TARIFNAME BIYOMALZEME ENTEGRE EDILMIS METAYÜZEYE SAHIP BIR BIYOSENSÖR ELDE ETME YÖNTEMI Teknik Alan Bulus, atil optik disklere biyomalzeme entegre edilmesiyle elde edilen metayüzeyler sayesinde Vücut siVisindaki biyobelirteçlerin tespit edilmesini saglayan bir biyosensör elde etme yöntemi ile ilgilidir. Önceki Teknik Hastanelerdeki is yükünü ve masraflarini azaltmak için saglik sistemi, merkezi teshis platformlarindan hasta basi test platformlarina geçis yapmakta ve böylece daha fazla bireye ulasilmasi hedeflenmektedir. Bu baglamda, biyosensör platformlari, bu mevcut testlere alternatif veya tamamlayici olarak hastalik teshisi üzerinde çok önemli bir etkiye sahiptir. Günümüzde, ELISA, Simoa, LumineX ve MultipleX Searchlight gibi geleneksel hastalik teshisi metotlari biyobelirteç tayini için kullanilmaktadir. Ancak bu metotlarin karmasik, uzun süreli ve pahali olmasi en büyük handikaplaridir. Bu nedenle, erken tani için düsük maliyetli, kolay kullanima sahip dogrulugu ve hassasiyeti yüksek, yari/kismi invazif testlerin gelistirilmesine acil ihtiyaç duyulmaktadir. Dünya Saglik Örgütü (WHO) hasta-basi tani sistemleri gelistirilirken (i) düsük maliyetli, (ii) hassas, (iii) spesifik, (iv) kullanici dostu, (V) hizli ve (Vi) dayanikli, (Vii) karmasik ekipman gerektirmeyen ve (Viii) rahatça kullanilabilen özelliklerinin olmasi gerektigini beliitmektedir. Bu nedenle, hasta- basi testleri gelistirilirken bu özelliklere dikkat edilmelidir. Optik biyosensörler hasta-basi tani testlerinin gelistirilmesi için en sik kullanilan stratejilerden biridir. Herhangi bir moleküler isaretlemeye ihtiyaç duymadan, hizli ve hassas ölçümler alinabilecek platformlarin gelistirilmesine uygundur. Bu uygulama alani yaygin olarak kullanilmasinin en önemli nedenleri arasindadir. Optik biyosensörlerin diger bir avantaji ise mikroakiskanlarin kolaylikla entegre edilebilmesidir. Böylece siVi geçisi kolaylikla saglanabilmekte ve gerekli örnek ve solüsyon kullanimi önemli ölçüde azaltilabilmektedir. Metamalzemeler ve metayüzeyler, isigi manipüle eden alt dalga boyu kalinliklarindaki ince plazmonik veya dielektrik malzeme katmanlari içeren nanoyapili ara-yüzlerdir. Bu nedenle optik sensör yapiminda yaygin olarak kullanilmaktadirlar. Metamalzemeler, dogada dogrudan bulunmazlar. Farkli malzemelerin sekline ve malzeme birlesimine bagli olarak bir araya getirilmesiyle tasarlanmis nanoyapilar olarak elde edilebilirler. Bu nanoyapilar sayesinde yeni özellikler (isik kontrol kabiliyeti gibi) elde edilmektedir. Metayüzey üretiminde farkli stratejiler kullanilmaktadir ancak bunlarin birçogu oldukça kompleks ve pahali prosedürlerdir. Herhangi bir hastaligin tespitinde kullanilabilecek potansiyel biyobelirteçleri (serum, kan, tükürük, idrar, gayta, lavaj siVisi, interstisyel siVi ve diger Vücut siVilarindan) tespit etmek için biyomalzeme entegre edilmis metayüzeyler, biyosensör olarak kullanilmaktir. Bu sistemler ayni zamanda metamalzeme plazmonik sensör olarak da isimlendirilebilmektedir. Hücrelerden eksozomlarin salinimi pek çok hastalikla iliskilendirilmektedir. Son zamanlarda yapilan çalismalar da salinan eksozomlarin, biyobelirteç olarak potansiyelini ortaya koymaktadir. Eksozomlarin membraninda üç farkli tetraspanin olarak da bilinen proteinler bulunmaktadir. Tetraspininlere özel olan antijenler kullanilarak eksozomlar yakalanabilmekte ve tayin edilebilmektedir. Tetraspaninler eksozomlarda bol miktarda bulundugundan, eksozom tespiti için en çok kullanilan belirteçlerden biridir. Bu bilgiler isiginda yukarida belirtilen olumsuzluklarin üstesinden gelmek üzere Vücut siVisindaki biyobelirteçlerin tespit edilmesini biyomalzeme entegre edilerek hassasiyeti aitirilmis biyosensörler (metayüzey/metamalzeme/metamalzeme plazmonik sensör) ile gerçeklestirmeyi, maliyet, biyouyumluluk ve karmasiklikla ilgili üretim zorluklarini çözmeyi ve düsük maliyetli kolay tespit yapmayi saglayan bir biyobelirteç elde etme yöntemine ihtiyaç duyulmaktadir. Teknigin bilinen durumda yer alan CN10203735 8 sayili Çin patent dokümaninda, biyomolekül tespitinde yüzey aktivasyonu gerçeklestirilen optik bir disk kullanimindan bahsedilmektedir. Bulusun Kisa Açiklamasi Bu bulusun amaci, atil optik disklere biyomalzeme entegre edilmesiyle elde edilen metayüzeyler sayesinde Vücut siVisindaki biyobeliiteçlerin tespit edilmesini saglayan biyosensör elde etme yöntemi gerçeklestirmektir. Bu bulusun baska bir amaci, âtil optik disklerden elde edilen nanoyapilar sayesinde düsük maliyetli biyosensör elde edilmesini saglayan bir yöntem gerçeklestirmektir. Bu bulusun bir baska amaci, âtil optik disklere kimyasal yollarla entegre edilen altin nanopaitikül (AuNP) ve olusturulan nanoadalar sayesinde hassas biyobelirteç tayini yapilmasini saglayan bir yöntem gerçeklestirmektir. Bu bulusun bir diger amaci, yüzeyinde Poli L Lizin (PLL) katmani, altin nanopartikül ve nanoada yapilarinin bulunmasiyla gümüs üst yüzeye sahip sensörlerde oksitlenmenin önlendigi hassas biyosensörler elde edilmesini saglayan Bu bulusun diger bir amaci, hastanelerdeki is yükü ve masrafi azaltmak için merkezi teshis platformlari yerine hasta basi test cihazlari gelistirilmesini saglayan Bulusun Ayrintili Açiklamasi Bu bulusun amacina ulasmak için gerçeklestirilen "Biyomalzeme Entegre Edilmis Metayüzeye Sahip Bir Biyosensör Elde Etme Yöntemi" ekli sekillerde gösterilmis olup, bu sekillerden; Sekil 1. Bulus konusu yönteme ait akis semasidir. Sekil 2. Metayüzeylerin üretim asamalarinin sematik anlatimidir (a) DVD plastik kalibin üzerine birden fazla metal kaplamasi (Titanyum: 10 nm; Gümüs: 30 nm; Altin: 15 nm) ile olusturulan plazmonik sensörün AFM ve SEM görüntüleri ve AFM profili. (b) Bos metayüzeye altin nanopartiküllerin PLL katmani araciligiyla entegre edilmesi (1:10 seyreltilmis) ile olusturulan plazmonik sensörün AFM ve SEM görüntüleri ve AFM profili. (c) Dogudan PLL katmani üzerine kloroaurik asit (HAuCl4) ve hidroksilamin hidroklorür (HONH2.HC1) kullanarak tohumlama yapilarak olusturulan nanoada yapili plazmonik sensörün AFM ve SEM görüntüleri ve AFM profili. (d) DVD plastik kalibin üzerine 65 nm Gümüs metal kaplamasi ile olusturulan plazmonik sensörün AFM ve SEM görüntüleri ve AFM profili. (e) Bos gümüs metayüzeye altin nanopartiküllerin PLL katmani araciligiyla entegre edilmesi (1:10 seyreltilmis) ile olusturulan plazmonik sensörün AFM ve SEM görüntüleri ve AFM profili. (f) Dogudan PLL katmani üzerine kloroaurik asit (HAuCl4) ve hidroksilamin hidroklorür (HONH2.HC1) kullanarak tohumlama yapilarak olusturulan nanoada yapili plazmonik sensörün AFM ve SEM görüntüleri ve AFM profili. Sekil 3. Bos altin ve gümüs üst metayüzeye sahip plasmonik sensörün performansinin incelenmesi (a) Bos altin üst metayüzeye sahip sensör için son ölçüm analizi yapilarak farkli gliserol çözeltilerinin (%1-%70) plazmonik rezonans degerindeki degisimleri. (b) Bos gümüs üst metayüzeye sahip sensör için son ölçüm analizi yapilarak farkli gliserol çözeltilerinin (%1-%70) plazmonik rezonans degerindeki degisimleri (c) Bos altin üst metayüzeye sahip sensör için son ölçüm analizi yapilarak farkli gliserol çözeltilerinin (%l-%70) plazmonik rezonans degerindeki degisimlerin isi haritasi ile gösterimi. (d) Bos gümüs üst metayüzeye sahip sensör için son ölçüm analizi yapilarak farkli gliserol çözeltilerinin (%l-%70) plazmonik rezonans degerindeki degisimlerin isi haritasi ile gösterimi. (e) Altin ve gümüs üst metayüzeylere sahip sensörlerin plazmonik rezonans degerinin farkli gliserol çözeltilerine göre degisiminin zamana göre gösterimi. (f) Altin ve gümüs üst metayüzeylere sahip sensörlerin farkli derisimde ve kirilma indisindeki gliserol çözeltilerinin olusturduklari etkinin dogrusal gösterimi. Sekil 4. Sensör performanslarinin karsilastirilmasi (a) Bos altin ve gümüs üst yüzeyin farkli derisimde ve kirilma indisindeki gliserol çözeltilerinin olusturduklari etkinin dogrusal gösterimi. (b) Farkli PLL konsantrasyonlari üzerine ayni tohumlama çözeltisi verilerek nanoada olusturulan yüzeyin farkli derisimde ve kirilma indisindeki gliserol çözeltilerinin olusturduklari etkinin dogrusal gösterimi. (0) Altin nanopartikül miktarinin altin üst metayüzeye sahip plazmonik sensör rezonansina farkli derisimde ve kirilma indisindeki gliserol çözeltilerinin olusturduklari etkinin dogrusal gösterimi. (d) Belirlenen altin nanopartikül miktarinin gümüs üst metayüzeye sahip plazmonik sensör rezonansina farkli derisimde ve kirilma indisindeki gliserol çözeltilerinin olusturduklari etkinin dogrusal gösterimi ve bos gümüs üst metayüzey ile karsilastirilmasi. (e) Tohumlama solüsyonun konsantrasyonunun altin üst metayüzeye sahip plazmonik sensör rezonansina farkli derisimde ve kirilma indisindeki gliserol çözeltilerinin olusturduklari etkinin dogrusal gösterimi. (f) Belirlenen tohumlama solüsyonun gümüs üst metayüzeye sahip plazmonik sensör rezonansina farkli derisimde ve kirilma indisindeki gliserol çözeltilerinin olusturduklari etkinin dogrusal gösterimi ve bos gümüs üst metayüzey ile karsilastirilmasi. Sekil 5. Sinyal iyilestirmesinin altin üst metayüzeye sahip sensörlerde karsilastirilmasi (a) Bos altin üst yüzeye sahip sensörün 108 paitikül/mL eksozom yakalanmasi ve sinyal gösterimi. (b) Altin Nanopaitikül entegred edilmis altin üst yüzeye sahip sensörün 108 paitikül/mL eksozom yakalanmasi ve sinyal gösterimi. (C)Tohumlama ile nanoada olusturulmus altin üst yüzeye sahip sensörün 108 partikül/mL eksozom yakalanmasi ve sinyal gösterimi. (d) Verilerin parametrik olmayan Kruskal-Wallis istatistiksel analizi (herhangi bir istatistiksel fark gözlenmedi (n=3, p0.05)). (e) Verinin normalize edilmesiyle (0-1 arasinda) tüm modifikasyonlarin karsilastirilmasi Sekil 6. Sinyal iyilestirmesinin gümüs üst metayüzeye sahip sensörlerde karsilastirilmasi (a) Bos gümüs üst yüzeye sahip sensörün 108 partikül/mL eksozom yakalanmasi ve sinyal gösterimi. (b) Altin Nanopartikül entegre edilmis gümüs üst yüzeye sahip sensörün 108 partikül/mL eksozom yakalanmasi ve sinyal gösterimi. (c) Tohumlama ile nanoada olusturulmus gümüs üst yüzeye sahip sensörün 108 paitikül/mL eksozom yakalanmasi ve sinyal gösterimi. (d) Verilerin parametrik olmayan Kruskal-Wallis istatistiksel analizi (istatistiksel fark yildiz isaretiyle gösterildi (n= 3, p<0.05)). (e) Verinin normalize edilmesiyle (0-1 arasinda) tüm modifikasyonlarin karsilastirilmasi Sekil 7. Altin nanopartikülleri entegre edilmis yüzeylere anti-CD63 antikoru tutturularak farkli sistemlere uygunlugu test edilmesi (a) Anti-CD81 antikoru tutturulmus altin nanopartikül entegre edilmis gümüs üst yüzeye sahip sensörün üzerine 108 partikül/mL verilerek performansin gösterimi. (b) Anti-CD63 antikoru tutturulmus altin nanopartikül entegre edilmis gümüs üst yüzeye sahip sensörün üzerine 108 paitikül/mL verilerek performansin gösterimi. Klinik uygulanabilirligi testi (0) Eksozom örnekleri yapay idrar içerisinde hazirlanarak altin nanopartikül entegre edilmis altin üst yüzeye sahip sensör üzerindeki performansinin gösterimi. (d) Eksozom örnekleri yapay idrar içerisinde hazirlanarak altin nanopartikül entegre edilmis gümüs üst yüzeye sahip sensör üzerindeki performansinin gösterimi. Sekilde yer alan parçalar numaralandirilmis olup, bu numaralarin karsiliklari asagida verilmistir: 100. Yöntem Atil optik disklere biyomalzeme entegre edilmesiyle elde edilen metayüzeyler sayesinde vücut sivisindaki biyobeliiteçlerin tespit edilmesini saglayan bulus konusu yöntem (100); -atil optik disklerin metal ile kaplanarak metayüzey elde edilmesi (101), -hazirlanan metayüzeye biyomalzeme entegre edilerek yüzeyin islevsel hale getirilmesi (102), -islevsel hale getirilen metayüzeye tohumlama çözeltisi verilerek yüzeyde nanoada olusturulmasi (1 03), -tohumlama çözeltisi verilen metayüzeye eksozom membran proteinine ait antikor verilmesi (104) ve -bir vücut sivisina yerlestirilen, antikora sahip metayüzey ile antikora iliskin eksozomun yakalanarak hastalik tespiti yapilmasi (105) adimlarini içermektedir. Bulus konusu yöntemin (100) âtil optik disklerin metal ile kaplanarak metayüzey elde edilmesi ( plastik koruma katmani bir biçak yardimi ile kaldirilmakta ve açiga çikan nanoperiyodik yapiya kimyasal asindirma islemi uygulanmaktadir. Bulusun bir uygulamasinda kimyasal asindirma islemine maruz birakilan nanoperiyodik yapiya sahip optik disk plastik kalip olarak kullanilmakta ve plastik kalip elektron-isinli buharlasma yöntemi sayesinde sirasiyla titanyum veya krom (yapiskan tabaka olarak), gümüs ve altin ile kaplanarak altin üst yüzeye sahip metayüzey (biyosensör/metamalzeme plazmonik sensör) elde edilmektedir. Bulusun bir baska uygulamasinda kimyasal asindirma islemine maruz birakilan nanoperiyodik yapiya sahip optik disk püskürtme (sputtering) yöntemiyle gümüs ile kaplanmaktadir. Bulus konusu yöntemin (100) hazirlanan metayüzeye biyomalzeme entegre edilerek yüzeyin islevsel hale getirilmesi (102) adiminda, altin ve gümüs üst yüzeye sahip metayüzeyler istenilen ölçülerde kesilerek etanol ile temizlenmektedir. Ardindan bu yüzeyler 0,05 mg/mL - 1 mg/mL araligindaki konsantrasyonlarda biyomalzeme olan PLL çözeltisi içerisinde 8-12 saat 2-8 oCade inkübe edilerek islevsel hale getirilmektedir. Bulus konusu yöntemin (100) islevsel hale getirilen metayüzeye tohumlama çözeltisi verilerek yüzeyde nanoada olusturulmasi (103) adiminda, PLL çözeltisi ile islevsellestirilmis yüzeye dogrudan tohumlama çözeltisi (kloroaurik asit (HAuCl4) ve hidroksilamin hidroklorür (HONH2.HCl)) verilmektedir. Yüzeyde uM HONH2.HCl verildigi durumda metayüzeyin yüzeyinde nanoada olusumu gerçeklesmektedir. Bulus konusu yöntemin (100) tohumlama çözeltisi verilen metayüzeye eksozom membran proteinine ait antikor verilmesi (104) adiminda, PLL çözeltisi uygulanarak nanoada olusturulan metayüzeye dogrudan baglayici bir protein olan 50-1000 ug/mL Protein G uygulanmaktadir. Protein-protein etkilesimi sayesinde Protein G metayüzeye tutturulmaktadir. Ardindan eksozomlarin membraninda bulunan proteinlerden biri olan CD81 tespiti için 50-500 ug/mL anti-CD81 antikoru yüzeye verilmekte ve 1-5 saat 2-8 oC'de inkübe edilmektedir. Bulus konusu yöntemin (100) bir vücut sivisina yerlestirilen, antikora sahip metayüzey ile antijene iliskin eksozomun yakalanarak hastalik tespiti yapilmasi (105) adiminda, böbrek hücrelerinin besiyerinden mikroakiskan kullanilarak eksozom izole edilmekte ve bu eksozomlarin konsantrasyonu, çapi ve boyut dagilimlari çözeltideki tekil parçaciklarin Brown hareketini izleyen lazer tabanli optik bir teknik (NTA Instrument (NS300, Malvern Instruments Ltd., Malvern, Worcestershire, UK) ile analiz edilmektedir. Konsantrasyonu belirlenen örnekler, 105-109 paitikül/mL olacak sekilde PBS ile seyreltilmektedir. Elde edilen eksozomlar altin nanopaitikül entegre edilen ve nanoada olusturulan yüzeye verilerek dalga boyu kaymasi hesaplanmaktadir. Hesaplanan dalga boyu kaymasi bilgisi isiginda eksozom varligi ve eksozomla iliskili hastalik tespiti yapilmaktadir. Bulusun bir uygulamasinda yöntemin (100) farkli hastaliklara uygulanabilirligini göstermek açisindan yüzeye anti-CD81 antikoru yerine anti-CD63 antikoru verilerek eksozom membraninda yer alan ikinci bir protein (CD-63 antijeni) kullanimi hedeIlenmektedir. PLL çözeltisi uygulanarak altin nanopartikül entegre edilen gümüs üst metayüzeye sahip sensöre dogrudan baglayici bir protein olan 50-1000 ug/mL Protein G uygulanmaktadir. Protein-protein etkilesimi sayesinde Protein G metayüzeye tutturulmaktadir. Ardindan eksozomlarin membraninda bulunan proteinlerden biri olan CD63 tespiti için 50 - 500 ug/mL anti-CD63 antikoru yüzeye verilmekte ve +2-8 oC'de 1-5 saat inkübe edilmektedir. Bulusun bir uygulamasinda yöntemin (100) klinik olarak uygulanabilirligini göstermek için eksozom örnekleri yapay idrar içerisinde hazirlanmaktadir. PLL çözeltisi uygulanarak altin nanopartikül entegre edilen gümüs üst metayüzeye sahip sensöre dogrudan baglayici bir protein olan 50 - 1000 ug/mL Protein G uygulanmaktadir. Protein-protein etkilesimi sayesinde Protein G metayüzeye tutturulmaktadir. Ardindan eksozomlarin membraninda bulunan proteinlerden biri olan CD81 tespiti için 50 - 500 ug/mL anti-CD81 antikoru yüzeye verilmekte ve 2-8 oC'de 1-5 saat inkübe edilmektedir. Böbrek hücrelerinin besiyerinden mikroakiskan kullanilarak eksozom izole edilmekte ve bu eksozomlarin konsantrasyonu, çapi ve boyut dagilimlari çözeltideki tekil parçaciklarin Brown hareketini izleyen lazer tabanli optik bir teknik (NTA Instrument (NS300, Malvem Instruments Ltd., Malvern, Worcestershire, UK) ile analiz edilmektedir. Konsantrasyonu belirlenen örnekler, 105-109 partikül/mL olacak sekilde yapay idrar ile seyreltilmektedir. Elde edilen eksozomlar altin nanopartikül entegre edilmis yüzeylere verilerek dalga boyu kaymasi hesaplanmaktadir. Hesaplanan dalga boyu kaymasi bilgisi isiginda eksozom varligi ve eksozomla iliskili hastalik tespiti yapilmaktadir. Söz konusu yönteme (100) erisilmesi için izlenen tüm deneysel süreç asagida belirtildigi sekilde gerçeklesmistir. Optik disklerin yüzeyinde barindigi nanoperiyodik yapilar kullanilarak altin ve gümüs üst yüzeye sahip metamalzemeler üretildi. Öncelikle DVD,deki plastik koruma katmani biçak yardimiyla kaldirildi ve sirasiyla kimyasal asindirma ve metal kaplama yapilarak plazmonik etki elde edildi. Altin üst yüzey için elektron- isinli buharlasma yöntemiyle titanyum veya krom, gümüs ve altin kaplanip, metamalzeme plazmonik sensörler elde edildi. Gümüs üst yüzey içinse püskürtme (sputtering) yöntemiyle gümüs dogrudan nanoperiyodik yapinin üstüne kaplandi. Elde edilen yüzeylerin yapilarini incelemek için taramali elektron mikroskopisi (Scanning Electron Microscope: SEM) ve atomik kuvvet mikroskopisi (Atomic Force Microscope: AFM) kullanildi. Sekil 2a,da altin üst yüzeye ait bos yüzeye ait SEM, AFM görüntüsü ve profili gösterilmektedir. Sekil 2d,da gümüs üst yüzeye ait bos yüzeye ait SEM, AFM görüntüsü ve profili gösterilmektedir. AFM sonuçlarina göre periyodik yapinin boyutu N740 nm olarak belirlendi (Sekil 2a- 2d). Ayni karakterizasyon islemleri altin nanopartikülleri entegre edilmis ve nanoada olusturulmus yüzeyler için de yapildi. Elde edilen görüntülerde, altin partiküller ve nanoadalar açikça görülmektedir (Sekil 2b-f). Hazirlanan metayüzeylerin hassasiyet performansi ölçümü için farkli oranlarda yüzeydeki kirilma indisini degistirerek yüzeye molekül baglanmasini taklit etmek amaciyla kullanildi. Sekil 3,te bos altin ve gümüs üst yüzeye sahip plazmonik sensör kullanildi ve rezonans kaymalari Sekil 3a-d,de görüldü. Zamana-bagli ölçümlerde ise MATLAB GUI tabanli kullanici dostu bir yazilim üretildi ve rezonans kaymalarinin zamana bagli hesaplanmasiyla elde edildi (Sekil 3e). Dalga boyu kaymasi, kirilma indisi degisimine göre çizilerek dogrusal bir grafik elde edildi (Sekil 3f). Bos altin üst yüzeye sahip plazmonik sensör ile bos gümüs üst yüzeye sahip plazmonik sensör sonuçlari karsilastirildigi zaman, gümüs yüzeyin daha hassas oldugu gözlendi (Sekil 4a). Altin ve gümüs üst yüzeyler elde edildikten sonra istenilen ölçülerde kesilerek etanol ile temizlendi. Daha sonra bu yüzeyler farkli konsantrasyondaki (0,05-1 mg/mL) PLL çözeltisi içerisinde 8-12 saat 2-8 oC'de inkübe edildi. Daha sonra üzerlerine ayni miktarda tohumlama solüsyonu verilerek nanoada olusturuldu. Elde edilen sonuçlara göre, 0,5 mg/mL PLL entegre edilmis yüzeyler en iyi sonucu verdigi görüldü (Sekil 4b). Daha sonraki islemlerde 0,5 mg/mL PPL ile modifiye edilmis yüzeyler kullanildi. Islevsel hale getirilen yüzeyler farkli konsantrasyonlardaki altin nanopartikül solüsyonu içerisinde gece boyunca inkübe edildi. Çok fazla altin nanopartikül entegre edilmesi nanoperiyodik yapiyi bozdugu için sinyal kaybina neden oldu. Elde edilen sonuçlara göre stok altin nanopartikül solüsyonunun 1:2 - 1:50 oranlarinda seyreltilmesi gerektigi gözlendi (Sekil 4c). Ayni islem gümüs üst metayüzeye sahip sensör ile tekrarlandi (Sekil Nanoada olusumu ise önce altin nanopartikül entegre edilmis yüzeylerde denendi ancak herhangi bir degisim gözlenmedi. Bu nedenle, PLL ile islevsellestirilmis yüzeye dogrudan tohumlama çözeltisi (kloroaurik asit (HAuCl4) ve hidroksilamin hidroklorür (HONH2.HCl)) verildi. Yüzeye nanoada olusturmak için, farkli konsantrasyonlarda PLL, kloroaurik asit (HAuCl4) ve hidroksilamin hidroklorür (HONH2.HCl) kullanilarak protokol optimize edildi. Sekil 5c,de görüldügü üzere, HM HAuCl4: 20 HM HONH2.HCl karistirilarak tohumlama yapildigi zaman en yüksek dalga boyu kaymasi gözlendi. Kirilma indisi duyarliligi (1) numarali denklem kullanilarak hesaplandigi zaman, en yüksek deger 0.5 mg/mL PLL konsantrasyonu üzerine 121 (v:v) 20 HM HAuCl4: 20 HM HONH2.HCl tohumlama yapildigi zaman elde edildi (Tablo 1). Daha sonraki adimlar, optimize edilen bu konsantrasyonlar üzerinden devam edildi. Kirilma indisi duyarliligi = 'ün ............. (1) Tablo 1: Farkli konsantrasyonlardaki tohumlama yapilarak sensörün kirilma indisi duyarliligi hesaplanmasi Örnek Kirilma indisi duyarliligi Bos altin üst yüzey 438.078 1 mg/mL PLL - 10 pM Tohumlama 500.957 Optimize edilen PLL konsantrasyonundan sonra, farkli konsantrasyondaki tohumlama solüsyonlari ( yüzeylere verilerek sinyal iyilestirilmesinde fark olup olmadigi gözlendi. Elde edilen sonuçlara göre en iyi sinyal 10 MM tohumlama solüsyonu verildigi zaman gözlendi (Sekil 4e-f). Gerçeklestirilen deneyde eksozom membranindaki proteinlerden biri olan CD81'e odaklanildi ve sensör yüzeyi anti-CD81 antikoru ile islevsellestirildi. Bunun için bos altin yüzey üzerine anti-CD81 antijenini tutturmak adina katman katman yüzey kimyasi yapmak gerekiyor. Katman katman kimyayi olusturmak için sensör yüzeyi, oda sicakliginda gece boyunca 1-10 mM 11-merkaptoundekanoik asit (MUA) ile islevsellestirildi, böylece yüzeyde karboksil gruplari olusturuldu. Inkübasyon süresi sona erdikten sonra baglanmamis moleküller etanol ile yikanarak uzaklastirildi ve yüzeyi oda sicakliginda kurutuldu. Daha sonra, hazirlanan mikroakiskan çip sensör yüzeyi ile birlestirildi ve 1-Etil-3-(3- dimetilaminopropil)karbodiimid (EDC) ( (50 mM) karisimi kanallara verildi ve 20-60 dakika oda sicakliginda inkübe edildi. Daha sonra baglanmamis molekülleri uzaklastirmak için kanallar PBS ile yikandi. Üçüncü adim da ise EDC/NHS ile olusturulan süksinimit gruplarina Protein G baglandi. Bu adim için 100 ug/mL Protein G PBS içinde hazirlandi ve kanallar araciligiyla uygulandi ve gece boyunca 2-8 oC'de inkübe edildi ve inkübasyon sona erdiginde kanallar PBS ile yikandi. Son adim olarak 50-500 ug/mL anti-CD81 antijeni yüzeye verildi ve 1-5 saat boyunca 2-8 oC'de inkübe Sensör yüzeyine yerlestirilen mikroakiskan çipler, poli(metil metakrilat) (PMMA, 2 mm kalinliginda) ve çift taraIli yapiskan film (DSA, 50 um kalinliginda) ile hazirlandi. PMMA ve DSA katmanlari ayri ayri RDWorks programi kullanilarak tasarlandi ve lazer kesici (LazerFiX, Türkiye) ile kesildi. PMMA katmaninda sivi girisi ve çikisi için bosluklar açildi ve kilcal hortumlarin (tübingler) bu bosluklara epoksi reçinesi yardimi ile sabitendi. DSA katmaninda sivi akisi için kanallar olusturuldu ve PMMA ile birlestirildi. Hazirlanan mikroakiskan çip, DSA yardimiyla sensör yüzeyine yapistirildi. Tohumlama yapilan yüzeyde, PLL uygulandigi için, MUA ve EDC/NHS kimyasi adimlari elenerek, dogrudan 50-1000 ug/mL Protein G uygulandi. Protein-protein etkilesimi sayesinde Protein G yüzeye tutturuldu. Daha sonra 50-500 ug/mL anti- CD81 antikoru yüzeye verildi ve 1-5 saat 2-8 oC'de inkübe edildi. Ayni islem anti- CD63 antikoru için de gerçeklestirildi. Daha sonra, örnek olarak kullanilabilmesi için eksozomlar, böbrek hücrelerinin besiyerinden mikroakiskan kullanilarak izole edildi. Izole edilen eksozomlarin konsantrasyonuni, çapini ve boyut dagilimlarini çözeltideki tekil parçaciklarin Brown hareketini izleyen lazer tabanli bir optik teknik olan NTA Instrument (NS300, Malvem Instruments Ltd., Malvern, Worcestershire, UK) kullanilarak analiz edildi. Konsantrasyonu belirlenen örnekler, 105-109 paitikül/mL olacak sekilde PBS ve yapay idrar ile seyreltildi. Elde edilen eksosomlar, islevsellestirelen iki yüzeye de verildi ve dalga boyu kaymasi hesaplandi. Bos altin üst yüzeye sahip plazmonik sensörde, Sekil 5a,da gösterildigi üzere dalga boyu kaymasi 1.27 nm (ortalama 0.94 ± 0.29 nm) olarak hesaplanirken, yüzeye altin nanopartikül entegre edildigi zaman bu kayma 1.82 nm (ortalama 1.54±0.52 nm) olarak hesaplanirken (Sekil 5b), tohumlama metoduyla nanoada olusturuldugu zaman bu kayma 1.7 nm (1.27±0.50 nm) olarak belirlendi (Sekil 50). Bu veriler normalize edildigi zaman (0-1), altin nanopartikül entegrasyonu bos yüzeye göre 5,5 kat sinyal aitirirken nanoada olusturulmasi sinyali 3,5 kat arttirilidigi görüldü (Sekil 5e). Sekil 6a,da gösterildigi üzere, bos gümüs üst yüzeye sahip sensörün dalga boyu kaymasi 1.11 nm (ortalama 0.77±0.34 nm) olarak hesaplanirken, yüzeye altin nanopartikül entegre edildigi zaman bu kayma metoduyla nanoada olusturuldugu zaman bu kayma 0.43 nm (0.42±0.20 nm) olarak belirlendi (Sekil 60). Bu veriler normalize edildigi zaman (0-1), altin nanopartikül entegrasyonu bos yüzeye göre 2,6 kat sinyal aitirirken nanoada olusturulmasi sinyali azaltmistir (Sekil 6e). Bulus konusu yöntem (100) sayesinde âtil optik disklerden elde edilen nanoyapilar düsük maliyetli sensör üretimine olanak saglamaktadir. Kimyasal yollarla entegre edilen altin nanopartiküller ve olusturulan nanoadalar daha hassas biyobelirteç tayinine olanak sunmaktadir. Bu temel kavramlar etrafinda, bulus konusu "Biyomalzeme Entegre Edilmis Metayüzeye Sahip Bir Biyosensör Elde Etme Yöntemi (100)" için çok çesitli uygulamalarin gelistirilmesi mümkün olup, bulus burada açiklanan örneklerle sinirlandirilamaz, esas olarak istemlerde belirtildigi gibidir. TR TR