TR2021015696A2 - Pri̇mer fi̇broblast hücre karakteri̇zasyonu i̇çi̇n bi̇r bi̇yosensör - Google Patents

Abstract

Bu buluş, biyosensörler alanında kullanılan, hücre kültürü biyobelirtecinin, bir elektrokimyasal iletici üzerindeki impedans sinyallerinin değiştirecek şekilde bağlanma veya başka şekilde reaksiyona sokmak için fonksiyonel yüzeylere sahip olan ileticileri içeren, elektrokimyasal özellikte olup hücre lizatlarındaki HSP47 protein miktarının belirlenmesine olanak veren ve primer fibroblast hücre karakterizasyonu için bir biyosensör (1) ile ilgilidir.

Description

TARIFNAME PRIMER FIBROBLAST HÜCRE KARAKTERIZASYONU IÇIN BIR BIYOSENSÖR Teknik Alan Bu bulus, biyosensörler alaninda kullanilan, fibroblast hücre kültürü biyobelirtecinin, bir elektrokimyasal iletici üzerindeki impedans sinyallerinin degistirecek sekilde `baglanma veya baska sekilde reaksiyona sokmak için fonksiyonel yüzeylere sahip olan ileticileri içeren, elektrokimyasal özellikte olup hücre lizatlarmdaki HSP47 protein miktarinin belirlenmesine olanak veren ve primer fibroblast hücre karakterizasyonu için bir biyosensör ile ilgilidir. Önceki Teknik Biyosensörler, sadece analit molekülüne afinite gösteren bir biyolojik algilayici yani enzim, reseptör, antikor, DNA veya protein molekülünün bir fizikokimyasal iletici (“transducer”) üzerine immobilizasyonu ile gelistirilen analiz sistemleridir.

Biyolojik algilayici ile analit molekülü arasindaki etkilesimin sonucunda ortaya çikan sinyaller “transducer” tarafindan analiz sistemine iletilir ve bu sinyalin konsantrasyona bagli karsiliginin analizi ile ölçüm gerçeklestirilir. Biyosensörler, üzerlerindeki biyoalgilayiciya göre katalitik veya afinite temelli olabilmektedir.

Katalitik temelli biyosensör sistemlerinde bir enzim analit molekülünü enzimatik olarak parçalar ve açiga çikan ikincil moleküller üzerinden veya bu ikincil molekülleri ölçülebilir hale getirebilen üçüncü] moleküller ile ölçüm gerçeklestiriiir. Afinite temelli biyosensörlerde ise antijen-antikor, DNA-DNA, protein-ligand baglanmasinin derecesinin ölçülmesi üzerinden analiz gerçeklestirilir.

Afinite temelli biyosensörler, örnekleri verilen reseptör-ligand çiftleri disinda ek bir moleküle gerek duymamalari nedeniyle katalitik olanlara göre daha avantajlidir.

Her iki tipteki biyosensörler de temelde, “transducer' tipine göre elektrokimyasal, optik ve piezoelektrik temelli tasarlanabilmektedir. Bu fizikokimyasal degismeler sonucunda açiga çikan sinyaller elektrokimyasal ise, `transducer, tipi elektriksel sinyalleri algilayici olabilmektedir. Örnegin bir enzim bir substrati dönüstürürken elektroaktif ürünler olusuyor veya elektrot yüzeyinin yük dagilimina bagli iletkenlik degisiyorsa analitin elektrokimyasal olarak ölçülmesi daha avantajlidir.

Buna karsilik olusan ürün optik olarak isik soguran veya emisyon yapan bir ürünse, bu durumda optik biyosensör kullanilmalidir. Basinçta, hizda, gerilmede bir degisim oluyorsa bu degisimleri elektriksel yüke çeviren piezoelektrik biyosensör tasarlamak daha uygundur. Bu yöntemler içerisinde girisime en az açik, buna karsilik hemen hemen her tipteki madde içerisinde ölçüm olanagi saglayabilecek sekilde en pratik ve en düsük maliyetli olan elektrokimyasal biyosensör sistemleridir. Elektrokimyasal biyosensör sistemlerinin düsük maliyetli ve kolay kullanilabilir olmalari, bilimsel çalismalarda da daha fazla tercih edilmelerine neden ohnakt ad 1r.

Biyoafinite esasli olarak gelistirilen biyosensör sistemleri, biyomolekül ve analitin birbirine baglanma kinetigine dayali biyosensör sistemleridir. Biyoafinite esasli biyosensörlerde biyotanima ajani olarak immün sistem biyomolekülleri, tek Zincirli DNA, yapay tek Zincirli DNA (Aptamer) veya hücre yüzey reseptörleri kullanilabilir. Biyosensörler ile son yillarda saglik alaninda son derece spesifik analizler yapilabilmektedir. Elektrokimyasal olarak gelistirilen afinite biyosensörleri, genellikle ikincil bir antikor molekülden veya analit molekülüne spesifik ikincil isaretçi bir molekülden gelen sinyallerle ölçümü temel alir.

Genellikle ikincil molekül elektrik akimini ölçülebilir bir sekilde degistirdiginden elektrokimyasal ölçüm gerçeklestirilebilir. moleküler bir saperondur ve kollajen biyosentezinde rol oynar. Deri fibroblastlan için oldukça kullanisli bir belirteçtir. Genellikle immünhistokimya yöntemi ile semi-kantitatif olarak belirlenmektedir. Immünhistokimya geleneksel, ancak çok basamakli bir süreçtir. Fibroblast karakterizasyonu için daha hizli ve kültür süreci boyunca kontrole olanak saglayabilecek bir sisteme ihtiyaç vardir. HSP 47 biyomolekülünün ölçümü, enzim bagli immunosorbent assay (ELISA) denilen ve kompleks bir kit sistemi ile farkli kimyasallarin farkli bekleme sürelerinde 96 kuyulu bir plak içindeki örneklere eklenerek isik temelli bir ölçüm alinmasi ile (spektrofotometrik) kantitatif olarak yapilmaktadir. Bununla birlikte ayrica, seçici olarak bir örnek üzerine damlatilan floresans isaretli bir immün boya (immunohistokimya/immunfloresan) ile genel olarak gözleme dayali bir metot uygulanarak da hedef biyomolekülün belirleme çalismalari yapilmaktadir. ELISA metodu, örnegin fiziksel özelliklerinden etkilenmektedir. Yani ölçüm aninda örnekte bulaniklik veya seffaf olmayan bir durum söz konusu oldugunda, ölçüm yapilamamakta ve yanlis sonuç elde edilmektedir. Ayrica ELISA islemi uzun süre alan ve gelismis isik teknolojisine sahip cihazlar ile ölçülebilen ve mutlaka cihaz konusunda yetkin bir personel gerektiren bir yöntemdir. Immünohistokimya (I H K) ise tamamen laboratuvar ortaminda yapilmasi gereken ve altyapi gereklilikleri olan bir metoddur.

Mevcut durumlarda kullanilan geleneksel yöntem olan immünhistokimyanin (I H K) basvuru konusu bulus ile karsilastirilmasi durumunda geleneksel yöntemde ön islem olarak 120 dakika süren fiksasyon, yikama ve bloklama islemleri sürerken basvuru konusu bulustaki biyosensör ile sadece mekanik yolla hücre parçalama islemi (5 dakika) gerçeklestirilmektedir. Geleneksel yöntem (IHK) ile toplam islem süresi 36 saat sürerken basvuru konUSu bulustaki biyosensör ile yalnizca 0,16 saat sürmektedir. Mevcut geleneksel yöntemin (IHK) maliyeti basvuru konusu bulusta yer alan biyosensörden çok fazladir. Geleneksel yöntemde (IHK) duyarlilik semi kantitatif iken basvuru konusu bulustaki biyosensör için ise kantitatiftir. Geleneksel yöntem (IHK) ile hatali pozitif veya negatif sonuç alinabilirken basvuru konusu biyosensör ile yalnizca ilgili proteine özgü sonuçlar alinabilmektedir. Geleneksel yöntem (IHK) tek kullanimlik iken basvuru konusu biyosensör ise tekrar kullanilabilir özelliktedir. Geleneksel yöntemin (IHK) kullanimi sirasinda fluoresan mikroskop gerekli iken basvuru konusu biyosensörde ise yalnizca bir bilgisayar kullaniini yeterlidir.

Teknigin bilinen durumunda yer alan U numarali Birlesik Devletler patent basvuru dokümaninda yer alan bulusta hücre empedans sensörlerinden bahsedilmektedir. Söz konusu dokümanda biyolojik hücreler de dâhil olmak üzere kimyasal ve biyolojik numuneleri algilamak için bir hücre elektrot empedans sensörünü tasarlamaya ve ölçmeye yönelik yöntemler ve aparatlardan bahsedilmektedir. Buradaki hücre elektrot empedans sensörü tasarlama yöntemi, bir hücresiz hücre elektrot empedansi ve bir hücre kapli hücre elektrot empedansinin belirlenmesi; hücre elektrot empedans ölçüm sisteminin sensör hassasiyetinin elde edilmesi ve sensör hassasiyetini en üst düzeye çikarmak için hücre elektrot empedans sensörünün bir veya daha fazla tasarim parametresinin seçilmesi yöntem adimlarini içermektedir. Elektrotlar arasindaki AC sinyalinin frekansi 10 kHz ila 40 kHz arasinda degistiginde, sensörün hassasiyeti maksimuma çikar. Teknigin bilinen durumunda yer alan dokümandabulustaki hücre empedans sensörünün çalismasi sirasinda, öncelikle bir hücresiz hücre elektrot empedansi ve bir hücre kapli hücre elektrot empedansinin belirlenmesi, hücre elektrot empedans ölçüm sisteminin sensör hassasiyetinin elde edilmesi ve sensör hassasiyetini en üst düzeye çikarmak için hücre elektrot empedans sensörünün bir veya daha fazla tasanm parametresinin seçilmesi islem adimlan yapilmaktadir. Ancak söz konusu islem adimlari genel olarak tüm sensör sistemlerinde benzer sekilde gerçeklesmektedir. Basvuru konusu bulusta söz konusu dokümandan farkli olarak HSP 47 biyomolekülünün ölçümü yapilmaktadir.

Teknigin bilinen durumunda yer alan W numarali Birlesik Devletler model dokümaninda yer alan bulusta hücre kültürü substrati, hücre kültürü için empedans sensörü ve hücre kültürü için empedans sensör dizisi kullanarak hücre durum tanimlama yönteminden bahSedilmektedir. Ayrica söz konusu dokümanda hücre kültürü için isi jeneratörü, hücre kültürü için sicaklik sensörü ve hücre kültürü platformundan bahsedilmektedir. Söz konusu dokümanda bir hücre kültürü substrati, hücre kültürü için bir empedans sensörü, hücre kültürü için bir empedans sensör dizisi ve bunu kullanan bir hücre durumu tanimlama yöntemi, hücre kültürü için bir isi üreteci, hücre kültürü için bir sicaklik sensörü ve bir hücre kültürü platformu bulunmaktadir. Hücre kültürü substrati, bir grafen oksit kapli polimer substrati içerir. Hücre kültürü substratinin bin'ktirilmesi kolaydir ve bu nedenle kitle hücre kültürü için uygundur. Hücre kültürü için bir empedans sensörü olarak hizmet veren ve hücrelerin kültürlenmesi için bir hücre kültürü substrati üzerine yerlestirilen ve hücrelerin kültür durumlanni izlemek olan hücre kültürü empedans sensörü, hücre kültürü substrati üzerinde düzenlenen bir birinci elektrot ve bir ikinci elektrot içermektedir. Hücre kültürü için empedans sensör dizisi, hücrelerin kültürlenmesi için bir hücre kültürü substrati üzerine yerlestirilen ve hücrelerin kültür durumlarini izlemek olan hücre kültürü için bir empedans sensör dizisi olarak hizmet etmekte ve hücre kültürü substrati üzerinde düzenlenen çok sayida empedans sensörünü içermekted ir.

Basvuru konusu bulusta yer alan primer fibroblast hücre karakterizasyonu için bir biyosensör, hücre kültür numunelerinde HSP47 protein miktarini hizlica tespit edebilen elektrokimyasal sensör ile ilgilidir. Basvuru konusu bulustaki biyosensörde, HSP47, sensör yüzeyinde bulunan ve sadece kendine özgü antikora baglanmaktadir. Basvuru konusu bulustaki bIVOSensörü ile biyoreseptör-analit molekülünün etkilesimi yüzey kapasitansi veya impedansi ölçümü ile tayin edilebilmekted ir. Impedans ve kapasitans elektriksel olarak tamamen elektrotlarin yüzey karakteristigini inceleyebilme olanagi sundugundan sadece biyoreseptör- analit”in baglanmasi ölçüm için yeterli olmaktadir. Biyosensör sisteminde, elektrotlarin hazirlanmasi en özgün ve yenilikçi yandir. Burada biyotanima reseptörü olarak kullanilan anti-HSP47 antikoru kullanilmistir. Antikorun elektrot üzerine saglikli bir sekilde irmnobilizasyonunun saglanmasi için elektrot iletkenligi ve yüzeyi de göz önüne alinmaktadir.

Mevcut teknikte basvuru konusu bulusta yer alan teknik özellikler ve basvuru konusu bulusun sagladigi teknik etkilere iliskin bir açiklama yer almamaktadir.

Mevcut uygulamalarda kullanilan örnegin kompozisyonundan etkilenmeyen, daha düsük maliyetli, laboratuvar ortamina gerek duymayan, düsük hacimda örnek ile dogrudan ölçüm yapilabilen ve bu alanda çalisan kisilerin kolaylikla kullanabilecegi bir sistem olan, süre olarak 30 dakikanin altinda ölçüm ile zamandan kazandiran ve daha duyarli bir ölçüm metodu sunulan bir biyosensörüne rastlanilmamaktad 1r.

Bulusun Amaçlari Bu bulusun amaci, örnegin kompozisyonundan etkilenmeyen primer fibroblast hücre karakterizasyonu için bir biyosensör gerçeklestirmektir.

Bu bulusun bir diger amaci, daha düsük maliyetli primer fibroblast hücre karakterizasyonu için bir biyosensör gerçeklestirmektir.

Bu bulusun bir diger amaci, laboratuvar ortamina gerek duymayan primer fIbrObIaSt hücre karakterizasyonu için bir biyosensör gerçeklestirmektir.

Bu bulusun bir diger amaci, düsük hacimde örnek ile dogrudan ölçüm yapilabilen primer fIbrOblaSt hücre karakterizasyonu için bir biyosensör gerçeklestirmektir.

Bu bulusun bir diger amaci, düsük hacimda örnek ile dogrudan ölçüm yapilabilen ve bu alanda çalisan kisilerin kolaylikla kullanabilecegi bir sistem olan primer fibroblast hücre karakterizasyonu için bir biyosensör gerçeklestirmektir.

Bu bulusun bir diger amaci, süre olarak 30 dakikanin altinda ölçüm ile zamandan kazandiran primer fibroblast hücre karakterizasyonu için bir biyosensör gerçeklestirmektir.

Bu bulusun bir diger amaci, daha duyarli bir ölçüm metodu sunan primer fibroblast hücre karakterizasyonu için bir biyosensör gerçeklestirmektir.

Bu bulusun bir diger amaciI biyoreseptör-analit molekülünün etkilesimi yüzey kapasitansi veya impedansi ölçümü ile tayin edilebilen primer fibroblast hücre karakterizasyonu için bir biyosensör gerçeklestimiektir.

Bu bulusun bir diger amaci, biyosensör, hücre kültür numunelerinde HSP47 protein miktarini hizlica tespit edebilen primer fibroblast hücre karakterizasyonu için bir biycsensör gerçeklestirmektir.

Bu bulusun bir diger amaci, impedans ve kapasitans elektriksel olarak tamamen elektrotlarin yüzey karakteristigini inceleyebilme olanagi sunan primer fibroblast hücre karakterizasyonu için bir biyosensör gerçeklestirmektir.

Bu bulusun bir diger amaci, hücre kültürü biyobelirtecinin, bir elektrokimyasal iletici üzerindeki impedans sinyallerinin degistirecek sekilde baglanma veya baska sekilde reaksiyona sokmak için fonksiyonel yüzeylere sahip olan ileticileri içeren, primer fibroblast hücre karakterizasyonu için bir biyosensör gerçeklestirrnektir.

Bu bulusun bir diger amaci, elektrokimyasal özellikte olup hücre lizatlarindaki HSP47 protein miktarmm belirlenmesine olanak veren primer fibroblast hücre karakterizasyonu için bir biyosensör gerçeklestirmektir.

Bulusun Kisa Açiklamasi Bu bulusun amacina ulasmak için gerçeklestirilen, ilk istem ve bu isteme bagli diger istemlerde tanimlanan bir primer fibroblast hücre karakterizasyonu için bir biyosensör ile biyolojik örneklerdeki HSP47 tayini su sekilde gerçeklestirilmektedir. Öncelikle altin elektrot, su ve etanol içeren bir kapa konularak sonik banyoda iki dakika bekletilerek safsizliklari giderihnektedir.A1tn-i elektrot, Saf su ile yikanip azot gazi altinda kurutulmaktadir. Bu adimdan sonra 1518 ölçümü yapilmaktadir (AuE). Sonrasinda altin elektrot yikanip kurutulduktan sonra, 100 mM Cys içeren etanol içerisinde bir saat bekletilmektedir. Bekleme isleminden sonra altin elektrotun, önce etanol sonrasinda saf. su ile nazikçe yikanarak EIS ölçümü yapilmaktadir (AuE/Cys). AuE/Cys elektrotun üzerinde grafen tabakalarinin `kovalent immobilizasyonu için %5”lik glutaraldehit damlatilarak 30 dakika bekletilmekted ir. Ardindan elektrot yikanarak üzerine 10ttL grafen damlatilarak 1 saat bekletilmektedir. 1 saatin sonunda baglanmayan grafenler yikanarak altin elektrot yüzeyinden uzaklastirilmakta ve altin elektrotun üzerine grafen tabakalarinin baglanma düzeyi EIS ile ölçülmektedir (AuE/Cys/GPH). AuE/Cys/GPH elektrotun üzerine anti-HSP47 baglanmasi için grafen üzerindeki amino gruplarini aktiflemek amaciyla, %5°lik glutaraldehit damlatilarak 30 dakika inkübe edilrnektedir. Sonrasinda elektrot yüzeyine 20iiL anti-HSP47 damlatilarak 1 saat inkübe edilmektedir. Ardindan fazla miktardaki anti-HSP47 yikanarak yüzeyden uzaklastirilARAK CV ve EIS ile elektrot karakterize edilmektedir (AuE/Cys/GPH/anti-HSP47). CV verileri EISveriIeri ile uyumlu bir sekilde karakterize edilebilmektedir.

Bulusun Ayrintili Açiklamasi Bu bulusun amacina ulasmak için gerçeklestirilen biyosensör, ekli sekillerde gösterilmis olup bu sekiller; Sekil 1. Biyosensör sisteminin perspektif görünüsüdür.

Sekil 2. Biyosensör sisteminin tabakalarinin patlatilmis görünüsüdür.

Sekil 3. Biyosensörün yandan görünüsüdür.

Sekil 4. Biyosensörün elektriksel devre semasi ile birlikte yandan patlatilmis görünüsüdür.

Sekil 5. Biyosensörün elektriksel devre semasimn görünüsüdür.

Sekil 6. Biyosensörün elektriksel devre semasinin sematik görünüsüdür.

Sekil 7. Randles devre semasinin sematik görünüsüdür.

Sekillerdeki parçalar tek tek numaralandirilmis olup, bu numaralann karsiligi asagida verilmistir.

Biyosensör Yalitkan destek tabaka Referans elektrot Çalisma elektrodu Yardimci elektrot iletken bilesenler Plastik destek tabaka Ö. Örnek sivisi Bulus, biyosensörler alaninda kullanilan, hücre kültürü biyobelirtecinin, bir elektrokimyasal iletici üzerindeki impedans sinyallerinin degistirecek sekilde baglanma veya baska sekilde reaksiyona sokmak için fonksiyonel yüzeylere sahip olan ileticileri içeren, elektrokimyasal özellikte olup hücre lizatlarindaki HSP47 protein miktarinin belirlenmesine olanak veren ve primer fibroblast hücre karakterizasyonu için bir biyosensör (1) olup, özelligi; biyosensörün (l) en az bir yalitkan destek tabaka (2), en az bir referans elektrot (3), en az bir çalisma elektrodu (4), en az bir yardimci elektrot (5), en az bir iletken bilesen (6), en az bir plastik destek tabaka (7) içermesi, biyosensörde (1), öncelikle elektrotlar saf su ile yikanarak yüzeylerindeki kirlilikler uzaklastirilmasi, biyosensörde (l) yikama sonrasi azot gazi altinda kurutulan elektrotlarin (3,4,5), redoks probu içerisine yerlestirilerek E18 ve CV ölçümü ile elektrokimyasal yüzey karakterizasyonunun yapilmasi, biyosensörde (1) altin elektrot (AuE) elektrot modifikasyon adimlarinin gerçeklestirilmesi, altin elektrot (AuE) elektrot modifikasyon adimlarinda sirasiyla AUSCE immobilizasyona hazirlanmasi, AUSCE/SAM modifikasyonu.

AuSCE/SAM/Grafen modifikasyonu ve AuSCE/SAM/Grafen/anti-HSP-47 modifikasyonu islemlerinin gerçeklestirilmesi, - HSP47 biyosensörünün (1) optimizasyonUnun gerçeklestirilmesi, - biyosensör (1) ile biyolojik örneklerdeki (Ö) HSP47 tayin edilmesidir.

Basvuru konusu biyosensör (1), biyosensörler alaninda kullanilmaktadir.

Biyosensör (1), hücre kültürü biyobelirtecinin, bir elektrokimyasal iletici üzerindeki impedans sinyallerinin degistirecek sekilde baglanma veya baska sekilde reaksiyona sokmak için fonksiyonel yüzeylere sahip olan ileticileri içermektedir. Biyosensör (1), elektrokimyasal özellikte olup hücre lizatlarindaki HSP47 protein miktarinin belirlenmesine olanak vermektedir. Biyosensör (1)i primer fibroblast hücre karakterizasyonu için kullanilmaktadir. Primer fibroblast hücre karakterizasyonu için biyosensör (1), örnegin (Ö) kompozisyonundan etkilenmemektedir. Primer fibroblast hücre karakterizasyonu için biyosensör (l), mevcut sistemlerde kullanilan sistemler arasinda daha düsük maliyetlidir. Primer fibroblast hücre karakterizasyonu için biyosensör (1), laboratuvar ortamina gerek duymamaktadir. Primer fibroblast hücre karakterizasyonu için biyosensör (1), düsük hacimde örnek ile dogrudan ölçüm yapilabilmektedir. Primer fIbrObIaSt hücre karakterizasyonu için biyosensör (1), düsük hacimde örnek (Ö) ile dogrudan ölçüm yapilabilmesini saglamakta ve bu alanda çalisan kisilerin kolaylikla kullanabilecegi bir sistem olmaktadir. Primer fibroblast hücre karakterizasyonu için biyosensör (1), süre olarak 30 dakikanin altinda ölçüm ile zamandan kazandirmaktadir. Primer fibroblast hücre karakterizasyonu için biyosensör (1), daha duyarli bir ölçüm metodu sunmaktadir.

Basvuru konusu olan primer fibroblast hücre karakterizasyonu için biyosensör (l), biyoreseptör-analit molekülünün etkilesiminin yüzey kapasitansi veya impedansi ölçümü ile tayin edilebilmesini saglamaktadir. Primer fibroblast hücre karakterizasyonu için biyosensör (l), biyosensör, hücre kültür numunelerinde HSP47 protein miktarini hizlica tespit edebilen primer fibroblast hücre karakterizasyonu içiii bir biyosensör gerçeklestimiektir, Primer fibroblast hücre karakterizasyonu için biyosensör (1), impedans ve kapasitans elektriksel olarak tamamen elektrotlann yüzey karakteristigini inceleyebilme olanagi sunmaktadir.

Primer fibroblast hücre karakterizasyonu için biyosensör (l), hücre kültürü biyobelirtecinin, bir elektrokimyasal iletici üzerindeki impedans sinyallerinin degistirecek sekilde baglanma veya baska sekilde reaksiyona sokmak için fonksiyonel yüzeylere sahip olan ileticileri içennektedir. Primer fibroblast hücre karakterizasyonu için biyosensör (1), elektrokimyasal özellikte olup hücre lizatlarindaki HSP47 protein miktarinin belirlenmesine olanak vermektedir.

Basvuru konusu bulus olan primer fibroblast hücre karakterizasyonu için biyosensör (1), yalitkan destek tabaka (2), referans elektrot (3)! çalis ma elektrodu (4), yardimci elektrot (5), iletken bilesenler (6) ve plastik destek tabakasi (7) içermektedir.

Basvuru konusu olan primer fibroblast hücre karakterizasyonu için biyosensör (1), hücre kültür numunelerinde HSP47 protein miktarini hizlica tespit edebilen elektrokimyasal sensör ile ilgilidir. Primer fibroblast hücre karakterizasyonu için biyosensörde (l), HSP47I kendi yüzeyinde bulunan ve sadece kendine özgü antikora baglanmaktadir. Primer fibroblast hücre karakterizasyonu için biyosensör (1) ile biyoreseptör-analit molekülünün etkilesimi yüzey kapasitansi veya impedansi Ölçümü ile tayin edilebilmektedir. Primer fibroblast hücre karakterizasyonu için biyosensörde (1), impedans ve kapasitans elektriksel olarak tamamen elektrotlann yüzey karakteristigini inceleyebilme olanagi sundugundan sadece biyoreseptör-analit°in baglanmasi ölçüm için yeterli olmaktadir. Primer fibroblast hücre karakterizasyonu için biyosensörde (l), elektrotlann hazirlanmasi sistemin en önemli kismidir. Primer fibroblast hücre karakterizasyonu için biyosensörde (1), biyotanima reseptörü olarak kullanilan anti-HSP47 antikoru kullanilmistir. Primer fibroblast hücre karakterizasyonu için biyosensörde (1), antikorun elektrot üzerine saglikli bir sekilde immobilizasyonunun saglanmasi için elektrot iletkenligi ve yüzeyi göz önüne alinmaktadir.

BUIUSun bir uygulamasinda biyosensörde (l), öncelikle elektrotlar saf su ile yikanarak yüzeylerindeki kirlilikler uzaklastirilmistir. Sonrasinda azot gazi altinda kurutulan elektrotlar, redoks probu içerisine yerlestirilerek E18 ve CV ölçümü ile elektrokimyasal yüzey karakterizasyonu yapilmistir. EIS için elde edilen impedans egrileri PSTrace 5.7 yazilimi ile analiz edilerek hesaplanmistir. Elektrokimyasal devre modeli olarak Randles devre modeli kullanilmistir. EIS parametreleri altin elektrot için ise 10.000 Hz ile 0,05 Hz arasinda frekans taramasi yapilmasi asamasinda her iki elektrota uygulanmistir.

Frekans olusturabilmek için alternatif akim (alternative current-AC) potansiyeli 10 mV olarak belirlenmistir. EIS birimi ise ohm,dur. EIS ile elde edilen veriler, Nyquist Plot seklinde elde edilmis ve EIS verisinin hesaplanmasi için devre semasi R(C(RW)) kullanilmistir. CV ölçümleri ise -0,2 ile 0,5 V arasinda 100 mV/sn tarama hizinda gerçeklestirilmistir. Elektrotlar modifiye edilmeden elde edilen EIS ve CV verileri yalin elektrot sinyali olarak belirlenerek immobilizasyonun izlenmesi için bir baselirie olusturulmustur.

B UIUSun bir uygulamasinda altin elektrot (AuE) elektrot modifikasyon adimlari su sekilde gerçeklestirilmektedir. Öncelikle Altin SCE(AuSCE) olarak SAM/Grafen/Anti- HSP-47 kullanilmaktadir. Ilk olarak AuSCE immobilizasyona hazirlanmaktadir. Öncelikle altin elektrot, su ve etanol (lzl) içeren bir kaba konularak sonik banyoda2 dakika bekletirlerek safsizliklari giderilmekte saf su ile yikanip azot gazi altinda kurutulmaktadir. Sonrasinda AuSCE/SAM mod ifikasyonu gerçeklestirilmektedir. AuSCE/SAM modifikasyonu sirasinda altin elektrot lOOmM Cys içeren etanol içerisinde bekletilmektedir. Bekleme isleminden sonra elektrot önce etanol sonrasinda saf su ile nazikçe yikanarak ve azot gazi ile kurutulmaktadir. AuSCE/SAM modifikasyonu sonrasinda AuSCE/SAM/Grafen modifikasyonu gerçeklestirilmektedir. AuSCE/SAM/Grafen modifikasyonu sirasinda SAM (Cys) tiyol üzerinden AuSCE üzerine baglanacagindan, NH2 ucu açikta birakilmaktadir. Öncelikle AuSCE/SAM %0,25 glutaraldehit içerisinde bekletilmektedir. Sonrasinda ise üzerinde NH2 ile fonksiyonelize edilmis 1mg/mL grafen çözeltisi damlatilmaktadir. Son olarak ise elektrot saf su ile yikanarak azot gazi ile nazikçe kurutularak bir sonraki immobilizasyon için hazirlanmaktadir.

AuSCE/SAM/Grafen modifikasyonu sonrasinda ise AuSCE/SAM/Grafen/anti- HSP-47 modifikasyonu gerçeklestirilmektedir. AuSCE/SAM/Grafen/anti-HSP-47 modifikasyonu sirasinda AuSCE/SAM/Grafen elektrot üzerinde bulunan NHz uçlari %O,25 gluaraldehit ile aktive edilerek ve üzerine anti-HSP-47 damlatilarak inkübe edilinektedir. Elektrot yikandiktan sonra lmg/mL insan serum albümini (HSA) içeren çözeltiye daldmlarak açik bulunan anti-HSP-47 baglanmamis uçlar kapatilmaktadir. Bu islemlerde her adim CV ve EIS ile kontrol edilerek biyosensör (1) sistemi gelistirilerek optimizasyon adimlarina geçilrnektedir.

Bulusun bir uygulamasmda HSP47 biyosensörünün (1) optimizasyonu su sekilde gerçeklestirilmektedir. Optimizasyon adimlarinda lineer standart grafigi, LOD, LOQ, tekrarlanabilirlik, yeniden üretilebilirlik ve duyarlilik, seçieilik gerçek örnek denemeleri ve depo kararliligi testleri yapilmistir. Gelistirilen biyosensör (1) sisteminin LOD ve LOQ degerleri de belirlenmistir. LOD için en düsük konsantrasyon sinyalinin standart sapmasinin (S) standart grafigin egimine (m) oraninin 3,3 ile çarpilmasi, LOQ°da da bu oranin 10 ile çarpilmasi söz konusudur (Esitlik 1 ve 2).

LOD = 3,3 (g) Esitlik I. LOD degerinin Hesaplanmasi LOQ = 10 (g) Esitlik 2. LOQ degerinin hesaplanmasi Kalibrasyon grafigi lineer ölçüm araligina göre, en düsük tayin siniri (LOD) Anti- HSP-47 Immobilizasyonundan sonra alinan impedans spektrumlarinin standart sapmasi (Sb) kalibrasyon egrisinin egimi (m) degerlerinin LOD=3,3(Sb(minimum Konsantrasyon)/m) seklinde hesaplanmasi ile bulunmustur.

Bulusun bir uygulamasinda biyosensör (l) sisteminde tekrarlanabilirlik, yeniden üretilebilirlik ve duyarlilik hesaplamalari su sekilde gerçeklestirilmektedir.

Hazirlanan kalibrasyon egrilerinin regresyon katsayilari, immobilizasyon adimlarindan sonraki impedans spektrumlari istatistiki olarak ayni konsantrasyon& ve immobilizasyon materyalinin yüzeye immobilizasyonu sonucunda impedans spektrum durumuna göre hesaplanmistir.

Bulusun bir uygulamasinda biyosensör (l) sisteminde seçieilik özelligi su sekilde belirlenmektedir. Hücre kültüründen direkt olarak alinan örnegin içerisindeki anti- HSP-47 ve bu örneklere standart HSP47 eklenerek geri eldenin yüzdesi ve gerçek ömekteki miktari belirlenmistir.

Basvuru konusu bulustaki biyosensör (1] HSP47 ölçümü için kullanilacak sekilde uyarlanmistir. HSP47`nin modifiye edilmis altin elektrotlar üzerindeki grafen tabakaya yerlestirilmis Anti-HSP-47 baglanmasinin ölçülmesi impedans spektroskopisi ile gerçeklestirilmektedir. EIS, elektrot yüzeyinin kalinligini veya yük dagilimini (kapasitans) ölçebildiginden elektrot yüzeyindeki elektriksel yük dagilimini degistiren çok küçük degisiklikleri bile tayin edecek sekilde duyarli bir yöntemdir. EIS ile elektrot yüzey kapasitansi, hiçbir biyokimyasal reaksiyona gerek olmadan potantiyostat kullanilarak ölçülebilmektedir.

Basvuru konusu bulustaki biyosensör (1) ile modifiye edilmis altin bir elektrot üzerinde HSP47 baglayan anti-HSP47iler ile modifiye edilmis bir sensör (1] gelistirilmekted Ir.

Bulusun bir uygulamasindaki sensör (l), biyolojik örneklerdeki HSP47 miktanni hizlica tespit edebilecek sekilde uyarlanmakta ve grafenle modifiye edilmektedir.

Biyolojik örneklerdeki HSP47 miktarini tespit eden sensör (1), en üst tabaka kaplamasi olarak kullanilan ve sensör yüzeyinin dayanikliligini arttiran yalitkan destek tabaka (2), elektrotlarin (3,4,5) içerisinde yer aldigi plastik yalitkan tabaka (7), elektrotlarin dis baglantisi için kullanilan bakir iletken bilesenler (7) içermektedir.

Bulusun bir uygulamasindaki yalitkan destek tabaka (2), elektrotlann (3,4,5) sirasiyla referans, çalisma ve yardimci elektrotlarin yalitimi için kullanilan plastik bir yüzeydir. Yalitkan destek tabaka (2), bu üç elektrot (3,4,5) disindabir maddenin, iletken bilesenler (6) ile temasini engellemektedir. Bu iletken bilesenler (6) plastik destek yüzeyin (7) üzerinde bulunmaktadirlar. Örnek sivisi (Ö), sirasiyla referans, çalisma ve yardimci elektrotlar (3,45) ile temas etmektedir. Bu elektrotlar (3,45) üzerindeki elektriksel akimi iletebilmek için iletken bilesenlerini (6) tanimlayan kisim ile temas halindedir. Elektrotlar (3.4.5) disinda ölçüm sivisi (Ö) baska bir elektriksel iletken bilesen ile temas etmemektedir. Elektrotlar (3,4,5) arasi mesafe 0,2 cm olmaktadir. Elektrotlann (3,4,5) üzerine damlatilan örnek (Ö) zamanla ortada bulunan çalisma elektrotu (4) ile temasa girecektir. Bu temas ile çalisma elektrotu (4) üzerinde bulunan grafen tabakalarina zaman içerisinde baglanmaktadir. Bu baglanma ile çalisma elektrotu (4) üzerine yardimci elektrot tarafindan gönderilen impedans sinyallerinde artis söz konusu olacak ve bu sinyal ile ölçüm gerçeklestiiilmektedir.

Bulusun bu uygulamasinda yer alan elektrokimyasal Sensör (1) ile biyolojik örneklerdeki HSP47 tayini su sekilde gerçeklestirilmektedir. Öncelikle altin elektrot, su ve etanol (111) içeren bir kapa konularak sonik banyoda 2 dakika bekletilerek safSizliklari giderilmektedir. Altin elektrot, Saf su ile yikanip azot gazi altinda kurutulmaktadir. Bu adimdan sonra EIS ölçümü yapilmaktadir (AuE).

Sonrasinda altin elektrot yikanip kurutulduktan sonra, 100 mM Cys içeren etanol içerisinde bir saat bekletilmektedir. Bekleme isleminden sonra altin elektrotun, önce etanol sonrasinda saf su ile nazikçe yikanarak EIS Ölçümü yapilmaktadir (AuE/Cys). AuE/Cys elektrotun üzerinde grafen tabakalarinin kovalent immobilizasyonu için %5tlik glutaraldehit damlatilarak 30 dakika bekletilmektedir.

Ardindan elektrot yikanarak üzerine lOuL grafen damlatilarak 1 saat bekletilmektedir. l saatin sonunda baglanmayan grafenler yikanarak altin elektrot yüzeyinden uzaklastirilmakta ve altin elektrotun üzerine grafen tabakalarinin baglanma düzeyi EIS ile ölçülmektedir (AUEICyS/GPH ). AuE/CyS/GPH elektrotun üzerine anti-H SP4? baglanmasi için grafen üzerindeki amino gruplarini aktiflemek amaciyla, %591ik glutaraldehit damlatilarak 30 dakika inkübe edilmektedir.

Sonrasinda elektrot yüzeyine ZOuL anti-HSP47 damlatilarak 1 saat inkübe edilmektedir. Ardindan fazla miktardaki anti-HSP47 yikanarak yüzeyden uzaklastinlARAK CV ve EIS ile elektrot karakterize edilmektedir (AuE/Cys/GPH/anti-HSP47J. CV verileri EIS verileri ile uyumlu bir sekilde karakterize edilebilmektedir.

Biyosensör (1) sisteminin modifikasyonuyla negatif yüklü redoks probu yüzeye hareket etmektedir. Bu nedenle akimda artis görülmektedir. Grafen ile modifikasyonda ise elektrot yüzeyinde olusan degisim yani elektrotun grafen ile kaplanmasi ile redoks probunun indirgenme yükseltgenme potansiyelinde kayma görülmektedir. Bu da kaplamanin basarili bir sekilde oldugu görülmektedir. HSP47 miktari tespit edilmek istenen biyolojik örnekler (Ö), sensörde (1] modifiye edilmis elektrot yüzeyine damlatilmaktadir. Sensöre (1) 100-150 Hz araliginda frekans ile en fazla 200mV potansiyel uygulanmaktadir. Sivi numune (Ö) içerisindeki HSP47”nin, grafen tabaka üzerindeki HSP47 taniyan antikorlara baglanmasi impedansi artirmakta, kapasitansi azaltmaktadir. Impedans artismmdaki oranin HSP47 oranina çevrilmesi, kapasitans azalisinrn da HSP47iye baglanmasindan ötürü azalma göstererek HSP47iye seçicilik dogrulamaktadir. Böylece bulustaki sensör (1) ile biyolojik ömeklerdeki (Ö) HSP47 miktari tespit edilebilmektedir.

Bu bulusta ayrica HSP47inin yüzeye baglanma karakteristigi izlenmektedir ve ölçüm metodu olarak yüzey impedansi ve kapasitansi kullanilmaktadir. Impedans (2 veya R) veya elektrokimyasal impedans spektroskopisi (EIS) elektrolit-elektrot ara yüzünün incelenmesinde, kütle transfer oranlannin ölçülmesinde ve elektrot reaksiyonlarinin arastirilmasinda kullanilan etkili bir ölçüm teknigidir. Bu ölçüm ile elektroaktif olinayan büyük kütledeki proteinler, antijenler çok düsük tayin araliklarinda ve çok düsük tayin sinirinda ölçülebilmektedir. Ikincil bir moleküle gerek duyulmamasi sadece iki molekül arasindaki etkilesimin ölçülmesi açisindan da diger elektrokimyasal yöntemlere göre daha ekonomik olmaktadir. Bu ölçüm en basit sekilde elektrotlann, yüzey kompozisyonunu ve yüzey direncini ölçen bir tekniktir. Ölçüm sonrasinda sensörün (1] tekrar kullanilabilmesi için elektrot etanoI-su karisimina sokularak 5 dakika bekletilmektedir. HSP47uzaklast1rild1ktan (yikama) sonra sensör (1) tekrar kullanilabilmektedir.

Claims (12)

1. ISTEMLER l. Bulus, biyosensörler alaninda kullanilan, hücre kültürü biyobelirtecinin, bir elektrokimyasal iletici üzerindeki impedans sinyallerinin degistirecek sekilde baglanma veya baska sekilde reaksiyona sokmak için fonksiyonel yüzeylere sahip olan ileticileri içeren, elektrokimyasal özellikte olup hücre lizatlarindaki HSP47 protein miktarinin belirlenmesine olanak veren ve primer fibroblast hücre karakterizasyonu için bir biyosensör (ll olup, özelligi; biyosensörün (1) en az bir yalitkan destektabaka (2), en az bir referans elektrot (3), en az bir çalisma elektrodu (4), en az bir yardimci elektrot (5), en az bir iletken bilesen (6), en az bir plastik destek tabaka (7) içermesi, biyosensörde (1), öncelikle elektrotlar saf su ile yikanarak yüzeylerindeki kirlilikler uzaklastirilmasi, biyosensörde (1) yikama sonrasi azot gazi altinda kurutulan elektrotlarin (3,4,5), redoks probu içerisine yerlestirilerek E18 ve CV ölçümü ile elektrokimyasal yüzey karakterizasyonunun yapilmasi, biyosensörde (1) altin elektrot (AuE) elektrot modifikasyon adimlarinin gerçeklestirilmesi, altin elektrot (AuE) elektrot modifikasyon adimlarinda sirasiyla AuSCE immobilizasyona hazirlanmasi, AuSCE/SAM modifikasyonu, AuSCE/SAM/Grafen modifikasyonu ve AuSCE/SAM/Grafen/anti-HSP-47 mod ifikasyonu islemlerinin gerçeklestirilmesi, HSP47 biyosensörünün (1) optimizasyonUnun gerçeklestirilmesi, biyosensör (1) ile biyolojik örneklerdeki (Ö) HSP47 tayin edilmesidir.
2. 2. Bulus, istem l”deki gibi bir biyosensör (1) olup, özelligi; hücre kültürü biyobelirtecinin, bir elektrokimyasal iletici üzerindeki impedans sinyallerinin degistirecek sekilde baglanma veya baska sekilde reaksiyona sokmak için fonksiyonel yüzeylere sahip olan ileticileri içermesidir.
3. Bulus, istem 1`deki gibi bir biyosensör (1) olup, özelligi; biyosensörde (l), HSP47, kendi yüzeyinde bulunan ve sadece kendine özgü antikora baglanmasidir.
4. Bulus, istem l”deki gibi bir biyosensör (l) olup, özelligi; biyoreseptör-analit molekülünün etkilesiminin yüzey kapasitansi veya impedansi ölçümü ile tayin edilmesidir.
5. Bulus, istem l`deki gibi bir biyosensör (l) olup, özelligi; öncelikle elektrotlar saf su ile yikanarak yüzeylerindeki kirlilikler uzaklastirilmasi ve sonrasinda azot gazi altinda kurutulan elektrotlarin redoks probu içerisine yerlestirilerek E18 ve CV ölçümü ile elektrokimyasal yüzey karakterizasyonunun yapilmasidir.
6. Bulus, istem 1'deki gibi bir biyosensör (1) olup, özelligi; elektrotlar modifiye edilmeden elde edilen E18 ve CV verileri yalin elektrot sinyali olarak belirlenerek immobilizasyonun izlenmesi için bir baseline olusturulmasidir.
7. Bulus, istem l”deki gibi bir biyosensör (l) olup, özelligi; altin elektrot (AuE) elektrot modifikasyonu gerçeklestirilmesidir.
8. Bulus, istem lideki gibi bir biyosensör (l) olup, özelligi; altin elektrot (AuE) elektrot modifikasyonu sirasinda ilk olarak AuSCE immobilizasyona hazirlanmasid 1r.
9. Bulus, istem 1”deki gibi bir biyosensör (1) olup, özelligi; altin elektrot (AuE) elektrot modifikasyonu sirasinda AuSCE/SAM modifikasyonu gerçeklestirilmesidir.
10. Bulus, istem l°deki gibi bir biyosensör (l) olup, özelligi; altin elektrot (AuE) elektrot modifikasyonu sirasinda AuSCE/SAM modifikasyonu sonrasinda AuSCE/SAM/Grafen modifikasyonu gerçeklestirilmesidir.
11. 11. Bulus, istem l`deki gibi bir biyosensör (l) olup, özelligi; altin elektrot (AuE) elektrot modifikasyonu sirasinda AuSCE/SAM/Grafen modifikasyonu sonrasinda ise AuSCE/SAM/G raf en/anti-H S P-47 mod if ikasyonu gerçeklestirilmesidir.
12. 12. Bulus, istem l'deki gibi bir biyosensör (l) olup, özelligi; HSP47 biyosensörünün (1) optimizasyonu sirasinda lineer standart grafigi, LOD,LOQ, tekrarlanabilirlik, yeniden üretilebilirlik ve duyarlilik, seçicilik gerçek örnek denemeleri ve depo kararliligi testleri yapilmasidir.