TW200307533A - Use of EDG receptor binding agents in cancer - Google Patents
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Description
200307533 玖、發明說明: 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於神經鞘胺醇-1-磷酸(S1P)受體激動劑之新 穎用途,特別係用於治療癌症之用途。 【先前技術】 s 1P受體激動劑為加速淋巴細胞返回(LH)劑,該LH劑劑 因淋巴細胞由血循環再分佈較佳可逆性再分佈之二次淋巴 組織,提引出淋巴細胞減少,而未唤起全身性免疫抑制。 自然細胞被隔離;來自血液的CD4及CD8 T-細胞及B_細胞 被刺激而遷移入淋巴結(LN)及貝葉氏集合淋巴結(pp),如 此例如抑制細胞滲濾至移植器官。 S1P受體激動劑典型係神經鞘胺醇類似物,例如2_經取代 之2-胺基丙烷-二醇或2_胺基丙醇衍生物,例如包含式χ 基團化合物 R3zR2zn--ch2r12 其中 2為H、CK6燒基、c2_6婦基、c2 6块基、苯基、經以〇脾 代之苯基;經以1至3個選自齒原原子、C3-8環烷基、苯基及 經以〇H取代之苯基組成的組群之取代基取代之Cl 6烷基; 4CH2_R4z基;其中為0H、醯氧基或式(a)殘基
85372 -6- 200307533 其中Zi為直接鍵或〇,較佳為〇 ; Rsz及j^z各自分別為h或選 擇性地經以1、2或3個鹵原子取代之c! _4燒基;
Rlz為OH、醯氧基或式(a)殘基、以及尺匕及^^各自分別為 Η、Ci-4fe基或酸基。 式X基團為附著至一個部分作為端末基團之官能基,其可 為親水性或親脂性,包含一或多個脂肪族 '芳脂族及/或雜 環族殘基,結果形成之分子其中z&Riz中之至少一者為式(a) 歹:¾基或包含式(a)殘基,式X基團可於多個神經鞘胺醇_ 1 _磷 酸受體之一發訊作為激動劑。 S1P受體激動劑為化合物,該化合物於一或多個神經鞘胺 醇-1-磷酸受體如S1P1至S1P8之一發訊作為激動劑。結合至 SIPx體之激動劑例如可能導致分子内非同質三元體〇蛋白 解離成為Ga-GTP及Οβγ-GTP,及/或增加激動劑占有之受體 之磷酸化,以及下游發訊路徑/激酶之活化。S1P受體激動 劑之結合親和力可如後述第一段之說明測量。 適當S1P受體激動劑例如為: -EP627406A1揭示之化合物,例如式:1化合物 9h2〇r3 r4rsn--ch2or2
Ri 其中Rl為直鏈或分支(C12_22)碳鏈 -其可於鏈中有一鍵結或雜原子選自雙鍵、參鍵、Ο、S、 NR〆其中R0為η、烷基、芳烷基、醯基或烷氧羰基及羰基, 及/或 85372 200307533 -其可帶有烷氧基、烯氧基、炔氧基、芳烷氧基、醯基、 、虎基胺基、燒硫基、驗胺基、fe氧談基、fe氧談基胺基、 醯氧基、烷基胺基甲醯基、硝基、函原子、胺基、羥基亞 胺基、羥基或羧基作為取代基;或 Ri為 -苯基燒基其中燒基為直键或分支(C8-2G)碳鍵;或 _苯基烷基其中烷基為直鏈或分支(C^o)碳鏈其中該苯基烷 基係經以下列基團取代 -選擇性經以鹵原子取代基之直鏈或分支(c6_2G)碳鏈, -選擇性經以鹵原子取代基之直鏈或分支(c6_2G)烷氧基鏈, -直鏈或分支(C6_2〇)烯氧基, -苯基烷氧基、齒苯基烷氧基、苯基烷氧基烷基、苯氧基烷 氧基或苯氧基燒基9 -經以C6_2G燒基取代之環燒基虎基, -經以C 6 - 2 0燒基取代之雜芳基fe基, -雜環C 6 - 2 G fe基或 -經以C2_2G烷基取代之雜環烷基, 以及其中 該基邵分具有 -於碳鏈,具有一個鍵結或一個雜原其係選自雙键、參鍵、 0、S、亞磺醯基、磺醯基、或NR6,其中R6定義如前,以 及 -fe氧基、稀氧基、块氧基、芳fe氧基、醒基、fe基胺基、 坑硫基、酿胺基、乳談基、fe氧談基胺基、驢氧基、: 200307533 基胺基甲醯基、硝基、#原子、胺基、羥基亞胺基、羥基 或叛基作為取代基,以及 R2、R3、R4及R5各自分別為Η、C"烷基或醯基 或其醫藥上可接受之鹽; -ΕΡ 1002792Α1揭示之化合物,例如式π化合物 ?h2or.3 _ 〇 一
FT4R’5N •丨 C.(CH2^C — (CH2)m ch2or.2
II 其中m為1至9,以及R,2、、R’4&R,5各自分別為H、烷基 或醯基, 或其醫藥上可接受之鹽; -EP 0778263A1揭示之化合物,例如式m化合物
(CH2)m.〇R"3 其中W為Η ; Cw燒基、c:2 6烯基或c2_6炔基;未經取代或 、、二以OH取代之苯基;R”4〇(CH2)n ;或經以1至3個選自鹵原 子、烷基、苯基及經以〇H取代之苯基組成的組群; X為Η或未經取代或經取代之直鏈烷基帶有碳原子數目 Ρ,或τ有碳原+數為(ρ])之未經取代或經取代纟直键燒氧 基例如^以1至3個選自下列基團組成的組群之取代基取 、1 6k基氧基、醯氧基、胺基、c1-6貌基 85372 -9- 200307533 胺基、醯胺基、酮基、齒Cw烷基、!i原子、未經取代苯基 以及經以1至3個選自Cw烷基、〇H、Cw烷氧基、醯基、醯 氧基、胺基、Ci_6:fe基胺基、酸胺基、鹵Ci-6健基及ΐ原子 組成的組群之取代基取代之苯基;γ為Η、Cw烷基、ΟΗ、 C^6烷氧基、醯基、醯氧基、胺基、Cl_6烷基胺基、醯胺基、 鹵Cw烷基或鹵原子,及Z2單键或帶有碳原子數q之直鏈伸 P及q各自分別為1至20之整數,但6^p+q^23,m’為1、2或 3,η為2或3, R"i、Rn2、R”3及R”4各自分別為Η、Ci_4烷基或醯基, 或其醫藥上可接受之鹽, -WO02/18395揭示之化合物,例如式IVa或IVb化合物 ?ΗΛ (R2a)2N·丨 C-CH2-Xj—〒H2
?H2R3b R 1a (R2a)2N"jC-CH2-)^j~* P rzzzQ
Ya-R4a IVb (CH2)7CH3 IVa xa為O、S、NRls4 -(CH2)na-,該基為未經取代或經以i至4 個鹵原子取代,na為1或2,Ris為Η或(C“4)燒基,該燒其為 未經取代或經以鹵原子取代;Ru為Η、〇H、(Ci 4)燒某或 〇(CN4)烷基,其中烷基為未經取代或經以1至3個卣原子取 代;Rlb為Η、OH或((^_4)烷基,其中烷基為未經取代或經以 85372 -10- 200307533 鹵原子取代;各個分別係選自H或(Ci 4)烷基,該烷基為 未經取代或經以鹵原子取代;尺3&為11、〇11、鹵原子或〇(Ci 4) 烷基,其中烷基為未經取代或經以卣原子取代;以及為 Η、OH、鹵原子、((^_4)烷基,其中烷基為未經取代或經以 起基或CKCi·4)燒基取代,其中烷基為未經取代或經以鹵原 子取代;Ya 為-CH2-、-c(0)-、-CH(OH)-、-C(=NOH)-、〇或 s,以及R4a為(C4_14)烷基或(C414)烯基; 或其醫藥上可接受之鹽; -WO 02/076995揭示之化合物,例如式V化合物 ㈠ l1c I- (CH2)mc-XcR2c R〇
V 其中 ^^為 1、2或 3 ;
Xc為0或直接鍵;
Rlc為Η,選擇性地經以OH、酿基、_原子、c3_1gj衰燒基、 苯基或羥基-伸苯基取代之Cw烷基;,烯基;c2_6決基; 或選擇性經以OH取代之苯基; R2c為 〇R5c °Re〇 —P〈 〇 其中Rsc為Η或選擇性經以1、2或3個鹵原子取代之Ci 4燒 基,以及R6。為Η或選擇性經以鹵原子取代之c14垸基; 85372 -11- 200307533 尺3。及R4。各自分別為Η、選擇性經以_原取代之(:^4燒 基、或醒基,以及
Rc為C13 -2〇燒基’其可於鍵中選擇性含有一個氧原子,及 其選擇性經以硝基、鹵原子、胺基、羥基或羧基取代;或 式(a)殘基
其中R7c為Η、Cw烷基或Cw烷氧基,以及R8e為經取代之 C 1 - 2 0燒驢基、苯基C 1 -14坑基其中C 1 -14燒基選擇性經以鹵原 子或OH取代、環烷基CH4烷氧基或苯基CM4烷氧基,其中 該環烷基環或苯基環選擇性經以ί原子、Ci-4烷基及/或Cm 烷氧基取代、苯基Ci_14烷氧基-Ci_14烷基、苯氧基CN14烷氧 基或苯氧基烷基取代,
Rc為式(a)殘基,其中當1^為Cw烷基、C2_6晞基或C2_6炔 基時,R8e為燒氧基, 或式VI化合物
其中 nx為2、3或4
Ru為Η ;選擇性經以OH、醯基、齒原子、環烷基、苯基或 85372 -12- 200307533 羥基-伸苯基取代之Cw烷基;C2_6烯基;c2-6炔基;或選擇 性經以OH取代之苯基; R2x為Η、CN4烷基或醯基
Rh及Ro各自分別為Η、選擇性經以原子或醯基取代之 Ci.4燒基, R5x為Η、Ci_4燒基或CN4垸氧基,以及 R6x為經以環fe基取代之Cl_2Q坑驗基;環燒基Ci_l4燒氧基, 其中環烷基為選擇性經以1¾原子、Cw烷基及/或<^-4烷氧基 取代;苯基Ci-u烷氧基其中該苯基環選擇性經以||原子、 Cw燒基及/或CV4燒氧基取代, 於Rlx為經以OH取代之C2_4烷基時,R6x亦為C4-14烷氧基;或 當Rix為Ci_4:fe基時’ R6x為戊氧基或己氧基, 但當Rk為Η或R!x為甲基時’ R6x非為苯基_伸丁氧基, 或其醫藥上可接受之鹽; -W002/06268A1揭示之化合物,例如式vil化合物
其中Rld及Rw各自分別為Η或胺基保護基; R3d為氫或基保護基; R4d為低碳坑基, nd為1至6之整數;
Xd為伸乙基、伸乙烯基、伸乙決基、具有式-D-CH2-之基 85372 -13- 200307533 團(其中D為羰基、_CH(OH)-、〇、S或N)、芳基或經以至多 3個選自如後文定義之a組之取代基取代之芳基;
Yd為單键、Cm伸烷基、經以至多3個選自a組及b組之取 代基取代之伸烷基、於碳鏈中央或末端含有〇或s之 c 1 _ i 〇伸烷基、或於竣鏈中央或末端含有〇或s為經以至多3 個選自a組及b組之取代基取代之伸烷基;
Rsd為氫、環燒基、芳基、雜環基、經以至多3個選自a組 及b組取代基取代之環烷基、經以至多3個選自&組及^組取 代基取代之芳基、或經以至多3個選自a組及b組取代基取代 之雜每基,以及 R6d&R7d各自分別為Η或選自a組之取代基; <a組〉鹵原子、低碳烷基、鹵低碳烷基、低碳烷氧基 、低碳烷硫基、羧基、低碳烷氧羰基、羥基、低碳脂肪族 醯基、胺基、一-低碳烷基胺基、二-低破烷基胺基、低竣脂 肪族醯胺基、氰基或硝基; <13組>為環烷基、芳基、雜環基,其各自選擇性經以至多 3個選自a組之取代基取代; 但當Rw為風時’ Yd為單鍵或直鏈伸燒基,或其藥理 上可接受之鹽或酯。 JP 14316985(JP2002316985)揭示之化合物,例如式 yin 化合物:
VIII 85372 -14- 200307533 7e、nf 其中 Rie、R2e、R3e JP-14316985 ;
R4e、R5e、R6e、R 或其藥理上可接受之鹽或酯。 例如式IX化 -WO 03/29184及WO 03/29205揭示之化合物 合物
CH2OH (CH2)nf CH2〇H NH.
IX 其中义丨為0或S’以及Rlf、R2f、R3f&nf揭示於 29184及〇3/29205,例如2-胺基-2_[4-(3_爷氧基苯氧其)2 氯苯基]丙基-1,3-丙烷-二醇或2-胺基-2-[4-(;氧基苯妒其) 2 -氯苯基]丙基-1,3 -丙娱二醇。 當引述專利申請案時,化合物之相關主題併入本發明以 供參照。 醯基可為Ry-CO-殘基,其中Ry為Cu烷基、C3_6環烷基、 苯基或苯基-Cw烷基。除非另行陳述:,否則烷基、烷氧基、 烯基或炔基可為直鏈或分支。 式I化合物中當作為1之碳鏈經取代時,較佳係經以鹵原 子、硝基、胺基、羥基或羧基取代。當碳鏈係由選擇性經 取代伸苯基忽斷時’碳鏈較佳為未經取代。當伸苯基部分 為經取代時’較佳係經!|原子、硝基、胺基、〒氧基、經 基或叛基取代。 較佳式I化合物為其中尺1為(:13_2〇烷基,選擇性地經以硝 -15 - 85372 200307533 基、卣原子、胺基、羥基或羧基取代;更佳其中Ri為選擇 性經以南原子、取代之C6_M_烷基鏈取代之苯基烷基,且烷 基部分為選擇性經以羥基取代之Cl·6烷基。更佳心為於苯基 經以直鏈或分支且較佳為直鏈C6-M烷基鏈取代之苯基_Ci 6 烷基。C6-M烷基鏈可於鄰位、間位或對位且較佳於對位。 較佳R2至R5各自為Η。 較佳式I化合物為2-胺基-2-十四烷基_1,3_戊烷二醇。特佳 S1P受體激動劑為FTY720,座^2_胺基_2]2_(4_辛基苯基) 乙基]丙烷-1,3-二醇呈自由態形式、或呈其醫藥上可接受之 鹽开> 式(後文稱為化合物Α),例如鹽酸鹽顯示如後:
HCI 較佳式II化合物為其中尺,2至11,5為11以及mg4,亦即2_胺 基-2-{2-[4-(l-酮基-5-苯基戊基)苯、基]乙基}丙烷_丨,3_二 醇’呈自由態形式’或呈醫藥上可接受之鹽形式(後文稱之 為化合物B)例如鹽酸鹽。 較佳式III化合物為其中W*CH3,R”jR”3各自為η,Z2 為伸乙基,X為庚氧基以及γ*Η,亦即2-胺基_4_(4_庚氧基 苯基)-2-甲基-丁醇,呈自由態形式,或呈醫藥可接受性鹽 形式(後又稱t為化合物C)例如鹽酸鹽。以R-對映異構物為 特佳。 85372 -16- 200307533 較佳式IVa化合物為FTY72〇_磷酸鹽(R2a為η,‘為〇H, Xa為〇,Rla及Rlb為〇H)。較佳式ivb化合物C_磷酸鹽(R2a為 H’ R3b4〇H’ Xa為 〇, Ru及 Rib為 〇H,Ya為 〇及‘為庚基)。 較佳式V化合物為化合物心磷酸鹽。 較佳式v化合物為磷酸一 -[(R)_2-胺基甲基_4_(4_戊氧 基-苯基)-丁基]酉旨。 較佳式VIII化合物為(2κ)-2-胺基-4-[3-(4-環己氧基丁基) 苯并[b>塞吩_6_基]-2-甲基丁-1-醇。 當式I至IX化合物分子内含有一或多個非對稱中心時,須 了解本發明涵蓋多種光學異構物,以及其外消旋混合物、 非對映異構物及其混合物。式III或式IVb化合物於載有胺基 之碳原子為非對稱時,較佳於此碳原子為R_組態。 式I至式IX化合物之醫藥上可接受性鹽例如包括與無機 酉父生成之鹽如氫氯酸鹽、氫溴酸鹽及硫酸鹽;與有機酸生 成之鹽如乙酸鹽、反丁烯二酸鹽、順丁烯二酸鹽、苯甲酸 鹽、檸檬酸鹽、蘋果酸鹽、甲烷磺酸鹽及苯磺酸鹽;或於 適當時,與金屬如鈉、鉀、鈣及鋁生成之鹽;與胺類如三 乙基胺生成之鹽;以及與二鹼基胺基酸如離胺酸生成之 鹽。本發明方法之化合物及鹽涵蓋水合物及溶劑合物形式。 基於觀祭得之活性,例如淋巴細胞之自動導向,如 EP627406A1或USP 6,004,565所述,於S1P受體激動劑利用 作為免疫抑制劑,例如用於急性同質共體移植片排斥。今 曰發現S 1P受體激動劑具有令人感興趣之性質,因而讓其可 用於癌症化學治療,特別實體腫瘤,特別惡化之實體腫瘤 85372 -17- 200307533 潦擴大只租腫瘤治療的全副武裝,祛w 合物裊、a 士、十、 剐武裝,特別用於抗癌化 物縣法造成疾鋦退行或穩定之病例。 【發明内容】 根據本發明之特殊發現,提供·· u -種於有需要之個體治療實體腫瘤之方法,讀方法 包含對該個體投予治療有效量之一種包含一個式X 基團4S1P受體激動劑或其醫藥上可接受之鹽。 12 -種於有需要之個體抑制實體腫瘤生長之方法,該 万法包含對該個體才曼予治㈣效量之一 包含一個 式X基團之S1P受體激動劑或其醫藥上可接受之鹽。 1.3 一種於有需要之個體謗使腫瘤退行例如謗使腫瘤質 塊縮小之方法,該方法包含對該個體投予治療有效 K 一種包含一個式x基團之Slp受體激動劑或其醫 藥上可接受之鹽。 1.4 一種於有需要之個體治療實體腫瘤入侵或此種腫瘤 生長相關症狀之方法,該方法包含對該個體投予治 療有政1之一種包含一個式X:基團之s 1 p受體激動劑 或其醫藥上可接受之鹽。 •5 種於有需要之個體預防腫瘤擴散或用於預防或抑 制_微轉之生長之方法,該方法包含對該個體投予 治療有效量之一種包含一個式X基團之S1P受體激動 汾]或其醫藥上可接受之鹽。 1,6 一種於有需要之個體抑制或控制失調血管新生,例 如神經鞘胺醇-1-磷酸(S1p)媒介之血管新生之方 85372 -18- 200307533 法,该方法包含對該個體投予治療有效量之一種包 含一個式X基團之s 1 p受體激動劑或其醫藥上可接受 之鹽。 1,7 一種於有需要之個體預防或治療新血管新生過程或 血管新生失調相關疾病之方法,該方法包含對該個 體投予治療有效量之一種包含一個式又基團之Slp受 體激動劑或其醫藥上可接受之鹽。 男體腫瘤」一同表示淋巴癌以外之腫瘤及/或轉移(無論 係位在何處),例如腦及其它巾樞m賴瘤⑼如腦膜、 腦、脊索、顱神經及中樞神經系統其它部分之腫瘤,例如 神經膠母細胞瘤或髓質母細胞瘤);頭頸癌;乳房腫瘤;循 環系統腫瘤(例如心、縱膈及胸膜以及其它胸部器官、血管 腫瘤及血管組織相關腫瘤);排泄系統腫瘤(例如腎、腎盂e、 輸尿管、膀胱、其它以及非特定泌尿器官腫瘤);胃腸道腫 雜如食道、胃、小腸、結腸、結腸直腸、直腸乙狀結腸 接合、直腸、肛門及肛門孔道腫瘤)、涉及肝臟及肝内膽管、 膽囊以其它非特定膽道部分、胰臟、其它及消化器官腫 瘤口腔腫瘤(唇、舌、齒錄、口腔底、口顯及其它口腔部 分、肥腺及其它唾腺部分、爲桃腺、口咽、鼻咽、梨形當 下咽及唇、口腔及咽之其它部位);生殖⑽腫瘤_1外 陰、陰迴、予宮頸、子宮體、予宮、卵巢及其它女性生殖 器^目關邵位、胎盤、陰莖、攝護腺、睪丸以及其它男性 生=器嘗相關部位腫瘤);啤吸道腫瘤(例如鼻腔及中耳、附 屬貝^、氧官、支氣管與肺臟腫瘤例如小細胞肺癌或 85372 -19- 200307533 非小細胞肺癌);骨骼系統腫瘤(例如四肢骨及關節軟骨、骨 關節軋η及其l邵位腫瘤),皮膚腫瘤(例如皮膚惡性黑素 瘤、非黑素瘤皮膚癌、皮膚基底細胞癌、皮膚鱗狀細胞癌、 中皮癌、卡波西氏肉瘤);以及涉及其它組織之腫瘤,包括 周邊神經系統及自主神經系統、結缔組織及軟組織、腹膜 後及腹膜、眼部及附屬器官、甲狀腺、腎上腺及其它内分 泌腺及相關結構腫瘤、繼發性非特化淋巴結惡性腫瘤、呼 吸系統及消化系統及繼發性惡性腫瘤,以及其它部位之繼 發性惡性腫瘤。 、;幻文及後文述及腫瘤、腫瘤病癌瘤或癌症時另外或此 夕:也暗示於原#器官或組織及/或於任何其它部位的轉 移,而與腫瘤及/或轉移位置無關。 當S1P受體激動劑為式丨化合物如化合物Α,或式iVa或 化合物時’-具體實施例中該Slp受體激動劑係用於治療方 法1·1、1.2、1.3或1.4供治療乳癌、攝護腺癌、膀胱癌、腎 癌或肺癌以外之實體腫瘤。 . 於—系列進—步特定具體實施例或替代具體實施例中, 本發明也提供 u -種於有以之㈣4增加化學治_活性或克服對 化子/口療J之說樂性之方法,包含對該個體投予治 療有效量之S1P受體激動劑’例如包含式X基團之Slp 受體激動劑或其醫藥上可接受之鹽,該Slp受體激動 劑係與該化學治療劑同時投藥或循序投藥。 U根據U之方法,其中化學治療劑為針對宿主細胞之 85372 -20- 200307533 ^號轉導路徑抑制劑、或涉及腫瘤形成及/或轉移形 成之過程、或由腫瘤細胞利用於增生、存活、分化 或發展出抗藥性之過程。 1 ·1 〇削述方法,其中s 1 p受體激動劑係間歇投予。 進一步特定具體實施例或替代例中,本發明也提供·· 2· 1 一種包含一個式X基團之S 1P受體激動劑或其醫藥上 可接受之鹽,其係用於如前文丨」至14定義之任一種
方法,較佳當S 1P受體激動劑為式以匕合物如化合物A 或式IVa或IVb化合物時,S1P受體激動劑較佳係用於 乳癌、知p護腺癌、膀胱癌、腎癌或肺癌以外之實體 腫瘤。 2.2 種311>受體激動劑例如包含一個式X基團之Slp受 體激動劑或其醫藥上可接受之鹽,其係用於前文15 至1 · 10或後文7定義之任一種方法。 3 · 1 種包含一個式x基團之S1P受體激動劑或其醫藥上 可接受之鹽,其係用製備一種醫藥組成物,.該醫藥 組成物供用於如前文1.1至1_4定義之任一種方法,較 佳富S1P受體激動劑為式丨化合物如化合物A或式 或IVb化合物時,sip受體激動劑較佳係用於乳癌、 攝護腺癌、膀胱癌、腎癌或肺癌以外之實體腫瘤。 3.2 一種SIP^:體激動劑例如包含一個式χ基團之slp受 體激動劑或其醫樂上可接受之鹽,其係用於製備供 如上1.5至1.1〇或後文7定義之任一種方法用之醫藥 組成物。 85372 -21 - 200307533 一種用於如上丨·1至丨.4定義之任一種方法之醫藥組 成物,包含包含一個式X基團之Slp受體激動劑或其 醫樂上可接受之鹽,連同一或多種醫藥上可接受之 稀釋劑或載劑,較佳當s 1P受體激動劑為式〗化合物如 化合物A或式iVa或IVb彳匕合物時,S1P受體激動劑較 佳係用於乳癌、攝護腺癌、膀胱癌、腎癌或肺癌以 外之實體腫瘤。 4,2 一種供前述丨.5至1·1〇或後述7定義之任一種方法之 w藥組成物,該組成物包含一種slp受體激動劑,例 如包含式X基團之S1P受體激動劑或其醫藥上可接受 <鹽,連同一或多種醫藥上可接受之稀釋劑或載劑。 種醫樂組合物,包含a)—第一劑,其為S1p受體激 動劑,例如包含一個式X基團之Slp受體激動劑或其 醫藥上可接受之鹽,以及b)—種辅劑,其為化學治療 劑例如定義如後。 5·2 一種醫藥組合物,包含定量a) —第一劑,其為Slp受 體激動劑,例如包含一個式X_基團之Slp受體激動劑 或其醫藥上可接受之鹽,以及b)一種辅劑,其為化學 /口療劑,其係選自如下xi)節定義之化合物俾產生協 同治療效果。 • 一種如前文定義之方法,包含共同投予亦即同時或 循序投予治療有效量之S1P受體激動劑,例如包含一 個式X基團之S1P受體激動劑或其醫藥上可接受之 ^以及種第二樂物物質,該第二藥物物質為化 85372 •22- 200307533 學治療劑,例如定義如後。 7. 一種於有需要之個體治療淋巴增生或骨髓增生病症 之方法,例如用於治療腫瘤入侵或腫瘤生長相關症 狀,该方法包含對該個體共同例如同時或循序投予 S1P κ隨激動劑,例如包含一個式X基團之$ 1 p受體激 動劑或其醫藥上可接受之鹽,以及一種第二藥物物 貝’遠第二藥物物質為化學治療劑,例如定義如後。 「淋巴癌」表現血液及淋巴系統之腫瘤(例如何杰金氏 病非何杰金氏淋巴瘤、貝奇氏(Burkitt,s)淋巴瘤、愛滋病 相關淋巴瘤、惡性免疫增生病、多發性骨髓瘤及惡性漿細 胞瘤、肺淋巴白血病、急性或慢性骨髓性白血病、急性或 慢性淋巴細胞性白血病、單核細胞白血病、其它特定細胞 類型白血病、非特定細胞類型白血病、其它及非特定類淋 巴、k血組織及相關組織之惡性腫瘤,例如彌漫性大細胞 淋巴瘤、τ-細胞淋巴瘤或表皮T-細胞淋巴瘤)。骨髓癌包括 急性或性骨髓性白血病。 「化學治療劑」一詞特別表示S1P受體激動劑以外的任何 化學治療劑。包括(但非限制性), u 芳香環轉化酶抑制劑, η·杬雌激素劑、抗雄激素劑(特別用於攝護腺癌)或促性 腺激素釋放因子激動劑, in·拓樸井構酶〗抑制劑或拓樸異構酶Η抑制劑, iv·微細管活化劑、燒化劑、抗腫瘤抗代謝化合物或銷 化合物, 85372 -23- 200307533 V. 鎖定目標/降低蛋白質或脂質激肽酶活性或蛋白質或 脂質磷酸酶活性之化合物、其它抗血管新生化合 物、或可謗生細胞分化過程之化合物,
Vi. 緩激肽1受體或血管緊張肽II拮抗劑, vii. 環氧合酶抑制劑、貳膦酸去乙醯化酶抑制劑、組織 腺去乙醯化酶抑制劑、乙醯肝素酶抑制劑(防止乙醯 肝素硫酸酯分解)例如PI-88,生物反應修飾劑,較佳 為淋巴激素或干擾素,例如干擾素7、優必昆丨丁化 抑制劑(ubiquitination inhibitor)或可阻斷抗細胞凋亡 路徑之抑制劑, viii. Ras腫瘤發生同質異形體抑制劑例如H-Ras、K-Ras、 或N-Ras,或法尼基轉移酶抑制劑例如L_744,832或 DK8G557, ix. 端粒酶抑制劑例如端粒酶靜止素, X. 蛋白酶抑制劑、基質金屬蛋白酶抑制劑、蛋胺酸胺 基肽酶抑制劑如本瓜麥(bengamide)或其衍生物,或 蛋白粒(proteosome)抑制劑例如PS-341及/或 xi) mTOR抑制劑。 「芳香環轉化酶抑制劑」一詞用於此處表示一種化合物 其可抑制雌激素的產生,亦即抑制酶基質雄烯二酮及睪丸 固酮分別轉成雌酮及雌二醇。該詞包括(但非限制性)類固 醇,特別亞特美斯坦(atamestane)、伊西美斯坦(exemestane) 及弗美斯坦(formestane),及特別非類固醇尤其亞明諾路特 他麥(aminoglutethimide)、羅格雷他麥(roglethimide)、派利 85372 -24- 200307533 多路特他麥(pyridoglutethimide)、翠洛斯坦(trilostane)、特 托拉同(testolactone)、奇托克諾左(ketokonazole)、瓦羅左 (vorozole)、法卓左(fadrozole)、阿納卓左(anastrozole)及雷 卓左(letrozole)。伊西美斯坦例如可以出售形式亦即以商品 名AROMASIN™投藥,伊西美斯坦例如可以出售形式例如 以商品名LENTARON™投藥。法卓左例如可以出售形式例 如以商品名AFEMAtm投藥。阿納卓左例如可以出售形式例 如以商品名ARIMIDEX™投藥。雷卓左例如可以出售形式例 如以商品名FEMAR™投藥。亞明諾路特他麥 例如可以出售形式例如以商品名ORIMETEN™投藥。包含 化學治療劑其為芳香環轉化酶抑制劑之組合物特別適合用 於治療激素受體陽性腫瘤例如乳癌。 「抗雌激素」一詞用於此處係有關一種可於雌激素受體 濃度拮抗雌激素效果之化合物。該術語包括(但非限制性) 塔莫西芬(tamoxifen)、富維斯創(fulvestrant)、拉洛西芬 (raloxifene)及拉洛西芬鹽酸鹽。塔莫西芬例如可以出售形 式例如以商品名NOLVADEX™投藥。拉洛西芬鹽酸鹽例如 可以出售形式例如以商品名EVISTA™投藥。富維斯創可如 US 4,659,516之揭示調配或可以出售形式例如以商品名 FASLODEXTM投藥。包含抗雌激素劑化學治療劑之本發明 組合物特別適合用於治療雌激素受體陽性腫瘤例如乳癌。 「抗雄激素劑」一詞用於此處表示任一種可抑制雄激素 生物效應之物質,包括(但非限制性)拜卡路他麥 (bicalutamide)(CASODEXTM),例如 US 4,636,505 之揭示調 85372 -25- 200307533 配。 「促性腺激素釋放因子激動劑」一詞用於此處包括(但非 限制性)阿布利斯(abarelix)、夠瑟林(goserelin)及夠瑟林乙 酸鹽。夠瑟林揭示於US 4,100,274且例如可以出售形式例如 以商品名ZOLADEXTM出售投藥。阿布利斯例如可如US 5,843,901之揭示調配。 「拓樸異構酶I抑制劑」一詞用於此處包括(但非限制性) 托普堤坎(topotecan)、伊利語堤坎(irinotecan)、9-硝基喜樹 鹼及巨分子喜樹鹼軛合物PNU-166148(W099/17804之化合 物A1)。伊利諾堤坎例如可以出售形式例如以商品名 CAMPTOSAR™出售投藥。托普堤坎例如可以出售形式例如 以商品名HYCAMTIN™出售投藥。 「拓樸異構酶II抑制劑」一詞用於此處包括(但非限制性) 蒽環素類(anthracyclines)例如阿黴素(doxorubicin)(包括微 脂粒調配物例如CAELYX™)、道諾汝必辛(daunorubicin)、 伊皮汝必辛(epirubicin)、依達汝必辛(idarubicin)及尼莫汝必 辛(nemorubicin)、蒽g昆類米托桑村(mitoxantrone)及艾索桑 村(Iosoxantrone),以及鬼臼毒類伊托波賽(etoposide)及添尼 波赛(teniposide)。伊托波赛例如可以出售形式例如以商品 名ETOPOPHOStm出售投藥。添尼波賽例如可以出售形式例 如以商品名VM 26-BRISTOLtm出售投藥。阿黴素例如可以 出售形式例如以商品名ADRIBLAS1TINtm出售投藥。伊皮汝 必辛例如可以出售形式例如以商品名FARMORUBICINtm出 售投藥。依達汝必辛例如可以出售形式例如以商品名 85372 -26- 200307533 ZAVEDOSTM出售投藥。米托桑村例如可以出售形式例如以 商品名NO VANTRON出售投藥。 「微細管活化劑」表示微細管安定劑及微細管解除安定 劑,包括(但非限制性)紫杉烷類例如太平洋紫杉酚 (paclitaxel)及朵西紫杉紛(docetaxel),長春花生物驗類例如 文布拉斯汀(vinblastine)特別文布拉斯;丁硫酸鹽、文克利斯 丁(vincristine)特別文克利斯;丁硫酸鹽及文諾利賓 (vinorelbine)、迪可德莫來(discodermolides)及伊波西隆 (epothilones)及其衍生物例如伊波西隆B或其衍生物。太平 洋紫杉酚例如可以出售形式例如以商品名TAXOLtm出售投 藥。朵西紫杉酚例如可以出售形式例如以商品名 TAXOTERE™出售投藥。文布拉斯汀例如可以出售形式例 如以商品名VINBLASTIN R.P. TM出售投藥。文克利斯汀例 如可以出售形式例如以商品名FARMISTIN出售投藥。迪可 德莫來例如可如US 5,010,099之揭示獲得。 「烷化劑」一詞用於此處包括(但非限制性)布沙芬 (busulfan)、克洛蘭布沙(chlorambucil)、賽洛弗法麥 (cyclophosphamide)、伊弗法麥(ifosfamide)、梅法蘭 (melphalan)或亞硝基尿素(BCNU或格利亞德(Gliadel™))。 赛洛弗法麥例如可以出售形式例如以商品名CYCLOSTIN™ 出售投藥。伊弗法麥例如可以出售形式例如以商品名 HOLOXANTM出售投藥。 「抗腫瘤抗代謝劑」一詞包括(但非限制性)5-氟尿嘧啶 、卡佩西塔賓(capecitabine)、珍西塔賓(gemcitabine)、赛塔 85372 -27- 200307533 拉賓(cytarabine)、富路達拉賓(fludarabine)、硫鳥嗓吟、美 索翠賽(methotrexate)及依達翠賽(edatrexate)。卡佩西塔賓 例如可以出售形式例如以商品名XELODA™出售投藥。珍 西塔賓例如可以出售形式例如以商品名GEMZARtm出售投 藥。 「銘化合物」一詞用於此處包括(但非限制性)卡波普拉ί丁 (carboplatin)、西斯普拉汀(cisplatin)、歐沙利普拉汁 (oxaliplatin)。卡波普拉丨丁例如可以出售形式例如以商品名 CARBOPLAT™出售投藥。歐沙利普拉汀例如可以出售形式 例如以商品名ELOXATIN™出售投藥。 「鎖定目標/蛋白質或脂質激酶活性之化合物或其它抗 血管新生化合物」一詞用於此處包括(但非限制性)蛋白質酪 胺酸激酶抑制劑及/或絲胺酸及/或蘇胺酸激酶抑制劑或脂 質激酶抑制劑例如鎖定目標、降低或抑制下列各項因子之 活性:受體酪胺酸激酶之表皮生長因子族群(EGFR、 ErbB2、ErbB3、ErbB2呈同質元極體或非同質二元體)、受 體酪胺酸激酶之血管内皮生成因子族群(VEGFR)、血小板 衍生生長因子受體(PDGFR)、纖維母細胞生長因子受體 (FGFR)、胰島素類生長因子受體1(IGF-1R)、TrK受體酪胺 酸激酶族群、Axl受體酪胺酸激酶族群、Ret受體酪胺酸激 酶族群、Kit/SCFR受體酪胺酸激酶、c-Abl族群成員及其基 因融合產物(例如BCR-Abl)、蛋白質激酶C (PKC)成員及絲 胺酸/蘇胺酸激酶之Raf族群、MEK、SRC、JAK、FAK、PDK 或PI(3)激酶族群成員、或PI(3)-激酶-相關激酶族群成員、 85372 -28 - 200307533 及/或環素(cyclin)-依賴型激酶族群(CDK)成員、以及具有其 它活性機轉例如非關蛋白質或脂質激酶抑制活性機轉之抗 血管新生化合物。 鎖定目標、降低或抑制VEGFR活性化合物特別為可抑制 VEGF受體酪胺酸激酶、抑制VEGF受體或結合VEGF之化合 物、蛋白質或抗體,特別為WO 98/35958所概略及特別揭示 之該等化合物、蛋白質或單株抗體,例如1-(4-氯苯胺 基)-4-(4_吡啶基甲基)酞畊或其醫藥上可接受之鹽例如丁二 酸鹽;揭示於WO 00/27820如N-芳基(硫基)蒽胺基酸醯胺衍 生物例如2-[(4-吡啶基)甲基]胺基-N-[3-甲氧基-5_(三氟甲 基)苯基]苄醯胺或2-[(1-氧化-4-吡啶基)甲基]胺基-N-[3-三 氟甲基苯基]苄醯胺;或揭示於WO 00/09495、WO 00/59509、WO 98/11223、WO 00/27819及 EP 0 769 947 ;下 列參考文獻所述化合物:M. Prewett等人,癌症研究丛(1999) 5209-5218,F. Yuan等人,美國國家科學院議事錄93期, 14765-14770 頁,1996 年 12 月,Z. Zhu 等人,癌症研究 58, 1998,3209-3214,以及J· Mordenti等人於毒理病理學,第 27 卷,第 1期,第 14-21 頁,1999 年;WO 00/37502 及 WO 94/10202 ;血管靜止素(AngiostatinTM),述於M. S. O’Reilly 等人,細胞79,1994,315-328 ;内靜止素(Endostatin™), 述於 Μ· S. 0,Reilly 等人,細胞 88,1997,277-285 ;蒽胺基 酸醯胺類;ZD4190 ; ZD6474 ; SU5416 ; SU6668 ;或抗 VEGF 抗體或抗VEGF受體抗體例如RuiiMab。 抗體一詞表示單株抗體、多株抗體、由至少2種完整抗體 85372 -29- 200307533 形成之多重特異性抗體、以及抗體片段,只要其具有所需 生物活性即可。 鎖定目標、降低或抑制表皮生長因子受體族群化合物特 別為可抑制EGF受體酿胺酸激酶族群成員,例如EGF、 ErbB2、ErbB3及ErbB4或結合至EGF或EGF相關配位子成 員,或對ErbB及VEGF受體激酶有雙重抑制效果成員,特別 為WO 97/02266概略揭示及特別揭示之該等化合物、蛋白質 或單株抗體例如實施例39化合物;或揭示於EP 0 564 409、 WO 99/03854、EP 0520722、EP 0 566 226、EP 0 787 722、 EP 0 837 063、US 5,747,498、WO 98/10767、WO 97/30034、 WO 97/49688、WO 97/38983以及特別 WO 96/30347(例如稱 作CP 358774之化合物)、WO 96/33980(例如化合物ZD 1839) 及 WO 95/03283(例如化合物 ZM 105180)或PCT/EP 02/08780 ;例如蔡斯圖住梅(trastuzumab)、赫佩ί丁(HerpetinR)、賽圖 西梅(cetuximab)、易瑞沙(1代88&)〇81-774、(!!1-1033、丑1^-569、GW-2016、E1.1、Ε2·4、E2.5、E6.2、Ε6·4、E2.ll、 Ε6·3或 Ε7·6·3。 鎖定目標、降低或抑制PDGFR活性化合物特別為可抑制 PDGF受體化合物,例如Ν-苯基-2-嘧啶-胺衍生物如伊馬提 尼(imatinib) 〇 鎖定目標、降低或抑制c-Abl族群成員及其基因融合產物 活性化合物例如N-苯基-2-嘧啶-胺衍生物例如伊馬提尼; PD180970 ; AG957 ;或 NSC 680410。 鎖定目標、降低或抑制蛋白質激酶C、Raf、MEK、SRC、 85372 -30- 200307533 JAK、FAK及PDK族群成員或PI(3)激酶或PI(3)激酶相關族群 成員及/或環-依賴型激酶族群(CDK)成員活性化合物特別 為EP 0 296 110揭示之該等史道羅波林(staurosporine)衍生 物例如米多史道林(midostaurin);其它化合物例如包括 UCN-01、沙芬哥(safingol)、BAY 43-9006、布來歐坦汁 (Bryostatin)l、佩利弗辛(Perifosine) ; U0126 ;艾莫弗辛 (Ilmofosine) ; RO 318220及RO 320432 ; GO 6976 ;艾西斯 (Isis)3521 ;或 LY33353 1/LY379196。 其它抗血管新生化合物為例如沙利竇邁(thalidomide) (THALOMID)及 TNP-470。 鎖定目標、降低或抑制蛋白質或脂質磷酸酶活性化合物 例如為磷酸酶1、磷酸酶2A、PTEN或CDC25抑制劑,例如 歐卡第克酸(okadaic acid)或其衍生物。 可謗生細胞分化過程化合物例如為視黃酸、α -、7 -或3 -生育驗或α-、9"-或生育三酴。 環氧合酶抑制劑一詞用於此處包括(但非限制性)例如西 樂克西(celecoxib)希樂葆((CelebrexR))羅菲克西 (rofecoxib)(偉適(VioxxR))、伊托利克西(etoricoxib)、瓦德克 西(valdecoxib)或5-烷基-2-芳基胺基苯基乙酸例如5-甲基 -2-(2’-氯-6’-氟苯胺基)苯基乙酸。 「組織腺去乙si化酶抑制劑」一詞用於此處包括(但非限 制性)MS-27-275、SAHA、派羅沙麥(pyroxamide)、FR_901228 或瓦普洛酸(valproic acid)。 「貳膦酸鹽」一詞用於此處包括(但非限制性)艾奇多尼克 85372 -31- 200307533 酸(etridonic acid)、克洛羅尼克酸(clodronic acid)、提路羅 尼克酸(tiludronic acid)、帕米羅尼克酸(pamidronic acid)、 亞蘭羅尼克酸(alendronic acid)、伊班羅尼克酸(ibandronic acid)、萊斯羅尼克酸(risedronic acid)及左羅尼克酸 (zoledronic acid)。「艾奇多尼克酸」例如可以出售形式例如 以商品名DIDRONEL出售投藥。「克洛羅尼克酸」例如可以 出售形式例如以商品名BONEFOS出售投藥。「提路羅尼克 酸」例如可以出售形式例如以商品名SKELID出售投藥。「帕 米羅尼克酸」例如可以出售形式例如以商品名AREDIA出售 投藥。「亞蘭羅尼克酸」例如可以出售形式例如以商品名 FOSAMAX出售投藥。「伊班羅尼克酸」例如可以出售形式 例如以商品名BONDRANAT出售投藥。「莱斯羅尼克酸」例 如可以出售形式例如以商品名ACTONEL出售投藥。「左羅 尼克酸」例如可以出售形式例如以商品名ZOMETA出售投 藥。 用於此處「基質金屬蛋白質抑制劑」一詞包括(但非限制 性)膠原擬肤抑制劑及非擬肽抑制劑:、四環素(tetracycline) 衍生物例如經妨酸擬肽抑制劑巴提馬斯塔(batimastat)及其 口服生物可利用類似物馬利馬斯塔(marimastat)、普諾馬斯 塔(prinomastat)、BMS-279251、BAY 12-9566、TAA211 或 AAJ996。 「mTOR抑制劑」一詞用於此處包括(但非限制性)拉帕黴 素(rapamycin)(西羅利馬(sirolimus))或其衍生物。拉帕黴素 為吸濕鏈絲菌(Streptomyces hygroscopicus)製造之已知巨環 85372 -32- 200307533 類抗生素。適當拉帕黴素衍生物包括式A化合物
其中
Rlaa為CH3或C3-6決基, 112以為11或-CH2-CH2-OH、3-羥基-2-(經基甲基)-2-甲基丙醯 基或四嗤基,以及 xaa為=0、(H,H)或(H,OH) 但當Xaa為=0以及Rlaa為CH3時,R2aa非為Η, 或當Rha為-CHyCH^OH時為其前驅藥,例如其生理上可水 解醚。 式 A 化合物揭示於 w〇 94/09010、WO 95/16691、WO 96/41807、USP 5,362,718或 WO 99/15530,各案以引用方式 併入此處。可如該等參考文獻揭示製備或以類似方式製備 較佳拉帕黴素衍生物為32_去酮基拉帕黴素、16_戊玦 基氧基-32-去酮基拉帕黴素、16_戊炔基氧基_32(s)_二氫、 拉帕黴素、16-戊·2_炔基氧基-32(s)_二氫_4〇_〇_(2_羥基乙 /基)-拉帕黴素,及更佳4(MK2,基乙基)_拉帕黴素。拉帕 黴素衍生物之其它範例包括CCI779或40-[3-羥基-2-(羥基甲 基)-2-甲基丙酸]_拉帕黴素或其醫藥上可接受之鹽揭示於 85372 -33- 200307533 USP 5,362,718、ABT578或40-(四唑基)_拉帕黴素,特別4〇_ 表-(四唑基)-拉帕黴素例如揭示於w〇 99/1553〇或拉帕黴素 類似物(rapalogs)揭示,例如 w〇 98/02441 及WO 01/14387, 例如 AP23573 〇 各例中,引用專利範圍申請案或科學公開文獻時,該化 合物之相關主題係以引用方式併入此處。同樣包含其醫藥 上可接文之鹽、對應外消旋混合物、非對映異構物、對映 異構物、互變異構物以及前文揭示化合物之對應晶體修改 (若存在)例如溶劑合物、水合物及多形性化合物,揭示於此 處。可用於本發明組合物作為活性成分之化合物分別可以 引述之參考文獻製備及投予。於本發明範圍内包含前述多 於兩種分開活性成分的組合,亦即本發明範圍内之醫藥組 合物包括二種或二種以上活性成分。此外,第一劑及辅劑 並非完全相同成分。 S1P激動劑亦即包含式X基團之S1P激動劑用於治療前文 所述實體腫瘤之用途,可於動物試驗方法以及於臨床試驗 獲得驗證,例如試驗方法說明如後。 【實施方式】 A.試管試驗 A.1抗腫瘤活性 使用原先由乳癌分離之小鼠乳癌細胞系例如jygMC(A) 。試驗程序之前,細胞數目調整為5xl05供接種於新鮮培養 基。細胞與含2.5 mM胸腺苷不含FCS之新鮮培養基共同培養 12小時,然後以PBS洗兩次,接著加入帶有1〇% FCS之新鮮 85372 -34- 200307533 培養基及又培養12小時。隨後細胞與含2.5 mM胸腺甞但不 含FCS之新鮮培養基共同培養12小時。為了由塊狀物中釋放 出細胞,細胞以PBS洗兩次,重新接種於含10% FCS之新鮮 培養基。調整為同步之後,細胞含或未含不等濃度式I化合 物共同培養3、6、9、12、18或24小時。使用0.2% EDTA處 理後收穫細胞,使用冰冷70%乙醇溶液固定,於37°C使用250 微克/毫升RNaseA(l-A型:Sigma化學公司)水解30分鐘,以 及使用普皮定破(propidium iodide)10毫克/毫升染色20分 鐘。培養期之後,以庫特(Coulter)計數器計算細胞以及藉 SRB比色檢定分析測定細胞數目。此等情況下,生成S1P激 動劑亦即鹽酸鹽形式化合物B,可於1(Γ12至1(Γ6Μ之濃度抑 制腫瘤細胞增生。 Α·2 S1P媒介HUVEC管生成檢定分析 用於管生成檢定分析,使用得自第2-8代繼代培養之 HUVEC,但收穫前之融合程度未大於70% 〇準備供檢定分 析用之細胞係使用哈佩斯(Herpes)平衡食鹽水溶液(HBSS得 自科隆内提(Clonetics)公司),然後使用胰蛋白酶/EDTA (0.25毫克/毫升,得自科隆内提公司)進行胰蛋白酶消化分 解。約90%細胞由孔板上剝離後,加入等量容積胰蛋白酶中 和溶液(TNS得自科隆内提公司),細胞收集於錐形瓶,錐形 瓶含有至少10毫升EBM-2(科隆内提公司)+ 0.1% BSA(西格 瑪公司)培養基。細胞於1000 rpm離心5分鐘,去除上清液, 以各5毫升EBM-2 + 0.1% BSA替代。細胞使用血球計數器計 算數目,細胞懸浮液容積調整而達到濃度500,000細胞/毫 85372 -35- 200307533 升。錐形瓶係以100 nM試驗化合物以各10奈克/毫升百日咳 毒素(PTx)準備,然後各試管内各加入1毫升細胞懸浮液。 試管於37°C,5%二氧化碳培養半小時。使用塗覆以纖維蛋 白膠之富洛布拉克(Fluoro-Blok)24-多孔插入孔板(8微米孔 大小,菲肯(Falcon)#351147),替代24孔孔板個別插入進行 遷移檢定分析。如前文說明準備前前培養細胞及試驗化合 物,然後將1〇〇微升加至插入孔板之適當孔内。300微升 EBM-2 + 2%木炭汽提培養基不含S1P,添加至標示為無刺 激㈠之孔底,300微升含S1P (500 nM)培養基添加至標示為 刺激(+)孔底。孔板於37°C,5%二氧化碳培養4小時。 卡爾辛(Calcein)AM,50微克/小瓶(分子探針公司#C3100) 經由添加20微升DMSO至小瓶内準備。然後12.5毫升 HBSS(每個孔板)溫熱至37°C,添加150微升至小瓶。然後小 瓶内容物移回至剩餘HBSS,讓終濃度變成4微克/毫升卡爾 辛AM。 冨洛布拉克孔板由孵育器中取出,分離頂插入孔板,「輕 輕拍打」去除黏在插入件上的過量育培養。然後插入板移 至新鮮24孔孔板,孔板含有5〇〇微升/孔之4微克/毫升卡爾辛 AM。然後孔板於37。〇,5%二氧化碳培育i 1/2小時。 培養後’孔板於賽托弗洛(Cyt〇flu〇r)n以485奈米激光以 及530奈米發光讀取。插入件上的富洛布拉克塗層只允許細 胞遷移至計數的底部。資料移至Excel計算,使用signiapi〇t 作出線圖,使用SigmaStat進行顯著性試驗(t_試驗(圖乃。 吕炙形成係以4倍放大於3個分開野計算分支點數目(兩 85372 -36- 200307533
處理組 PBS S1P FTY720磷酸鹽 FTY720磷酸鹽 +s 1P 化合物C磷酸鹽 化合物C磷酸鹽+S1P 免立點 8士 5 42±13 48±15 14±7 44±16 18±£ 結果證實FTY720-磷酸鹽或化合物c磷酸鹽具有作為血管 新生激動劑之獨特活性,但出乎意外地可作為sip媒介血管 新生拮抗劑。化合物C磷酸鹽較佳為外消旋混合物或R _對映 異構物。PTx用作為抑制Gia(ED(M)媒介活性之對照組。 B·活體試驗 B · 1抗腫瘤活性 抗腫瘤活性係以T/c%(處理組動物腫瘤容積除了對照組 動物腫瘤容積乘以100之平均增加)表示。 一份癌細胞(1X107)例如人類A375黑素瘤細胞移植至 BALB/c-nu/nu小鼠。腫瘤大小達到約1〇χΐ〇毫米時,動物任 意分成四小組,開始接受式!化合物處理。經2周處理㈣ 牲動物,此時收穫腫瘤及組織,且準備進行形態學分析及 分子分析。腫瘤大小係以卡規測定。此種檢定分析中, 激動劑例如化合物B4C(磷酸鹽形式),當以〇5至5毫克/千 克投藥時,㈣於鹽水對照組可減慢腫瘤生i ::如化合 物C-鹽酸鹽以2.5毫克/千克每周5次劑量投藥,結果獲得: 85372 -37- 200307533 Τ/C值 30%。 Β·2與VEGF-R蛋白質酪胺酸激酶抑制劑組合 移植人類MDA-MB-435乳房腫瘤之裸鼠使用VEGF-R蛋白 質酪胺酸激酶抑制劑處理2周,例如1-(4-氣苯胺基)-4-(4-外匕 啶基甲基)酞畊丁二酸鹽使用劑量1〇〇毫克/千克每周口服5 次、S1P受體激動劑例如化合物c(鹽酸鹽)使用劑量2.5毫克/ 千克靜脈注射每周5次或其組合。抗腫瘤功效係以前文指示 之Τ/C%表示。化合物C鹽酸鹽與!^^氯苯胺基)_4_(4_吡啶 基甲基)§太p井丁 一缸鹽比單獨個別藥劑之抗腫瘤效果較高 (T/C%27)(化合物C鹽酸鹽T/C 66% ; 1-(4-氯苯胺基)-4-(4-吡 啶基甲基)酞畊丁二酸鹽,T/C% 91)。當裸鼠移植人類A375 黑素瘤細胞且以類似方式使用相同組合處理時,也獲得良 好抗腫瘤反應:組合治療獲得T/C% 15,個別藥劑單獨治療 獲得T/C% 35及44。 B.3抗腫瘤新生活性 多孔腔室含有⑴神經鞘胺醇-1_磷酸鹽(5μΜ/室)或(Η)人 VEGF(1微克/室)於〇_5毫升〇.8%w/v瓊脂(含有肝素,20單位 /毫升),皮下移植入小鼠脅腹。S1P或VEGF謗使血管床組織 環繞多孔室周圍生長。此項反應係與劑量有關,可經由組 織稱重以及測定組織血液含量定量。小鼠每日一次接受⑴ 口服化合物Α(0·3、3、30或50毫克/千克)或(ii)靜脈注射化 合物C R對映異構物(2·5毫克/千克)或(iii)靜脈注射化合物c S對映異構物(2.5毫克/千克)或(iv)口服或靜脈注射媒液(5〇/〇 葡萄糖,10毫克/千克)處理,處理係始於多孔腔室移植前4_6 85372 -38- 200307533 小時且持續4日。最末劑量投藥後24小時,犧牲小鼠測定形 成血管床化組織。環繞多孔腔室之血管床化組織重量及血 液含量經測定。使用化合物A或化合物C R或S對映異構物處 理動物顯示血管床化組織重量及/或血液含量比單獨接受 媒液處理動物少。 C · 床試驗 c.l S1P受體激動劑如式I、π或m化合物如化合物A、B或c 之研究 20位患有進行中惡化階段實體腫瘤,且對標準治療有抗 樂性或頑固病人接受劑量遞增研究測定之化合物劑量。每 周以理學檢查及實驗室檢查調查病人之一般性臨床狀況。 腫瘤及腫瘤轉變負擔之改變每2個月接受放射線檢查一 /入。最初病人接受處理2個月。隨後只要疾病不會進行且藥 物之耐受性良好則繼續接受處理。 王要評估變數:安全性(不良反應)、標準血清生化學及血 液學方面、藉電腦斷層掃描(CT scan)或磁振造影(MRI)算出 腫瘤大小。 C · 2組合治療 適當臨床研%例如為患有惡化實體腫瘤之開放標籤非隨 機分組劑量遞增研究。此種研究特別證實本發明組合之各 、I*成刀之韬同増效效果。用於增生性疾病的有利效果可 透過研先結果直接決^,或經由如業界人士已知改變實驗 設計決定。此等研究特別適合比較使用活性成分及使用本 發明組合4單-治療效果。較佳藥劑⑷劑量遞增至達到最 85372 -39- 200307533 大耐受劑量,辅劑⑻劑量係以固定劑量投藥。另外,藥劑 ⑷以固足劑量投藥,辅劑(b)劑量遞增。病人係每日或間歇 接又樂劑(a)劑f。處理功效係於12、18或24周後以每^周藉 放射攝影評估腫瘤測定。 曰 另外,安慰劑對照組雙盲研究可用來證實前述本發明組 合物效果。 單獨使用S1P文體激動劑時,實施本發明方法所需每日劑 里例如係依據使用之化合物、宿主、投藥模式及接受治療 之病情嚴重程度決疋。較佳每日劑量為〇.丨至1〇〇毫克以單劑 或平分多劑投樂。病人之適當每日劑量約為口服例如〇· i至 50笔克,S1P受體激動劑可藉任何習知途徑投藥,特別腸道 例如口服投藥,例如呈錠劑、膠囊劑、飲用溶液劑劑型; 丹内或肺臟(藉吸入)投藥或腸道外投藥,例如呈注射溶液劑 或懸浮液劑劑型。口服投藥用適當單位劑型包含約〇1至3〇 笔克’通常為0.25至30毫克sip受體激動劑連同一或多種醫 樂上可接受之稀釋劑或載劑。為了抑制血管新生,·重要地 係選擇夠高劑量之S1P受體激動劑,:原因在於低濃度Slp受 體激動劑或促進血管新生。Slp激動劑投予病人時,提供抗 血言新生效果之適當劑量可藉前文A、b及C所述濃度遞增 及劑量遞增研究而選用。 本發明組合物也可組合手術介入、輕微長時間全體體溫 升高及/或光照射療法施用。 投予本發明之醫藥組合物可獲得有益效果例如協同增效 療效’例如有關減慢、中止或逆轉腫瘤的生成,腫瘤轉移 85372 200307533 的散播或生長,或延長腫瘤反應或血管新生抑制持續時 間,也可獲得其它有利效果例如副作用較低,生活品質改 良或此1Γ率及罹病率減低,此等效果係與施用本發明組合 之單-醫藥活性成分之單—治療作比較,特別係用於治療 對已知抗癌劑之其它化學治療頑固之腫瘤的治療。 另一項效果為可使用較低劑量至本發明組合活性成分, 該劑量不僅較小,同時施用次數也減少;或可用於減低副 作用發生率’同時控制腫瘤的生長。此點係根據病人期望 及需求決定。 根據本發明之—具體實施例,較佳醫藥組合物包含 ΠΙ IVa、IVb、V或VI例如化合物A、B或c,以 及 作為輔劑,一戎多插4 L ,· ·、 /.·. 如上⑻、(U1)、(iv)、(v)、㈣或(xi) :曰不·^化合物例如卡波普拉汁、西斯普拉#、太平洋紫 杉酚、朵西紫杉酚、珍西 ‘、 /西d阿磁素、鎖疋目標、降低 或抑制蛋白質路胺酸激酶之血管内 (VEGFR)或血小板衍决座卫门^ . 丁狹君f 生長因子文體(PDGFR)、貳膦酸鹽哎 mTOR抑制劑活性之化合物。 - 化—具體實施例係有關Slp受體激動劑⑷组合 、余ΓΓΓ 於治療淋巴癌或骨髓癌例如前文揭示之用 ^ ,且口物可包含例如布沙、 富路達拉賓、_辛、二Γ: “呤、 賽作為貊朴H '、 θ卡巴祭、布利歐黴素或美索翠 姓 )。拓樸異構酶11抑制劑例如道諾汝必辛或 特別鎖定目標、降低她PDG姆性或陶族群成員= 85372 -41 - 200307533 性及其基因融合產物如伊馬提尼之化合物,較佳用作為輔 劑b)例如用於治療淋巴癌。 /、同投予」或「組合投予」等詞用於此處表示涵蓋投 予選疋治療劑的單一病人,意圖包括無需藉相同途徑或同 時投予藥劑之治療計畫。 本發明之一目的係提供一種醫藥組成物,包含定量且為 對抗增生惡性病治療有效量之本發明組合物。此種組成物 中,第一樂劑a)及輔劑b)可共同投藥,接續投藥、或以組合 單位劑型或兩個分開單位劑型投藥。單位劑型也可為固定 組合。 、本發明^•藥組成物可以已知方式或適合供腸道例如口服 或直腸以及腸道外投予哺乳類(溫血動物)包括人類之方式 製備,組成物包含治療有效量之至少—種藥理活性組合成 分(例如前文指示),或組合一或多種醫藥上可接受之載劑或 稀釋劑,特別適合供腸道或料外投藥。 么匕田商术組成物例含有约0.1〇/〇至約99.90/〇,較佳約1%至 :、舌丨生成刀 '纟二口或腸道外投藥用之組合治療之醫藥製 如為早位劑型例如糖衣錠、鍵劑、膠囊劑或栓劑或安 非另行指示,否則係以已知方式製備,例如利用習 知〜合、造粒、包糖衣、溶解及康乾過程製備。須了解 :别釗里《各早位劑型所含组合成分之單位含量本身並非 有效量,經由投予多劑量單位來達成所需有效量。 特別治療有效量乏;。 ,、 本發明組合之個別組合成分可同時或 循序或以任·一種順序将7 .. 丁’各成分可分開或呈固定組合投 85372 -42- 200307533 予。例如才艮據本發明延遲增生惡性病之進行或治療方法包 含⑴投予呈自由態或醫藥可接受性鹽形式之第一藥劑勾; 以及(11)投予呈自由態或醫藥可接受性鹽形式之辅劑b),該 ,藥可同時或以任何順序循序進行使用劑量為治療有效 量,較佳為協同增效有效量,例如以對應此處揭示用量之 每日劑量或間歇劑量。本發明組合物之個別組合成分可於 治療過程中於不同時間分開投藥,或以分開劑型或單—組 口剤型同時投樂。此外’投藥一詞也涵蓋使用組合成分前 驅藥,該前驅藥於活體内將轉成組合成分。因此須了解本 發明涵蓋同時或交替治療,「投藥」一詞也可據此解譯說 明。 本發明組合物採用之各種組合成分之有效劑量可依據採 用 < 特疋化合物或醫藥組成物、投藥模式、治療病情、治 療病情嚴重程度改變。如此,本發明組合之用法用量係根 據多項因素包括投藥途徑以及病人肝腎功能選用。熟諳技 轟之备師、臨床治療師或獸醫師可決定且處方預防、對抗 或停止疾病進行所需有效量之單一活性成分。達成活性成 刀於有效但又無毒範圍内之較佳化處方需要基於活性成分 對目標位置之生物利用率動力學資料。 第一樂劑或成分(a)之每日劑量當然係依據多項因素改 叉,例如選用之化合物、治療之特定病情及期望效果。但 通常以每日劑量約〇1至1〇〇毫克以單劑或平分多劑投予 S1P雙體激動劑例如化合物A、B或c時可達成滿意效果。S1P 又骨豆激動劑可藉任一種習知途徑投藥,特別為腸道例如經 85372 -43- 200307533 飲用落液劑劑型投藥,或腸道外
體,或以約50至約500毫克/日, ㈡炙劑量範圍口服投予人 ’且較佳約100至約250毫克/ 日〈劑量範圍投予。若藥物係以分開醫藥組成物投予,則 可呈GB 2,177,700揭示之形式投予。弗美斯坦可以約1〇〇至 、、’勺500¾克/日,且較佳約250至約3〇〇毫克/日之劑量範圍投 予人體。阿納卓左可以約〇·25至約20毫克/日,且較佳約 至約2.5毫克/日之劑量範圍口服投予人體。亞明諾路特他麥 可以約200至約500毫克/日之劑量範圍投予人體。 口例如以錠劑、膠囊劑、 投樂例如以注射宏洁齋丨或 塔莫西芬檸檬酸鹽可以約1〇至约4〇毫克/日之劑量範圍 投予人體。 文布拉斯汀可以約1 ·5至1 〇毫克/平方米日之劑量範圍投 予人體。文克利斯汀硫酸鹽可以約〇 〇25至〇·〇5毫克/千克體 重•周之劑量範圍投予人體。文諾利賓可以約1〇至5〇毫克/ 平方米日之劑量範圍投予人體。 伊托波賽磷酸鹽可以約25至115毫克/平方米日例如56.8 或113.6毫克/平方米日之劑量範圍投予人體。 添尼波賽可以約75至150毫克之劑量範圍約略每2周一次 投予人體。阿黴素可以約10至1〇〇毫克/平方米日例如25或50 85372 -44- 200307533 毫克/平方米日之劑量範圍投予人體。伊皮汝必辛可以約ι〇 至200毫克/平方米日之劑量範圍投予人體。依達汝必辛可 以約0 · 5至5 0毫克/平方米日之劑量範圍投予人體。米托桑村 可以約2.5至25毫克/平方米日之劑量範圍投予人體。 太平洋紫杉酸可以約50至300毫克/平方米日之劑量範圍 投予人體。朵西紫杉酚可以約25至1〇〇毫克/平方米日之劑量 範圍投予人體。 賽洛弗法麥可以約50至1500毫克/平方米曰之劑量範圍 投予人體。梅法蘭可以約0.5至1〇毫克/平方米日之劑量範圍 投予人體。 5-尿嘧啶可以約50至1〇〇〇毫克/平方米日例如5〇〇毫克/平 方米日之劑量範圍投予人體。卡佩西塔賓可以約1〇至1〇〇〇 *克/平方米日之劑量範圍投予人體。珍西塔賓鹽酸鹽可以 約1000毫克/平方米/周之劑量範圍投予人體。美索翠賽可以 約5至500毫克/平方米日之劑量範圍投予人體。 托普堤坎可以約1至5毫克/平方米日之劑量範圍投予人 骨豆。伊利諾堤坎可以約5〇至35〇毫克/平方米日之劑量範圍投 予人體。 卡波普拉厅可以約200至4〇〇毫克/平方米約每4周一次之 劑里範圍投予人體。西斯普拉汀可以約25至乃毫克/平方米 約每3周一次之劑量範圍投予人體。歐沙利普拉汀可以約5〇 至85毫克/平方米約每2周一次之劑量範圍投予人體。 伊馬#疋尼可以約2.5至850毫克/日,更佳5至600毫克/日, 及最佳20至300毫克/日之劑量範園投予人體。 85372 -45- 200307533 亞蘭羅尼克酸可以約5至10毫克/曰之劑量範園投予人 體。克洛羅尼克酸可以約750至1500毫克/日之劑量範圍投予 人體。艾奇多尼克酸可以約200至400毫克/日之劑量範圍投 予人體。伊班羅尼克酸可以約1至4毫克每3至4周一次之劑 量範圍投予人體。萊斯羅尼克酸可以約2〇至30毫克/日之劑 量範圍投予人體。帕米羅尼克酸可以約15至90毫克每3至4 周一次之劑量範圍投予人體。提路羅尼克酸可以約2〇〇至 400毫克/日之劑量範圍投予人體。 蔡斯圖住梅可以約1至4毫克/平方米/周之劑量範圍投予 人體。 拜卡路他麥可以約25至50毫克/平方米/日之劑量範圍投 予人體。 1-(4-氯苯胺基)-4-(4-吡啶基甲基)酞畊或其鹽例如丁二 酸鹽可以約50至1500毫克/日,更佳約100至75〇毫克/日,及 最佳約250至500毫克/日之劑量範圍投予人體。 拉帕黴素或其衍生物例如為40-0-(2-羥基乙基)-·拉帕徵 素可以約0· 1至25毫克之劑量範圍投予人體。 調配例:軟膠囊劑 30毫克 300毫克 20毫克 350毫克 式I化合物如化合物A鹽酸鹽 聚乙二醇3〇〇 玻利索貝(Polysorbate)80 總量
S1P受體激動劑例如包含式χ基團之S1P受體激動劑於根 據本發明使用要求劑量範圍之耐受性良好。例如化合物A 85372 -46- 200307533 之急性LDw於大鼠及猴大於1 〇毫克/千克口服劑量。 又另一方面,本發明係關於使用Slp激動劑作為前血管新 生樂物。後來發現誘生新-血管新生為多種疾病(例如心肌血 管新生、創傷癒合或糖尿病性血管功能異常/血管病變)之絕 佳治療目標。 如前文說明,高濃度S1P受體激動劑(2 μΜ或以上如2-5 μΜ或0.5-1 μΜ)具有抗血管新生功效,Slp受體激動劑可抑 制VEGF謗生血管新生。相反地,低濃度(〇:M卜…例如 〇·1-〇·5 μΜ或〇·5-1 μΜβΙΡ激動劑對血管新生有提升效果, 石可增強VEGF媒介血管新生。如此,Slp激動劑用於血管 新生有雙相效果。 如此,本發明進一步提供: 8·—種S1P激動劑例如包含式χ基團之Slp激動劑例如化 合物A或化合物A_磷酸鹽用於謗生新_血管新生過程之用 途,例如用作為前血管新生劑例如用於適合促進血管新生 之適應症。 9.-種製備藥物之方法’該藥物係用於治療或預防經由 抑制新-血管新生過程而媒介例如藉抗血管新生因子媒介 之疾病,例如用於適合促進血管新生之疾病,例如用於創 =療合或治療心肌梗塞或糖尿病性血管功能異常/血管病 變,該方法包含使用S1P受體激動劑例如包含式χ基團⑽ 激動劑例如化合物A或化合物人·磷酸鹽作為活性成分。 =·種治療或預防疾病之方法,該疾病係經由抑制新· 血官新生過程而媒介例如藉抗血管新生因子媒介之疾病, 85372 -47· 200307533 例如用於適合促進血管新生之疾病,例如用於創傷癒合或 冶療心肌梗塞或糖尿病性血管功能異常/血管病變,該方法 包含對需要此種治療之個體投予有效量之S1 p受體激動劑 例如包含式X基團S1 p激動劑例如化合物a或化合物A-磷酸 鹽。 適合促進血管新生之S1P激動劑包括如前文就癌症治療 足我之化合物’例如包含式X基團之S1P激動劑或根據式I 土 IX之化合物或其醫藥上可接受之性或酯。較佳S1 p激動劑 為化合物A-磷酸鹽。S1p激動劑可單獨使用,或組合一或多 種其它可促進血管新生之藥劑如VEGF使用。 為了促進血管新生,重要地係選用夠低劑量之S1P受體激 動劑’原因在於高濃度S 1P受體激動劑會抑制血管新生。當 S1P激動劑投予病人時,提供前驅血管新生效果之適當劑量 可經由前文於A、B及c所述之濃度遞增研究及劑量遞增研 究選定。
使用下列縮寫: BSA·牛血清白蛋白 ECGS ··内皮細胞生長因子組合ECL :增強化學發光 S :神經鞘胺醇-1-磷酸 PBS :磷酸鹽緩衝食鹽水 JNK 1/2 ·· c-接合_N_端基激酶1/2 RT :室溫 TF當量:組織因子當量 EGR-1/NFAT :早期生長反應蛋白質丨/活化τ細胞核因予 F1P :化合物A-磷酸鹽(FTY720-磷酸鹽) S1P受體激動劑例如包含式X基團之S1P激動劑用於 85372 -48- 200307533 血管新生之用途例如可根據後述方法驗證。 D.細胞培養及材料 人類臍靜脈内皮細胞(HUVEC)於37°C及5%二氧化碳於培 養基M199培養,培養基M199補充20% SCS(海克隆 (HyClone),猶他州,羅格),1單位/毫升肝素,50微克/毫升 ECGS,2 mM麩胺,100單位/毫升音黴素及0.1毫克/毫升鏈 黴素。用於實驗之細胞高達繼代培養第5代。短時間缺乏營 養之HUVEC係將含1% SCS之M199剝除營養經歷5小時時間 獲得。重組人VEGF165係得自普莫西爾(PromoCell)(德國, 海德堡)。磷酸特異性ERK1/2、p38激酶多株抗體、單磷酸 ERK1/2抗體及LumiGLO化學發光劑係得自新英格蘭生物實 驗室(麻省,貝佛利)、多株ΙκΒ抗體係得自聖塔克魯茲生技 公司(加州,聖塔克魯茲)。過氧化酶輛合驢抗兔免疫球蛋白 G(IgG)及羊抗小鼠IgG係購自艾莫山(Amersham)生命科學 公司(英國,艾莫山)。伊莫比隆(Immobilon)-P轉移膜為米利 玻(Millipore)(麻省,貝多弗)產品。神經勒胺醇係得自西格 瑪化學公司;S1P係得自拜歐莫(Biomol)公司。化合物A-磷 酸鹽備用溶液係藉下述方案製備。化合物A-磷酸鹽溶解於 使用濃縮鹽酸追蹤的甲醇(0.5毫克化合物A-磷酸鹽於500微 升甲醇加2微升鹽酸)。所得溶液溶劑於真空蒸發去除,所 得殘餘物再度溶解(變化法1)於0.1 %脫脂BSA於無菌去離子 水溶液(500微升)或(變化法2)溶解於0.5%崔頓(Triton)X-lOO 於去離子水。所得備用溶液(2.5 mM)經過超音波振盪處理 且儲存於4°C。 85372 -49- 200307533 凝血檢定分析 細胞播種於6孔平板,8 0 - 9 0 %融合及生長隔夜。由孔板上 刮下細胞,根據Clauss,M.,生物化學期刊271,17629-17634 (1996),Mechtcheriakova,D·,血液 93,381 1-3823 (1999)所 述方法分析組織因子活性。簡言之,與VEGF (1.5 nM)、TNF-α (100單位/毫升)、S (0.5-2 μΜ),SIP (0.5-2 μΜ),化合物 Α(0·5-2 μΜ)及化合物Α-磷酸鹽(0.5-2 μΜ)謗導4小時後,細 胞洗兩次,且刮下於1毫升凝血緩衝液(12 mM乙酸鈉,7 mM 巴比妥酸二乙酯及130 mM氯化鈉;pH 7.4)。50微升再懸浮 細胞混合50微升檸檬酸化血漿,使用50微升氣化鈣溶液於 37t:再鈣化後測定凝血時間。使用得自兔腦血栓形成質之 標準曲線測定TF當量。 E.西方墨點分析 經各項處理後,細胞以冷PBS洗兩次,於100微升Laemmli 緩衝液内溶解,刮下且於95°C加熱5分鐘。藉SDS-PAGE分 離總細胞溶解產物及移至伊莫比隆-P膜。該膜使用含0.1 % 呑恩(Tween)-20及3%脫脂乳之PBS封阻30分鐘,於室溫與一 次抗體於封阻緩衝液稀釋共同培養1小時。所得膜使用含 0.1%呑恩-20 PBS洗三次各5分鐘,且於室溫與過氧化酶軛 合二次抗體共同培育1小時。於洗滌步騾後,膜與ECL反應 劑共同培養1分鐘,視需要曝露於該膜。用於使用另一種抗 體重新探測,膜於PBS洗兩次,於55°C使用汽提緩衝液(62.5 mM Tds-HCL,pH 6.8,2% SDS,100 mM 2-鐃基乙醇)汽提 30分鐘,於室溫使用PBS洗三次5分鐘。各次免疫偵測之後, 85372 -50- 200307533 膜屬包袠於沙朗瑞(§aranWrap)於4。〇儲存。 之試管試驗血營新生檢定分析 内皮細胞於生長因子減少馬奇傑基體(BD生科公司)形狀 ’k:成毛細管狀結構係根據製造程序進行。簡言之,HUvec 經過胰蛋白酶消化,再懸浮於不含血清之M199培養基,但 含有大豆胰蛋白酶抑制劑(1毫克/毫升,西格瑪公司)。離心 後,細胞以〇·5χ1〇5細胞/毫升密度再懸浮於不含血清之培養 基’細胞懸浮液係於無及有下列各種刺激物存在下,播種 於預先塗覆有50微升馬奇傑之96孔細胞培養孔板(克斯塔
(Costar),康寧公司):VEGF^ ( 5 禮,S1P於 0·1·2 μΜ,S 於〇·5_2 μΜ,化合物Α於0·5_2 μΜ,及化合物1磷酸鹽於〇1_2 μΜ。8小時後’馬奇傑於細胞使用3%甲醛於PBS固定且維持 於4 C。結果係以裝配有冷CCD相機(卡帕公司(Kappa) GmbH ’德國,格萊坎)之尼康化亞弗(Nik〇n叫响⑷顯微鏡 拍攝之影像’由重複進行試驗之各孔所得兩個顯微鏡試 驗,直接計算分支點數目而定量獲得結果。 F·於馬奇傑之管生成檢定分析試管試驗中,化合物-A磷酸 鹽謗生内皮細胞形態發生,且可能涉及Gi媒介發訊路徑 化合物A及化合物A-磷酸鹽對内皮細胞形態分化的影響 係於馬奇傑使用試管試驗血管新生檢定分析測定。内皮細 胞形態發生是一項複雜過程,要求細胞-胞外基質交互作 用’接著為基質的重新模式化,刺激遷移,細胞_細胞交互 作用,以及血管周圍蛋白質分解。如圖1所示,化合物A-磷酸鹽可以鐘形劑量相依性方式促進毛細管狀網路生成, 85372 -51- 200307533 顯示最大活性於約ο·5 μΜ。每個顯微鏡視野之分支數,反 映出謗導刺激強度,/分支數可娘美化合物Α_鱗酸鹽及川, 顯著超越VEGF觸發的效果。化合物人本身於Q.5] _具有 比較化合物A-磷酸鹽微弱但一致的增強效果。化合物[磷 酸鹽及化合物A於0.5-1 μΜ不會衰減VEGF_媒介再度模式 化,反而係與多肽生長因子合作(例如參考圖2)。此外,化 合物A-磷酸鹽以及S1P刺激管生成完全可藉百日咳毒素 (PTX ’ 50奈克/毫升)抑制,百日咳毒素是一種^型非同質 三元體G蛋白抑制劑。可解譯為於化合物A_磷酸鹽刺激生物 反應(參考圖3)可能涉及EDG_1(slPi)受體媒介的發訊事 件。神經鞘胺醇的本身強度似乎比Slp更低,神經鞘胺醇於 1 μΜ可衰減S1P及化合物冬磷酸鹽誘生毛細管狀結構的反 應,但對VEGF謗生管生成物抑制作用(例如參考圖句。就此 方面而言,神經鞘胺醇之表現與化合物A不同。資料指出s 與SIP間平衡對内皮細胞之活化/血管新生有關鍵重要性, 最可能係透過EDG受體族群。重要地,高濃度神經鞘胺醇 及化合物Α(2-5 μΜ)抑制VEGF觸發管生成。該資料提示於 試管試驗化合物Α及化合物Α-磷酸鹽對血管新生顯示雙相 劑量相依性效果。 G.藉化合物A-磷酸鹽活化erk 1/2 MAP激酶 透過MAP激酶之信號轉導於多種内皮細胞功能扮演關鍵 角色。使用0·5 μΜ化合物A-磷酸鹽處理HUVEC,結果導致 ERK1/2之一過性活化,磷酸化/活化尖峰出現於1〇分鐘, 分鐘時返回基準線(例如參考圖5)。於HUVEC並未偵測得藉 85372 -52- 200307533 化合物A-磷酸鹽活化p38激酶之JNK1/2。此外,化合物A-磷酸鹽以劑量相依性方式觸發ERK1/2活化,於2 μΜ顯示較 強活性,此點係與管生成檢定分析的結果成對比,管生成 檢定分析中化合物Α-鱗酸鹽於2 μΜ之強度比0.5 μΜ低。化 合物Α或S於處理5分鐘至60分鐘範圍皆未於内皮細胞之動 力學謗生MAP激酶活化。為了估計發炎/NFkB相依性方案於 内皮細胞之化合物A_磷酸鹽刺激生物反應上可能扮演的角 色,膜再度使用抗ΙκΒ抗體探測。ΙκΒ濃度不受化合物A-磷 酸鹽處理影響。此外,内皮細胞使用化合物Α-磷酸鹽處理 無法謗生Ε選擇素(E-Selectin)表現成為NFkB依賴型二次反 應基因。如此,資料強力指出化合物A-磷酸鹽發訊未涉及 NFkB活化,NFkB活化為内皮細胞急性發炎反應的主要串級 反應。 H.化合物A及化合物A-磷酸鹽未誘生内皮細胞組織因子反 應 典型發炎刺激TNF-α及主要血管新生生長因子VEGF對内 皮細胞之重要特性為其向上調節組織因子的強度。測試化 合物A、化合物A-磷酸鹽、S或S1P是否也可於HUVEC謗生 組織因子。資料驗證此等化合物單獨或組合時皆未升高組 織因子活性(例如參考圖6)。化合物A及化合物A-磷酸鹽略 為提升VEGF誘生組織因子,但未能提升TNF-a謗生組織因 子。所得資料集合指出化合物A、化合物A-磷酸鹽、S及S1P 對血管新生VEGF之發炎TNF-a產生機械方面獨特的作用。 I· S1P受體激動劑對個別人類S1P受體之結合親和力可以下 85372 -53- 200307533 述檢定分析測定: 人S1P受體一過性轉移感染入HEK293細胞 EDG受體及Gj白質經過轉殖,對EDG受體、Gra、Grp 及Gi-γ的4種cNDAs混合,使用磷酸鈣沉澱法,用來轉移感 染 HEK293細胞單層(M. Wigler等人,細胞。1977 ; 11 ; 223 以及DS_ Im等人,分子藥理學。2000 ; 57 ; 753)。簡言之, 含25微克DNA及0.25 Μ氯化鈣之DNA混合物添加至HEPES 緩衝2 mM磷酸氫二鈉。次融合ΗΕΚ293細胞單層使用25 mM φ 氯醌毒化,然後DNA沉澱施用至細胞。4小時後,單層以磷 酸鹽緩衝鹽水洗滌,再度饋入培養基(90% 1:1杜別克改性必 須培養基(DMEM) : F_12 +10%胎牛血清)。加入DNA後48-72 小時,細胞刮入於冰上含有10%蔗糖HME緩衝液(以mM表 示·· 20 HEPES,5 MgCl2,1 EDTA,pH 7.4),且使用當斯 (Dounce)均化器破壞而收穫細胞。於80〇xg離心後,上清液 以HME不含蔗糖稀釋,及於100,000xg離心1小時。所得丸 粒再度均化且於100,000xg離心第2小時。粗產物膜丸粒再懸 | 浮於含蔗糖之HME,取出一份,浸泡在液態氮中簡短冷凍。 膜儲存於70°C。藉布瑞福(Bradford)蛋白檢定分析以分光方 式測定蛋白質濃度。 使用S1P受體/HEK293膜製劑之GTPyS結合檢定分析 GTPYS結合實驗係如DS. Im等人,分子藥理學,2000 ; 57 ; 753所述進行。配位子媒介GTPYS結合至G蛋白質係於GTP 結合緩衝液(以 mM表示·· 50 HEPES,100 NaCl,10 MgCl2, pH 7.5),使用25微克得自一過性感染HEK293細胞之膜製劑 85372 -54- 200307533 測定。配位子係於 10 μΜ GDP及 0.1 nM [35S]GTPyS(1200 Ci/ 毫莫耳)存在下添加至膜,且於3〇°C培育3〇分鐘。使用布蘭 代(Brandel)收穫機(麻里蘭州,蓋瑟堡)將結合&GTPyS與未 結合的GTPyS分離,且使用液體閃爍計數器計數。 【圖式簡單說明】 圖1 顯不化合物A-磷酸鹽可以鐘形劑量相依性方式強力促進 毛細管狀網路生成,顯示最大活性於約0.5 μΜ。 圖2 顯示化合物Α-磷酸鹽及化合物a於0.5-1 μΜ時,不會衰減 VEGF媒介之重新模式化,反而係與多肽生長因子合作。 圖3 顯示化合物Α-磷酸鹽及S1P媒介管生成實際上可由百日 叹毒素(PTX,50奈克/毫升)完全抑制,ρτχ是一種α"。型非 同質二元體G蛋白抑制劑。可解譯為EDG-1(slPi)受體媒介 發訊事件可能涉及化合物人_磷酸鹽刺激生物反應。. 圖4 - 顯示神經鞘胺醇於1 μΜ時,本身似乎比S1P之強度弱,衰 減S1P及化合物八_磷酸鹽謗生毛細管狀結構之能力,而對 VEGF-身生管生成不具有抑制效果。就此方面而言,神經 鞘胺醇之表現係與化合物A不同。資料指出神經鞘胺醇與 S 1P間之平衡似乎對内皮細胞活化/血管新生相當重要,最 可此透過EDG文體族群發揮作用。要緊地,高濃度神經鞘 胺醇及化合物Α (2_5 μΜ)可抑制VEGF觸發管生成。 85372 -55- 200307533 圖5 顯示HUVEC使用化合物A-磷酸鹽於0.5 μΜ處理,可能導 致ERK1/2的一過性活化,磷酸化/活化尖峰出現於10分鐘, 及於20分鐘時返回基準線。 圖6 試驗化合物A、化合物Α-磷酸鹽、神經鞘胺醇或S1P是否 確實對HUVEC謗生組織因子。資料證實單獨此等化合物或 組合使用皆未升高組織因子活性,如圖6所示。化合物A及 化合物A-磷酸鹽略為增強VEGF,但未增強TNF- α -謗生組 織因子。 圖7 化合物C於S1P媒介HUVEC管生成檢定分析之影響。 85372 56-
Claims (1)
- 200307533 拾、申請專利範園: 1 β 一種於有需要之個體治療實體腫瘤或抑制實體腫瘤生長 之方法,其包含對該個體投予治療有效量之S 1Ρ受體激動 劑,但當S1P受體激動劑為1?1^72〇或171^72〇_磷酸鹽時, 該腫瘤非為乳房、攝護腺、膀胱、腎臟或肺臟腫瘤。 2· —種於有需要之個體治療實體腫瘤侵襲或此種實體腫瘤 生長相關症狀、防止腫瘤轉移的擴散或預防或抑制顯微 腫瘤轉移的生長之方法,其包含對該《好治療有效 量之S1P受體激動劑。 3 ·種於有需要之個體抑制或控制失調血管新生、例如神 經鞘胺醇-1-磷酸鹽(Slp)媒介之血管新生之方法,其包含 對該個體投予治療有效量之Slp受體激動劑。〇 •種万;有而要之個體預防或治療由新血管新生過程媒介 :關聯血管新生失調之疾病之方法,其包含對該個體投 予治療有效量之S1P受體激動劑。 5·種於有需要〈個體提升化學治療劑活性或克服對化學 ^口療劑《抗樂性之方法,其包含對該個體與化學治療劑 同時或循序投予治療有效量。 6·如前述申請專利範圍各項中任一項之方法,其中該⑽受 體激動劑係間歇投予。 7·如前述中請專利範圍各項中任—項之方法,其包含同時 或循序合併投予治療有效量之⑽受體激動劑以及第二 樂物物質’該第二藥物物質為化學治療劑。 8.—種治療淋巴增生病症或骨料生病症之方法,其包A 85372 200307533 對該個體同時或循序投予S1p亭减、、私ι ^ 丁 又肢激動劑及第二藥物物 質’邊第二樂物物質為化學治療劑。 9. 如前述申請專利範圍各項中任一 g 、 /、Y仕项炙万法,其中該S1p受 體激動劑包含式X基團: ·ν^Ν--ch2r1z 其中 Z為H、Cl-6燒基、CW希基、&決基、苯基、經以〇h 取代之苯基;經以1至3個選自自原原子、c3-8環烷基、 苯基及經以OH取代之苯基組成的組群之取代基取代之 Cw烷基;或〇^1142基;其中尺心為〇H、醯氧基或式(a) 殘基⑻ 其中Zi為直接鍵或〇 ,較佳為〇 ;:R5z及R6z各自分別為Η 或選擇性地經以1、2或3個_原子取代之Ci4烷基; Rlz為OH、醯氧基或式殘基、以及及各自分別為 Η、C 1 · 4燒基或驗基。 10· —種醫藥組合物,其包含勾第一藥劑,其為Slp受體激動 劑,以及b)輔劑,其為化學治療劑。 11·如申請專利範圍第10項之組合物,其中該辅劑係選自 i· 芳香環轉化酶抑制劑, 85372 -2- 200307533 u·抗雌激素劑、抗雄激素劑或促性腺激素釋放因子 激動劑, ln.拓樸異構酶1抑制劑或拓樸異構酶π抑制劑, lv,微細管活化劑、烷化劑、抗腫瘤抗代謝化合物威 銘化合物, ν·鎖疋目標/降低蛋白質或脂質激肽酶活性或蛋白 質或脂質磷酸酶活性之化合物、其它抗血管新生化合 物、或可誘生細胞分化過程之化合物, vL 緩激肽1受體或血管緊張肽II拮抗劑, .i · 氧&酶抑制劑、武腾故去乙酸化酶抑制劑、組 織腺去乙醯化酶抑制劑、乙醯肝素酶抑制劑,生物反應 修飾劑,優必昆汀化抑制劑(ubiquitinati〇n inhibit〇r)或可 阻斷抗細胞凋亡路徑之抑制劑, viii· Ras腫瘤發生同質異形體抑制劑, ix· 端粒酶抑制劑, χ·蛋白酶抑制劑、基質金屬蛋白酶抑制劑、·蛋胺酸 月ir基肤酶抑制劑,或蛋白粒抑制劑,及/或 xi) mTOR抑制劑。 12. —種治療或預防疾病之方法,該疾病係經由抑制新血管 新生過程所媒介,該方法包含對需要此種治療之個體投 予有效量之S1P受體激動劑。 13. 如申請專利範圍第12項之方法’其中該S1P受體激動劑包 含如申請專利範圍第9項定義之式X基團。 85372
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