * .. ^ , ; ： : ^ 線）（SEQ ID NO : 62)。卜二？ 86478 60- 200416044 <110>美商拜奥精公司序列表 <12〇>人類化抗淋巴細胞毒素β受體之抗體

jC13Q>JBI N-A156TW <140> 092117964 1 <141> 2003^07^01 j <150〉 60/392993 <151〉2002-07-01 · ___________________ ___________________ <150> 60/417372 <151〉 2002-10-〇9 ;<160> 62 J ；<170> FastSEQ for Windows Version 4.0 ；<210> 1 <211> 107 <212〉 PRT一 <213〉;小鼠「 * : — 一 —— . j 1 t i<400> 1 Asp lie Val Met Thr Gin Ser Gin Lys Phe Met Ser Thr Ser Val '；1 5 10 15 :Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn Val Gly lie ； 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Ser Leu ； 35 40 45 ：Ser Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Thr Asn Val Gin ：65 70 75 Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gin Gin Tyr Asp Thr Tyr Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105

Gly Asn lie Gly Ser 80 Phe <210> 2 丨 <211> 116 <212〉PRT__..一、<213> 小鼠: : <400〉 2 Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly 1 5 l〇 15 Ser Val Arg lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr 20 25 30 Tyr Leu His Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Gly Trp lie Tyr Pro Gly Asn Val His Ala Gin Tyr Asn Glu Lys 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala 65 Ί0 75

Ala Tyr lie Phe Tyr 80 86478 200416044

Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala lie Tyr Phe Cys 85 90 95

Ala Arg Ser Trp Glu Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val 100 105 110

Thr Val Ser Ser 115 <210> 3 <211> 321 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <221> CDS <222〉（1)··.(321) <223〉人工之人類化bhaio可變輕鍵，型1 <400> 3 gac att cag atg acc cag tct cct age tcc ctg tcc gcc tea gta gga Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 48 gac agg gtc acc ate acc tgc aag gcc agt cag aat gtg ggt att aac Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn Val Gly He Asn 20 25 30 gtt gcc tgg tat caa cag aaa cca ggg aag get cct aaa tea ctg att Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu lie 35 40 45 tcc teg gcc tcc tac egg tac agt gga gtc cct tct aga ttc aca ggc Ser Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Thr Gly 50 55 60 agt gga tct ggg aca gat ttc act etc acc ate age age ctg cag cct Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 9aa gac ttc gca acc tat ttc tgt cag caa tat gac acc tat cca ttc Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gin Gin Tyr Asp Thr Tyr Pro Phe 85 90 95 aeg ttc ggc cag ggt acc aag gtg gag ate aaa Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 96 144 192 240 288 321

<210> 4 <211> 107 <212〉 PRT <213〉人工序列 • <220〉 <223>人工之人類化BHA10可變輕鏈，型1 <400> 4 86478 200416044

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn Val Gly lie Asn 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu lie 35 40 45 Ser Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Thr Gly 5〇 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gin Gin Tyr Asp Thr Tyr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 <210> 5 <211> 321 <212> DNA <213〉人工序列 ‘ <22.0〉二 <223>人工之人類化BHA10可變輕鏈，型2 : • - · " . <221> CDS <222〉（1)...(321) <400> 5 gac att cag atg acc cag tct cct age tcc ctg tcc gcc tea gta gga Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gac agg gtc acc ate acc tgc aag gcc agt cag aat gtg ggt att aat Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn Val Gly He Asn 20 25 30 gta gcc tgg tat "caa cag aaa cca ggg aag get cct aaa tea ctg att Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu lie 35 40 45 tcc teg gcc tcc tac egg tac agt gga gtc cct tcc aga ttc age ggc Ser Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tct ggg aca gat ttc act etc acc ate age age etc cag cct Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 7 5 80 gaa gac ttc gca acc tat ttc tgt cag caa tat gac acc tat cca ttc Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gin Gin Tyr Asp Thr Tyr Pro Phe 85 90 95 aeg ttc ggc cag ggt acc aag gtg gag ate aaa Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 48 96 144 192 240 288

<210> 6 <211> 107 <212> PRT 86478 321 200416044 <213>人工序列 <220> <223>人工之人類化BHA10可變輕鏈，型2 <400> 6

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Lys Ala Ser G'ln Asn Val Gly He Asn 20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu lie 35 40 45

Ser Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gin Gin Tyr Asp Thr Tyr Pro Phe 85 90 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 <210> 7 <211> 321 <212> DNA <213〉人工序列― <220〉 ·...... ....... <223> ΧΞ之人類化BH△丨n變輕鏈，型3 : <221> CDS <222〉（1)…（321) <400> 7 gac att cag atg acc cag tct cct age tcc ctg tcc gcc tea gta gga Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15 gac agg gtc acc ate acc tgc aag gcc agt cag aat gtg ggt att aat Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn Val Gly lie Asn 20 25 30 gta gcc tgg ttc caa cag aaa ccc ggg aag get cct aaa tea ctg att Val Ala Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu lie 35 40 45 tcc teg gcc tcc tac egg tac agt gga gtc cct tct aga ttc age ggc Ser Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tct ggg aca gat ttc act etc acc ate age age ctg cag cct Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 48 96 144 192 240 288 gaa gac ttc gca acc tat tac tgt cag caa tat gac acc tat cca ttc Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asp Thr Tyr Pro Phe 85 90 95 aeg ttc ggc cag ggt acc aag gtq gag ate aaa Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 -4 - 86478 321 200416044 <210> 8 <211> 107 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 ·、 <223>人工之人類化BHA10可變輕鏈，型3 <400> 8 Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn Val Gly lie Asn 20 25 30 Val Ala Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu lie 35 40 45 Ser Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asp Thr Tyr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 <210> 9 <211> 348 <212> DNA — •丨 <213>;人工序列 1 1 <220〉 ........... .、一----.. <223>人工之人類化bhaio可變重鏈，型1丨 <221> CDS <222> (1).. •(348) <400> 9 cag gtc caa ctg gtg cag tet gga get gag gtg aag aag cct ggg tcc 48 Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 tea gtg aag gtg tcc tgc aag get tet ggc tac act ttc aca acc tac 96 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 tat ttg cac tgg gtg agg cag gcc cct gga cag gga ett gag tgg att 144 Tyr Leu His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45 gga tgg att tat cct gga aat gtt cat get cag tac aat gag aag ttc 192 Gly Trp lie Tyr Pro Gly Asn Val His Ala Gin Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 aag ggc agg gcc aca ctg aca gca gac aaa tcc acc age aca gcc tac 240 Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 7 5 80 atg gag etc age age ctg agg tet gaa gat act geg gtc tat ttc tgt 288 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 86478 200416044 85 90 95 gca aga tee tgg gaa ggt ttt cct tac tgg ggc caa ggg acc aeg gtc 336

Ala Arg Ser Trp Glu Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val 100 105 110 acc gtc tee tea 348

Thr Val Ser Ser 115 <210> '10 <211> 116 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <223>人工之人類化BHA10可變重鏈，型1 <400> 10

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30

Tyr Leu His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45

Gly Trp lie Tyr Pro Gly Asn Val His Ala Gin Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60

Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95

Ala Arg Ser Trp Glu Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val 100 105 110

Thr Val Ser Ser 115 <210> 11 <211> 348 <212>,DNA_______________ <213〉人工庠列丨 <220〉 <223〉人工之人類化BHA10可變重鏈，型2 <221> <222> S ) D 1 C ( • (348) <400> 11 cag gtc caa ctg gtg cag tct gga get gag gtg aag aag cct ggg tee 48

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 15 10 15 tea gtg aag gtg tee tgc aag get tct ggc tac act ttc aca acc tac 96

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 tat ttg cac tgg gtg agg cag gee cct gga cag gga ett gag tgg att 144

Tyr Leu His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45 86478 200416044 gga tgg att tat cct gga aat gtt cat get cag tac aat gag aag ttc 192

Gly Trp lie Tyr Pro Gly Asn Val His Ala Gin Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 aag ggc agg gcc aca ate act gca gac aaa tee acc age aca gee tac 240

Lys Gly Arg Ala Thr lie Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gag etc age age ctg agg tet gaa gat act geg gtc tat tac tgt 288

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aga tee tgg gaa ggt ttt cct tac tgg ggc caa ggg acc aeg gtc 336

Thr Val Ser Ser 115 <210> 12 <211> 116 ·

<212> PRT .. I <213〉人工序列丨 • * --- -------------------------------------------------------........... <4 00〉ΊΧ-......... 一

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30

Tyr Leu His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45

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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Ser Trp Glu Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val 100 105 110

Thr Val Ser Ser 115 <210> 13 <211> 348 <212> DNA <213>人工序列 <220> - - <223>人工之人類化BHA10可變重鏈，型3 <221> CDS < <222> (1)...(348) <400> 13 cag gtc caa ctg gtg cag tet gga get gag gtg aag aag cct ggg tcc 48

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 86478 96 200416044 96 tea gtg aag gtg tee tgc aag get tct ggc tac act ttc aca acc tac Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 tat ttg cac tgg gtg agg cag gee cct gga cag gga ett gag tgg atg Tyr Leu His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 gga tgg att tat cct gga aat gtt cat get cag.tac aat gag aag ttc Gly Trp lie Tyr Pro Gly Asn Val His Ala Gin Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 aag ggc agg gtc aca ate act gca gac aaa tee acc age aca gee tac Lys Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 7 0 75 80 atg gag etc age age ctg agg tet gaa gat act geg gtc tat tac tgt Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aga tee tgg gaa ggt ttt cct tac tgg ggc caa ggg acc aeg gtc Ala Arg Ser Trp Glu Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val 100 105 110 acc gtc tee tea Thr Val Ser Ser 115 144 192 240 288 336 348 <210〉 14 <211> 116 <212> PRT_______________________________. ---............— <213>人工异列 j <400〉 14

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30

Tyr Leu His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Trp lie Tyr Pro Gly Asn Val His Ala Gin Tyr Asn Glu Lys Phe 5〇 55 60

Lys Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 7〇 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Ser Trp Glu Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val 100 105 no

Thr Val Ser Ser 115 <210> 15 <211> 214 <212〉 PRT <213>人玉岸列 <220> 86478 200416044 <223>人工之人類化BHA10輕鏈，型4 <400> 15

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asn Val Gly lie Asn 20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu lie 35 40 45

Ser Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 7 5 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gin Gin Tyr Asp Thr Tyr Pro Phe 85 90 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110

Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140

Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 16 <211> 445

<212> PRT _________ _______ 一 ———…................ I <213>人工;I：列：丨 <220> ·... <223>人工之人類化BHA10重鏈，型4 <400> 16

Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30

Tyr Leu His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Trp lie Tyr Pro Gly Asn Val His Ala Gin Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Ser Trp Glu Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val 100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 86478 200416044 145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser 165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 180 185 190

Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 195 200 205

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro 245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser 325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380

Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415

Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430

Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 - 440 445 <210> 17 <211> 31 <212> DNA 一 <213>又工序列1 ---- <220> <223> 引子 <400> 17 31 tgaggagacg gtgaccgtgg cccttggccc c <210> 18 <211> 22 <212〉 DNA ___ <213>人工本『—丨 -- <220> <223>引子 <221> misc feature 86478 -10- 200416044 <222> 5,15 <223> S = Cys or Gly <221> misc—feature <222> 6 — <223> M = Ala or Cys <221> misc_feature <222> 8 ~ <223> R = Ala or Gly <221> misc_feature <222> 20 — <223> W = Ala or Thr <400> 18 aggtsmarct gcagsagtcw gg 22 <210> 19 <211> 41 <212> DNA <213>人工序列 <220〉 <223>引子 ' <221> misc_feature <222> 35 ~ <223> K = Gly or Thr <221> misc一feature <222> 17, 35 <223> W = Ala or Thr <221> misc—feature <222> 36, 37 <223> Y = Cys or" Thr <400> 19 actagtcgac atgggcwtca agatggagtc acakwyycwg g 41 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223> 引子 <400> 20 gttagatctc cagcttggtc cc 22 <210> 21 <211> 10 <212> PRT <213>小鼠 <400> 21

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<213> 小鼠； I <400> 22

Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 15 10 15 <210> 23 <211〉 9

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Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro 1 5 <210> 24 <211> 35 <212> DM芑______—一 <213>又王涵]—— 」 ’ "... :-:,1 …一'Ί <220> · > Κ

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<213>人《±^列丨 I . 一一 ------- <220> ---------— 一 — <223>引子. <400> 29 gaagttcaag ggcagggcca caatcactgc agacaaatcc accagcacag cctacatgga 60 gctcagcagc ctgaggtctg aagatactgc ggtctattac tgtgcaagat cc 112 <210> 30 <211> 71

<212> DNA

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<210> 50 <211> 36 <212> DNA <213>人工序列 . <220> <223> 引子. <400> 50 cagtggagtc ccttctagat tcagcggcag tggatc 36 <210> 51 <211> 58 <212> DNA <213>人卫序列j <220〉 <223>引子 <400> 51 ctcaccatca gcagcctgca gcctgaagac ttcgcaacct attactgtca gcaatatg 58 <210> 52 <211> 52 <212> DNA <213>人工序列1 <220> <223> 引子 <400> 52 cctatccatt cacgttcggc cagggtacca aggtggagat ctaacaaggg eg 52 <210> 53 <211> 31

<212> DNA <213>人工序列…， <220> <223> 引子 <400> 53 cggatcctca accgggagac agggagagge t 31 <210> 54 -17- 86478 200416044 <211> 28 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>引子 <400> 54 cggatcccta acactctccc ctgttgaa 28 <210> 55 <211> 30 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>引子 <400> 55 gctagcggat ccaccatgga ctggacctgg 30 <210> 56 <211> 31 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223>引子 <400> 56 cggatcctca accgggagac agggagaggc t <210> 57 <211> 33 <212>^ DNA <213〉人工;^列; <220〉 <223>引子 <40〇> 57 cccttaggat ccaccatggg cttcaagatg gag <210> 58 <211> 28 <212> DNA <213>小鼠 31 33 <220> <223>引子 <400> 58 cggatcccta acactctccc ctgttgaa 28 <210> 59 <211> 717 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>引子 86478 18- 48200416044 <221> CDS <222〉（1)...(716) <400> 59 atg ggc ttc aag atg gag tea cag tet ctg gtc ttt gta tac atg ttg Met Gly Phe Lys Met Glu Ser Gin Ser Leu Val Phe Val Tyr Met Leu 1 5 10 15 ctg tgg ttg tet ggt gtt gat gga gac att cag atg acc cag tet cct Leu Trp Leu Ser Gly Val Asp Gly Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro 20 25 30 age tcc ctg tcc gcc tea gta gga gac agg gtc acc ate acc tgc aag Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Lys 35 40 45 gcc agt cag aat gtg ggt att aat gta gcc tgg tat caa cag aaa cca Ala Ser Gin Asn Val Gly lie Asn Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro 50 55 60 ggg aag get cct aaa tea ctg att tcc teg gcc tcc tac egg tac agt Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu lie Ser Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser 65 70 7 5 80 gga gtc cct tcc aga ttc age ggc agt gga tet ggg aca gat ttc act Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 etc acc ate age age etc cag cct gaa gac ttc gca acc tat ttc tgt Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys 100 105 110 cag caa tat gac acc tat cca ttc aeg ttc ggc cag ggt acc aag gtg Gin Gin Tyr Asp Thr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val 115 120 125 gag ate aaa ega act gtg get gca cca tet gtc ttc ate ttc ccg cca Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro 130 135 140 tet gat gag cag ttg aaa tet gga act gcc tet gtt gtg tgc ctg ctg Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 145 150 155 160 aat aac ttc tat ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat aac Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn 165 170 175 gcc etc caa teg ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac age Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser 180 185 190 aag gac age acc tac age etc age age acc ctg aeg ctg age aaa gca Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala 195 200 205 gac tac gag aaa cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly 210 215 220 96 144 192 240 288 336 384 432 480 528 576 624 86478 -19- 672 200416044 ctg age teg ecc gtc aca aag age ttc aac agg gga gag tgt tag 7I7

Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 60 <211> 238 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>引子 <400> 60

Met Gly Phe Lys Met Glu Ser Gin Ser Lea Val Phe Val Tyr Met Leu 1 5 10 15

Leu Trp Leu Ser Gly Val Asp Gly Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro 20 25 30

Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Lys 35 40 45

Ala Ser Gin Asn Val Gly 工le Asn Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro 50 55 60

Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu lie Ser Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser 65 70 75 80

Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95

Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys 100 105 110

Gin Gin Tyr Asp Thr Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val 115 120 125

Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro 130 135 140

Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 145 150 155 160

Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn 165 170 175

Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser 180 185 190

Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala 195 200 205

Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly 210 215 220

Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 61 <211> 1392 <2i2> DNA <213>人工序列 <220> <223> 引子 <221> <222> s D c 2 9 3 <400> 61 atg gac tgg acc tgq agg gtc ttc tgc ttg ctg get gta gca cca ggt 48 -20- 86478 96200416044

Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly 15 10 15 gcc cac tcc cag gtc caa ctg gtg cag tct gga get gag gtg aag aag Ala His Ser Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 cct ggg tcc tea gtg aag gtg tcc tgc aag get tct ggc tac act ttc Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 aca acc tac tat ttg cac tgg gtg agg cag gcc cct gga cag gga ett Thr Thr Tyr Tyr Leu His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu 50 55 60 gag tgg atg gga tgg att tat cct gga aat gtt cat get cag tac aat Glu Trp Met Gly Trp lie Tyr Pro Gly Asn Val His Ala Gin Tyr Asn 65 70 7 5 80 gag aag ttc aag ggc agg gtc aca ate act gca gac aaa tcc acc age Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser 85 90 95 aca gcc tac atg gag etc age age ctg agg tct gaa gat act geg gtc Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 tat tac tgt gca aga tcc tgg gaa ggt ttt cct tac tgg ggc caa ggg Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Trp Glu Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gin Gly 115 120 125 acc aeg gtc acc gtc tcc tea gcc tcc acc aag ggc cca teg gtc ttc Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 130 135 140 ccc ctg gca ccc tcc tcc aag age acc tct ggg ggc aca geg gcc ctg Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 145 150 155 160 ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa ccg gtg aeg gtg teg tgg Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 165 170 175 aac tea ggc gcc ctg acc age ggc gtg cac acc ttc ccg get gtc eta Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 180 185 190 cag tcc tea gga etc tac tcc etc age age gtg gtg acc gtg ccc tcc Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 195 200 205 age age ttg ggc acc cag acc tac ate tgc aac gtg aat cac aag ccc Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro 210 215 220 age aac acc aag gtg gac aag aaa gtt gag ccc aaa tct tgt gac aag Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 225 230 235 240 act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa etc ctg ggg gga ccg Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 144 192 240 288 336 384 432 480 528 576 624 672 720 86478 -21 - 768 200416044 24 5 250 255 tea gtc ttc etc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc etc atg ate tee 816 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met He Ser 260 265 270 egg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg age cac gaa gac 864 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 275 280 285 cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat 912 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val Kis Asn 290 295 300 960 gee aag aca aag ccg egg gag gag cag tac aac age aeg tac cgt gtg Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 305 310 315 320 gtc age gtc etc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 325 330 335 tac aag tgc aag gtc tee aac aaa gee etc cca gee ccc ate gag aaa Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys 340 345 350 acc ate tee aaa gee aaa ggg cag ccc ega gaa cca cag gtg tac acc Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr 355 360 365 ctg ccc cca tee cgq gat gag ctg acc aag aac cag gtc age ctg acc Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr 370 375 380 1008 1056 1104 1152 g y 8 t c 3

aaa ggc ttc tat ccc age gac ate gee gtg gag tgg gag Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu 390 395 400 1200 age aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc aeg cct ccc gtg ttq 1248 Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 405 410 415 gac tee gac ggc tee ttc ttc etc tac age aag etc acc gtg gac aag 1296 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 420 425 430 age agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tea tgc tee gtg atg cat gag 1344 Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 435 440 445 get ctg cac aac cac tac aeg cag aag age etc tee ctg tet ccc ggt 1392 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 450 455 460 <210> 62 <211> 464 <212> PRT <213>人工序列 86478 -22- 200416044 <220> <223>引子 <400> 62 Met Asp Trp 1 Ala His Ser Pro Gly Ser 35 Thr Thr Tyr 50 Glu Trp Met 65 Glu Lys Phe Thr Ala Tyr Tyr Tyr Cys 115 Thr Thr Val 130 Pro Leu Ala 145 Gly Cys Leu Asn Ser Gly Gin Ser Ser 195 Ser Ser Leu 210 Ser Asn Thr 225 Thr His Thr Ser Val Phe Arg Thr Pro 27 5 Pro Glu Val 290 Ala Lys Thr 305 Val Ser Val Tyr Lys Cys Thr lie Ser 355 Leu Pro Pro 37 0 Cys Leu Val 385 Ser Asn Gly Asp Ser Asp Ser Arg Trp

Thr Trp Arg Val Phe Cys 5

Gin Val Gin Leu Val Gin 20 25 Ser Val Lys Val Ser Cys 40

Tyr Leu His Trp Val Arg 55

Gly Trp lie Tyr Pro Gly 70 “

Lys Gly Arg Val Thr lie 85

Met Glu Lea Ser Ser Leu 100 105

Ala Arg Ser Trp Glu Gly 120

Thr Val Ser Ser Ala Ser 135

Pro Ser Ser Lys Ser Thr 150

Val Lys Asp Tyr Phe Pro 165

Ala Leu Thr Ser Gly Val 180 185

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 200

Gly Thr Gin Thr Tyr lie 215

Lys Val Asp Lys Lys Val 230

Cys Pro Pro Cys Pro Ala 245

Leu Phe Pro Pro Lys Pro 260 265

Glu Val Thr Cys Val Val 280

Lys Phe Asn Trp Tyr Val 295

Lys Pro Arg Glu Glu Gin 310

Leu Thr Val Leu His Gin 325

Lys Val Ser Asn Lys Ala 340 345

Lys Ala Lys Gly Gin Pro 360

Ser Arg Asp Glu Leu Thr 375

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser _ 390

Gin Pro Glu Asn Asn Tyr 405

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 420 425

Gin Gin Gly Asn Val Phe

Leu Leu Ala Val Ala Pro 10 15

Ser Gly Ala Glu Val Lys ^ 30

Lys Ala Ser Gly Tyr Thr 45

Gin Ala Pro Gly Gin Gly 60

Asn Val His Ala Gin Tyr 75

Thr Ala Asp Lys Ser Thr 90 95

Arg Ser Glu Asp Thr Ala 110

Phe Pro Tyr Trp Gly Gin ^ 125

Thr Lys Gly Pro Ser Val 140

Ser Gly G丄y Thr Ala Ala 155

Glu Pro Val Thr Val Ser 170 175

His Thr Phe Pro Ala Val 190

Ser Val Val Thr Val Pro 205

Cys Asn Val Asn His Lys 220

Glu Pro Lys Ser Cys Asp 235

Pro Glu Leu Leu Gly Gly 250 255

Lys Asp Thr Leu Met lie 270

Val Asp Val Ser His Glu 285

Asp Gly Val Glu Val His 300

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arq 315

Asp Trp Leu Asn Gly Lys 330 335

Leu Pro Ala Pro lie Glu 350

Arg Glu Pro Gin Val Tyr 365

Lys Asn Gin Val Ser Leu 380

Asp He Ala Val Glu Trp 395

Lys Thr Thr Pro Pro Val 410 415

Ser Lys Leu Thr Val Asp 4 30

Ser Cys Ser Val Met His

Gly Lys Phe Leu Asn 30 Ser Val Gly Phe Leu 160 Trp Leu Ser Pro Lys 240 Pro Ser Asp Asn Val 320 Glu Lys Thr Thr Glu 400 Leu Lys Glu 86478 -23- 200416044 435 440 44b Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 450 455 460 86478 24-

Claims

200416044 拾、申請專利範圍： 1· 一種人類化抗淋巴細胞毒素β受體（LTj_R)之抗體，其輕鏈互補決定區是由SEQ ID NO : 1之胺基酸殘基24到 34、50到56及89到97所界定，而其重鏈互補決定區是由 SEQ ID NO : 2之胺基酸殘基3 i到35、5〇到65及95到1〇2 所界疋，並且其中該抗體在其輕鏈中包含至少一個下列殘基：Y36、S49、T63及F87 ;或在其重鏈中包含至少一個下列殘基：Y27、T30、148、A67、L69及 F91 (Kabat 氏編碼原則）。 2· —種抗體，其會如申請專利範圍第1項之人類化抗體結合在相同的淋巴細胞毒素β受體之抗原決定位。 3· —種人類化抗淋巴細胞毒素β受體（LT-p_R)之抗體，其輕鏈互補決定區是由SEQ ID NO : 1之胺基酸殘基24到 34、50到56及89到97所界定，而其重鏈互補決定區是由 SEQ ID NO : 2之胺基酸殘基3 1到35、50到65及95到102 所界定，並且其中該抗體在其輕鏈中包含殘基Y36、S49 及F87 (Kabat氏編碼原則）。 4· 一種人類化抗淋巴細胞毒素β受體（LT-p-R)之抗體，其輕鏈互補決定區是由S E Q ID N〇：1之胺基酸殘基2 4到 34、50到56及89到97所界定，而其重鏈互補決定區是由 SEQ ID NO : 2之胺基酸殘基3 1到35、50到65及95到102 所界定，並且其中該抗體在其重鏈中包含殘基Y27及 Τ3 0 (Kabat氏編碼原則）。 5·如申請專利範圍第1項之抗體，其中該抗體包含由SEQ 86478 200416044 ID NO : 6之胺基酸殘基1到107所界定的輕鏈可變區域序歹ij 。 6·如申請專利範圍第1項之抗體，其中該抗體包含由SEQ ID NO : 14之胺基酸殘基1到113所界定的重鏈可變區域序歹J 。 7·如申請專利範圍第5項之抗體，其中該抗體尚包含由 SEQ ID NO : 14之胺基酸殘基1到113所界定的重鏈可變區域序列。 8·如申請專利範圍第1項之抗體，其中該抗體包含由SEQ ID NO : 1 5之胺基酸殘基1到2 14所界定的輕鏈可變區域序歹1J。 9·如申請專利範圍第1項之抗體，其中該抗體包含由SEQ IDNO· 16之胺基酸殘基1到442所界定的重鏈可變區域序歹1J。 10·如申請專利範圍第1項之抗體，其中該抗體包含由SEq ID NO : 1 5之胺基酸殘基1到2 1 4所界定的輕鏈可變區域序列及由SEQ ID NO : 16之胺基酸殘基1到442所界定的重鏈可變區域序列。 1 1. 一種抗體，其包含與由細胞株：殖株3D9 (ATCC專利寄存編號PTA-4726,寄存於2002年9月27日）所產生之抗體相同的重鏈及輕鏈多胜肽序列。 1 2 · —種細胞，其會產生根據申請專利範圍第丨_ n項中任一項之抗體。 1 3 ·根據申請專利範圍第1 _ 11項中任一項之抗體，其中該抗 86478 200416044 體大致上保有該親源抗體的結合特性。 14 ·根據申請專利範圍第1 - 11項中任一項之抗體，其中該抗體另連結在細胞毒性基團上。 1 5 ·根據申請專利範圍第1 - 11項中任一項之抗體，其中該抗體另連結在化學治療藥物上。 16 · —種組合物，其包含根據申請專利範圍第卜11項中任一項之抗體及醫藥可接受的載劑。 1 7· —種用來治療或降低贅生物在人體内之發展、惡化或影響之醫藥組合物，其包含根據申請專利範圍第丨_丨丨項中任一項之抗體及醫藥可接受的載劑。 1 8· —種用來降低在人體内之腫瘤體積之醫藥組合物，其包含根據申請專利範圍第丨_丨丨項中任一項之抗體及醫藥可接受的載劑。 H 一種分離之核酸，其包含由細胞株：殖株3D9 (ATcc專利寄存編號PTA-4726，寄存於2 〇〇2年9月27曰）所產生之抗體之輕鏈的編碼序列。 2〇· —種分離之核酸，其包含由細胞株：殖株3〇9 (atcc專利寄存編號PTA-4726,寄存於2002年9月27日）所產生之抗體之重鏈的編碼序列。 21·種为離之核酸’其包含SEQ ID NO : 5之殘基1到1 07 的編碼序列。 22. —種分離之核酸，其包含SEq id no : 13之殘基丨到丨13 的編碼序列。 23 · —種表現載體，其包含根據申請專利範圍第2 1項之核 86478 200416044 酸。 24· —種表現載體，其包含根據申請專利範圍第22項之核酸。 25· —種細胞，其包含根據申請專利範圍第23或24項之一的表現載體。 26· —種細胞，其為細胞株··殖株3D9 (ATCC專利寄存編號 PTA-4726，寄存於2002年9月27曰）。 27.根據申請專利範圍第i-丨丨項中任一項之抗體，其中該抗體為抗原結合片段。 28·根據申請專利範圍第27項之抗體，其中該片段是選自由 Fab片段、Fab’片段、F(ab)2片段、及Fv片段所組成之群。 29·根據申請專利範圍第1-；11項中任一項之抗體或抗原結合片段’其中該抗體是連接在聚乙二醇或白蛋白上。 3 0.根據申請專利範圍第項中任一項之抗體或抗原結合片段，其中該抗體的恆定區是經修飾過的以減少至少一種與未經修飾過之抗體有關的恆定區調節之生物效應功能。 3 1.根據申請專利範圍第^丨丨項中任一項之抗體或抗原結 a片段’其包含具有經改變過之效應物功能的F c區。 32· —種融合瘤細胞，其含有3〇9 (ATCC登錄編號第 PTA-4726號）。 3 3 ·根據申請專利範圍第3 2項之融合瘤細胞，其中該融合瘤細胞會產生人類化抗體，或其抗原結合部分。 86478 200416044 34. 35. 36. 37. 38. 39. 40. 41. 42. 43. 一種輕鏈’其包含來自SEq ID n〇：1之互補性決定區 (CDRs)及可變區框架胺基酸殘基γ36、s49、及Ρ87 (Kabat氏編碼系統），其中該輕鏈的其餘部分是來自人類抗體。一種重鏈’其包含來自SEq ID NO : 2之互補性決定區 (CDRs)及可變區框架胺基酸殘基丫27及T3〇 (Kabat氏編碼系統）’其中該重鏈的其餘部分是來自人類抗體。一種人類化抗體，其包含如申請專利範圍第34項之輕鏈 ’及如申請專利範圍第3 5項之重鏈，或該抗體的抗原結合片段。根據申請專利範圍第3 6項之抗體，其結合到淋巴細胞毒素β受體（LT-p-R)上。一種人類化抗體，其包含前文定為SEQ ID N〇：1之 BHA10可變輕鏈序列的cDRs。一種人類化抗體’其包含前文定為SEq ID NO : 2之 BHA10可變重鏈序列的CDRs。一種人類化抗體，或其抗原結合片段，其包含可變區，此可變區包含相當於來自小鼠BHA10抗體之CDRs的 CDRs，其能專一地與LT-β-ΙΙ結合。根據申請專利範圍第40項之片段，其為Fab片段。種用於治療或減少在病患體内之癌症之醫藥組合物，其包含有效劑量之根據申請專利範圍第1至i i、丨3至 15、27至3 1及36至40項中任一項之人類化抗體。一種用於治療或減少在病患體内之固體腫瘤之醫藥組 86478 2〇〇4l6〇44 44. 合物’其包含有效劑量之根據申請專利範圍第、 13至I5、27至31及36至40項中任一項之人類化抗體。根據申請專利範圍第43項之醫藥組合物，其中該固體腫瘤是選自由非小細胞肺癌（NSCLC)、大腸直腸癌（CRC) 、乳癌、丽列腺癌、腸胃癌、皮膚癌、胃癌、食道癌、及膀脱癌所組成之群。 86478 6-