KR20130088904A - 암에서 ｅｄｇ 수용체 결합제의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 임의로 화학요법제와 함께 스핑고신-1-포스페이트 수용체 아고니스트를 사용하여 고형종양, 예를들어 종양 침습을 치료하는, 특히 조절되지 않은 혈관형성을 억제하거나 조절하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한, 스핑고신-1-포스페이트 수용체 아고니스트와 화학요법제의 배합물을 포함한다.

Description

암에서 ＥＤＧ 수용체 결합제의 용도 {USE OF EDG RECEPTOR BINDING AGENTS IN CANCER}

본 발명은 특히 암 치료에서 스핑고신-1-포스페이트(S1P) 수용체 아고니스트의 신규 용도에 관한 것이다.

S1P 수용체 아고니스트는 전신화된 면역억제를 야기시키지 않으면서 이차적 림프조직으로의 순환으로부터의 림프구의 바람직하게는 가역적인 재분포로부터 발생하는 림프구감소증을 유도하는 림프구 호밍(lymphocyte homing; LH) 성분을 촉진시킨다. 비감작 세포는 격리되며; 혈액으로부터의 CD4 및 CD8 T-세포 및 B-세포는 림프절(LN) 및 파이어반(Peyer's patches; PP) 내로 이동하도록 촉진되고, 따라서 예를들면, 이식된 기관 내로 세포가 침윤하는 것이 억제된다.

S1P 수용체 아고니스트는 통상적으로 2-치환된 2-아미노-프로판-1,3-디올 또는 2-아미노-프로판올 유도체와 같은 스핑고신 유사체, 예를들어 하기 화학식 X의 기를 포함하는 화합물이다:

<화학식 X>

상기 식에서,

Z는 H; C_1-6 알킬; C_2-6 알케닐; C_2-6 알키닐; 페닐; OH에 의해서 치환된 페닐; 할로겐, C_3-8 시클로알킬, 페닐 및 OH에 의해서 치환된 페닐로 구성된 군으로부터 선택된 1 내지 3개의 치환체에 의해서 치환된 C_1-6 알킬; 또는 CH₂-R_4z이고, 여기에서 R_4z는 OH, 아실옥시 또는 하기 화학식 a의 잔기이며,

<화학식 a>

여기에서 Z₁은 직접결합 또는 O, 바람직하게는 O이고; R_5z 및 R_6z는 각각 독립적으로 H, 또는 1, 2 또는 3개의 할로겐 원자에 의해서 임의로 치환된 C_1-4 알킬이며,

R_1z는 OH, 아실옥시 또는 화학식 a의 잔기이며;

R_2z 및 R_3z는 각각 독립적으로 H, C_1-4 알킬 또는 아실이다.

화학식 X의 기는 친수성 또는 친유성일 수 있으며 하나 또는 그 이상의 지방족, 지환족, 방향족 및(또는) 헤테로시클릭 잔기를 포함하는 부분에, Z 및 R_1z 중의 적어도 하나가 화학식 a의 잔기이거나, 화학식 a의 잔기를 함유하는 생성된 분자가 하나 또는 그 이상의 스핑고신-1-포스페이트 수용체에서 아고니스트로서 신호를 보내는 정도로 말단기로 부착된 작용기이다.

S1P 수용체 아고니스트는 하나 또는 그 이상의 스핑고신-1 포스페이트 수용체, 예를들어 S1P1 내지 S1P8에서 아고니스트로서 신호를 보내는 화합물이다. S1P 수용체로의 아고니스트 결합은 예를들어, 세포내 헤테로트리머릭(intracellular heterotrimeric) G-단백질의 Gα-GPT 및 Gβγ-GPT로의 해리 및(또는) 아고니스트-점유된 수용체의 증가된 포스포릴화 및 하류 시그날링 경로(downstream signaling pathways)/키나제의 활성화를 야기시킬 수 있다. S1P 수용체 아고니스트의 결합친화성은 이하의 단락 1에 기술된 바와 같이 측정될 수 있다.

적절한 S1P 수용체 아고니스트의 예는 다음과 같다:

- EP627406A1에 기술된 바와 같은 화합물, 예를들어 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염:

<화학식 I>

상기 식에서,

R₁은 이중결합, 삼중결합, O, S, NR₆ (여기에서 R₆는 H, 알킬, 아르알킬, 아실 또는 알콕시카르보닐임), 및 카르보닐로부터 선택된 결합 또는 헤테로 원자를 탄소쇄 내에 가질 수 있고(있거나), 치환체로서 알콕시, 알케닐옥시, 알키닐옥시, 아르알킬옥시, 아실, 알킬아미노, 알킬티오, 아실아미노, 알콕시카르보닐, 알콕시카르보닐아미노, 아실옥시, 알킬카르바모일, 니트로, 할로겐, 아미노, 히드록시이미노, 히드록시 또는 카르복시를 가질 수 있는 직쇄 또는 분지쇄 (C_12-22) 탄소쇄이거나;

R₁은 알킬이 직쇄 또는 분지쇄 (C_6-20) 탄소쇄인 페닐알킬; 또는 알킬이 직쇄 또는 분지쇄 (C_1-30) 탄소쇄이며, 할로겐에 의해서 임의로 치환된 직쇄 또는 분지쇄 (C_6-20) 탄소쇄, 할로겐에 의해서 임의로 치환된 직쇄 또는 분지쇄 (C_6-20) 알콕시 쇄, 직쇄 또는 분지쇄 (C_6-20) 알케닐옥시, 페닐알콕시, 할로페닐알콕시, 페닐알콕시알킬, 페녹시알콕시 또는 페녹시알킬, C_6-20 알킬에 의해서 치환된 시클로알킬알킬, C_6-20 알킬에 의해서 치환된 헤테로아릴알킬, 헤테로시클릭 C_6-20 알킬, 또는 C_2-20 알킬에 의해서 치환된 헤테로시클릭 알킬에 의해서 치환된 페닐알킬이며, 여기에서 알킬 부분은 탄소쇄 내에 이중결합, 삼중결합, O, S, 설피닐, 설포닐, 또는 NR₆ (여기에서 R₆는 상기 정의한 바와 같다)로부터 선택된 결합 또는 헤테로원자를 가질 수 있으며, 치환체로서 알콕시, 알케닐옥시, 알키닐옥시, 아르알킬옥시, 아실, 알킬아미노, 알킬티오, 아실아미노, 알콕시카르보닐, 알콕시카르보닐아미노, 아실옥시, 알킬카르바모일, 니트로, 할로겐, 아미노, 히드록시 또는 카르복시를 가질 수 있고;

R₂, R₃, R₄ 및 R₅는 각각 독립적으로 H, C_1-4 알킬 또는 아실이다;

- EP 1002792A1에 기술된 바와 같은 화합물, 예를들어 하기 화학식 II의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염:

<화학식 II>

상기 식에서,

m은 1 내지 9이고,

R'₂, R'₃, R'₄ 및 R'₅는 각각 독립적으로 H, 알킬 또는 아실이다;

- EP 0778263A1에 기술된 바와 같은 화합물, 예를들어 하기 화학식 III의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염:

<화학식 III>

상기 식에서,

W는 H; C_1-6 알킬, C_2-6 알케닐 또는 C_2-6 알키닐; 비치환되거나 OH에 의해서 치환된 페닐; R"₄O(CH₂)_n; 또는 할로겐, C_3-8 시클로알킬, 페닐, 및 OH에 의해서 치환된 페닐로 구성된 군으로부터 선택된 1 내지 3개의 치환체에 의해서 치환된 C_1-6 알킬이고,

X는 H, 또는 예를들어 C_1-6 알킬, OH, C_1-6 알콕시, 아실옥시, 아미노, C_1-6 알킬아미노, 아실아미노, 옥소, 할로C_1-6 알킬, 할로겐, 비치환된 페닐, 및 C_1-6 알킬, OH, C_1-6 알콕시, 아실, 아실옥시, 아미노,C_1-6 알킬아미노, 아실아미노, 할로C_1-6 알킬 및 할로겐으로 구성된 군으로부터 선택된 1 내지 3개의 치환체에 의해서 치환된 페닐로 구성된 군으로부터 선택된 1 내지 3개의 치환체에 의해서 치환된, p개의 탄소원자를 갖는 비치환되거나 치환된 직쇄 알킬 또는 (p-1)개의 탄소원자를 갖는 비치환되거나 치환된 직쇄 알콕시이며,

Y는 H, C_1-6 알킬, OH, C_1-6 알콕시, 아실, 아실옥시, 아미노, C_1-6 알킬아미노, 아실아미노, 할로C_1-6 알킬 또는 할로겐이고,

Z₂는 단일결합 또는 q개의 탄소원자를 갖는 직쇄 알킬렌이며,

p 및 q는 각각 독립적으로 1 내지 20의 정수이고, 단 6≤p+q≤23이며,

m'는 1, 2 또는 3이고,

n은 2 또는 3이며,

R"₁, R"₂, R"₃ 및 R"₄는 각각 독립적으로 H, C_1-4 알킬 또는 아실이다;

- WO 02/18395에 기술된 바와 같은 화합물, 예를들어 하기 화학식 IVa 또는 IVb의 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염 또는 수화물:

<화학식 IVa>

<화학식 IVb>

상기 식에서,

X_a는 O, S, NR_1s 또는 -(CH₂)_na-기이며, 이 기는 비치환되거나 1 내지 4개의 할로겐에 의해서 치환되고,

n_a는 1 또는 2이며,

R_1s는 H, 또는 비치환되거나 할로겐에 의해서 치환된 (C_1-4)알킬이고,

R_1a는 H, OH, (C_1-4)알킬 또는 O(C_1-4)알킬이며, 여기에서 알킬은 비치환되거나 1 내지 3개의 할로겐에 의해서 치환되고,

R_1b는 H, OH 또는 (C_1-4)알킬이며, 여기에서 알킬은 비치환되거나 할로겐에 의해서 치환되고,

각각의 R_2a는 독립적으로 H, 또는 비치환되거나 할로겐에 의해서 치환된 (C_1-4)알킬로부터 선택되며,

R_3a는 H, OH, 할로겐 또는 O(C_1-4)알킬이고, 여기에서 알킬은 비치환되거나 할로겐에 의해서 치환되며,

R_3b는 H, OH, 할로겐, (C_1-4)알킬 (여기에서, 알킬은 비치환되거나 히드록시에 의해서 치환됨), 또는 O(C_1-4)알킬 (여기에서, 알킬은 비치환되거나 할로겐에 의해서 치환됨)이고,

Y_a는 -CH₂-, -C(O)-, -CH(OH)-, -C(=NOH)-, O 또는 S이며,

R_4a는 (C_4-14)알킬 또는 (C_4-14)알케닐이다;

- WO 02/076995에 기술된 바와 같은 화합물, 예를들어 하기 화학식 V의 화합물 또는 화학식 VI의 화합물, 또는 이들의 약제학적으로 허용되는 염:

<화학식 V>

<화학식 VI>

상기 식에서,

m_c는 1, 2 또는 3이고,

X_c는 O 또는 직접결합이며,

R_1c는 H; OH, 아실, 할로겐, C_3-10 시클로알킬, 페닐 또는 히드록시-페닐렌에 의해서 임의로 치환된 C_1-6 알킬; C_2-6 알케닐; C_2-6 알키닐; 또는 OH에 의해서 임의로 치환된 페닐이고,

R_2c는 하기 화학식의 기이며,

{여기에서 R_5c는 H, 또는 1, 2 또는 3개의 할로겐 원자에 의해서 임의로 치환된 C_1-4 알킬이고, R_6c는 H, 또는 할로겐에 의해서 임의로 치환된 C_1-4 알킬임}

R_3c 및 R_4c는 각각 독립적으로 H, 할로겐에 의해서 임의로 치환된 C_1-4 알킬, 또는 아실이고,

R_c는 쇄 내에 산소 원자를 임의로 가질 수 있으며, 니트로, 할로겐, 아미노, 히드록시 또는 카르복시에 의해서 임의로 치환될 수 있는 C_13-20 알킬; 또는 하기 화학식 a'의 잔기이고,

<화학식 a'>

{여기에서 R_7c는 H, C_1-4 알킬 또는 C_1-4 알콕시이며, R_8c는 치환된 C_1-20 알카노일, 페닐C_1-14 알킬 (여기에서, C_1-14 알킬은 할로겐 또는 OH에 의해서 임의로 치환됨), 시클로알킬C_1-14 알콕시 또는 페닐C_1-14 알콕시 (여기에서, 시클로알킬 또는 페닐 환은 할로겐, C_1-4 알킬 및(또는) C_1-4 알콕시에 의해서 임의로 치환됨), 페닐C_1-14 알콕시-C_1-14 알킬, 페녹시C_1-14 알콕시 또는 페녹시C_1-14 알킬임}

R_c는 또한, R_1c가 C_1-4 알킬, C_2-6 알케닐 또는 C_2-6 알키닐인 경우에 R_8c가 C_1-14 알콕시인 화학식 a'의 잔기이며,

n_x는 2, 3 또는 4이고,

R_1x는 H; OH, 아실, 할로겐, 시클로알킬, 페닐 또는 히드록시-페닐렌에 의해서 임의로 치환된 C_1-6 알킬; C_2-6 알케닐; C_2-6 알키닐; 또는 OH에 의해서 임의로 치환된 페닐이며,

R_2x는 H, C_1-4 알킬 또는 아실이고,

R_3x 및 R_4x는 각각 독립적으로 H, 할로겐에 의해서 임의로 치환된 C_1-4 알킬, 또는 아실이며,

R_5x는 H, C_1-4 알킬 또는 C_1-4 알콕시이고,

R_6x는 시클로알킬에 의해서 치환된 C_1-20 알카노일; 시클로알킬 환이 할로겐, C_1-4 알킬 및(또는) C_1-4 알콕시에 의해서 임의로 치환된 시클로알킬C_1-14 알콕시; 페닐 환이 할로겐, C_1-4 알킬 및(또는) C_1-4 알콕시에 의해서 임의로 치환된 페닐C_1-14 알콕시이며,

R_6x는 또한, R_1x가 OH에 의해서 치환된 C_2-4 알킬인 경우에 C_4-14 알콕시이거나, R_1x가 C_1-4 알킬인 경우에 펜틸옥시 또는 헥실옥시이고,

단, R_5x가 H이거나 R_1x가 메틸인 경우에 R_6x는 페닐-부틸렌옥시가 아니다;

- WO 02/06268A1에 기술된 바와 같은 화합물, 예를들어 하기 화학식 VII의 화합물, 또는 그의 약물학적으로 허용되는 염 또는 에스테르:

<화학식 VII>

상기 식에서,

R_1d 및 R_2d는 각각 독립적으로 H 또는 아미노-보호기이고,

R_3d는 수소 또는 히드록시-보호기이며,

R_4d는 저급 알킬이고,

n_d는 1 내지 6의 정수이며,

X_d는 에틸렌, 비닐렌, 에티닐렌, 화학식 -D-CH₂-의 기(여기에서, D는 카르보닐, -CH(OH)-, O, S 또는 N임), 아릴, 또는 이하에 정의하는 a 기로부터 선택된 3개 이하의 치환체에 의해서 치환된 아릴이고,

Y_d는 단일결합, C_1-10 알킬렌, a 및 b 기로부터 선택된 3개 이하의 치환체에 의해서 치환된 C_1-10 알킬렌, 탄소쇄의 중간 또는 말단에 O 또는 S를 갖는 C_1-10 알킬렌, 또는 a 및 b 기로부터 선택된 3개 이하의 치환체에 의해서 치환된 탄소쇄의 중간 또는 말단에 O 또는 S를 갖는 C_1-10 알킬렌이며,

R_5d는 수소, 시클로알킬, 아릴, 헤테로사이클, a 및 b 기로부터 선택된 3개 이하의 치환체에 의해서 치환된 시클로알킬, a 및 b 기로부터 선택된 3개 이하의 치환체에 의해서 치환된 아릴, 또는 a 및 b 기로부터 선택된 3개 이하의 치환체에 의해서 치환된 헤테로사이클이고,

R_6d 및 R_7d는 각각 독립적으로 H, 또는 a 기로부터 선택된 치환체이며,

<a 기>는 할로겐, 저급 알킬, 할로게노 저급 알킬, 저급 알콕시, 저급 알킬티오, 카르복실, 저급 알콕시카르보닐, 히드록시, 저급 지방족 아실, 아미노, 모노-저급 알킬아미노, 디-저급 알킬아미노, 저급 지방족 아실아미노, 시아노 또는 니트로이고,

<b 기>는 각각 a 기로부터 선택된 3개 이하의 치환체에 의해서 임의로 치환된 시클로알킬, 아릴, 헤테로사이클이며,

단 R_5d가 수소인 경우에, Y_d는 단일결합이거나 선형 C_1-10 알킬렌이다;

- JP-14316985 (JP2002316985)에 기술된 바와 같은 화합물, 예를들어 하기 화학식 VIII의 화합물, 또는 그의 약물학적으로 허용되는 염 또는 에스테르:

<화학식 VIII>

상기 식에서,

R_1e, R_2e, R_3e, R_4e, R_5e, R_6e, R_7e, n_e, X_e 및 Y_e는 JP-14316985에 기술된 바와 같다;

- WO 03/29184 및 WO 03/29205에 기술된 바와 같은 화합물, 예를들어 하기 화학식 IX의 화합물, 예를들어 2-아미노-2-[4-(3-벤질옥시페녹시)-2-클로로페닐]프로필]-1,3-프로판-디올 또는 2-아미노-2-[4-(벤질옥시페닐티오)-2-클로로페닐]프로필-1,3-프로판-디올:

<화학식 IX>

상기 식에서,

X_f는 O 또는 S이며,

R_1f, R_2f, R_3f 및 n_f는 WO 03/29184 및 03/29205에 기술된 바와 같다.

특허출원에 대한 인용이 되어 있는 각각의 경우에, 화합물에 대한 사항은 본 출원에 참고로 포함된다.

아실은 잔기 R_y-CO-이며, 여기에서 R_y는 C_1-6 알킬, C_3-6 시클로알킬, 페닐 또는 페닐-C_1-4 알킬이다. 다른 식으로 언급되지 않는 한, 알킬, 알콕시, 알케닐 또는 알키닐은 직쇄이거나 분지될 수 있다.

화학식 I의 화합물에서 R₁의 탄소쇄가 치환되는 경우에, 이것은 바람직하게는 할로겐, 니트로, 아미노, 히드록시 또는 카르복시에 의해서 치환된다. 탄소쇄가 임의로 치환된 페닐렌에 의해서 차단되는 경우에, 탄소쇄는 바람직하게는 비치환된다. 페닐렌 부분이 치환되는 경우에, 이것은 바람직하게는 할로겐, 니트로, 아미노, 메톡시, 히드록시 또는 카르복시에 의해서 치환된다.

화학식 I의 바람직한 화합물은 R₁이 니트로, 할로겐, 아미노, 히드록시 또는 카르복시에 의해서 임의로 치환된 C_13-20 알킬인 화합물이며, 더욱 바람직하게는 R₁이 할로겐에 의해서 임의로 치환된 C_6-14-알킬 쇄에 의해서 치환된 페닐알킬이고, 알킬 부분은 히드록시에 의해서 임의로 치환된 C_1-6 알킬인 화합물이다. 더욱 바람직하게는, R₁은 직쇄 또는 분지쇄, 바람직하게는 직쇄인 C_6-14 알킬쇄에 의해서 페닐 상에서 치환된 페닐-C_1-6 알킬이다. C_6-14 알킬쇄는 오르토, 메타 또는 파라 위치일 수 있으며, 바람직하게는 파라 위치이다.

바람직하게는 R₂ 내지 R₅ 각각은 H이다.

화학식 I의 바람직한 화합물은 2-아미노-2-테트라데실-1,3-프로판디올이다. 화학식 I의 특히 바람직한 S1P 수용체 아고니스트는 FTY720, 즉 유리형태 또는 약제학적으로 허용되는 염 형태의 2-아미노-2-[2-(4-옥틸페닐)에틸]프로판-1,3-디올 (이하에서는 화합물 A라 칭함), 예를들어 하기 화학식에서 보는 바와 같은 히드로클로라이드 형태이다:

화학식 II의 바람직한 화합물은 R'₂ 내지 R'₅가 각각 H이고, m이 4인 화합물, 즉 유리형태 또는 약제학적으로 허용되는 염 형태의 2-아미노-2-{2-[4-(1-옥소-5-페닐펜틸)페닐]에틸}프로판-1,3-디올 (이하에서는 화합물 B라 칭한다), 예를들어 히드로클로라이드이다.

화학식 III의 바람직한 화합물은 W가 CH₃이고, R"₁ 내지 R"₃ 각각이 H이며, Z₂가 에틸렌이고, X가 헵틸옥시이며, Y가 H인 화합물, 즉 유리형태 또는 약제학적으로 허용되는 염 형태의 2-아미노-4-(4-헵틸옥시페닐)-2-메틸-부탄올 (이하에서는 화합물 C라 칭한다), 예를들어 히드로클로라이드이다. R-에난티오머가 특히 바람직하다.

화학식 IVa의 바람직한 화합물은 FTY720-포스페이트 (R_2a는 H이고, R_3a는 OH이며, X_a는 O이고, R_1a 및 R_1b는 OH임)이다. 화학식 IVb의 바람직한 화합물은 화합물 C-포스페이트 (R_2a는 H이고, R_3b는 OH이며, X_a는 O이고, R_1a 및 R_1b는 OH이며, Y_a는 O이고, R_4a는 헵틸임)이다. 화학식 V의 바람직한 화합물은 화합물 B-포스페이트이다.

화학식 V의 바람직한 화합물은 인산 모노-[(R)-2-아미노-2-메틸-4-(4-펜틸옥시-페닐)-부틸]에스테르이다.

화학식 VIII의 바람직한 화합물은 (2R)-2-아미노-4-[3-(4-시클로헥실옥시부틸)벤조[b]티엔-6-일]-2-메틸부탄-1-올이다.

화학식 I 내지 IX의 화합물이 분자 내에 하나 또는 그 이상의 비대칭 중심을 갖는 경우에, 본 발명은 라세메이트, 부분입체이성체 및 이들의 혼합물을 포함할 뿐만 아니라 다양한 광학이성체를 포함하는 것으로 이해된다. 아미노 그룹을 갖는 탄소원자가 비대칭인 경우에 화학식 III 또는 IVb의 화합물은 바람직하게는 이 탄소원자에서 R-배열을 갖는다.

화학식 I 내지 IX의 화합물의 약제학적으로 허용되는 염의 예로는 히드로클로라이드, 하이드로브로마이드 및 설페이트와 같은 무기산과의 염, 아세테이트, 푸마레이트, 말레에이트, 벤조에이트, 시트레이트, 말레이트, 메탄설포네이트 및 벤젠설포네이트 염과 같은 유기산과의 염, 또는 필요에 따라서 나트륨, 칼륨, 칼슘 및 알루미늄과 같은 금속과의 염, 트리에틸아민과 같은 아민과의 염, 및 라이신과 같은 이염기성 아미노산과의 염이 포함된다. 본 발명의 방법의 화합물 및 염은 수화물 및 용매화물 형태를 포함한다.

S1P 수용체 아고니스트는 관찰된 활성, 예를들어 EP627406A1 또는 USP 6,004,565에 기술된 바와 같은 림프구의 호밍을 기초로 하여, 예를들어 급성 동종이식 거부반응의 치료시에, 예를들어 면역억제제로서 유용한 것으로 확인되었다. 본 발명에서, S1P 수용체 아고니스트는 그들을 특히 고형종양, 특히 진행된 고형종양의 암 화학요법에 유용한 것으로 만드는 흥미로운 특성을 갖는 것으로 확인되었다. 특히 항암성 화합물에 의한 치료가 질병 퇴행 또는 안정화와 연관되지 않는 경우에는 고형종양의 암 치료에서 의료비품을 확대시킬 필요성이 여전히 존재한다.

본 발명의 특별한 소견에 따르면 다음이 제공된다:

1.1. 화학식 X의 기를 포함하는 S1P 수용체 아고니스트 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염의 치료학적 유효량을 고형종양의 치료가 필요한 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체에게서 고형종양을 치료하는 방법.

1.2. 화학식 X의 기를 포함하는 S1P 수용체 아고니스트 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염의 치료학적 유효량을 고형종양의 성장을 억제할 필요가 있는 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체에게서 고형종양의 성장을 억제하는 방법.

1.3. 화학식 X의 기를 포함하는 S1P 수용체 아고니스트 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염의 치료학적 유효량을 종양 퇴행을 유도할 필요가 있는 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체에게서 종양 퇴행, 예를들어 종양 덩이 감소를 유도하는 방법.

1.4. 화학식 X의 기를 포함하는 S1P 수용체 아고니스트 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염의 치료학적 유효량을 종양 성장과 연관된 고형종양 침습 또는 증상 치료가 필요한 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체에게서 종양 성장과 연관된 고형종양 침습 또는 증상을 치료하는 방법.

1.5. 화학식 X의 기를 포함하는 S1P 수용체 아고니스트 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염의 치료학적 유효량을 종양의 전이성 확산 예방, 또는 미소전이의 성장 예방 또는 억제가 필요한 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체에게서 종양의 전이성 확산을 예방하거나, 미소전이의 성장을 예방 또는 억제하는 방법.

1.6. 화학식 X의 기를 포함하는 S1P 수용체 아고니스트 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염의 치료학적 유효량을 통제되지 않은 혈관형성의 억제 또는 조절이 필요한 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체에게서 통제되지 않은 혈관형성, 예를들어 스핑고신-1-포스페이트(S1P) 매개된 혈관형성을 억제 또는 조절하는 방법.

1.7. 화학식 X의 기를 포함하는 S1P 수용체 아고니스트 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염의 치료학적 유효량을 신생혈관형성과정에 의해서 매개되거나 통제되지 않은 혈관형성과 연관된 질병의 예방 또는 치료가 필요한 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체에게서 신생혈관형성과정에 의해서 매개되거나 통제되지 않은 혈관형성과 연관된 질병을 예방 또는 치료하는 방법.

"고형종양"은 림프성 암 이외의 종양 및(또는) 전이부(어디에 위치하든지), 예를들어 뇌 및 그밖의 다른 중추신경계 종양(예를들어 뇌척수막, 뇌, 척수, 뇌신경 및 중추신경계의 그밖의 다른 부분의 종양, 예를들어 신경교아세포종 또는 수질 아세포종); 두부 및(또는) 경부 암; 유방종양; 순환기계 종양(예를들어 심장, 종격 및 흉막, 및 그밖의 다른 흉내 기관, 혈관 종양 및 종양-연관된 혈관조직); 배설기계 종양(예를들어 신장, 신우, 요관, 방광, 그밖의 특정되지 않은 비뇨기 기관); 위장관 종양(예를들어 식도, 위, 소장, 결장, 결장직장, 직장S상결장 접합부, 직장, 항문 및 항문관), 간 및 간내 담관, 담낭, 그밖의 특정되지 않은 담관계의 부분, 췌장, 그밖의 기관 및 소화성 기관을 포함하는 종양; 구강(입술, 혀, 잇몸, 구강저, 입천장, 및 구강의 다른 부분, 이하선, 및 타액선의 그밖의 다른 부분, 편도, 구강인두, 비인강, 이상동, 하인두, 및 입술, 구강 및 인두의 그밖의 다른 부위); 생식기계 종양(예를들어 외음문, 질, 자궁경, 자궁체, 자궁, 난소, 및 여성 생식기관과 연관된 다른 부위, 태반, 음경, 전립선, 고환, 및 남성 생식기관과 연관된 다른 부위); 호흡기 종양(예를들어 비강 및 중이, 부비동, 후두, 기관, 기관지 및 폐, 예를들어 소세포 폐암 또는 비-소세포 폐암); 골격계 종양(예를들어 사지의 뼈 및 관절연골, 골관절연골 및 그밖의 다른 부위); 피부 종양(예를들어 피부의 악성 흑색종, 비-흑색종 피부암, 피부의 기저세포암, 피부의 편평상피암, 중피종, 카포시육종); 및 말초신경 및 자율신경계, 결합조직 및 연조직, 복막후강 및 복막, 눈 및 부속기, 갑상선, 부신 및 그밖의 다른 내분비선 및 관련 구조물을 포함하는 다른 조직이 연루된 종양, 림프절의 이차성 및 비특정화된 악성 신생물, 호흡기 및 소화기계의 이차성 악성 신생물, 및 그밖의 다른 부위의 이차성 악성 신생물을 의미한다.

이전 및 이하에서 종양, 종양질환, 암종 또는 암이 언급되는 경우에는, 종양 및(또는) 전이부의 위치가 어디이든지 원래의 기관 또는 조직에서 및(또는) 어떤 다른 위치에서의 전이도 또한 선택적으로 또는 추가로 포함된다.

S1P 수용체 아고니스트가 화학식 I의 화합물, 예를들어 화합물 A, 또는 화학식 IVa 또는 IVb의 화합물인 경우에 한가지 구체예에서 이것은 유방, 전립선, 방광, 신장 또는 폐 종양 이외의 다른 고형종양을 위한 치료방법 1.1, 1.2, 1.3 또는 1.4에서 사용된다.

일련의 추가의 특이적 또는 대체용 구체예에서 본 발명은 또한 다음을 제공한다:

1.8. 화학요법제의 활성을 증진시키거나 화학요법제에 대한 내성을 극복할 필요가 있는 개체에게 S1P 수용체 아고니스트, 예를들어 화학식 X의 기를 포함하는 S1P 수용체 아고니스트, 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염을 화학요법제와 동시에 또는 순차적으로 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체에게서 화학요법제의 활성을 증진시키거나 화학요법제에 대한 내성을 극복하는 방법.

1.9. 화학요법제가 종양 형성 및(또는) 전이 형성에 연루된 숙주세포 또는 과정에 대해서 지향되거나, 증식, 생존, 분화 또는 약물 내성의 발생을 위해 종양세포에 의해서 이용되는 시그날 트랜스덕션(transduction) 경로의 억제제인 상기 1.8에 따르는 방법.

1.10. S1P 수용체 아고니스트가 간헐적으로 투여되는 상기 지시된 바와 같은 방법.

일련의 추가의 특이적 또는 대체용 구체예에서 본 발명은 또한 다음을 제공한다:

2.1. S1P 수용체 아고니스트가 화학식 I의 화합물, 예를들어 화합물 A, 또는 화학식 IVa 또는 IVb의 화합물인 경우에 바람직하게는 유방암, 전립선암, 방광암, 신장암 또는 폐암 이외의 고형종양에 대해, 상기 1.1 내지 1.4에서 정의된 바와 같은 방법에서 사용하기 위한 화학식 X의 기를 포함하는 S1P 수용체 아고니스트, 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염.

2.2. 상기 1.5 내지 1.10 또는 이하의 7에서 정의된 바와 같은 방법에서 사용하기 위한 S1P 수용체 아고니스트, 예를들어 화학식 X의 기를 포함하는 S1P 수용체 아고니스트, 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염.

3.1. S1P 수용체 아고니스트가 화학식 I의 화합물, 예를들어 화합물 A, 또는 화학식 IVa 또는 IVb의 화합물인 경우에 바람직하게는 유방암, 전립선암, 방광암, 신장암 또는 폐암 이외의 고형종양에 대해 상기 1.1 내지 1.4에서 정의된 바와 같은 방법에서 사용하기 위한 약제학적 조성물의 제조시에 사용하기 위한 화학식 X의 기를 포함하는 S1P 수용체 아고니스트, 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염.

3.2. 상기 1.5 내지 1.10 또는 이하의 7에서 정의된 바와 같은 방법에서 사용하기 위한 약제학적 조성물의 제조시에 사용하기 위한 S1P 수용체 아고니스트, 예를들어 화학식 X의 기를 포함하는 S1P 수용체 아고니스트, 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염.

4.1. S1P 수용체 아고니스트가 화학식 I의 화합물, 예를들어 화합물 A, 또는 화학식 IVa 또는 IVb의 화합물인 경우에 바람직하게는 유방암, 전립선암, 방광암, 신장암 또는 폐암 이외의 고형종양을 위한 것으로, 하나 또는 그 이상의 약제학적으로 허용되는 희석제 또는 담체와 함께 화학식 X의 기를 포함하는 S1P 수용체 아고니스트, 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는, 상기 1.1 내지 1.4에서 정의한 바와 같은 방법에서 사용하기 위한 약제학적 조성물.

4.2. 하나 또는 그 이상의 약제학적으로 허용되는 희석제 또는 담체와 함께 S1P 수용체 아고니스트, 예를들어 화학식 X의 기를 포함하는 S1P 수용체 아고니스트, 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는, 상기 1.5 내지 1.10 또는 이하의 7에서 정의된 바와 같은 방법에서 사용하기 위한 약제학적 조성물.

5.1. a) S1P 수용체 아고니스트, 예를들어 화학식 X의 기를 포함하는 S1P 수용체 아고니스트 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염인 제1 약제, 및 b) 화학요법제, 예를들어 이하에 정의된 바와 같은 화학요법제인 보조약제를 포함하는 약제학적 배합물.

5.2. 상승적 치료 효과를 생성하도록 a) S1P 수용체 아고니스트, 예를들어 화학식 X의 기를 포함하는 S1P 수용체 아고니스트 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염인 제1 약제, 및 b) 이하의 항목 xi)에서 정의한 화합물로부터 선택된 화학요법제인 보조약제를 포함하는 약제학적 배합물.

6. 치료학적 유효량의 S1P 수용체 아고니스트, 예를들어 화학식 X의 기를 포함하는 S1P 수용체 아고니스트, 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염, 및 예를들어 이하에 언급한 바와 같은 화학요법제인 제2 약물성분을 병용투여, 예를들어 동시에 또는 순차적으로 투여하는 것을 포함하는 상기 정의한 바와 같은 방법.

7. S1P 수용체 아고니스트, 예를들어 화학식 X의 기를 포함하는 S1P 수용체 아고니스트, 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염, 및 예를들어 이하에 언급한 바와 같은 화학요법제인 제2 약물성분을 개체에게 병용투여, 예를들어 동시에 또는 순차적으로 투여하는 것을 포함하는, 림프세포 증식성 또는 골수 증식성 질병을 치료하는, 예를들어 치료가 필요한 개체에게서 종양 침습 또는 이러한 종양 성장과 연관된 증상을 치료하는 방법.

"림프성 암"은 예를들어, 혈액 및 림프계통의 종양(예를들어 호지킨병, 비-호지킨 림프종, 버키트 림프종, AIDS-관련된 림프종, 악성 면역증식성 질환, 다발성 골수종 및 악성 형질세포 신생물, 림프성 백혈병, 급성 또는 만성 골수성 백혈병, 급성 또는 만성 림프구성 백혈병, 단구성 백혈병, 특정한 세포 타입의 그밖의 다른 백혈병, 비특정화된 세포 타입의 백혈병, 림프구, 조혈 및 관련된 조직의 그밖의 비특정화된 악성 신생물, 예를들어 광범위 대세포 림프종, T-세포 림프종 또는 피부 T-세포 림프종)을 의미한다. 골수성 암은 예를들어 급성 또는 만성 골수성 백혈병을 포함한다.

용어 "화학요법제"는 특히 S1P 수용체 아고니스트 이외의 모든 화학요법제를 의미한다. 여기에는 다음이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다:

i. 아로마타제 억제제,

ii. 항에스트로젠, 항-안드로젠(특히 전립선 암의 경우) 또는 고나도렐린 아고니스트,

iii. 토포이소머라제 I 억제제 또는 토포이소머라제 II 억제제,

iv. 미소관 활성제, 알킬화제, 항신생물성 항대사제 또는 플라틴 화합물,

v. 단백질 또는 지질 키나제 활성 또는 단백질 또는 지질 포스파타제 활성을 표적화/감소시키는 화합물, 추가의 항-혈관형성 화합물, 또는 세포분화과정을 유도하는 화합물,

vi. 브라디키닌 1 수용체 또는 안지오텐신 II 길항제,

vii. 시클로옥시게나제 억제제, 비스포스포네이트, 히스톤 데아세틸라제 억제제, 헤파라나제 억제제(헤파린 설페이트 분해를 방지함), 예를들어 PI-88, 생물학적 반응 변형제, 바람직하게는 림포킨 또는 인터페론, 예를들어 인터페론 γ, 유비퀴틴화 억제제, 또는 항-세포소멸 경로를 차단하는 억제제,

viii. Ras 종양원성 이소형태(isoforms), 예를들어 H-Ras, K-Ras 또는 N-Ras의 억제제, 또는 파르네실 트랜스퍼라제 억제제, 예를들어 L-744,832 또는 DK8G557,

ix. 텔로머라제(telomerase) 억제제, 예를들어 텔로메스타틴,

x. 프로테아제 억제제, 매트릭스 메탈로프로테이나제 억제제, 메티오닌 아미노펩티다제 억제제, 예를들어 벤가미드 또는 그의 유도체, 또는 프로테오좀 억제제, 예를들어 PS-341, 및(또는)

xi. mTOR 억제제.

본 발명에서 사용된 것으로서 용어 "아로마타제 억제제"는 에스트로젠 생성, 즉 기질 안드로스텐디온 및 테스토스테론이 각각 에스트론 및 에스트라디올로 전환되는 것을 억제하는 화합물에 관한 것이다. 이 용어는 스테로이드, 특히 아타메스탄, 엑세메스탄 및 포르메스탄, 및 특히 비-스테로이드, 특히 아미노글루테트이미드, 로글레티미드, 피리도글루테트이미드, 트리로스탄, 테스토락톤, 케토코나졸, 보로졸, 파드로졸, 아나스트로졸 및 레트로졸을 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니다. 엑세메스탄은 예를들어, 상품명 아로마신(AROMASIN™)으로 판매되는 그 형태로 투여될 수 있다. 포르메스탄은 예를들어, 상품명 렌타론(LENTARON™)으로 판매되는 그 형태로 투여될 수 있다. 파드로졸은 예를들어, 상품명 아페마(AFEMA™)로 판매되는 그 형태로 투여될 수 있다. 아나스트로졸은 예를들어, 상품명 아리미덱스(ARIMIDEX™)로 판매되는 그 형태로 투여될 수 있다. 레트로졸은 예를들어, 상품명 페마라(FEMARA™) 또는 페마르(FEMAR™)로 판매되는 그 형태로 투여될 수 있다. 아미노글루테트이미드는 예를들어, 상품명 오리메텐(ORIMETEN™)으로 판매되는 그 형태로 투여될 수 있다. 아로마타제 억제제인 화학요법제를 포함하는 본 발명의 배합물은 호르몬 수용체 양성 종양, 예를들어 유방종양의 치료에 특히 유용하다.

본 발명에서 사용된 것으로 용어 "항에스트로젠"은 에스트로젠 수용체 레벨에서 에스트로젠의 효과에 길항하는 화합물에 관한 것이다. 이 용어에는 타목시펜, 풀베스트란트, 랄록시펜 및 랄록시펜 히드로클로라이드가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 타목시펜은 예를들어, 상품명 놀바덱스(NOLVADEX™)로 판매되는 그 형태로 투여될 수 있다. 랄록시펜 히드로클로라이드는 예를들어, 상품명 에비스타(EVISRA™)로 판매되는 그 형태로 투여될 수 있다. 풀베스트란트는 US 4,659,516에 기술된 바와 같이 제제화될 수 있거나, 예를들어, 상품명 파스로덱스 (FASLODEX™)로 판매되는 그 형태로 투여될 수 있다. 항에스트로젠인 화학요법제를 함유하는 본 발명의 배합물은 에스트로젠 수용체 양성 종양, 예를들어 유방종양의 치료에 특히 유용하다.

본 발명에서 사용된 것으로 용어 "항-안드로젠"은 안드로젠성 호르몬의 생물학적 효과를 억제할 수 있는 모든 화합물에 관한 것이며, 예를들어 US 4,636,505에 기술된 바와 같이 제제화될 수 있는 비칼루타미드(카소덱스(CASODEX™))가 포함되나, 이것으로 제한되지는 않는다.

본 발명에서 사용된 것으로 용어 "고나도렐린 아고니스트"는 아바렐릭스, 고세렐린 및 고세렐린 아세테이트를 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다. 고세렐린은 US 4,100,274에 기술되어 있으며, 예를들어 졸라덱스(ZOLADEX™)로 판매되는 그 형태로 투여될 수 있다. 아바렐릭스는 예를들어, US 5,843,901에 기술된 바와 같이 제제화될 수 있다.

본 발명에서 사용된 것으로 용어 "토포이소머라제 I 억제제"는 토포테칸, 이리노테칸, 9-니트로캄프토테신 및 거대분자 캄프토테신 컨쥬게이트 PNU-166148(WO 99/17804에서 화합물 A1)을 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다. 이리노테칸은 예를들어, 상품명 캄프토자르(CAMPTOSAR™)로 판매되는 그 형태로 투여될 수 있다. 토포테칸은 예를들어, 상품명 하이캄틴(HYCAMTIN™)으로 판매되는 그 형태로 투여될 수 있다.

본 발명에서 사용된 것으로 용어 "토포이소머라제 II 억제제"는 독소루비신 (리포좀 제제, 예를들어 카엘릭스(CAELYX™)를 포함), 다우노루비신, 에피루비신, 이다루비신 및 네모루비신과 같은 안트라사이클린, 안트라퀴논 미톡산트론 및 로속산트론, 포도필로톡신 에토포사이드 및 테니포사이드를 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다. 에토포사이드는 예를들어, 상품명 에토포포스(ETOPOPHOS™)로 판매되는 그 형태로 투여될 수 있다. 테니포사이드는 예를들어, 상품명 VM 26-브리스톨 (VM 26-BRISTOL™)로 판매되는 그 형태로 투여될 수 있다. 독소루비신은 예를들어, 상품명 아드리블라스틴(ADRIBLASTIN™)으로 판매되는 그 형태로 투여될 수 있다. 에피루비신은 예를들어, 상품명 파르모루비신(FARMORUBICIN™)으로 판매되는 그 형태로 투여될 수 있다. 이다루비신은 예를들어, 상품명 자베도스(ZAVEDOS™)로 판매되는 그 형태로 투여될 수 있다. 미톡산트론은 예를들어, 상품명 노반트론 (NOVANTRON™)으로 판매되는 그 형태로 투여될 수 있다.

용어 "미소관 활성제(microtubule active agent)"는 탁산, 예를들어 파클리탁셀 및 도세탁셀, 빈카 알칼로이드, 예를들어 빈블라스틴, 특히 빈블라스틴 설페이트, 빈크리스틴, 특히 빈크리스틴 설페이트, 및 빈오렐빈, 디스코더몰라이드 및 에포틸론 및 그의 유도체, 예를들어 에포틸론 B 또는 그의 유도체를 포함하는 미소관 안정화 및 미소관 불안정화제에 관한 것이나, 이들로 제한되지는 않는다. 파클리탁셀은 예를들어, 상품명 탁솔(TAXOL™)로 판매되는 그 형태로 투여될 수 있다. 도세탁셀은 예를들어, 상품명 탁소테레(TAXOTERE™)로 판매되는 그 형태로 투여될 수 있다. 빈블라스틴 설페이트는 예를들어, 상품명 빈블라스틴 알피(VINBLASTIN R.P.™)로 판매되는 그 형태로 투여될 수 있다. 빈크리스틴 설페이트는 예를들어, 상품명 파르미스틴(FARMISTIN™)으로 판매되는 그 형태로 투여될 수 있다. 디스코더몰라이드는 예를들어, US 5,010,099에 기술된 바와 같이 수득될 수 있다.

본 발명에서 사용된 것으로 용어 "알킬화제"는 부설판, 클로람부실, 시클로포스파마이드, 이포스파마이드, 멜파란 또는 니트로소우레아(BCNU 또는 글리아델 (Gliadel™))를 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다. 시클로포스파마이드는 예를들어, 상품명 시클로스틴(CYCLOSTIN™)으로 판매되는 그 형태로 투여될 수 있다. 이포스파마이드는 예를들어, 상품명 홀록산(HOLOXAN™)으로 판매되는 그 형태로 투여될 수 있다.

용어 "항신생물성 항대사제"는 5-플루오로우라실, 카페시타빈, 젬시타빈, 시타라빈, 플루다라빈, 티오구아닌, 메토트렉세이트 및 에다트렉세이트를 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다. 카페시타빈은 예를들어, 상품명 젤로다(XELODA™)로 판매되는 그 형태로 투여될 수 있다. 젬시타빈은 예를들어, 상품명 젬자르 (GEMZAR™)로 판매되는 그 형태로 투여될 수 있다.

본 발명에서 사용된 것으로서 용어 "플라틴 화합물"은 카보플라틴, 시스-플라틴 및 옥살리플라틴을 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다. 카보플라틴은 예를들어, 상품명 카보플라트(CARBOPLAT™)로 판매되는 그 형태로 투여될 수 있다. 옥살리플라틴은 예를들어, 상품명 엘록사틴(ELOXATIN™)으로 판매되는 그 형태로 투여될 수 있다.

본 발명에서 사용된 것으로서 용어 "단백질 또는 지질 키나제 활성을 표적화/감소시키는 화합물, 또는 추가의 항-혈관형성 화합물"은 단백질 티로신 키나제 및(또는) 세린 및(또는) 트레오닌 키나제 억제제 또는 지질 키나제 억제제, 예를들어 수용체 티로신 키나제의 표피성장인자 부류(호모- 또는 헤테로다이머로서 EGFR, ErbB2, ErbB3, ErbB4), 수용체 티로신 키나제의 혈관내피성장인자 부류(VEGFR), 혈소판-유도된 성장인자-수용체(PDGFR), 섬유아세포 성장인자-수용체(FGFR), 인슐린-유사 성장인자 수용체 1(IGF-1R), Trk 수용체 티로신 키나제 부류, Axl 수용체 티로신 키나제 부류, Ret 수용체 티로신 키나제, Kit/SCFR 수용체 티로신 키나제, c-Abl 부류의 구성원 및 그들의 유전자-융합 생성물(예를들어, BCR-Abl), 단백질 키나제 C(PKC)의 구성원 및 세린(트레오닌) 키나제의 Raf 부류, MEK, SRC, JAK, FAK, PDK 또는 PI(3) 키나제 부류의 구성원, 또는 PI(3)-키나제-관련된 키나제 부류의 구성원 및(또는) 사이클린-의존성 키나제 부류(CDK)의 구성원, 및 예를들어 단백질 또는 지질 키나제 억제와 연관되지 않은 그들의 활성에 대한 다른 기전을 갖는 항-혈관형성 화합물을 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다.

VEGFR의 활성을 표적화하거나, 감소시키거나 억제하는 화합물은 특히 VEGF 수용체 티로신 키나제를 억제하거나, VEGF 수용체를 억제하거나, VEGF에 결합하는 화합물, 단백질 또는 항체이며, 특히 1-(4-클로로아닐리노)-4-(4-피리딜메틸)프탈라진 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염, 예를들어 숙시네이트와 같이 WO 98/35958에, N-아릴(티오)안트라닐산 아미드 유도체, 예를들어 2-[(4-피리딜)메틸]아미노-N-[3-메톡시-5-(트리플루오로메틸)페닐]벤즈아미드 또는 2-[(1-옥시도-4-피리딜)메틸]아미노-N-[3-트리플루오로메틸페닐]벤즈아미드와 같이 WO 00/27820에, 또는 WO 00/09495, WO 00/59509, WO 98/11223, WO 00/27819 및 EP 0 769 947에 일반적이며 구체적으로 기술된 이들 화합물, 단백질 또는 모노클로날 항체; 및 문헌 (M. Prewett et al., Cancer Research 59 (1999) 5209-5218; F. Yuan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 93, pp. 14765-14770, Dec. 1996; Z. Zhu et al., Cancer Res. 58, 1998, 3209-3214; 및 J. Mordenti et al., Toxicologic Pathology, Vol. 27, no. 1, pp 14-21, 1999)에 기술된 바와 같은 것; WO 00/37502 및 WO 94/10202에 기술된 것; 문헌(M. S. O'Reilly et al., Cell 79, 1994, 315-328)에 기술된 안지오스타틴(Angiostatin™); 문헌(M. S. O'Reilly et al., Cell 88, 1997, 277-285)에 기술된 엔도스타틴(Endostatin™); 안트라닐산 아미드; ZD4190; ZD6474; SU5416; SU6668; 또는 항-VEGF 항체 또는 항-VEGF 수용체 항체, 예를들어 RhuMab이다.

항체는 완전(intact) 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 적어도 2개의 완전 항체로부터 형성된 다중특이적(multispecific) 항체, 및 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한은 항체 단편을 의미한다.

표피성장인자 수용체 부류의 활성을 표적화하거나, 감소시키거나 억제하는 화합물은 특히 EGF 수용체 티로신 키나제 부류의 구성원, 예를들어 EGF 수용체, ErbB2, ErbB3 및 ErbB4를 억제하거나, EGF 또는 EGF 관련 리간드에 결합하거나, 또는 ErbB 및 VEGF 수용체 키나제에 대하여 이중 억제효과를 갖는 화합물, 단백질 또는 항체이며, 특히는 WO 97/02266의 실시예 39의 화합물과 같이 WO 97/02266에, 또는 EP 0 564 409, WO 99/03854, EP 0520722, EP 0 566 266, EP 0 787 722, EP 0 837 063, US 5,747,498, WO 98/10767, WO 97/30034, WO 97/49688, WO 97/38983, 및 특히 WO 96/30347(예를들어, CP 358774로 공지된 화합물), WO 96/33980(예를들어, 화합물 ZD 1839) 및 WO 95/03283(예를들어, 화합물 ZM105180) 또는 PCT/EP02/08780에 일반적이며 구체적으로 기술된 화합물, 단백질 또는 모노클로날 항체, 예를들어 트라스투주마브(trastuzumab)(헤르페틴 (Herpetin™)), 세툭시마브(cetuximab), 이레사(Iressa), OSI-774, CI-1033, EKB-569, GW-2016, E1.1, E2.4, E2.5, E6.2, E6.4, E2.11, E6.3 또는 E7.6.3이다.

PDGFR의 활성을 표적화하거나 감소시키거나 억제하는 화합물은 특히, PDGF 수용체를 억제하는 화합물, 예를들어 N-페닐-2-피리미딘-아민 유도체, 예를들어 이마티니브(imatinib)이다.

c-Abl 부류 구성원 및 그들의 유전자 융합생성물의 활성을 표적화하거나, 감소시키거나 억제하는 화합물은 예를들어 N-페닐-2-피리미딘-아민 유도체, 예를들어 이마티니브, PD180970, AG957 또는 NSC 680410이다.

단백질 키나제 C, Raf, MEK, SRC, JAK, FAK 및 PDK 부류의 구성원, 또는 PI(3) 키나제 또는 PI(3)-키나제-관련된 부류의 구성원, 및(또는) 사이클린-의존성 키나제 부류 (CDK)의 구성원의 활성을 표적화하거나, 감소시키거나 억제하는 화합물은 특히 EP 0 296 110에 기술된 스타우로스포린 유도체, 예를들어 미도스타우린 (midostaurin)이며; 추가의 화합물의 예로는 예를들어 UCN-01, 사핑골, BAY 43-9006, 브리오스타틴(Bryostatin) 1, 페리포신(Perifosine), UO126, 일모포신(Ilmofosine), RO 318220 및 RO 320432, GO 6976, 이시스(Isis) 3521, 또는 LY333531/LY379196이 포함된다.

추가의 항-혈관형성 화합물은 예를들어 탈리도마이드(탈로미드(THALOMID)) 및 TNP-470이다.

단백질 또는 지질 포스파타제의 활성을 표적화하거나, 감소시키거나 억제하는 화합물은 예를들어 포스파타제 1, 포스파타제 2A, PTEN 또는 CDC25의 억제제, 예를들어 오카다산(okadaic acid) 또는 그의 유도체이다.

세포분화과정을 유도하는 화합물은 예를들어 레티노산, α-, γ- 또는 δ-토코페롤 또는 α-, γ- 또는 δ-토코트리에놀이다.

본 발명에서 사용된 것으로 용어 시클로옥시게나제 억제제는 예를들어 셀레콕시브(세레브렉스(Cerebrex^R)), 로페콕시브(비옥스(Vioxx^R)), 에토리콕시브, 발데콕시브 또는 5-알킬-2-아릴아미노페닐아세트산, 예를들어 5-메틸-2-(2'-클로로-6'-플루오로아닐리노)페닐 아세트산을 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용된 것으로 용어 "히스톤 데아세틸라제 억제제"는 MS-27-275, SAHA, 파이록사미드, FR-901228 또는 발프로산을 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다.

본 발명에서 사용된 것으로 용어 "비스포스포네이트"는 에트리돈산, 클로드론산, 틸루드론산, 파미드론산, 알렌드론산, 이반드론산, 리세드론산 및 졸레드론산을 포함하나, 이들로 제한되는 것은 아니다. "에트리돈산"은 예를들어, 상품명 디드로넬(DIDRONEL™)로 판매되는 그 형태로 투여될 수 있다. "클로드론산"은 예를들어, 상품명 보네포스(BONEFOS™)로 판매되는 그 형태로 투여될 수 있다. "틸루드론산"은 예를들어, 상품명 스켈리드(SKELID™)로 판매되는 그 형태로 투여될 수 있다. "파미드론산"은 예를들어, 상품명 아레디아(AREDIA™)로 판매되는 그 형태로 투여될 수 있다. "알렌드론산"은 예를들어, 상품명 포사맥스(FOSAMAX™)로 판매되는 그 형태로 투여될 수 있다. "이반드론산"은 예를들어, 상품명 본드라나트(BONDRANAT™)로 판매되는 그 형태로 투여될 수 있다. "리세드론산"은 예를들어, 상품명 악토넬(ACTONEL™)로 판매되는 그 형태로 투여될 수 있다. "졸레드론산"은 예를들어, 상품명 조메타(ZOMETA™)로 판매되는 그 형태로 투여될 수 있다.

본 발명에서 사용된 것으로 용어 "매트릭스 메탈로프로테이나제 억제제"는 콜라겐 펩티도미메틱(peptidomimetic) 및 비-펩티도미메틱 억제제, 테트라사이클린 유도체, 예를들어 하이드록사메이트 펩티도미메틱 억제제 바티마스타트(batimastat) 및 그의 경구적으로 생체이용가능한 유사체 마리마스타트(marimastat), 프리노마스타트(prinomastat), BMS-279251, BAY 12-9566, TAA211 또는 AAJ996을 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다.

본 발명에서 사용된 것으로 용어 "mTOR 억제제"는 라파마이신(시롤리무스 (sirolimus)) 또는 그의 유도체를 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다. 라파마이신은 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus)에 의해서 생산된 공지의 마크로라이드 항생제이다. 라파마이신의 적합한 유도체는 예를들어, 하기 화학식 A의 화합물, 또는 R_2aa가 -CH₂-CH₂-OH인 경우에 그의 프로드럭, 예를들어 그의 생리적으로 가수분해 가능한 에테르를 포함한다:

<화학식 A>

상기 식에서,

R_1aa는 CH₃ 또는 C_3-6 알키닐이며,

R_2aa는 H 또는 -CH₂-CH₂-OH, 3-히드록시-2-(히드록시메틸)-2-메틸-프로파노일 또는 테트라졸릴이고,

X_aa는 =O, (H,H) 또는 (H,OH)이며,

단 X_aa가 =O이고 R_aa가 CH₃인 경우에 R_2aa는 H가 아니다.

화학식 A의 화합물은 예를들어, 본 발명에 참고로 포함된 WO 94/09010, WO 95/16691, WO 96/41807, USP 5,362,718 또는 WO 99/15530에 기술되어 있다. 이들은 이들 문헌에 기술된 바와 같이, 또는 이 문헌에 기술된 방법과 유사하게 제조될 수 있다.

바람직한 라파마이신 유도체는 32-데옥소라파마이신, 16-펜트-2-이닐옥시-32-데옥소라파마이신, 16-펜트-2-이닐옥시-32(S)-디하이드로-라파마이신, 16-펜트-2-이닐옥시-32(S)-디하이드로-40-O-(2-히드록시에틸)-라파마이신, 및 더욱 바람직하게는 40-O-(2-히드록시에틸)-라파마이신이다. 라파마이신 유도체의 추가의 예로는 예를들어, CCI779 또는 USP 5,362,718에 기술된 바와 같은 40-[3-히드록시-2-(히드록시메틸)-2-메틸프로파노에이트]-라파마이신 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염, ABT578, 또는 예를들어, WO 99/15530에 기술된 바와 같은 40-(테트라졸릴)-라파마이신, 특히 40-에피-(테트라졸릴)-라파마이신, 또는 예를들어 WO 98/02441 및 WO 01/14387에 기술된 라파로그(rapalogs), 예를들어 AP23573이 포함된다.

특허출원 또는 과학문헌이 언급되어 있는 각각의 경우에는, 화합물에 관한 내용이 본 출원에 참고로 포함된다. 유사하게, 그 문헌들에 기술된 그의 약제학적으로 허용되는 염, 상응하는 라세메이트, 부분입체이성체, 에난티오머, 토토머, 및 존재하는 경우에, 상술한 화합물의 상응하는 결정 변형체, 예를들어 용매화물, 수화물 및 다형체도 포함된다. 본 발명의 배합물에서 활성성분으로 사용된 화합물은 각각 인용된 문헌에 기술된 바와 같이 제조 및 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 범위 내에는 상술한 바와 같은 두개 이상의 별개의 활성성분의 배합물이 포함되며, 즉 본 발명의 범위 내의 약제학적 배합물은 3개의 활성성분 또는 그 이상을 포함할 수 있다. 또한, 제1 약제 및 보조약제는 둘다 동일한 성분은 아니다.

상기 규정된 바와 같은 고형종양을 치료하는데 있어서의 S1P 아고니스트, 예를들어 화학식 X의 기를 포함하는 S1P 아고니스트의 유용성은 예를들어 후술하는 방법에 따라 임상적으로 뿐만 아니라 동물시험방법에서 입증될 수 있다.

A. 시험관내

A.1. 항종양 활성

유방암으로부터 최초로 분리된 마우스 유방암 세포주, 예를들어 JygMC(A)가 사용된다. 세포수는 절차를 시작하기 전에 신선한 배지 내에서 평판배양하기 위하여 5×10⁵으로 조정한다. 세포를 FCS가 없이 2.5 mM 티미딘을 함유하는 신선한 배지에서 12시간 동안 배양한 다음에, PBS로 2회 세척하고, 이어서 10% FCS를 함유하는 신선한 배지를 첨가하고, 추가로 12시간 동안 더 배양한다. 그후에, 세포를 FCS 없이 2.5 mM 티미딘을 함유하는 신선한 배지에서 12시간 동안 배양한다. 블록(block)으로부터 세포를 유리시키기 위하여 세포를 PBS로 2회 세척하고, 10% FCS를 함유하는 신선한 배지 내에서 재평판배양한다. 동기화(synchronisation)시킨 후에, 세포를 다양한 농도의 화학식 I의 화합물의 존재 또는 부재 하에서 3, 6, 9, 12, 18 또는 24시간 동안 배양한다. 0.2% EDTA로 처리한 후에 세포를 수확하고, 빙냉 70% 에탄올 용액으로 고정시키고, 37℃에서 250 ㎍/㎖의 RNaseA (타입 1-A: Sigma Chem. Co.)에 의해서 30분 동안 가수분해시키고, 20분 동안 프로피디움 요오다이드에 의해서 10 ㎎/㎖로 염색한다. 배양기간 후에, 세포의 수는 쿨터 계수기 (Coulter counter) 내에서 세포를 세고, SRB 비색시험하는 두가지 모두에 의해서 결정한다. 이들 조건 하에서, S1P 아고니스트, 예를들어 히드로클로라이드 염 형태의 화합물 B는 10^-12 내지 10^-6 M 범위의 농도에서 종양세포의 증식을 억제한다.

A.2. S1P-매개된 HUVEC 관형성 시험

관형성 시험을 위해서 2-8 계대로부터 수득한 HUVEC가 사용되며, 수확하기 전에 결코 70% 이상 융합되지 않는다. 세포는 헤르페스 평형화 식염수 용액(클로네틱스(Clonetics)로부터의 HBSS)으로 세척한 다음에 트립신/EDTA(0.25 ㎎/㎖, 클로네틱스)로 트립신 처리함으로써 시험에 준비한다. 대략 90%의 세포를 플레이트로부터 들어 올리고, 동일 용적의 트립신 중화용액(클로네틱스로부터의 TNS)을 첨가하고, 세포를 적어도 10 ㎖의 EBM-2(클로네틱스) + 0.1% BSA(Sigma) 배지를 함유하는 원뿔형 관 내로 수집한다. 세포를 1000 rpm에서 5분 동안 원심분리하고, 상등액을 제거하고, 5 ㎖의 신선한 EBM-2 + 0.1% BSA로 대체시킨다. 세포를 혈구계를 사용하여 세고, 세포 현탁액의 용적은 500,000 세포/㎖의 농도가 되도록 조정한다. 원뿔형 관은 각각 100 nM의 시험화합물 및 10 ng/㎖의 퍼튜신 독소(PTx)를 사용하여 준비한 다음에, 각각의 튜브에 1 ㎖의 세포현탁액을 첨가한다. 그후, 관을 37℃, 5% CO₂에서 1/2시간 동안 배양한다. 이동시험은 24-웰 플레이트 내의 각각의 삽입물 대신에 피브로넥틴으로 코팅된 플루오로-블록 24-멀티웰 삽입 플레이트(8 ㎛ 공극 크기, Falcon #351147)를 사용하여 수행한다. 세포 및 시험화합물을 상술한 바와 같이 제조하고 예비-배양한 다음에 100 ㎕를 삽입 플레이트 내의 각각의 적절한 웰에 첨가한다. S1P를 함유하지 않는 300 ㎕의 EBM-2 + 2% 목탄-스트리핑된 배지를 자극이 없는 것(-)으로 표지된 웰의 바닥에 첨가하고, S1P(500 nM)를 함유하는 300 ㎕의 배지를 자극이 있는 것(+)으로 표지된 웰의 바닥에 첨가한다. 그후, 플레이트를 37℃, 5% CO₂에서 4시간 동안 배양한다.

50 ㎍/바이알의 칼세인(Calcein) AM(분자 프로브 #C3100)은 우선 20 ㎕의 DMSO를 바이알에 첨가함으로써 제조된다. 그후, 12.5 ㎖의 HBSS(플레이트 당)를 37℃로 가온하여 150 ㎕를 바이알에 첨가한다. 그후, 바이알의 내용물을 나머지 HBSS에 다시 옮겨 최종 농도 4 ㎍/㎖의 칼세인 AM을 제조한다.

플루오로-블록 플레이트(Fluoro-Blok plate)를 배양기로부터 꺼내고, 상부 삽입 플레이트를 분리하여, "가볍게 털어서(flicked)" 삽입물에 붙어있는 과잉의 배지를 제거한다. 그후, 삽입 플레이트를 4 ㎍/㎖ 칼세인 AM 500 ㎕/웰을 함유하는 새로운 24-웰 플레이트에 옮긴다. 그후, 플레이트를 37℃, 5% CO₂에서 1½시간 동안 배양한다.

배양한 후에, 플레이트를 485 ㎚의 여기 및 530 ㎚의 방사 파장의 사이토플루오르(Cytofluor) II 상에서 판독한다. 삽입물에서 플루오로-블록 코팅은 바닥으로 이동한 세포만을 계수한다. 데이타는 계산을 위해서 엑셀(Excel)로 옮기고, 시그마플롯(SigmaPlot)을 사용하여 그래프를 작성시키고, 유의성 시험(t-시험)을 위해서 시그마스태트(SigmaStat)를 사용한다 (도 7).

관형성은 4×배율에서 3개의 독립적인 시야에서의 분지점(branching point)(두개의 독립적인 코드를 연결)의 수를 계수함으로써 정량분석한다. 결과는 다음과 같이 보고된다.

이들 결과는 단독으로 혈관형성의 아고니스트로서, 따라서 놀랍게도 S1P-매개된 혈관형성의 길항제로서 작용하는 FTY720-포스페이트 또는 화합물 C-포스페이트의 독특한 능력을 입증하는 것이다. 화합물 C-포스페이트는 바람직하게는 라세메이트 또는 R-에난티오머이다. PTx가 Giα(EDG-1) 매개된 활성을 억제하는 대조군으로 사용된다.

B. 생체내

B.1. 항종양 활성

항종양 활성은 T/C% (처리된 동물의 종양 용적에서의 평균 증가를 대조동물의 종양 용적의 평균 증가로 나누고 100을 곱한 값)로 표현된다.

암세포의 분취량(1×10⁷), 예를들어 인간 A375 흑색종 세포를 BALB/c-nu/nu 마우스에 이식한다. 종양의 크기가 약 10×10 ㎜에 도달하면, 동물은 4개의 서브그룹으로 무작위적으로 지정하고, 화학식 I의 화합물에 의한 처리를 개시한다. 2주일 처리한 후에 동물을 희생시키고, 이때 종양 및 조직을 수확하여 형태학적 및 분자 분석을 준비한다. 종양의 크기는 칼리퍼스로 결정한다. 이 시험에서 S1P 아고니스트, 예를들어 화합물 B 또는 C(히드로클로라이드 염 형태)는 0.5 내지 5 ㎎/㎏의 용량으로 투여한 경우에 식염수 대조군에 대비해서 종양 성장을 지연시킨다: 예를들어, 화합물 C-HCl은 2.5 ㎎/㎏ 5×/주일의 용량으로 투여한 경우에 30%의 최종 T/C 값을 나타낸다.

B.2. VEGF-R 단백질 티로신 키나제 억제제와의 배합물

인간 MDA-MB-435 유방종양이 이식된 누드 마우스를 2주일 동안, 100 ㎎/㎏(경구) 5×/주일의 용량의 VEGF-R 단백질 티로신 키나제 억제제, 예를들어 1-(4-클로로아닐리노)-4-(4-피리딜메틸)프탈라진 숙시네이트, 2.5 ㎎/㎏(정맥내) 5×/주일의 용량의 S1P 수용체 아고니스트, 예를들어 화합물 C(히드로클로라이드 염), 또는 둘다의 배합물로 처리한다. 항종양은 상기 언급한 바와 같이 T/C%로 표현한다. 화합물 C-HCl과 1-(4-클로로아닐리노)-4-(4-피리딜메틸)프탈라진 숙시네이트의 배합물은 어느 하나의 약제 단독인 경우(화합물 C-HCl, T/C 66%; 1-(4-클로로아닐리노)-4-(4-피리딜메틸)프탈라진 숙시네이트, T/C% 91)에 비해서 더 큰 항종양 효과(T/C% 27)를 나타낸다. 우수한 항종양 반응은 또한, 누드 마우스에게 인간 A375 흑색종 세포를 이식하고 동일한 배합물을 사용하여 유사한 방식으로 처리한 경우에도 수득된다: 배합 치료는 T/C% 15를 나타내는 반면에, 각각의 약제로 단독으로 처리한 경우에는 각각 T/C% 35 및 44를 나타낸다.

B.3. 항혈관형성 활성

(i) 스핑고신-1-포스페이트(5 μM/챔버) 또는 (ii) 0.5 ㎖의 0.8% w/v 한천(헤파린 20 U/㎖를 함유) 중의 인간 VEGF(1 ㎍/챔버)를 함유하는 다공성 챔버를 마우스의 옆구리에 피하로 이식한다. S1P 또는 VEGF는 챔버의 주위에서 혈관신생된 조직의 성장을 유도한다. 이 반응은 용량-의존적이며, 조직의 중량 및 혈액 함량을 측정함으로써 정량분석될 수 있다. 마우스는 챔버를 이식하기 4-6시간 전에 시작하여 연속해서 4일 동안, 하루에 한번 (i) 화합물 A(0.3, 3, 30 또는 50 ㎎/㎏)로 경구적으로, 또는 (ii) 화합물 C의 R 에난티오머(2.5 ㎎/㎏)로 정맥내로, 또는 (iii) 화합물 C의 S 에난티오머(2.5 ㎎/㎏)로 정맥내로, 또는 (iv) 비히클(5% 글루코즈, 10 ㎖/㎏)로 경구 또는 정맥내로 처리한다. 마지막 용량을 투여한지 24시간 후에 동물을 희생시켜 혈관형성된 조직을 측정한다. 챔버 주위의 혈관형성된 조직의 중량 및 혈액 함량을 측정한다.

화합물 A로, 또는 화합물 C의 R 또는 S 에난티오머로 처리한 동물은 비히클 단독으로 처리한 동물에 비해서 혈관형성된 조직의 중량 및(또는) 혈액 함량이 감소된 것으로 나타낸다.

C. 임상실험

C.1. S1P 수용체 아고니스트, 예를들어 화학식 I, II 또는 III의 화합물, 예를들어 화합물 A, B 또는 C의 임상적 이점의 조사

표준 치료법에 대하여 내성이거나 무반응성인 진행성의 진전된 단계의 고형종양을 갖는 20명의 환자에게 용량 점증시험에 의해서 결정된 투약량으로 상기의 화합물을 투여한다. 환자의 일반적인 임상적 상태는 신체검사 및 실험실 검사에 의해서 매주 조사한다. 종양 및 전이 부담량(burden)의 변화는 방사선학적 검사에 의해서 매 2개월 마다 평가한다. 최초에 환자는 2개월 동안의 치료를 받는다. 그후에, 이들은 그들의 질병이 진행하지 않고 약물이 만족스럽게 내성이 되는 동안 치료를 유지한다.

평가를 위한 주요 변수: 안전성(부작용), 표준 혈청 생화학 및 혈액학, 전산화단층조영(CT) 스캔 또는 자기공명영상화(MRI).

C.2. 배합치료

적합한 임상시험은 예를들어, 진전된 고형종양을 갖는 환자에게서의 오픈 라벨 비-무작위 용량 점증식 시험(open label non-randomized, dose escalation study)이다. 이러한 시험은 특히, 본 발명의 배합물의 활성성분들의 상승작용을 입증한다. 증식성 질환에 대한 유익한 효과는 이들 시험의 결과를 통해서, 또는 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 공지된 시험 디자인에서의 변화에 의해서 직접적으로 결정될 수 있다. 이러한 시험은 특히, 활성성분을 사용한 단일요법 및 본 발명의 배합물의 효과를 비교하는데 적합하다. 바람직하게는, 약제 (a)의 용량은 최대내약용량(maximum tolerated dosage)에 도달할 때까지 점증시키고, 보조약제 (b)는 고정된 용량으로 투여된다. 다른 방식으로는, 약제 (a)를 고정용량으로 투여하고, 보조약제 (b)의 용량을 점증시킨다. 각각의 환자는 약제 (a)의 용량을 매일 또는 간헐적으로 투여받는다. 치료의 효능은 이러한 시험에서, 예를들어 12, 18 또는 24주일 후에 매 6주일 마다 종양의 방사선 평가에 의해서 결정될 수 있다.

대체방법으로는, 본 발명에서 언급된 배합물의 이점을 입증하기 위하여 위약-조절된 이중맹검시험이 사용될 수 있다.

S1P 수용체 아고니스트를 단독으로 사용하는 경우에 본 발명의 방법을 실시하는데 필요한 매일의 투약량은 예를들어, 사용된 화합물, 숙주, 투여 방식 및 치료할 상태의 중증도에 따라서 달라질 수 있다. 바람직한 1일 투약량 범위는 단일 용량으로 또는 분할된 용량으로 약 0.1 내지 100 ㎎이다. 환자에게 적합한 1일 용량은 0.1 내지 50 ㎎ 경구투여 정도이다. S1P 수용체 아고니스트는 어떤 통상적인 경로로도, 특히 장내로, 예를들어 정제, 캅셀제, 드링크 용액제의 형태로, 예를들어 경구로, 비내로, 폐로(흡입에 의해서), 또는 예를들어 주사용 용액 또는 현탁액의 형태로 비경구적으로 투여될 수 있다. 경구투여에 적합한 단위 투약형은 하나 또는 그 이상의 약제학적으로 허용되는 희석제 또는 담체와 함께 약 0.1 내지 30 ㎎, 통상적으로는 0.25 내지 30 ㎎의 S1P 수용체 아고니스트를 포함한다. 혈관형성을 억제하기 위해서는 충분히 높은 용량의 S1P 수용체 아고니스트를 선택하는 것이 중요한데, 이는 S1P 수용체 아고니스트의 낮은 농도는 혈관형성을 촉진시키기 때문이다. S1P 아고니스트가 환자에게 투여되는 경우에 항-혈관형성효과를 제공하는데 적합한 용량은 상기 A, B 및 C에 기술된 바와 같은 농도- 및 용량-점증 시험에 의해서 선택될 수 있다.

본 발명의 배합물은 또한, 수술 개입, 온화하게 지속되는 전신 고체온 및(또는) 방사선조사 요법과 함께 적용될 수 있다.

본 발명의 약제학적 배합물의 투여는 유익한 효과, 예를들어 신생물 형성, 전이 확산 또는 성장을 지연시키거나 억제하거나 반전시키는 것과 관련한 상승적 치료학적 효과, 또는 종양반응 또는 혈관형성 억제의 더 긴 지속기간을 나타내며; 이것은 또한 그밖의 다른 유익한 효과, 특히 항암제로서 공지된 다른 화학요법에 대하여 무반응성인 종양의 치료시에 본 발명의 배합물에서 사용된 약제학적 활성성분 중의 단지 하나를 적용하는 단일요법에 비해서, 예를들어 적은 부작용, 개선된 생활의 질, 또는 감소된 치사율 및 이환율을 나타낼 수도 있다.

본 발명의 배합물의 활성성분을 더 저용량으로 사용, 예를들어 투약량이 더 적을 필요가 있을 뿐 아니라 덜 빈번하게 적용될 수 있거나, 신생물 형성의 성장을 조절하면서 부작용의 발생을 감소시키기 위해서 사용될 수 있다는 추가의 이점이 있다. 이것은 치료할 환자의 요구 및 필요조건에 따른다.

본 발명의 한가지 구체예에 따르면, 바람직한 약제학적 배합물은 a) 화학식 I, II, III, IVa, IVb, V 또는 VI, 예를들어 화합물 A, B 또는 C, 및 b) 보조약제로서 상기 단락 (ii), (iii), (iv), (v), (vii) 또는 (xi)에 지적된 바와 같은 하나 또는 그 이상의 화합물, 예를들어 카보플라틴, 시스플라티눔, 파클리탁셀, 도세탁셀, 젬시타빈, 독소루비신, 수용체 티로신 키나제의 혈관 내피성장인자 부류(VEGFR) 또는 혈소판-유도된 성장인자-수용체(PDGFR)의 활성을 표적화하거나, 감소시키거나 억제하는 화합물, 비스포스포네이트 또는 mTOR 억제제를 함유한다.

본 발명의 추가의 구체예는 예를들어 상술한 바와 같이 림프성 또는 골수성 암의 치료시에 화학요법제 (b)와 함께 S1P 수용체 아고니스트 (a)를 사용하는데 관한 것이다. 배합물은 추가의 보조약제 b)로서 예를들어 부설판, 시타라빈, 6-티오구아닌, 플루다라빈, 히드록시우레아. 프로카바진, 블레오마이신 또는 메토트렉세이트를 함유할 수 있다. 토포이소머라제 II 억제제, 예를들어 다우노루비신, 또는 특히 PDGFR 또는 c-Abl 부류 구성원 및 그들의 유전자 융합생성물의 활성을 표적화하거나, 감소시키거나 억제하는 화합물, 예를들어 이마티니브가 예를들어, 림프 암의 치료에 사용하는데 보조약제 (b)로서 바람직하다.

본 발명에서 사용된 것으로서 용어 "병용투여" 또는 "배합투여" 등은 단일 환자에 대한 선택된 치료학적 약제의 투여를 포함하는 것을 의미하며, 약제들을 반드시 동일한 투여경로로 또는 동시에 투여할 필요는 없는 치료 처방을 포함하는 것을 의미한다.

본 발명의 한가지 목적은 증식성 악성질병에 대하여 함께 치료학적으로 효과적인 양으로 본 발명의 배합물을 포함하는 약제학적 조성물을 제공하는 것이다. 이 조성물에서 제1 약제 a) 및 보조약제 (b)는 하나의 배합된 단위 투약형으로 또는 두개의 별개의 단위 투약형으로 함께, 번갈아서 또는 별도로 투여될 수 있다. 단위 투약형은 또한 고정된 배합물일 수도 있다.

본 발명에 따르는 약제학적 조성물은 그 자체가 공지된 방식으로 제조될 수 있으며, 예를들어 상기 지적한 바와 같은 치료학적 유효량의 적어도 하나의 약물학적 활성배합물 파트너를 단독으로, 또는 특히 장내 또는 비경구 적용하는데 적합한 하나 또는 그 이상의 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와의 배합물로 포함하는 인간을 포함한 포유동물(온혈동물)에게 경구 또는 직장과 같은 장내 및 비경구 투여하는데 적합한 것이다.

적합한 약제학적 조성물은 예를들어, 약 0.1% 내지 약 99.9%, 바람직하게는 약 1% 내지 약 60%의 활성성분(들)을 함유한다. 장내 또는 비경구 투여하기 위한 배합요법을 위한 약제학적 제제는 예를들어, 당의정, 정제, 캅셀제 또는 좌제, 또는 앰플제와 같은 단위 투약형의 제제이다. 달리 언급되지 않는 한, 이들은 그 자체가 공지된 방식으로, 예를들어 통상적인 혼합, 과립화, 당-코팅, 용해 또는 동결건조 방법을 이용하여 제조된다. 각각의 투약형의 개개 용량에 함유된 배합 파트너의 단위 함량은 그 자체로 유효량을 구성할 필요는 없는 것으로 이해될 수 있는데, 이는 필요한 유효량은 다수의 투약단위의 투여에 의해서 수득될 수 있기 때문이다.

특히, 본 발명의 배합물의 배합 파트너 각각의 치료학적 유효량은 동시에 또는 순차적으로, 및 어떤 순서로도 투여될 수 있으며, 성분들은 별도로 또는 고정된 배합물로 투여될 수도 있다. 예를들어, 본 발명에 따르는 증식성 악성질병의 진행을 지연시키거나 치료하는 방법은 동시에 또는 어떤 순서로든 순차적으로, 함께 치료학적 유효량으로, 바람직하게는 상승적 유효량으로, 예를들어 본 발명에 기술된 양에 상응하는 투약량을 매일 또는 간헐적으로, (i) 유리형태 또는 약제학적으로 허용되는 염 형태의 제1 약제 a)를 투여하고, (ii) 유리형태 또는 약제학적으로 허용되는 염 형태의 보조약제 b)를 투여하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명의 배합물의 개개 배합 파트너는 치료의 과정 중에 상이한 시점에 별도로, 또는 분할 또는 단일 배합물 형태로 동시에 투여될 수 있다. 또한, 용어 투여는 생체내에서 배합 파트너 그 자체로 전환하는 배합 파트너의 프로드럭을 사용하는 것을 또한 포함한다. 따라서, 본 발명은 이러한 동시 또는 교호적 치료의 모든 처방을 포함하는 것으로 이해되며, 용어 "투여"도 상응하게 이해된다.

본 발명의 배합물에서 사용된 배합 파트너 각각의 유효 투약량은 사용된 특정의 화합물 또는 약제학적 조성물, 투여의 방식, 치료할 상태, 치료할 상태의 중증도에 따라서 달라질 수 있다. 따라서, 본 발명의 배합물의 투약 처방은 투여의 경로 및 환자의 신장 및 간 기능을 포함하는 다수의 인자에 따라서 선택된다. 통상적으로 숙련된 의사, 임상의 또는 수의사는 상태의 진행을 방지하거나, 그에 대해 반작용을 하거나, 또는 억제하는데 필요한 단일 활성성분의 유효량을 용이하게 결정하여 처방할 수 있다. 독성이 없이 효능을 수득하는 범위 내의 활성성분의 농도를 수득하는데 최적의 정밀성은 표적부위에 대한 활성성분의 이용율의 동력학을 기초로 한 처방을 필요로 한다.

제1 약제 또는 성분 (a)에 대한 1일 투약량은 물론 다양한 인자, 예를들어 선택된 화합물, 치료할 특정의 상태 및 목적하는 효과에 따라 달라질 수 있다. 그러나, 일반적으로 S1P 수용체 아고니스트, 예를들어 화합물 A, B 또는 C를 단일 용량 또는 분할 용량으로서 약 0.1 내지 100 ㎎의 수준의 1일 투약량 비율로 투여함으로써 만족스러운 결과를 수득한다. S1P 수용체 아고니스트는 어떤 통상적인 경로로도, 특히 장내에, 예를들어 정제, 캅셀제, 드링크 용액제의 형태로, 예를들어 경구로, 또는 예를들어 주사용 용액 또는 현탁액의 형태로 비경구적으로 투여될 수 있다. 경구투여에 적합한 단위 투약형은 하나 또는 그 이상의 약제학적으로 허용되는 희석제 또는 담체와 함께 약 0.1 내지 30 ㎎, 예를들어 0.1 내지 25 ㎎의 성분 (a)를 포함한다.

파드로졸은 인간에게 약 0.5 내지 약 10 ㎎/일, 바람직하게는 약 1 내지 약 2.5 ㎎/일의 용량 범위로 경구적으로 투여될 수 있다. 익세메스탄은 인간에게 약 5 내지 약 200 ㎎/일, 바람직하게는 약 10 내지 약 25 ㎎/일의 용량 범위로 경구적으로, 또는 약 50 내지 500 ㎎/일, 바람직하게는 약 100 내지 약 250 ㎎/일의 용량으로 비경구적으로 투여될 수 있다. 약물이 별개의 약제학적 조성물로 투여되어야 한다면, 이것은 GB 2,177,700에 기술된 형태로 투여될 수 있다. 포르메스탄은 인간에게 약 100 내지 500 ㎎/일, 바람직하게는 약 250 내지 약 300 ㎎/일의 용량 범위로 비경구적으로 투여될 수 있다. 아나스트로졸은 인간에게 약 0.25 내지 20 ㎎/일, 바람직하게는 약 0.5 내지 약 2.5 ㎎/일의 용량 범위로 경구적으로 투여될 수 있다. 아미노글루테미드는 인간에게 약 200 내지 500 ㎎/일의 용량 범위로 투여될 수 있다.

타목시펜 시트레이트는 인간에게 약 10 내지 40 ㎎/일의 용량 범위로 투여될 수 있다.

빈블라스틴은 인간에게 약 1.5 내지 10 ㎎/㎡일의 용량 범위로 투여될 수 있다. 빈크리스틴 설페이트는 인간에게 약 0.025 내지 0.05 ㎎/㎏ 체중ㆍ주일의 용량 범위로 비경구적으로 투여될 수 있다. 빈오렐빈은 인간에게 약 10 내지 50 ㎎/㎡일의 용량 범위로 투여될 수 있다.

에토포사이드 포스페이트는 인간에게 약 25 내지 115 ㎎/㎡일, 예를들어 56.8 또는 113.6 ㎎/㎡일의 용량 범위로 투여될 수 있다.

테니포사이드는 대략 매 2주일 마다 약 75 내지 150 ㎎의 용량 범위로 인간에게 투여될 수 있다. 독소루비신은 인간에게 약 10 내지 100 ㎎/㎡일, 예를들어 25 또는 50 ㎎/㎡일의 용량 범위로 투여될 수 있다. 에피루비신은 인간에게 약 10 내지 200 ㎎/㎡일의 용량 범위로 투여될 수 있다. 이다루비신은 인간에게 약 0.5 내지 50 ㎎/㎡일의 용량 범위로 투여될 수 있다. 미톡산트론은 인간에게 약 2.5 내지 25 ㎎/㎡일의 용량 범위로 투여될 수 있다.

파클리탁셀은 인간에게 약 50 내지 300 ㎎/㎡일의 용량 범위로 투여될 수 있다. 도세탁셀은 인간에게 약 25 내지 100 ㎎/㎡일의 용량 범위로 투여될 수 있다.

시클로포스파마이드는 인간에게 약 50 내지 1500 ㎎/㎡일의 용량 범위로 투여될 수 있다. 멜파란은 인간에게 약 0.5 내지 10 ㎎/㎡일의 용량 범위로 투여될 수 있다.

5-플루오로우라실은 인간에게 약 50 내지 1000 ㎎/㎡일, 예를들어 500 ㎎/㎡일의 용량 범위로 투여될 수 있다. 카페시타빈은 인간에게 약 10 내지 1000 ㎎/㎡일의 용량 범위로 투여될 수 있다. 젬시타빈 히드로클로라이드는 인간에게 약 1000 ㎎/㎡/주일의 용량 범위로 투여될 수 있다. 메토트렉세이트는 인간에게 약 5 내지 500 ㎎/㎡일의 용량 범위로 투여될 수 있다.

토포테칸은 인간에게 약 1 내지 5 ㎎/㎡일의 용량 범위로 투여될 수 있다. 이리노테칸은 인간에게 약 50 내지 350 ㎎/㎡일의 용량 범위로 투여될 수 있다.

카보플라틴은 인간에게 대략 매 4주일 마다 약 200 내지 400 ㎎/㎡의 용량 범위로 투여될 수 있다. 시스플라틴은 인간에게 대략 매 3주일 마다 약 25 내지 75 ㎎/㎡의 용량 범위로 투여될 수 있다. 옥살리플라틴은 인간에게 매 2주일 마다 약 50 내지 85 ㎎/㎡의 용량 범위로 투여될 수 있다.

이마티니브는 인간에게 약 2.5 내지 850 ㎎/일, 더욱 바람직하게는 5 내지 600 ㎎/일, 가장 바람직하게는 20 내지 300 ㎎/일의 용량 범위로 투여될 수 있다.

알렌드론산은 인간에게 약 5 내지 10 ㎎/일의 용량 범위로 투여될 수 있다. 클론드론산은 인간에게, 예를들어 약 750 내지 1500 ㎎/일의 용량 범위로 투여될 수 있다. 에트리돈산은 인간에게 약 200 내지 400 ㎎/일의 용량 범위로 투여될 수 있다. 이반드론산은 인간에게 매 3 내지 4주일 마다 약 1 내지 4 ㎎의 용량 범위로 투여될 수 있다.

리세드론산은 인간에게 약 20 내지 30 ㎎/일의 용량 범위로 투여될 수 있다. 파미드론산은 인간에게 매 3 내지 4주일 마다 약 15 내지 90 ㎎의 용량 범위로 투여될 수 있다. 틸루드론산은 인간에게 약 200 내지 400 ㎎/일의 용량 범위로 투여될 수 있다.

트라스투주마브는 인간에게 약 1 내지 4 ㎎/㎡/주일의 용량 범위로 투여될 수 있다.

비칼루타미드는 인간에게 약 25 내지 50 ㎎/㎡일의 용량 범위로 투여될 수 있다.

1-(4-클로로아닐리노)-4-(4-피리딜메틸)프탈라진 또는 그의 염, 예를들어 숙시네이트는 인간에게 약 50 내지 1500, 더욱 바람직하게는 약 100 내지 750, 가장 바람직하게는 250 내지 500 ㎎/일의 용량 범위로 투여될 수 있다.

라파마이신 또는 그의 유도체, 예를들어 40-O-(2-히드록시에틸)-라파마이신은 약 0.1 내지 25 ㎎의 용량 범위로 투여될 수 있다.

제제 실시예: 연질 캅셀제

화학식 I의 화합물, 예를들어 화합물 A, HCl 30 ㎎

폴리에틸렌 글리콜 300 300 ㎎

폴리소르베이트 80 20 ㎎

총합 350 ㎎

S1P 수용체 아고니스트, 예를들어 화학식 X의 기를 포함하는 S1P 수용체 아고니스트는 본 발명에 따라서 사용하는데 필요한 투약량에서 잘 받아들여 진다. 예를들어, 화합물 A에 대한 급성 LD₅₀은 랫트 및 원숭이에게서 10 ㎎/㎏ (경구) 초과이다.

추가의 관점에서, 본 발명은 프로-혈관형성 약물로서의 S1P 아고니스트의 용도에 관한 것이다. 신생혈관형성의 유도는 최근에, 다수의 상태 (예를들어, 심근 혈관형성, 창상 치유 또는 당뇨병성 혈관기능부전/맥관병)에서 탁월한 표적으로 인식되었다.

상술한 바와 같이, 고농도의 S1P 수용체 아고니스트(2 μM 또는 그 이상, 예를들어 2-5 μM 또는 대략 5 μM)는 항-혈관형성 효과를 나타내며, S1P 수용체 아고니스트는 VEGF-유도된 혈관형성을 억제할 수 있다. 반대로, 저농도(0.1-1 μM, 예를들어 0.1-0.5 μM 또는 0.5-1 μM)의 S1P 아고니스트는 혈관형성에 대한 증진효과를 가지며, VEGF-매개된 혈관형성을 강화시킬 수 있다. 따라서, S1P 아고니스트는 혈관형성에 있어서 이상성(biphasic) 효과를 가질 수 있다.

따라서, 본 발명은 또한 추가로 다음을 제공한다:

8. 예를들어, 혈관형성의 촉진이 지시되는 적응증에서 신생혈관형성 과정의 유도시에, 예를들어 프로-혈관형성제로서의 S1P 아고니스트, 예를들어 화학식 X의 기를 포함하는 S1P 아고니스트, 예를들어 화합물 A 또는 화합물 A-포스페이트의 용도;

9. 활성성분으로서 S1P 수용체 아고니스트, 예를들어 화학식 X의 기를 포함하는 S1P 아고니스트, 예를들어 화합물 A 또는 화합물 A-포스페이트를 포함하며, 예를들어, 혈관형성의 촉진이 지시되는 적응증에서, 예를들어 창상 치유시에 또는 심근경색 또는 당뇨병성 혈관기능부전/맥관병의 치료시에 신생혈관형성 과정의 억제에 의해서 매개된, 예를들어 항-혈관형성 인자에 의해서 매개된 질병을 치료 또는 예방하기 위한 의약을 제조하는 방법.

10. 유효량의 S1P 수용체 아고니스트, 예를들어 화학식 X의 기를 포함하는 S1P 아고니스트, 예를들어 화합물 A 또는 화합물 A-포스페이트를 치료가 필요한 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 예를들어, 혈관형성의 촉진이 지시되는 적응증에서, 예를들어 창상 치유시에 또는 심근경색 또는 당뇨병성 혈관기능부전/맥관병의 치료시에 신생혈관형성 과정의 억제에 의해서 매개된, 예를들어 항-혈관형성 인자에 의해서 매개된 질병을 치료 또는 예방하는 방법.

혈관형성을 촉진시키는데 적합한 S1P 아고니스트에는 암의 치료와 관련하여 상기에서 정의된 것, 예를들어 화학식 X의 기를 포함하는 S1P 아고니스트 또는 화학식 I 내지 IX에 따르는 화합물, 또는 이들의 약제학적으로 허용되는 염 또는 에스테르가 포함된다. 바람직하게는 S1P 아고니스트는 화합물 A-포스페이트이다. S1P 아고니스트는 단독으로, 또는 혈관형성을 촉진시키는 하나 또는 그 이상의 추가의 약제, 예를들어 VEGF와의 배합물로 사용될 수 있다.

혈관형성을 촉진시키기 위하여는 충분히 저용량의 S1P 수용체 아고니스트를 선택하는 것이 중요한데, 이는 고농도의 S1P 수용체 아고니스트는 혈관형성을 억제하기 때문이다. S1P 아고니스트가 환자에게 투여되는 경우에 프로-혈관형성 효과를 제공하는데 적합한 용량은 상기의 A, B 및 C에 기술된 바와 같은 농도- 및 용량-증점 시험에 의해서 선택될 수 있다.

도 1은 화합물 A-포스페이트가 대략 0.5 μM에서 최대 활성을 나타내는 벨 (bell)-형상의 용량-의존적 방식으로 모세관-유사 네트워크 형성을 크게 촉진시키는 것을 나타낸다.
도 2는 화합물 A-포스페이트 및 화합물 A 둘다는 0.5-1 μM에서 VEGF-매개된 리모델링(remodelling)을 약화시키지 않고 오히려 폴리펩타이드 성장 인자와 협력작용하는 것을 나타낸다.
도 3은 S1P-자극된 관형성 뿐만 아니라 화합물 A-포스페이트가 α_i/o-타입의 헤테로트리머릭 G 단백질의 억제제인 퍼튜시스 독소(PTX, 50 ng/㎖)에 의해서 실질적으로 완전하게 억제되는 것을 나타낸다. 이것은 화합물 A-포스페이트-자극된 생체반응에서 EDG-1(S1P₁) 수용체-매개된 시그날화 현상의 가능한 연루로 해석될 수 있다.
도 4는 그 자체가 S1P 보다 덜 강력한 것으로 보이는 스핑고신이 1 μM에서 VEGF-유도된 관형성에 대한 억제효과를 갖지 않으면서 모세관-유사 구조를 유도하는 S1P 및 화합물 A-포스페이트 둘다의 능력을 약화시키는 것을 나타낸다. 이와 관련하여, 스핑코신은 화합물 A와는 상이하게 거동한다. 데이타는 스핑고신과 S1P 사이의 균형이 가장 가능하게는 EDG 수용체 부류를 통해서 내피세포 활성화/혈관형성에 대하여 결정적으로 중요한 것으로 보임을 시사한다. 중요하게는, 고농도의 스핑고신 및 화합물 A(2-5 μM)는 VEGF-유발된 관형성을 억제한다.
도 5는 0.5 μM에서 화합물 A-포스페이트에 의한 HUVEC의 처리는 10분에 포스포릴화/활성화의 피크를 가지고, 20분까지 기준선으로 복귀하는 ERK1/2의 일시적 활성화를 나타낼 수 있음을 보여준다.
도 6은 화합물 A, 화합물 A-포스페이트, 스핑고신 또는 S1P도 또한 HUVEC 상에서 조직 인자를 유도하는지 여부를 시험한 결과이다. 수득된 데이타는 도 6에 나타낸 바와 같이 이들 화합물 중의 어떤 것도 단독으로 또는 배합물로 조직인자 활성을 상승시킬 수 없음을 입증한다. 화합물 A 및 화합물 A-포스페이트는 VEGF-유도된 조직인자는 약간 상승시킬 수 있지만 TNF-α-유도된 조직활성은 상승시킬 수 없다.
도 7은 S1P-매개된 HUVEC 관형성 시험에서 화합물 C의 효과를 나타낸 것이다.

이하의 약어가 사용된다:

BSA: 소혈청알부민

ECGS: 내피세포 성장인자 셋트

ECL: 증진된 화학발광

S: 스핑고신

PBS: 포스페이트-완충된 식염수

JNK1/2: c-jun-N-말단 키나제1/2

RT: 실온

TF 당량: 조직인자 당량

EGR-1/NFAT: 조기 성장반응 단백질 1/활성화된 T-세포의 핵인자

F1P: 화합물 A-포스페이트 (FTY720-포스페이트)

혈관형성의 촉진에서 S1P 수용체 아고니스트, 예를들어 화학식 X의 기를 포함하는 S1P 아고니스트의 유용성은 예를들어, 이하에 기술하는 방법에 따라서 입증될 수 있다.

D. 세포배양 및 물질

인간 제대정맥 내피세포(HUVEC)를 20% SCS(HyClone, Logan, UT), 1 U/㎖ 헤파린, 50 ㎍/㎖ ECGS, 2 mM 글루타민, 100 U/㎖ 페니실린 및 0.1 ㎎/㎖ 스트렙토마이신이 보충된 배지 M199 내에서 37℃ 및 5% CO₂ 하에 배양한다. 계대수 5까지의 세포가 실험을 위해서 사용된다. 단기-절식시킨 HUVEC는 5시간 동안 1% SCS-함유 M199로 절식시킴으로써 수득된다. 재조합 인간 VEGF₁₆₅는 프로모셀(PromoCell, Heidelberg, Germany)로부터 수득된다. 포스포-특이적 ERK1/2, p38 키나제 폴리클로날 항체, 비포스포 ERK1/2 항체 및 LumiGLO 화학발광 시약은 뉴잉글랜드 바이오랩(New England Biolabs, Beverly, MA)으로부터 수득하고, 폴리클로날 IκB 항체는 산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Calif.)로부터 수득한다. 퍼옥시다제-컨쥬게이트된 당나귀 항-토끼 면역글로부린 G(IgG) 및 양 항-마우스 IgG는 아머샴 라이프 사이언스(Amersham LIFE SCIENCE, Amersham Place, England)로부터 구입한다. 임모빌론-P 전이막은 밀리포어(Millipore, Bedford, MA)의 제품이다. S는 시그마 케미칼 코포레이션(Sigma Chemical Co.)으로부터 수득하고; S1P는 바이오몰(Biomol)로부터 수득한다. 화합물 A-포스페이트 원액은 이하의 프로토콜에 의해서 제조된다. 화합물 A-포스페이트를 진한 HCl을 미량 함유하는 메탄올(2 ㎕의 HCl을 함유하는 500 ㎕의 메탄올 중에 0.5 ㎎의 화합물 A-포스페이트)에 용해시킨다. 생성된 용액으로부터 용매는 진공 하에서 증발시키고, 수득된 잔류물은 (방법 1) 멸균 탈이온수 중의 0.1% 탈지된 BSA 용액(500 ㎕)에, 또는 (방법 2) 탈이온수 중의 0.5% 트리톤 X-100에 재용해시킨다. 생성된 원액(2.5 mM)은 초음파처리하고, 4℃에서 저장한다.

응괴시험 (clotting assay)

세포를 80-90% 컨플루언시(confluency)로 6-웰 플레이트에 접종하고, 밤새 성장시킨다. 세포를 플레이트로부터 긁어 모으고, 문헌(Clauss, M., J. Biol. Chem. 271, 17629-17634 (1996), Mechtcheriakova, D., Blood 93, 3811-3823 (1999))에 기술된 방법에 따라 조직인자 활성에 대하여 분석한다. 간략하면, VEGF(1.5 nM), TNF-α(100 U/㎖), S(0.5-2 μM), S1P(0.5-2 μM), 화합물 A(0.5-2 μM) 및 화합물 A-포스페이트(0.5-2 μM)로 4시간 동안 유도한 후에 세포를 2회 세척한 다음, 1 ㎖ 응괴 완충액(12 mM 나트륨 아세테이트, 7 mM 디에틸바르비테이트 및 130 mM 나트륨 클로라이드; pH 7.4) 내로 긁어서 모은다. 50 ㎕의 재현탁된 세포를 50 ㎕의 시트레이트화 혈장과 혼합시키고, 37℃에서 50 ㎕의 20 mM CaCl₂ 용액으로 재석회화(recalcification)한 후에 응괴시간을 결정한다. TF-당량은 토끼 뇌 트롬보플라스틴으로부터 수득된 표준곡선을 사용하여 결정된다.

E. 웨스턴 블럿 분석 (Western Blot Analysis)

다양한 처리를 한 후에, 세포를 냉 PBS로 2회 세척하고, 100 ㎕의 램리 완충액(Laemmli buffer)에 용해시키고, 긁어 모아서 95℃에서 5분 동안 가열한다. 총 세포용해물을 SDS-PAGE에 의해서 분리하고, 이모빌론(Immobilon)-P 막에 옮긴다. 막을 0.1% 트윈-20 및 3% 탈지유를 함유하는 PBS로 30분 동안 차단시키고, 차단완충액 내에 희석된 일차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 배양한다. 수득된 막을 0.1% 트윈-20을 함유하는 PBS로 5분 동안 3회 세척하고, 실온에서 1시간 동안 퍼옥시다제-컨쥬게이트된 이차 항체와 함께 배양한다. 세척단계 후에, 막을 ECL 시약과 함께 1분 동안 배양하고, 필요한 바에 따라 필름에 노출시킨다. 또 다른 항체로 재프로브화시키기 위해서 막을 PBS 중에서 2회 세척하고, 스트리핑 완충액 (62.5 mM 트리스-HCl, pH 6.8, 2% SDS, 100 mM 2-머캅토에탄올)으로 55℃에서 30분 동안 스트리핑하고, 실온에서 PBS로 5분 동안 3회 세척한다. 막은 각각의 면역검출 후에 4 ℃에서 사란랩(SaranWrap)으로 습윤 포장하여 저장한다.

마트리겔 상에서의 시험관내 혈관형성시험

성장인자 감소된 마트리겔(Matrigel) 매트릭스(BD Bioscience) 상에서 내피세포의 모세관-유사 구조물로의 형태발생은 제조절차에 따라서 수행된다. 간략하면, HUVEC를 트립신 처리하고, 대두 트립신 억제제(1 ㎎/㎖, Sigma)를 함유하는 혈청-비함유 M199 배지 내에 재현탁시킨다. 원심분리한 후에 세포를 혈청-비함유 배지 내에 0.5×10⁵ 세포/㎖의 밀도로 재현탁시키고, 세포 현탁액을 다양한 자극물, 즉 1.5 nM의 VEGF, 0.1-2 μM의 S1P, 0.5-2 μM의 S, 0.5-2 μM의 화합물 A, 및 0.1-2 μM의 화합물 A-포스페이트의 부재 또는 존재하에서 50 ㎕의 마트리겔로 예비코팅한 96-웰 세포배양 플레이트(Costar, Corning Incorporated) 내에 접종한다. 8시간 후에, 마트리겔 상의 세포를 PBS 중의 3% 포름알데히드로 고정시키고, 4℃에서 저장한다. 결과는 이중으로 수행된 각각의 웰로부터 두개의 현미경 시야 상의 분지점을 직접 계수함으로써 냉각된 CCD 카메라가 장치된 니콘 디아포트 현미경 (Nikon Diaphot microscope; Kappa GmbH, Gleichen, Germany)을 사용하여 만들어진 이미지로부터 정량화시킨다.

F. 화합물 A-포스페이트는 마트리겔 상에서의 시험관내 관형성 시험에서 내피세포의 형태발생 및 G_i-매개된 시그날링 경로의 가능한 연루를 유도한다.

내피세포의 형태발생적 분화에 대한 화합물 A 및 화합물 A-포스페이트의 효과는 마트리겔 상에서의 시험관내 혈관형성 시험을 사용하여 측정된다. 내피세포 형태발생은 세포-세포외 매트릭스 상호작용에 이어서 매트릭스 리모델링, 자극된 이동, 세포-세포 상호작용, 및 혈관주위 단백분해를 필요로 하는 복잡한 과정이다. 도 1에서 보는 바와 같이, 화합물 A-포스페이트는 대략 0.5 μM에서 최대 활성을 나타내는 벨-형상의 용량-의존적 방식으로 모세관-유사 네트워크 형성을 촉진시킬 수 있다. 자극의 유동효능을 반영하는 현미경 시야 당, 분지점의 수는 화합물 A-포스페이트 및 S1P에 대해서 동등하며, VEGF-유발된 효과를 유의적으로 초과할 수 있다. 0.5-1 μM에서 화합물 A 그 자체는 화합물 A-포스페이트에 비해서 약하지만 일관된 증진효과를 갖는다. 화합물 A-포스페이트 및 화합물 A는 둘다 0.5-1 μM에서 VEGF-매개된 리모델링을 약화시키지 않으며, 오히려 폴리펩타이드 성장인자와 협력작용을 한다 (참조, 도 2). 또한, S1P-자극된 관형성 뿐만 아니라 화합물 A-포스페이트는 α_i/o-타입의 헤테로트리머릭 G 단백질의 억제제인 퍼튜시스 독소 (PTX, 50 ng/㎖)에 의해서 완전하게 억제된다. 이것은 화합물 A-포스페이트-자극된 생체반응에서 EDG-1 (S1P₁) 수용체-매개된 시그날링 현상의 가능한 연루로 해석될 수 있다 (참조, 도 3). 그 자체가 S1P 보다 덜 강력한 것으로 보이는 S는 1 μM에서 VEGF-유도된 관형성에 대한 억제효과를 갖지 않으면서 모세관-유사 구조를 유도하는 S1P 및 화합물 A-포스페이트 둘다의 능력을 약화시킨다 (참조, 도 4). 이와 관련하여, S는 화합물 A와는 상이하게 거동한다. 데이타는 S와 S1P 사이의 균형이 가장 가능하게는 EDG 수용체 부류를 통해서 내피세포 활성화/혈관형성에 대하여 결정적으로 중요한 것으로 보임을 시사한다. 중요하게는, 고농도의 S 및 화합물 A(2-5 μM)는 VEGF-유발된 관형성을 억제한다. 이 데이타는 시험관내에서 혈관형성에 대한 화합물 A 및 화합물 A-포스페이트의 이상성 용량-의존적 효과를 시사한다.

G. 화합물 A-포스페이트에 의한 ERK1/2 MAP 키나제의 활성화

MAP 키나제를 통한 시그날 트랜스덕션은 다양한 내피세포 기능에서 중요한 역할을 한다. 0.5 μM의 화합물 A-포스페이트에 의한 HUVEC의 처리는 10분에 포스포릴화/활성화의 피크를 가지고, 20분까지 기준선으로 복귀하는 ERK1/2의 일시적 활성화를 야기시킬 수 있다 (참조예, 도 5). 화합물 A-포스페이트에 의한 p38 키나제 및 JNK1/2의 활성화는 HUVEC에서 검출할 수 없다. 또한, 화합물 A-포스페이트는 2 μM에서 더 강력한 할성을 나타내면서 용량-의존적 방식으로 ERK1/2 활성화를 유발시킬 수 있다. 이것은 2 μM의 화합물 A-포스페이트가 0.5 μM 보다 덜 강력할 수 있는 관형성 시험으로부터의 결과에 대비되는 것이다. 화합물 A도 S도 5분 내지 60분 처리 범위의 동력학에서 내피세포에서 MAP 키나제 활성을 유도할 수 없다. 내피세포의 화합물 A-포스페이트-자극된 생체반응에서 염증성/NFκB-의존성 프로그램의 가능한 역할을 추정하기 위해서 막을 안티-IκB 항체로 재프로브 처리한다. IκB 레벨은 화합물 A-포스페이트 처리에 의해서 영향을 받지 않는다. 또한, 화합물 A-포스페이트에 의한 내피세포의 처리는 NFκB-의존성 이차 반응성 유전자로서 E-셀렉틴 발현을 유도할 수 없다. 따라서, 이 데이타는 화합물 A-포스페이트 시그날링은 내피세포에서의 급성 염증성 반응에서 주된 다단계인 NFκB 활성화를 연루시키지 않음을 강력하게 시사한다.

H. 화합물 A 및 화합물 A-포스페이트는 내피세포 상에서 조직인자 발현을 유도하지 않는다.

고전적인 염증성 자극 TNF-α 및 내피세포 상의 주된 혈관형성 성장인자 VEGF 둘다의 중요한 특징적 특색은 조직인자를 상향조절하는 그들의 효능이다. 화합물 A, 화합물 A-포스페이트, S 또는 S1P는 이들이 또한 HUVEC 상에서 조직 인자를 유도하는지 여부를 시험한다. 데이타는 이들 화합물 중의 어떤 것도 단독으로 또는 배합물로 조직인자 활성을 상승시킬 수 없음을 입증한다 (참조예, 도 6). 화합물 A 및 화합물 A-포스페이트는 VEGF-유도된 조직인자는 약간 상승시킬 수 있지만 TNF-α-유도된 조직인자는 상승시킬 수 없다. 수득된 데이타는 함께 화합물 A, 화합물 A-포스페이트, S 및 S1P가 혈관형성 VEGF 및 염증성 TNF-α에 대하여 기전적으로 명백하게 작용함을 시사한다.

I. 개별적인 인간 S1P 수용체에 대한 S1P 수용체 아고니스트의 결합 친화성은 이하의 시험에서 측정될 수 있다:

HEK293 세포 내로 인간 S1P 수용체의 일시적인 형질감염

EDG 수용체 및 G_i 단백질을 클론화하고, 등량의 EDG 수용체에 대한 4개의 cDNAs, G_i-α, G_i-β 및 G_i-γ를 혼합시키고, 칼슘 포스페이트 침전방법(M. Wigler et al., Cell. 1977;11;223 및 DS. Im et al., Mol. Pharmacol. 2000;57;753)을 사용하여 HEK293 세포의 단일층을 형질감염시키는데 사용한다. 간략하면, 25 ㎍의 DNA 및 0.25 M CaCl을 함유하는 DNA 혼합물을 HEPES-완충된 2 mM Na₂HPO₄에 첨가한다. HEK293 세포의 합류하 단일층을 25 mM 클로로퀸으로 독물처리한 후에, DNA 침전물을 세포에 적용한다. 4시간 후에, 단일층을 포스페이트-완충된 식염수로 세척하고, 배지 (90% 1:1 둘베코 변형 필수배지 (DMEM):F-12 + 10% 우태아혈청)를 재공급한다. DNA를 첨가한 지 48-72시간 후에 세포를 얼음 상에서 10% 수크로즈를 함유하는 HME 완충액(20 mM HEPES, 5 mM MgCl₂, 1 mM EDTA, pH 7.4) 중에서 긁어 모음으로써 수확하고, 다운스 균질화기(Dounce homogenizer)를 사용하여 파괴시킨다. 800×g에서 원심분리한 후에 상청액을 수크로즈를 함유하지 않는 HME로 희석하고, 100,000×g에서 1시간 동안 원심분리한다. 생성된 펠릿을 재균질화시키고, 100,000×g에서 추가로 1시간 동안 더 원심분리한다. 이러한 조질 막 펠릿을 수크로즈를 함유하는 HME에 재현탁시키고, 분취하여 액체 질소 내에 액침시킴으로써 즉시(snap)-동결시킨다. 막은 70℃에서 저장한다. 단백질 농도는 브래드포드 (Bradford) 단백질 시험에 의해서 분광학적으로 측정한다.

S1P 수용체/HEK293 막 제제를 사용하는 GTPγS 결합시험

GTPγS 결합실험은 문헌(DS. Im et al., Mol. Pharmacol. 2000;57;753)에 기술된 바와 같이 수행된다. G-단백질에 대한 리간드-매개된 GTPγS 결합은 일시적으로 형질감염된 HEK293 세포로부터의 25 ㎍의 막제제를 사용하여 GTP 결합 완충액(50 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, pH 7.5) 내에서 측정한다. 리간드를 10 μM GDP 및 0.1 nM [³⁵S]GTPγS (1200 Ci/mmol)의 존재하에서 막에 첨가하고, 30℃에서 30분 동안 배양한다. 결합된 GTPγS는 브랜들 수거기(Brandel harvester; Gaithersburg, MD)를 사용하여 결합되지 않은 것으로부터 분리하고, 액체섬광계수기를 사용하여 계수한다.

Claims (4)

1. 유리 형태 또는 약제학적으로 허용되는 염 형태의 2-아미노-2-[2-(4-옥틸페닐)에틸]프로판-1,3-디올, 2-아미노-4-(4-헵틸옥시페닐)-2-메틸부탄올, 및 유리 형태 또는 약제학적으로 허용되는 염 형태의 하기 화학식 IX의 화합물로부터 선택되는 S1P 수용체 아고니스트, 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체 물질을 포함하는, 고형 종양의 성장을 억제하기 위한 약제학적 조성물:
   <화학식 IX>
   

   

   
   상기 식에서,
   R_1f는 비치환되거나 또는 할로겐, 트리플루오로메틸, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콕시 또는 탄소수 1 내지 7의 저급 알킬로 치환된 벤질옥시이고,
   R_2f는 수소, 할로겐, 트리할로메틸, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콕시, 탄소수 1 내지 7의 저급 알킬, 펜에틸 또는 벤질옥시이고,
   R_3f는 수소, 할로겐, 트리플루오로메틸, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콕시, 히드록시, 벤질옥시, 탄소수 1 내지 7의 저급 알킬, 페닐, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콕시메틸 또는 탄소수 1 내지 4의 저급 알킬티오이고,
   X_f는 O 또는 S이고,
   n_f는 1이되,
   단, 상기 S1P 수용체 아고니스트가 2-아미노-2-[2-(4-옥틸페닐)에틸]프로판-1,3-디올 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염인 경우, 상기 종양은 유방 종양, 전립선 종양, 방광 종양, 신장 종양 또는 폐 종양이 아니다.
2. 제1항에 있어서, 간헐적 투여를 위한 것인 약제학적 조성물.
3. 제1항에 있어서, S1P 수용체 아고니스트가 유리 형태 또는 약제학적으로 허용되는 염 형태의 2-아미노-2-[2-(4-옥틸페닐)에틸]프로판-1,3-디올인 약제학적 조성물.
4. 제1항에 있어서, S1P 수용체 아고니스트가 2-아미노-2-[2-(4-옥틸페닐)에틸]프로판-1,3-디올 히드로클로라이드인 약제학적 조성물.
   

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