TARIFNAME BIYOBELIRTEÇ TESPITINDE KULLANILAN BIR CIHAZ ELDE ETME YÖNTEMI Teknik Alan Bulus, biyobelirteçlerin tespit ve tayininin Iloresansla güçlendirilmis ve yüzeye uzakligi belirlenmis metamalzeme-tabanli plazmonik sensörler ile yapilmasini saglayan tasinabilir bir ölçüm cihazi elde etme yöntemi ile ilgilidir. Önceki Teknik Metamalzemeler dogal olarak bulunmayan, rasyonel olarak tasarlanmis yapilardir. Bu malzemeler uzaysal olarak düzenlenmis meta-atomlar tarafindan isigi manipüle eden alt dalga boyu kalinliklarindaki ince plazmonik veya dielektrik malzeme katmanlari içeren nanoyapili ara-yüzlerdir. Bu meta-atomlar, faz, genlik ve polarizasyon gibi isik özelliklerini dogrudan degistirebilir ve böylece dogal malzemelerin fotonik davranisini aittirabilirler. Bu nedenle, metamalzemeler düz merceklerde, hologramlarda, görünmez cilt pelerinlerinde ve fotonik cihazlarda kullanilir. Metamalzemelerin isik kontrol kabiliyeti büyük ölçüde tasarlanmis nanoyapilara, özellikle bunlarin sekline ve malzeme bilesimine baglidir. Ayrica, metamalzeme-tabanli plazmonik yüzeyler, klasik yüzey plazmonlari (YP) platformlarina göre çesitli avantajlar saglar: 1) Hassasiyeti artirmak için elektromanyetik spektrumlarin ultra-hassaslikla ayarlanmasi, 2) üretimde esneklik, 3) sinyal okumada kararlilik, 4) daha düsük radyasyon sönümlemesi ve daha yüksek kalite faktörü ve 5) çoklu rezonanslar olusturma. Bu malzemeler, kolloidal, düzlemsel veya periyodik desenli nanoyapilardan olusur. Bu yapilar sayesinde alt dalga boyu ölçeklerinde lokal isik yapilandirmasini saglar. Örnegin, fotonik ve plazmonik kolloidal paitiküllerin birlestirilmesiyle olusturulan metamalzemeler, hücre görüntülenmesine ve hastalik biyobelirteç tayinine olanak vermistir. Bu birlestirme islemi sirasinda, maalesef nanopaitiküller ya optik ya da fotonik davranislarini kaybederler. Polimerik malzemeler kullanarak partiküller arasinda belli bir uzaklik saglandiginda, metamalzemenin optik özellikleri kararli kalmasina ragmen bu yapilarin uygulanabilirligi hücre görüntüleme ve isaretlemeyle sinirli kalmistir. Düzlemsel formlarda tasarlanan, hiperbolik metamalzemeler biyo-duyarliliga karsi yüksek hassasiyet gösterir. Fakat bu yapilar birden fazla, farkli özellikteki malzemenin üst üste kaplanmasini içeren karmasik, mesakkatli, zaman alan ve pahali sistemlerle ancak olusturulur. Bu sistemler, yakin kizilötesi veya kizilötesi dalga boylarindaki ölçümler ile izlenir. Bu nedenle karmasik ekipmanlar ve uzman bir kisi olmadan hasta-basinda uygulanabilirligi düsüktür. Metamalzeme üretimindeki bu zorluklari asmak için arastirmacilar halihazirda periyodik desenlere sahip yüzeyleri de kullanmislardir. En önemli örneklerini dogadaki nanoboyutlu desenlerden alarak, biyo-ilham ve mikrotemas baskilama stratejileriyle üretilen periyodik nanodesenli (örnegin, bal petegi gibi) yapilar yukaridaki belirtilen üretim sorunlarinin bir kismina çözüm bulmustur. Ayrica, biyouyumlu ipek kullanilarak fotonik kristal opalleri ve plazmonik sensörler üretilip, kirilma indisi farkina bagli degisimlerle biyolojik moleküllerin varligi tespit edilmistir. Son zamanlarda optik diskler üzerinde bulunan periyodik nanodesenleri kullanarak arastirmacilar plazmonik yüzeyler üretmeyi basarmislardir. Kirilma indisi degisimlerinin yani sira, bu yüzeylerde biyolojik molekül tespiti de yapilmistir. Yakin zamanda, Çok Amaçli Sayisal Disk (Digital Versatile Disc: DVD) tabanli bir plazmonik yüzeyde biyolojik moleküllerin (proteinler ve Virüs partikülleri) tayini yapilmistir. Fakat, sadece DVD yüzeyleriyle yapilan metamalzeme plazmonik sensörler yeteri kadar hassas ölçümler alinmasina olanak vermemektedir. Bu nedenle, sensör yüzeyi üzerinde hassasiyetin arttirilmasi gerekliligi göze çarpmaktadir. Bu tarz durumlarda, plazmonik yüzeylerde sinyal ve hassasiyetin artirimi için altin nanopartiküller ve Iloresans yapida moleküller kullanilir. Özellikle, Iloroforlar, kuantum noktalar ve nanokristaller uzun süredir biyomoleküler görüntüleme ve sensör teknolojilerinde uygulanir. Örnegin, fotonik malzemeler kullanilarak Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) isinlayici olmayan dipol-dipol etkilesimleri yoluyla donör partiküllerinden alici paitiküllere uyarmalarin aktarilmasini saglar. FRET stratejileri renk ayarindan, enerji hasatina ve sensörlere kadar çesitli uygulamalarda yaygin olarak kullanilir. Ancak, daha büyük boyutlarda nanokristaller kullanilsa bile (merkezden merkeze mesafe nedeniyle), FRET verimliligi yaklasik 10 nm uzunluk ölçegi ile sinirlidir. Daha uzun mesafelerde (16-20 nm), FRET'in etkisi önemsiz hale gelir. Çünkü FRET etkisi 1/r6 oraninda düserek yerini Purcell etkiye (1/r3 oraninda) birakir (r: plazmon-florofor arasindaki ayirma mesafesi). Floroforlarin plazmonik yüzeylere entegre edilmesi sonucu fotolüminesans etkisi olusturulur ve böylece donör-alici etkilesimlerinin gücü aittirilir. Fakat bu ölçümlerin yapilmasi küçük bir yüzey alaninda karmasik ekipmanlarla oldugundan hasta basi tani testlerinde kullanilabilecek sensörler degildir. Ek olarak, optik diskler üzerindeki nanoyapilar mikro-temas baskilama yöntemiyle ilkin polidimetilsiloksan (PDMS) damgaya akabinde de polimetilsilseskuioksan (PMSSQ) malzemesine aktarilarak nanodesenli yapilar olusturulmustur. Yüzey duyarliliginin arttirilmasi için nanodesenli yapilarda rastgele olusan nanobosluklar üzerine floresans moleküller yerlestiginde sinyalin 69 ila 118 kat daha arttigini tespit etmislerdir. Fakat bu nanobosluklar, plazmonik yüzeyler üretilirken tamamen rastgele olusur ve herhangi bir sekilde bu islemin kontrolü ve standardizasyonu bulunmaz. Ayrica, bu periyodik nanoyapilar genis alanda üretilemez ve belli sayida kullanimdan sonra PDMS damga üzerindeki nanodesen boyutlarini koruyamazlar. Tüm bunlar bugün uygulanan metamalzeme tekniklerinin, üretim ve yöntem standardizasyonunda temel sorunlara ve akabinde de teknolojik bosluklara sahip olduklarini gösterip, hasta basinda kullanilmaya uygun tasinabilir biyobelirteç tespit cihazina ihtiyaç oldugunu açikça ortaya koymaktadir. dokümaninda yüzey plazmon rezonansi ve yüzey plazmonla eslestirilmis emisyon dahil olmak üzere plazmonik etkilerin bir kombinasyonu yoluyla optik çiktinin arttirilmasini saglamak üzere yapilandirilan bir dizi optik elemandan bahsedilmektedir. Böyle bir optik eleman, süperkritik açi Iloresan fenomenlerinden yararlanmak için optimize edilmis konfigürasyonlar tarafindan saglananlar gibi, optik elemana yayilan isigin açisal dagilimini tercihli olarak ayirt etmek için geometrik olarak konfigüre edilebilmektedir. Bir düzenlemede, bir biyoçipten yüzey tarafindan olusturulan bir Ilüoresansin yüksek verimli bir toplayicisina bir plazmonik güçlendirme olgusunun dahil edilmesi, küçük miktarlarda analitin saptanmasinda uygulamaya sahip olan yüksek verimli optik elemanlar saglamaktadir. Saglanan optik eleman, özellikle biyomedikal teshis uygulamasinda kullanilan hassas bir cihazdir. Bulusun Kisa Açiklamasi Bu bulusun amaci, biyobeliiteçlerin tespit ve tayininin Iloresansla güçlendirilmis ve yüzeye uzakligi belirlenmis metamalzeme-tabanli plazmonik sensörler ile yapilmasini saglayan bir ölçüm cihazi elde etme yöntemi gerçeklestirmektir. Bu bulusun baska bir amaci hem klinikte hem de hasta basinda kullanmaya uygun tasinabilir bir ölçüm cihazi gerçeklestirmektir. Bu bulusun bir baska amaci, raIlarda kalmis, kullanilmayan ve âtil olarak gözüken optik disklerin üzerinde halihazirda bulunan periyodik nanodesenlerin kullanimiyla metamalzeme elde edilmesini saglayan bir yöntem gerçeklestirmektir. Bu bulusun bir diger amaci, plazmonik, fotonik ve mikroakiskan yapilarin birlestirilmesiyle ölçüm cihazi elde edilmesini saglayan bir yöntem gerçeklestirmektir. Bu bulusun diger bir amaci, birden fazla biyobelirteci tanima kapasitesine sahip ölçüm cihazi gerçeklestirmektir. Bu bulusun diger bir amaci, düsük maliyetli, kullanimi kolay, yüksek hassasiyetle ölçüm yapabilen ve ölçüm için uzman personel gerektirmeyen bir cihaz elde etme yöntemi gerçeklestirmektir. Bulusun Ayrintili Açiklamasi Bu bulusun amacina ulasmak için gerçeklestirilen "Biyobelirteç Tespitinde Kullanilan Bir Cihaz Elde Etme Yöntemi" ekli sekillerde gösterilmis olup, bu sekillerden; Sekil 1. Bulus konusu yönteme ait akis semasidir. Sekil 2. Bulusun izdüsümü çizimleri. a) DVD plastik kalibi ve birden fazla metal kaplamasi (Titanyum: 10 nm; Gümüs: 30 nm; Altin: 15 nm) b) 3-MNHS ile elde edilen kisa mesafeli modifikasyon (~4 nm), c) SH-PEG 600-biyotin ile elde edilen orta mesafeli modifikasyon (~6-10 nm), d) SH-PEG 2000-biyotin ile elde edilen uzun mesafeli modifikasyon (N16-20 nm). Sekil 3. a) DVD plastik kalibin ve b) bu kalip üzerine birden fazla metal kaplamasi (Titanyum: 10 nm; Gümüs: 30 nm; Altin: 15 nm) ile olusturulan metamalzeme plazmonik sensörün AFM ve SEM görüntüleridir. Sekil 4. Yüzey kimyasi uygulamalari (a-b) 3-MNHS ile kisa mesafeli (~4 nm), (c- ile uzun mesafeli (N16-20 nm) modifikasyonlari gösterilmektedir. Sekil 5. (a) AVidin-FITC ve aVidin molekülleri (b) kisa, (c) orta ve (d) uzun mesafeli modifikasyonlara aVidin-FITC uygulamasidir. Sekil 6. (a-b) Kisa mesafeli modifikasyon üzerine, (c-d) orta mesafeli modifikasyon üzerine ve (e-f) uzun mesafeli modifikasyon üzerine aVidin ve aVidin-FITC proteinlerinin baglanmasi. (g-h) Violin-kutu grafigi ve verinin normalize edilmesiyle (0-1 arasinda) tüm modifikasyonlarin karsilastirilmasi gösterilmektedir. Parametrik olmayan Kruskal-Wallis istatiksel analizi yapilarak veriler incelenmis ve istatiksel farklilik, * p<0.05 ve ** p<0.01 olarak gösterilmistir. Sekil 7. AVidin-FITC proteinlerinin yapay idrarda (a-b) SH-PEG 600-biyotin ile modifiye edilen sensör yüzeyi üzerine baglanmasi. (0) Son ölçüm analizi yapilarak farkli gliserol çözeltilerinin (%1-%70) plazmonik rezonans degerindeki degisimleri. (d) Modifikasyon yapilan ve yapilmayan sensör üzerine farkli derisimde ve kirilma indisindeki gliserol çözeltilerinin olusturduklari etkinin gösterimidir. Sekil 8. Floresan mikroskobu görüntülemesi. (a) Sirasiyla bos yüzey, aVidin- FITC ve yikama sirasinda elde edilen görüntüler. (b) Analiz sonucu olusan yesil isik yogunlugu karsilastirilmasi ve (c) normalize edilen veriler gösterilmektedir. Sekilde yer alan parçalar numaralandirilmis olup, bu numaralarin karsiliklari asagida verilmistir: 100. Yöntem Kan, serum veya idrar seklindeki biyolojik siVilardaki hastalik yapici biyobelirteçlerin hem klinikte hem de hasta basinda Iloresansla güçlendirilmis metamalzeme plazmonik sensör kullanarak tespit eden tasinabilir bir ölçüm cihazi elde etmeyi saglayan bulus konusu yöntem (100); -optik disk (DVD) yüzeyindeki nanoperiyodik yapinin açiga çikarilarak kimyasal asindirma yapilmasi (101), -asindirilan yüzeyin kaplanmasiyla metamalzeme plazmonik sensör elde edilmesi (102), -metamalzeme plazmonik sensör yüzeyinde mikrokanal olusturulmasi (103) ve -yüzeyinde mikrokanal olusturulan metamalzeme plazmonik sensöre kisa, orta ve uzun mesafeli modifikasyonlarin uygulanip Iloresans malzeme entegre edilerek biyobelirteç ölçüm cihazi elde edilmesi (104) adimlarini içermektedir. Bulus konusu yöntemin (100) optik disk yüzeyindeki nanoperiyodik yapinin açiga çikarilarak kimyasal asindirma yapilmasi (101) adiminda, optik disk yüzeyinde bulunan ve istenmeyen plastikler bir bistüri araciligiyla yüzeyden uzaklastirilmaktadir. Ardindan yüzey hacimce 121 oraninda hazirlanan etanol- metanol karisimi ile temizlenmekte ve yüzeyden boya ile istenmeyen katmanlar arindirilmaktadir. Hacimce 124 oraninda hazirlanan aseton-izopropanol karisimi temizlenen yüzeye istenilen periyodik yapi elde edilene kadar 30-120 saniye uygulanarak kimyasal asindirma gerçeklestirilmektedir. Bulus konusu yöntemin (100) asindirilan yüzeyin kaplanmasiyla metamalzeme plazmonik sensör elde edilmesi (102) adiminda, asindirilan yüzeyler elektron- isinli buharlasma yöntemi kullanilarak sirasiyla 5-15 nm titanyum, 25-50 nm gümüs ve 5-20 nm altin ile kaplanip metamalzeme plazmonik sensör elde edilmektedir. Bulus konusu yöntemin (100) metamalzeme plazmonik sensör yüzeyinde mikrokanal olusturulmasi (103) adiminda, metamalzeme sensör yüzeyine mikroakiskan bir çip entegre edilerek yüzeyde istenilen ölçülerde mikrokanallar olusturulmaktadir. Bulusun bir uygulamasinda olusturulan mikrokanallar (4-10 mm) X (10-40 mm) X (25-250 um), en X uzunluk X yükseklik boyutlarindadir. Bulusun bir uygulamasinda plazmonik sensör (10-20 mm X 15-50 mm) boyutlarindadir. Bulus konusu yöntemin (100) yüzeyinde mikrokanal olusturulan metamalzeme plazmonik sensöre kisa, orta ve uzun mesafeli modifikasyonlarin uygulanip Iloresans malzeme entegre edilerek biyobelirteç ölçüm cihazi elde edilmesi (104) adiminda, elde edilen metamalzeme plazmonik sensörün biyobelirteçlere karsi olan hassasiyetini artirmak amaciyla sensör yüzeyine Iloresans malzemeler, biyomoleküller araciligiyla entegre edilmektedir. Bulusun bir uygulamasinda kullanilan Iloresans malzeme, Iluoresein izotiyonosiyanat (FITC), dir. Floresans malzemenin biyomoleküllere baglanmasi için aVidin-biyotin etkilesimi kullanilmakta olup, bu etkilesim için aVidin-FITC molekülleri seçilmektedir. Floresans malzeme, metamalzeme plazmonik sensör yüzeyine 6-10 nm mesafe ile uygulanmaktadir. Bulus konusu yöntem (100) sayesinde elde edilen tasinabilir ölçüm cihazi; kan, serum veya idrar seklindeki biyolojik siVilardaki hastalik yapici biyobeliiteçlerin hem klinikte hem de hasta basinda düsük maliyetle ve yüksek hassasiyetle ölçülmesini saglamaktadir. Bulus konusu yöntem (100) sayesinde biyobeliiteç tayini yapan ölçüm cihazina ulasilmasi için gerçeklestirilen deneysel süreç ve karakterizasyon çalismalari su sekildedir: Optik disklerin (DVD) yüzeyinde bulunan nanoperiyodik yapi sensör üretimi için kullanilmaktadir. Ilk olarak, DVD yüzeylerdeki periyodik yapinin plazmonik etkiyi saglayabilmesi için organik çözücülerle kimyasal asindirma islemi uygulanip, bir sonraki asamadaki metal kaplama için yüzeyler hazir hale getirildi. Bu islem için DVD yüzeyinde bulunan istenmeyen plastikler, bir bistüri araciligiyla basit bir sekilde yüzeyden uzaklastirildi. Akabinde, etanol-metanol (1:1, hacim:hacim) karisimi ile temizlenen bu yüzeylerden ilgili boya ve istenmeyen katmanlar yüzeyden arindirildi. Literatürde belirtildigi üzere, 124 (hacim:hacim) oraninda aseton-izopropanol karisimi 60 saniye uygulanarak, asindirma islemi gerçeklestirildi. Bu yüzeyler, elektron-isinli buharlasma yöntemiyle titanyum (10 nm), gümüs (30 nm) ve altin (15 nm) kaplanip, metamalzeme plazmonik sensörler elde edildi. Sonrasinda, daha genis alanda nanoperiyodik alanin devamliligini gözlemlemek için taramali elektron mikroskopisi (Scanning Electron Microscope: SEM) kullanildi. Bu islem için 60 saniye kimyasal asindirmaya maruz birakilan DVD yüzeyleri ön isleme tabi tutuldu. Yüzeyler ilk önce ethanol ile yikandi ve 5 dakika boyunca sonike edildi. Böylelikle, yüzeyde bulunan yabanci maddeler ortamdan uzaklastirildi. DVD yüzeyler polikarbonat yapida oldugu için bu yüzeylerin SEM cihazinda görüntülenebilmesi için iletken bir madde ile kaplanmasi gerekmektedir. Aksi takdirde, yüzeyde biriken negatif yükler karakterizasyon metodunun dogru bir sekilde gerçeklestirilmesine engel olmaktadir. Bu nedenle, yüzeyler püskürtmeli kaplama (sputter coating) metoduyla altin-paladyum (Au- Pd) karisimi ile kaplandi. Kaplama islemi için hassas asindirma ve kaplama sistemi (Precision Etching and Coating System: PECS) kullanildi. Islem sirasinda cihaz parametreleri, kaplama özkütlesi (density) 19.32 g/cm3 ve akustik direnç 23.20 X 105 gm/cm2s (akustik empedans) olacak sekilde ayarlandi. Kaplama islemi sonucunda olusan film kalinligi yaklasik olarak 10 nm olup nanoperiyodik yapiya herhangi bir zarar vermemektedir. SEM karakterizasyonu sonucunda, nanoperiyodik yapilarin genis alanda devamlilik gösterdigi ve yer yer de kivrimli bir ilerleyisin oldugu gözlemlendi. Ayrica, AFMade bu DVD yüzeylerin daha küçük boyutta incelendiginde ise N740 nm periyotlarinin oldugu hesaplandi (Sekil 3a). Benzer islemler, metal kapli metamalzeme plazmonik sensör için de uygulandi (altinpaladyum kaplama hariç). Burada da benzer yapilarin kaplama sonrasinda da genis (SEM) ve dar (AFM) alanda devam ettigi ve yüzey periyotunun daha da düzgün oldugunu gözlemlendi (Sekil 3b). Sonrasinda, biyomoleküllerin uygulanmasi için mikroakiskan bir çip entegre edilerek metamalzeme plazmonik sensör (15 mm X 15 mm) üzerine mikrokanal (4.5 mm X 10.2 mm X 50 um; en X uzunluk X yükseklik) olusturuldu. Üretilen plazmonik metamalzemenin biyobelirteçlere karsi olan hassasiyetini bir adim öteye tasimak amaciyla yüzey üzerine Iloresans malzemeleri biyomoleküller araciligiyla entegre edilmesi planlandi. Böylelikle, Iloresans moleküllerinin yüzeye olan mesafesinin degismesi sonucunda olusabilecek özel durumlarin plazmonik sinyale olan etkisi arastirilmak istendi. Literatürde, plazmonik yüzeyler ile Iloresans moleküllerinin olasi etkilesimleri incelenmis olup, sonuç olarak iki farkli tipte optik durum öngörülmüstür. Ilk durum, Iloresans moleküllerinin nano- yapilarla kurmus oldugu isinima bagli olmayan isi enerji transferleri ile alakalidir ve bu etki FRET olarak adlandirilir. FRET etkisi Iloresans moleküllerinin yüzeye olan uzakliginin yaklasik 10 nmanin altinda tutunmasi ile meydana gelir. Ikinci durumda ise Iloresans molekülünün yüzeyden yaklasik 10 nm,den fazla uzaklasmasi, FRET etkisinden kurtulmasi ve bunun sonucu meydana gelen emisyon sinyalinin artan elektromanyetik alan ile gelistirilmesine dayanir. Bu etki literatürde, Purcell etkisi olarak belirtilir. Yukarida belirtilen iki optik etki düsünülerek, çalismada floresans malzeme olarak fluoresein izotiyonosiyanat (FITC) seçildi. Bu seçimde, emisyon dalga boyu ile plazmonik sogurma dalga boylarinin spektrumda benzer araliklarda yer almalari etkili olmustur. Floresans moleküllerinin biyomoleküllere baglanmasi aVidin-biyotin etkilesimi kullanilmak istenip, aVidin-FITC molekülleri kullanildi. FITC,nin yüzeye olan uzakligi üç asamada belirlendi. (1) Kisa mesafeli modifikasyonda sensör ve floroforlar arasindaki asil mesafeyi saglayan unsur aVidin molekülleri oldugundan, aVidinin boyutu belirleyici unsur olmustur ve literatürde ~4 nm olarak raporlanmistir. 3- merkaptopropanil- N-hidroksisüksinimidil propiyonat (10 mM) araci molekülü burada kullanilarak, tiyol gruplariyla metamalzeme sensörün altin kismina baglanma gerçeklesip süksinimit gruplari da aVidin-FITC moleküllerini baglamak için kullanildi. Bu konfigürasyonda, FRET (~4 nm) etkilesimine bakildi. (2) Orta mesafeli modifikasyon uygulanarak, sensör ve floroforlar arasindaki mesafeyi arttirmak için SH-PEG 600-biyotin (molekül agirlik: 600 Da) (10 mM) kullanildi. Bu polimerik molekülün uç kismindaki tiyol fonksiyonel grubu altin metamalzeme yüzeyle etkilesirken, yüzeye biyotin kismini sunmaktadir. Daha sonra, aVidinfloroforlar sisteme farkli derisimlerde gönderilerek, sensör yüzeyinden belli bir yükseklikte florofor kapli bir katman olusturuldu. Literatürde belirtildigi gibi PEG molekülünün uzunlugu sahip oldugu tekrarli etilen glikol miktarlariyla iliskilidir. Etilen glikol sayisi (n), PEG moleküler agirligi (18.02 + bulunur. Baglarin oryantasyonuna bagli olarak, her bir alt-ünite segmentinin boyu 0.278 nm-0.358 nm arasinda degisir. Kullanilan araci molekül entegre biyotinin aVidin ile olusturdugu kompleks boyutlari da 4.2 nm-5.8 nm arasinda degisir 7.8 nm-10.4 nm boyutlarindadir (tiyol boyutu angstrom seViyesinde oldugundan hesaba katilmamistir). Bu modifikasyon ile sensör ve floroforlar arasindaki mesafe Uzun mesafeli modifikasyon uygulayarak, daha çok Purcell etkiyi görmek amaçlandi ve (2),de bahsedilen modifikasyon stratejisi daha uzun bir polimerik molekül olan hesaplandigi gibi, buradaki araci molekülün florofora kattigi yükseklik yaklasik 16.7 nm-21.9 nm arasinda olmaktadir. Tüm yüzey kimya stratejileri Sekil 4 ve ,te gösterilmektedir. Kisa, orta ve uzun mesafeli modifikasyon deneyleri baslangicinda ortak olarak öncelikle ölçüm baslangicinda referans hatti olusturmak adina bos çipten arka fon sinyali (hava) alindi. Sonra, mikroakiskan çipe hortumlarla kararli bir sinyal degeri elde etmek için sabit hizda (5 uL/dk) yaklasik 350 saniye distile su siringa pompasiyla gönderildi. Distile su ile dengeye gelen sensör yüzeyine avidin proteini (kontrol) ( veya avidin-FITC, 3200 saniye boyunca gönderildi. Sinyal yükselen bir egilimden dengeli bir yaklasima geçtiginde, çip yüzeyine tutunamayan proteinleri uzaklastirmak için tekrar su ile 300 saniye boyunca yikanma islemi uygulandi (Sekil 6a-f). Kisa, orta ve uzun mesafeli modifikasyonda, avidin protein baglanmasi sirasiyla ortalama 1.23 nm, 0.36 nm ve 0.22 nm bir plazmonik rezonans kaymasina neden olurken, avidin-FITC deneylerinde ise bu ortalama degerler 1.04 nm, 1.89 nm ve 0.83 nm olarak hesaplandi (Sekil 6g). Sonrasinda, verileri normalize ettigimizde (0-1) sirasiyla kisa, orta ve uzun modifiye edilmis yüzeyler de avidin baglandigi zaman 0.68, 0.20 ve 0.17 olarak hesaplanirken, avidin-FITC deneylerinde bu degerler 0.58, 0.90 ve 0.47 oldu (Sekil 6h). Ek olarak, her üç deney düzenegini kendi kontrol gruplariyla karsilastirdigimizda, yüzeye yakin bir modifikasyon varliginda ayni derisime sahip avidin-FITC molekülün plazmonik sinyali azalttigini (kisa mesafeli modifikasyonda) ve sensör yüzeyi ile uzak bir mesafede avidin-FITC molekülü plazmonik etkiyi arttirdigi gözlemlendi (orta ve uzun mesafeli modifikasyonlarda). Sonuç olarak, kisa mesafede yaklasik %15 civarinda bir sinyal kaybindan (FRET etki), orta ve uzun mesafeli modifikasyonlarda ise yaklasik sirasiyla 4.5 ve 2.8 kat sinyal artirimi (Purcell) gözlemlendi. Bu sonuçlar isiginda uygulamaya yönelik olarak, eger yüzey kimyasi sensöre yakin bir sekilde (~4 nm) yapilacaksa floresans molekülün sinyali azaltacagini ve eger floresans bir molekül kullanilacaksa orta mesafeli yüzey modifikasyonun yapilmasinin daha verimli olacagini göstermektedir. Biyolojik sivilar (örnegin, kan, serum veya idrar), su ve/veya fosfat tampon çözeltisiyle (PBS) karsilastirildiklarinda hem yogunluklari hem de içerikleri (iyonik güç, iyonik yük ve protein/seker içerikleri) bakimindan büyük farkliliklar göstermektedir. Gelistirdigimiz sensörün performansini ve hastalik belirteçlerine özgüllügünü anlamak adina ilkin su ortamini degistirerek, yapay idrar örnekleri içerisinde 100 nM avidin-FITC olacak sekilde test sivilari hazirlandi ve ayni sistem SH-PEG 600-biyotin içeren yüzeyler üzerinde denendi. Bu deney düzeneginde yaklasik 2.54 nm plazmonik rezonans kaymasi gözlendi (Sekil 7a-b). Kontrol olarak ise iki farkli deney seti düzenlendi: (l) avidin-FITC içermeyen yapay idrar ve (2) . Bu iki kontrolde, su ile alinan baslangiç verisi, kirilma indisi farkli olan yapay idrar verildikten sonra belli bir süre artti ve sonra sabitlendi (Sekil 7b). Su ile yikama yapildiktan sonra baslangiç noktasina (su verisiyle ayni seviyeye) düsen sinyal, yüzeyde herhangi bir plazmonik rezonans kaymasina neden olmadi (Sekil 7b). Ayrica, SH-PEG 600-biyotin modifiye yüzeylerde (Avidin FITC baglanmasindan sonra) farkli gliserol derisimleri uygulanarak (%l-%70), gelistirilen sensörün kirilma indisi degisimlerine hassasiyetine bakildi ve herhangi bir modifikasyon yapilmamis sensör ile karsilastirildi (Sekil 7c-d). Gözlemlenen sonuçlarda, kirilma indisi degisimlerinde modifikasyonu ve modifikasyonsuz sensörler benzer sonuçlar gösterdi (Sekil 7c-d). Sekil 6 ve 7,daki sonuçlari beraber inceledigimizde, yüzeye baglanan avidin-FITC molekülünün yüzeyden belli bir uzaklikta yerlestirildiginde daha fazla plazmonik rezonans kaymasina neden oldugu ve modifikasyon olmayan sensörlerle de kirilma indisi açisindan benzer sonuçlar ortaya koymasi, bu yapinin baglanma hassasiyetini arttirdigini bize sundu. Sonraki adimda, sensör hassasiyet performansi ölçümü yapildi. Sivilardaki kirilma indisindeki degisime bagli olan sensör sinyal degisimleri incelenerek, sensörün kirilma indisi duyarliligi ve liyakat rakami (figure-of-merit: FOM) hesaplamalari yapildi. Sekil 7,te gösterilen gliserol deneylerinde (%l-%70, hacim:hacim), rezonans dalgaboyu degerlerinde gözlemlenen kaymalarin büyüklügü kirilma indisindeki degisime bölünerek kirilma indisi duyarliligi 338.5 nm/kirilma indisi olarak hesaplandi. Ayrica, FOM ise kirilma indisinin yari maksimumda tam genislik (full Width at half maximum: FWHM) degerlerine bölünmesiyle hesaplandi. Hassasiyet performansi ölçümünde kullanilan degerler Tablo l,de özetlendi. Tablo 1. Sensör performansi parametreleri. Gliserol derisimleri, kirilma indisi (RIU), yari maksimumda tam genislik (FWHM) ve liyakat rakami (FOM). Gliserol Derisimi Kirilma Indisi FWHM FOM (%Ll (RIU) [nm] (HRIU) Ayrica, orta mesafeli yüzey modifikasyonu (SH-PEG 600-biyotin) bulunan yüzeylerde, aVidin-FITC proteini baglanmasi öncesindeki bos yüzeyden (i), protein baglanmis yüzeyden (ii) ve yikama sonrasi olusan yüzeyden (iii) dikey isik mikroskobu vasitasiyla görüntüler alindi (Sekil 8a). Fiji-Image] (NIH) açik kaynak uygulamasi kullanilarak, yukarida bahsedilen 3 durum için alinan görüntüler üzerinden yesil isik yogunlugu analizi yapildi (Sekil 8b). Yesil renk yogunlugunun, aVidin-FITC proteini baglanmis yüzeyde en fazla oldugu, bos yüzeyde ise en düsük oldugu saptandi. Yesil isik yogunlugu verileri normalize baglanan aVidin-FITC proteinin yikama sonrasinda yüzeyde yaklasik %60 oraninda kaldigi ve parlakligini korudugu gözlemlendi. Bu temel kavramlar etrafinda, bulus konusu "Biyobeliiteç Tespitinde Kullanilan Bir Cihaz Elde Etme Yöntemi (100)" için çok çesitli uygulamalarin gelistirilmesi mümkün olup, bulus burada açiklanan örneklerle sinirlandirilamaz, esas olarak istemlerde belirtildigi gibidir. TR TR TR TR TR TR TR TR TR TR TR TR TR TR TR TR TR TR