TARIFNAME RAHIM AGZI KANSERI TEDAVISI IçIN BIR ILAÇ Bulusun Ilgili Oldugu Teknik Alan Bulus, indiyum (III) ftalosiyanin bilesiginin rahim agzi kanseri tedavisi için fotodinamik terapide kullanimi ile ilgilidir. Teknigin Bilinen Durumu Kanser, köken aldiklari hücre tipine bagli olarak degisik davranislar gösteren yüze yakin sayidaki kompleks hastaliklari kapsayan bir olgu olarak tanimlanan; gen ekspresyonundaki çoklu degisikliklerin neden oldugu anormal hücre büyümesidir. Hücre proliferasyonu ve hücre ölümü arasindaki dengenin bozulmasina neden olmaktadir. Invazyon ve metastaz yetenegi ile vücudun çesitli bölgelerine yayilabilmekte, yayildiklari bölgede doku ve organlarin islevini yitirmesine neden olmaktadir. Kanserler, baslangiç yaslarina, büyüme oranlarina, yayilimlarina, evrelerine ve tedaviye verdikleri tepkilere göre çesitlilik göstermektedir. Buna ragmen tüm kanser çesitleri, onlari tek bir birim aile içerisinde birlestiren moleküler seviyede ortak karakteristik özellikler göstermektedir. Kanser, eger tedavi edilmezse kisinin ölümü ile sonuçlanmakta ve günümüzde kansere bagli ölümler, dünya genelinde ölüm nedeni siralamasinda ikinci sirada yer almaktadir. Kanser sonucu meydana gelen ölüm, hastaligin vermis oldugu zararin yani sira mevcut konvansiyonel tedavilerin neden oldugu yan etkiler sonucunda da meydana gelebilmektedir. Mevcutta kullanilan konvansiyonel ilaçlarin yan etkilerinin ölümcül sonuçlara sebep olmamasi için ilaç dozlari yeterli seviyede hastaya verilememekte, bunun sonucunda da tam ve etkin bir tedavi saglanamamaktadir. Hastaligin tedavi edildiginin düsünüldügü durumlarda bile tümör popülasyonundaki tüm hücreler öldürülemedigi için hastalik tekrar nüksedebilmektedir. Günümüzde kanser tedavisinde ameliyat/cerrahi, kemoterapi ve radyoterapi olmak üzere üç temel tedavi yöntemi uygulanmaktadir. Daha az siklikla hormon tedavileri, biyolojik tedavi yöntemleri ve hedefe yönelik tedaviler de kullanilmaktadir. Bu tedavi yöntemleri tek basina veya birlikte uygulanabilmektedir. Cerrahi yöntemde, kanserli doku vücuttan çikarilmaktadir. Pek çok kanser türünde cerrahi tedavi ilk uygulanan yöntemdir. Radyoterapi, kanser hücrelerini öldürmek veya büyümelerini önlemek için yüksek enerjili X-isinlarinin veya diger radyasyon türlerinin kullanildigi bir kanser tedavi yöntemidir. Bu tedavi yöntemi, iç veya dis isinlama olarak ikiye ayrilmaktadir. Distan yapilan isinlamada, X-isinlari bir makineden dogrudan kanserli hücreye ve çevresindeki dokulara yönlendirilir. Içten yapilan isinlamada ise; içine radyoaktif madde konulan kapsüller kisinin vücut bosluguna, tümörün üzerine ve çevresine yerlestirilir. Bazi hastalarda radyoterapi sonrasinda yorgunluk, deride kizariklik, kusma gibi yan etkiler görülmektedir. Kemoterapi; ya kanser hücrelerini öldürerek ya da onlarin bölünmelerini durdurarak tümörün büyümesini engellemek için kullanilan kanser tedavi yöntemidir. Bir diger kanser tedavi yöntemi olan kemoterapi ise, kanser hücrelerini yok etmek veya bu hücrelerin büyümesini kontrol altina almak için antikanser ilaçlar kullanilarak yapilmaktadir. Kemoterapi, hastaya farkli sekillerde verilebilmektedir. Agiz yoluyla verildiginde veya damar veya kas içine enjekte edildiginde ilaçlar kan dolasimina girmekte ve vücuttaki kanser hücrelerine ulasabilmektedir (sistemik kemoterapi). Kemoterapötik ilaçlar, dogrudan beyin omurilik sivisina, bir organa veya karin gibi bir vücut bosluguna yerlestirildiginde, esas olarak bu bölgelerdeki kanser hücrelerini etkilemektedir (bölgesel kemoterapi). Kemoterapinin verilis sekli tedavi edilen kanserin tipine ve evresine baglilik göstermektedir. Kemoterapötik ilaçlar; DNA replikasyonu veya metabolizmasini içeren enzimleri inhibe ederek hücre bölünmesini durdurmaktadir. Ancak; kemoterapötik ilaçlar spesifik olarak sadece tümör hücrelerini hedef almamakta, kemik iligi, bagirsak mukozasi ve saç folikülleri gibi hizla yenilenen dokularin normal bölünen hücrelerine de zarar vermektedir. Bu sebeple, kemoterapi birçok sorunu da beraberinde getirmektedir. Kanser hücreleri ve hizli bir sekilde bölünen normal hücreler birbirine benzedikleri için birbirlerinden ayrilmalari zordur ve hücreler ilaçlara direnç de gelistirebilmektedir. Her insan ve her tümör genetik olarak farkli oldugu için her ilaç her hastaya uygulanamamaktadir. Bu sebeple, kemoterapi ile tedavi edilen bazi hücreler hayatta kalabilmekte ve ilaca dirençli kanserlere dönüsebilmekte, hatta daha sonrasinda tedaviye bagli hastaliklar dahi gelisebilmektedir. Ayrica, tümörleri öldüren ilaçlarin çogu normal hücreleri kansere dönüstüren mutasyonlara da neden olabilmektedir. Tüm bu sebeplerden dolayi, kanser hücrelerini hedefleyen ancak normal hücreleri etkilemeyecek yeni ilaçlarin gelistirilmesi gerekmektedir. Rahim agzi kanseri kadinlar arasinda en sik görülen kanser tiplerinden biri olup, kansere %98 oraninda HPV (Insan Papilloma Virüsü) neden olmaktadir. Kanserli hücrelerin rahmi ve döl yolunu (vajina) birbirine baglayan serviks kisminda çogalip türemesi sonucu meydana gelmektedir. Rahim agzi kanseri, genellikle yavas gelisim gösteren bir kanser tipidir. Rahim agzinda kanser görülmeden önce, rahim agzi hücreleri, displazi olarak bilinen degisikliklerden geçmektedir. Burada anormal hücreler rahim agzi dokusunda görünmeye baslamakta ve zamanla anormal hücreler kanser hücresi haline gelebilmekte, rahim agzi ve çevresindeki alanlarda daha derin bir sekilde büyümeye ve yayilmaya baslayabilmektedir. Diger kansertiplerinde oldugu gibi rahim agzi kanserinde de bazi durumlarda mevcut tedaviler ile tam bir tedavinin saglanamamasi hastaligin nüksüne neden olmaktadir. Rahim agzi kanseri olan hastalar için farkli tedavi seçenekleri bulunmaktadir. Standart seçenekler arasinda diger kanser tiplerinde de oldugu gibi; cerrahi, radyoterapi ve kemoterapi sayilabilir. Burada; erken teshis, tedavi sürecinde en etkili yol olmaktadir. Cerrahi ile yapilan tedavi yönteminde hastaya genel anestezi uygulanarak rahim agzindaki kanserli dokunun bir kismi veya tamami alinabilmektedir. Kemoterapi veya radyoterapi yöntemleri ise cerrahi müdahaleden sonra gerekli görüldügü takdirde hastalara uygulanmaktadir. Kemoterapide kansere bagli olmayan ama kanser için kullanilan ilaçlarin neden oldugu yan etkilerden (kalp krizi vb.) kaynakli ölümler ve yasam kalitesinin düsmesi alternatif kisa süreli ve etkili tedavi yollarinin arastirilmasina ihtiyaç duyulmasina neden olmaktadir. Fotodinamik terapi (PDT) yöntemi; fotosensitizer (isiga duyarli madde), isik ve oksijen molekülünün varliginda gerçeklesen, günümüzde kullanilan diger tedavi yöntemlerine göre daha az zararli ve etkili bir kanser tedavi yöntemidir. Bahsi geçen fotosensitizerler, yapilarina uygun dalga boyuna sahip isigin enerjisini absorbe ederek temel halden uyarilmis hale geçen ve absorpladiklari enerjiyi biyomoleküllere transfer eden kimyasal bilesikler olarak tanimlanmaktadir. Fotodinamik terapi ilk örnegi, 1900 yilinda Raab'in akridin turuncusunu isik ile reaksiyona sokmasi sonucunda toksik bir etki olustugunu gözlemlemesi sonucu kayitlara geçmistir. Ayrica Raab yaptigi çalismasinda akridin boyasi ile günes isigini kullanarak tek hücreli bir hayvan türü olan paramesyumun öldügünü de gözlemlemistir. Ayni deney isigin olmadigi bir ortamda tekrar gerçeklestirildiginde ise, degisiklik olmamasi sebebiyle boyanin isik ile etkilesim içinde oldugu ortaya çikmistir (Rasmussen-Taxdal, 1955). 1905 yilinda Tappeiner ve Jesionek tarafindan 6 hasta üzerinde yüz bazal hücrelerindeki kötü huylu tümörlere fotodinamik terapi uygulanmistir. Bu çalismada %1 eosin çözeltisi kullanilmis ve uzun süre boyunca günes isigi ile ark Iambalarindan yararlanilmis ve yapilan çalismalar sonucunda dört hastanin tümörlerinde iyilesme gözlenmistir (Tappeiner, 1909). Modern fotodinamik tedavinin ilk adimlari ise, 1961 yilinda Lipson ve arkadaslarinin hematoporfirin türevi (HPD) ile yaptiklari çalismalar ile atilmis (Lipson, 1961), 1984 yilinda Parker ve çalisma arkadaslarinin hematoporfirin türevini kullanarak deneysel iris neovaskülarizasyonlarinda gerileme elde etmeleri ile de fotodinamik tedavi için önemli bir adim atilmistir. 1987 yilinda Dougherty ve çalisma arkadaslari tarafindan 113 adet deri ve deri alti tümörleri üzerinde arastirma yapilmis ve bu çalismalar sonucunda 111 tümörde kismi ya da tamamen iyilesme gözlemlenmistir. Ancak, bu çalismalarin hiçbiri klinik uygulamaya geçirilememistir. PDT uygulamalarinda, tek basina toksik etki göstermeyen fotosensitizer olarak adlandirilan, isiga duyarli bir madde isiga maruz birakilmaktadir. Sonucunda olusan serbest radikaller ve singlet oksijen birçok biyolojik molekül ile etkilesir ve apoptoz (programli hücre ölümü) veya nekroz yoluyla kanserli hücrelerin ölmesine neden olmaktadir. Bir diger deyisle PDT, isiga duyarli ilacin hastaya damar yoluyla verilmesinin ardindan bu ilacin tümörlü dokuda birikmesi ve belli bir dalga boyuna sahip isik ile uyarilarak tümörü yok etmesi prensibine dayanmaktadir. lsiga duyarli bu ilaçlarin normal dokulara oranla tümörlü dokularda birikme ve muhafaza edilebilme egilimleri çok daha fazladir. Isik, normal dokuya kiyasla tümörlü dokuda daha uzun süre kalabilmektedir. Isik, isiga duyarli ilaç tarafindan soguruldugunda gerçeklesen reaksiyonlar sonucunda açiga çikan singlet oksijen asiri derecede toksiktir. Singlet oksijen, yalnizca istenen bölgede nekroz olusumuna sebep olur ve dokudaki ömrü çok kisa olmakla birlikte Iokaldir. Bu sekilde saglikli dokulara zarar vermeden tümörlü bölgede bulunan hücrelerin yok olmasi saglanmaktadir. Fotodinamik tedavide, isik enerjisi toksik olmayan isiga duyarli madde olan fotosensitizer araciligi ile kimyasal enerjiye dönüstürülmekte ve bu kimyasal enerji hedef dokuya nakledilmektedir. Fotodinamik terapide fotosensitizerin vücuda verilmesi, hedeflenen bölgede fotokimyasal bir etki ortaya koymasi ve bu maddenin aktiflestirilmesini içeren iki temel basamaktan olusmaktadir. Temelde iki seçicilik özelligi bulunmaktadir. Bunlardan ilki vücuda verilen isiga duyarli madde olan fotosensitizerin özellikle hedef bölgede toplanmasi, digeri ise bu maddenin aktive edilmesini saglayan isigin sadece istenilen bölgeye uygulanmasidir. Fotodinamik terapinin etki mekanizmasi, temel halde olan isiga duyarli madde, sogurabilecegi dalga boyuna sahip isik ile uyarildiktan sonra yüksek enerjideki triplet haline geçip, aktif hale gelen fotosensitizerin biyomoleküllerle etkilesmek için tip I ve tip lI reaksiyonlari olmak üzere iki farkli yol takip etmesiyle gerçeklesmektedir. Fotodinamik terapide üç önemli unsurdan biri oksijendir ve oksijenin önemi singlet oksijen formuna geçisinden kaynaklanmaktadir. Oksijen temel halde iken dis anti-bag orbitallerinde eslenmemis iki elektron bulunmaktadir. Bu dis elektronlardan bir tanesinin yönünün degistirilmesiyle olusan singlet oksijen yüksek derecede reaktiftir. Singlet oksijen yüksek reaktiviteye sahip olmasindan dolayi diger moleküllerle etkilesime girer ve sahip oldugu enerjiyi transfer eder. Singlet oksijen olusumu PDT yönteminin temelini olusturur. Tip I reaksiyonlari, ROS (Reaktif Oksijen Türleri) olusumuna sebebiyet veren elektron transferi reaksiyonlari meydana getiren reaksiyonlardir. Tip ll reaksiyonlari ise (102), olusumuna neden olan enerji transfer reaksiyonlaridir. Tip I reaksiyonlarinda, uyarilmis halde bulunan fotosensitizerin sahip oldugu hidrojen atomu hücrede bulunan bir moleküle aktarilmasiyla yüksek reaktif özelligi gösteren radikaller ortaya çikar ve bu radikaller moleküler oksijen ile reaksiyona girer. Bunun sonucunda oksijenlenmis ürünler meydana gelir. Fotodinamik terapide kullanilan birçok isiga duyarli maddenin ise etkisini çogunlukla ROS olan 102 üzerinden, tip II reaksiyon mekanizmalari ile gösterir. Tip II reaksiyonlarinda uyarilmis haldeki fotosensitizer enerjisini dogrudan moleküler oksijene (02) vererek singlet oksijen (102) olusmasina neden olur. Moleküler oksijenin elektronik olarak uyarilmis hali olan singlet oksijen (102) biyomolekülleri oksitler ve hücrede hasara sebep olur. Tip III reaksiyonu ise immün kompleks iliskili reaksiyonlardir. Bu reaksiyon ayni zamanda hipersensitivite reaksiyonu olarak da bilinmektedir. Çözünür bir antijene karsi olusan antikor ile antijenin baglanarak kompleks sistemini aktive etmesi sonucu ortaya çikan bir reaksiyondur. Antijen-antikor birlesmesi sonucunda immün kompleks olusmaktadir. Reaksiyonun siddeti immün kompleksin büyüklügü ve dagilimi ile iliskilidir. Immün kompleksler damar duvarinda, eklemlerin sinovyal membraninda ve beyinde koroidal pleksusta oldukça sik gözlenmektedir. Tip llI reaksiyonlari lokal veya sistemik olabilmektedir. Tip lV reaksiyonlari ise, hücre aracili veya gecikmis tip hipersensitivite olarak bilinmektedir. Bu reaksiyonlarin klasik örnegi antijen enjekte edildikten 48 saat sonra pik yapan tüberkülin (Montoux) reaksiyonudur. Tip IV reaksiyonlari, birçok otoimmün ve enfeksiyon hastaliklari, yabanci antijenden ve enfeksiyon nedenli granülom patogenezi ile iliskilidir. Fotodinamik terapide kullanilan isigin dalga boyu, isigin doku içerisinde ulasabildigi derinlik açisindan oldukça önemlidir. Ancak kullanilan isigin dalga boyu ile enerjisi arasinda ters oranti bulunmaktadir. Bu yüzden uygulanan terapinin yan etkilerini en aza indirgemek amaciyla yüksek dalga boyuna sahip isik kullanilmasi tercih edilmelidir. PDT uygulamalari için en uygun dalga boyu araligi 650 ile 850 nm arasinda oldugu saptanmistir ve bu aralik 'Fototerapötik pencere" olarak tanimlanmistir. Fotosensitizerlerin uyarilmasinda kullanimi kolay ve ucuz olmasindan dolayi ark lambalari kullanilmaktadir. Ancak; bu tip lambalar genis spektruma sahip isik kaynaklari oldugundan, isinmayi engellemek için UV ve IR filtreleri kullanilmasi gerekir. Bununla birlikte PDT'de, genis bir dalga boyu araligina sahip LED'ler de isik kaynagi olarak kullanilabilmektedir. Bir baska önemli isik kaynagi ise, isik isinlarini odaklanmasini kolaylastiran az bir sapma ile tek bir renkte ve senkronize isik dalgalari halinde yayilabilen lazer isigidir. Lazerler, fotodinamik terapide kullanilmasi bakimindan fotodinamik terapide optik fiberlerin çalismasi, endoskopik iç tümörlerin tedavisine ve tümör dokusuna isik kaynaginin yerlestirilmesine imkan vermesi gibi karakteristik özelliklere sahiptir. Ayrica, lazer isiginin yüksek gücü PTD*de fotosensitizerin aktivasyonu için kullanilmasinin sebeplerinden biridir. Vücudun kanser hücreleri tarafindan tehdit edilen ve hasara ugratilan bölgesinde kullanilan fotosensitizer, onu aktive eden isik ve fotosensitizer ajanin uygulanis sekline göre degisiklik gösterebilir. Fotosensitizer ajanin türü de, isik kaynagi ve uygulanan tedavi sekline göre degisiklik göstermektedir. Tedavide kullanilan fotosensitizer ajanin kanser hücrelerine alinmasindan sonra ajanin absorbe edebilecegi dalga boyuna sahip isik sadece kanserli hücrelerin bulundugu kisma uygulanmaktadir. Kanser hücrelerini besleyen kan damarlarinin tahrip edilmesi ve bagisiklik sisteminin kanser hücrelerine karsi ataginin uyarilmasini saglamasi açisindan fotodinamik terapi önemli bir tedavi yöntemidir. Fotosensitizer ajanin hastaya verilmesi ve isigin uygulanmasi arasindaki zaman periyodu kullanilan fotosensitizer ajana bagli olarak degismektedir. Kullanilacak fotosensitizer ise; tümör dokularinda birikmesi, istenilen bölgede kisa zamanda birikmesi, safsizliklar barindirmamasi, saglikli dokularda birikmemesi, uyarilmasini saglayan isigin olmadigi durumlarda toksik etkisinin olmamasi ve yüksek verimle singlet oksijen olusturabilme egiliminde olmasi gibi özelliklere göre belirlenmektedir. yilinda Braun ve Tchemiac tarafindan yapilan çalismada ftalimid ve asetik asitten o- siyanobenzamid eldesi esnasinda bulunmus, ancak yapilari 1933-1940 yillari arasinda Linstead ve Roberstson'un çalismalari ile aydinlatilmistir. Ftalosiyaninler yüksek konjugasyonlu 18 TT elektron sistemine sahip, 16 üyeli düzlemsel bir makro halkadan olusan bir bilesik sinifidir. Yapisal olarak hemoglobin, klorofil a ve 512 gibi porfirinlere benzemelerine ragmen dogada bulunmazlar. Günümüzde ftalosiyaninler, karakteristik mavi ve yesil renkleriyle pigment olarak baski mürekkeplerinde, kaplamalarda, boyalarda ve plastiklerde kullanimlarinin yanisira; lazerler, sensörler, nanotüpler, kendiliginden isik yayan bilesikler (OLED), fotodinamik tedavi (PDT), kanser tedavisi, katalizör gibi uygulamalarda kullanilmaktadirlar. Mevcut teknikte rahim agzi kanseri tedavisinde kullanilan tedavi yöntemlerinin yetersiz olmasi, kemoterapötik ilaçlarin sebep oldugu yan etkiler, kemoterapide kansere bagli olmayan ama kemoterapötik ilaçlarin neden oldugu yan etkilerden (kalp krizi vb.) kaynakli ölümler ve yasam kalitesinin düsmesi gibi sebepler dolayisiyla, rahim agzi kanseri tedavisinde kullanilmak üzere bir ilaç gelistirilmesi gerekli kilinmistir. Bulusun Kisa Açiklamasi ve Amaçlari Mevcut bulusta, indiyum (III) ftalosiyanin bilesiginin rahim agzi kanseri tedavisi için fotodinamik terapide kullanimi açiklanmaktadir. Bulusta, Pc bilesigi insan serviks karsinomasi kökenli HeLa hücrelerine PDT yöntemi kullanilarak uygulanmis ve çogalma hizi analizi sonucunda doza bagimli olarak hücre canliliginin azaldigi ve 100 uM ürün konsantrasyonunun hücrelerin %47,45'inin canli kalmasina yani % 52,551inin ölümüne neden oldugu gösterilmistir. Degerlendirilen hücre indeksi parametresi ile hem farkli konsantrasyonlarin hücreler üzerinde antiproliferatif etkiler gösterdigi hem de hücreleri farkli mekanizmalar ile ölüme sürükledigi belirlenmistir. Mitoz indeksi parametresi ile de hücrelerin mitoz bölünmeye geçirmesini zamana bagli olarak anlamli ölçüde azalttigi gösterilmistir. Bu haliyle farkli konsantrasyonlarda farkli mekanizmalar kullanarak kanser hücrelerinin ölümüne yol açtigi bulunmustur. Bulusun en önemli amaci, rahim agzi kanserinin etkin bir sekilde tedavi edilmesini saglamaktir. Bulusta sentezlenen etken madde olan indiyum (Ill) ftalosiyanin bilesigi sayesinde HeLa kanser hücrelerinin yarisindan fazlasinin ölümü saglanmaktadir. Bulusun bir diger amaci, fotodinamik terapi yöntemiyle rahim agzi kanserinin tedavisinde kullanilmak üzere bir antikanserojen etkili ilaç üretilmesidir. indiyum (lll) ftalosiyanin bilesigi içeren bir ilaç ile rahim agzi kanserine sebep olan kanserli hücrelerinin ölmesi ve kanserin tedavisi saglanmaktadir. Rahim agzi kanseri hücre soyu olan HeLa hücrelerine uygulanan indiyum (lll) ftalosiyanin bilesiginin IC50 konsantrasyonu 100 pM olarak belirlenmistir. Bulusun bir diger amaci, antikanser bir ilacin doga dostu bir sentez yöntemiyle elde edilmesidir. Bulusta, rahim agzi kanserinde kullanilmak üzere sentezlenen ilaç etken maddesi olan indiyum (III) ftalosiyanin bilesiginin sentezinde solvent kullanilmamaktadir. Bu sebeple de yesil sentez kapsaminda doga dostudur. Bulusun bir diger amaci, rahim agzi kanseri tedavisi için fotodinamik terapide kullanilmak üzere yüksek singlet oksijen üretiminin oldugu bir antikanser ilaç etken maddesi elde edilmesidir. indiyum (III) ftalosiyanin bilesiginin fotodinamik terapide kullaniminda çok yüksek singlet oksijen üretiminin olmaktadir. Sekillerin Açiklamasi ( bilesiklerinin kimyasal yapilari. Sekil 2: Bilesik 1iin FT-IR spektrumu. Sekil 3: Bilesik 2inin FT-IR spektrumu. Sekil 4: Bilesik 2"nin NMR spektrumu. Sekil 5: Bilesik 2inin kütle spektrumu. Sekil 6: Bilesik 2'nin floresans spektrumu Sekil 7: Bilesik 2inin isik altinda absorbans grafigi. Sekil 8: Bilesik 2'nin isik altinda fotobozunma spektrumu. Bulusun Ayrintili Açiklamasi Bulus, rahim agzi kanseri tedavisinde kullanim için fotodinamik terapi ile uygulanmak üzere ftalosiyanin (Bilesik 2, ln(III)PC ya da bilesigi ile ilgilidir. Bulus ayrica ftalosiyanin bilesiginin etken madde olarak kullanildigi bir antikanserojen ilaç ile ilgilidir. Bilesik 2'nin kimyasal yapisi Formül I'deki gibidir: Formül l Söz konusu indiyum (III) ftalosiyanin bilesiginin sentez yöntemi; (III) asetatin bir havan içerisine alinarak toz haline getirilmesi, - Toz haline getirilen karisimin reaksiyon tüpüne alinmasi, - Reaksiyon tüpüne on damla eklenmesi ve 5 dakika süre ile Argon gazi geçirilmesi, - Reaksiyon kabi sikica kapatildiktan sonra çeker ocak içerisinde 360 °C sicaklikta isitilmasi, - Renk yesile döndükten sonra 8 dakika daha isitmaya devam edilmesi, - Oda sicakligina sogutulduktan sonra ince tabaka kromatografisi (TLC) ile safliginin kontrol edilmesi ve elde edilen yesil ürünün kloroform ile kolon kromatografisi ile saflastirilmasi, ftalosiyaninin (Bilesik 2) bir hafta boyunca vakumda fosfor pentoksit (P205) kullanilarak kurutulmasi, Yukaridaki yöntemle elde edilen bilesik koyu yesil kristal formda olup, verim 82 mg'dir (%16,14). Erime noktasi 300°C olan Bilesik 2'nin kapali formülü CsgHgglnNsos, molekül agirligi 1491,61 g/mol'dür. Bilesige iliskin teorik elementel analiz yapildiginda yapisini aydinlatmak için FTIR analizi yapilmis olup Sekil 3'te gösterilmektedir. FTIR sonuçlari, Bilesik 2 yapisinin dogru sentezlendigini göstermistir. Söz konusu bilesik; kloroform (CHCl3) , aseton (CSHGO), tetrahidrofuran (THF), etanol (C2H50H), metanol (CH3OH), dimetilformamid (DMF) veya dimetil sülfoksit (DMSO) gibi yaygin solventlerde çözünmektedir (Tablo 1). Tablo 1. In(lll) Pc bilesiginin çözünürlük verileri. Kompleks Çözücüler ve Dielektrik sabitleri (s: Flm) Kloroform THF Aseton Etanol Metanol DMF DMSO QBandi Vibrasyon Bilesik 2'nin floresans kuantum verimini (CDF) hesaplamak için Esitlik-'i kullanilmistir. Bunun için Bilesik 2 kompleksinin ve standart Çinko (Il) ftalosiyaninin (ZnPC) dimetil sülfoksitte (DMSO) yaklasik 10-63 molarlik çözeltisi hazirlanmistir, floresans spektrumu olusturmak amaciyla en uygun uyarilma dalga boyu olarak 639 nm seçilmistir. Böylelikle emisyon ve egzitasyon spektrumlari elde edilmistir. Esitlik-1 asagidaki (DF : (basim Sid F A 112 (DF: numunenin floresans kuantum verimi, wma): standart bilesigin floresans kuantum verimi, F: Numunenin floresans emisyon egrisinin altindaki alan, Fsid: Standart bilesigin floresans emisyon egrisinin altindaki alan, A: Numunenin absorbansi, Astd: Standart bilesigin absorbansi, n: Numunenin çözüldügü çözücünün refraktif indisi, netd: Standart bilesigin çözüldügü çözücünün refraktif indisidir. Bulusa konu Bilesik 2'nin singlet oksijen kuantum verimleri oda sartlarinda Çinko (II) ftalosiyanin (ZnPc) standardi yardimiyla ve singlet oksijen söndürücüsü ile asagida yer alan Esitlik-2 kullanilarak hesaplanmistir: RDPBFa Ibs (DA ; örnegin singlet oksijen verimi, RDPBF: örnek varliginda DPBF'in parçalanma orani, RDPBFstd: standart varliginda DPBF'in parçalanma orani, Singlet oksijenin varligindan kaynakli zincir reaksiyonlarini önlemek için 3 X105 moI.L" 1 konsantrasyona sahip DPBF kullanilmistir. DPBF içeren bir sensitizerin çözeltileri (isinlama dalga boyunda absorbans = 2.0), karanlik bir ortamda hazirlanmis olup, yukarida açiklanan kurulum kullanilarak Q bandi bölgesinde isinlanmistir. Sekil 7'ye göre bu verim %49 olarak bulunmustur. Fotodegredasyon kuantum verimini (CDd) belirlemek için, tüm komplekslerin çözeltileri kullanilan çözücü içinde Q bandinin maksimum absorbansi 1.0'a ayarlanmis olup, zamanla isinim altinda Q bandinin yogunlugundaki azalma asagidaki Esitlik-3 kullanilarak gözlenmistir: C0 (mol.dm'3): isinlamadan önceki Bilesik 2 konsantrasyonu, Ct (mol.dm'3): isinlamadan sonraki Bilesik 2 konsantrasyonu, V: reaksiyon hacmi (3.0 cm3), S: isinlanmis hücre alani, t: isinlama zamani, NA Avogadro sayisi, fotobozunma kuantum verimi (CDd) = 2,0017x10'05 olarak bulunmus olup, bu sonuç ftalosiyanin bilesikleri için kabul edilen bir degerdir ve isik altinda ln(lll)Pc kompleksinin stabil oldugunu göstermektedir. Yukarida açiklanan PDT karakteristik ölçüm sonuçlari dikkate alindiginda, Bilesik 2'nin kanser hücrelerini yok etmede aktif oldugu ve bu haliyle de kanserin PDT ile tedavisinde potansiyel olabilecegi görülmüstür. Elde edilen ln(lll)Pc kompleksinin kanser hücrelerinin mitokondriyal dehidrogenaz enzim aktivitesinde meydana getirdigi degisikliklerin belirlenmesi amaciyla kültüre edilen insan serviks kanseri kökenli HeLa hücrelerine 24 saat süresince farkli konsantrasyonlarda ln(lll)Pc kompleksi uygulanmistir. Çogalma hizi analizi rutin olarak kültürü yapilan HeLa hücreleri 96 kuyucuklu kültür kaplarina her bir kuyucukta 3x104 hücre/ml besiyeri olacak sekilde ekim yapilmistir. 24 saat süresince hücrelerin yapismasi ve yayilmasi beklendikten sonra 50 uM, 100 ulVl ve 150 uM konsantrasyonlarda hazirlanan ln(lll)Pc kompleksi hücrelere uygulanmistir. Deney sürelerinin sonunda kuyucuklardaki besiyeri çekilerek 40 pl 3-(4,5-dimetiltiyazol-2-il)- eklenmistir. Yaklasik 4 saat beklendikten sonra MTT bulunan kuyucuklara eklenerek çalkalayicili etüvde 1 saat inkübasyona birakilmistir. Olusan formazan kristallerinin 1 saatlik inkübasyon süresince çözünmesinin ardindan, olusturulan deney gruplarinin absorbans degerleri, 690 nm dalga boyu referans alinarak 570 nm'de spektrofotometre ölçümleri ile gerçeklestirilmistir. Bu uygulama sonucunda elde edilen edilen kontrol grubuna göre, 50 pM Bilesik 2 konsantrasyonunun hücrelerinin konsantrasyonunun ise %28,81*e düsürdügü görülmektedir. Bulusta hem elde edilen sonuçlarin desteklenmesi hem de hücre ölüm tiplerinin belirlenebilmesi amaciyla gerçek zamanli hücre analiz sistemi kullanilarak hücre indeksi parametresi degerlendirilmis ve bu parametrenin degerlendirilebilmesi amaciyla 16 kuyucuklu E-Plate kullanilmistir. Öncelikle E-Plate"in her bir kuyucuguna 100 pl besiyeri eklenmis ve hücre analiz cihazinda arka plan ölçümleri alinmistir. Daha sonra HeLa hücreleri için 100 pl besiyerinde 6000 hücre olacak sekilde her bir kuyucuga ekim yapilmistir. Ekim isleminin ardindan E-Plateiler 20 dakika boyunca steril çalisma kabini içerisinde oda sicakliginda inkübe edilmis ve daha sonra hücre analiz cihazindaki yerlerine yerlestirilerek 3700 sicaklikta %5 karbondioksit ((302) ortam sartlarinda inkübasyona devam edilmistir. E-Plate'lere hücre ekimi gerçeklestirildikten sonra hücre analiz cihazina her 15 dakikada bir ölçüm almasi için komut verilmistir. Hücre ekiminde yaklasik 24 saat sonra hücrelerin çogalma fazinin kompleksi bulunan besiyeri ile degistirilerek 72 saat süresince 15 dakika araliklarla ölçüm alinmaya devam edilmistir. Daha sonra konsantrasyona ve zamana bagimli hücre indeksi degerlerine ait grafikler bilgisayar ekranina aktarilmistir. Gerçek zamanli hücre analiz sisteminden elde edilen hücre indeksi degerleri incelendiginde; In(III)Pc kompleksinin HeLa hücreleri üzerindeki antiproliferatif etkileri görülmektedir. Elde edilen hücre indeksi degerleri standart egriler ile karsilastirildiginda uygulanan 50 pM Pc kompleksi konsantrasyonu hücreler üzerinde DNA'ya hasar verici etki olustururken Pc kompleksi konsantrasyonunun sitoskeletal etki meydana getirdigi görülmektedir. HeLa hücreleri üzerine ürünün optimum konsantrasyonunun ( 0-72 saat süresince uygulanmasi sonucunda, hücrelerin mitotik indeks degerleri üzerindeki etkilerinin belirlenmesi amaciyla deney gruplarina göre hazirlanan preparatlar önce oda sicakligindaki 1 N hidroklorik asit (HCl) ile 1 dakika daha sonra 60 °C deki 1 N HCI ile 10 dakika hidroliz edilmistir. Hidroliz isleminden sonra preparatlara 1 saat süresince Feulgen metodu uygulanmistir. Bu preparatlar daha sonra Feulgen metoduna özel yikama solüsyonu ile 2'ser dakikadan 3 kez yikanmis ve havada kurutulmustur. Preparatlar kurutulduktan sonra, 2 dakika süre ile Giemsa boyasi ile boyanarak sayim için hazir duruma getirilmistir. Bu preparatlardan mitoz indeksi (MI) degerlerini saptamak amaci ile geç profaz, metafaz, anafaz ve telofaz evreleri sayilmistir. Erken profaz evresi interfaz grubundaki hücrelere morfolojik olarak benzerlik gösterdiginden bu evre ile birlikte degerlendirilmistir. Her deney grubu için üçer preparat degerlendirilmis ve her bir preparattan ortalama 3000 hücre sayilarak, mitoz indeksi degerleri saptanmistir. Mitotik indeks degerleri 24. saatte %ö'dan %3,7'ye; 48. saatte Tüm deney gruplarinda uygulanan konsantrasyon ve zamana göre saptanan hücre kinetigi parametreleri degerleri kontrole ve birbirlerine göre degerlendirilmis ve bu amaçla tüm deney gruplarindan saptanan degerlere tek yönlü ANOVA testi uygulanmistir. Gruplarin kontrole göre anlamliliklari DUNNETT'S testi ile, gruplarin birbirleri ile olan anlamliliklari ise t-testi ile degerlendirilmistir. Istatistiksel degerlendirmelerde p<0.01 anlamlilik seviyesi temel alinmistir. Bilesik 2'nin insan serviks kanseri kökenli HeLa hücre kültürlerinde meydana getirdigi antikanser etkiler farkli hücre kinetigi parametreleri degerlendirilerek arastirilmistir. Elde edilen veriler, Bilesik 2'nin konsantrasyona ve zamana bagli olarak hücre proliferasyonunda anlamli bir azalisa neden oldugu. ayni zamanda yine farkli konsantrasyonlarda farkli ölüm mekanizmalari ile hücre ölümünün gerçeklestigi gösterilmistir. 100 pM'lik Bilesik 2 konsantrasyonu, hücreler üzerinde DNA'ya hasar verici etki olustururken 150 pM"lik Bilesik 2 konsantrasyonu sitoskeletal etki meydana getirmistir. Ayrica, optimum konsantrasyon olan 100 pM'Iik Bilesik 2 konsantrasyonunun kullanildigi mitoz indeksi parametresi de, hücrelerin mitoz bölünmesinin zamana bagli olarak anlamli ölçüde azaldigini göstermektedir. Sonuç olarak, farkli mekanizmalar ile insan serviks (rahim agzi) kanseri hücrelerinin anlamli ölçüde ölmesi, bulusa konu bilesigin bu kanserin tedavisinde kullanilabilecek bir ilaç olabilecegini göstermektedir. Ikinci asamada Pc maddesini vücuda verdikten sonra sadece kanserli bölge kirmizi isiga maruz birakilmakta ve rahim agzi kanserinin tedavisi etkin bir sekilde saglanmaktadir. TR TR TR TR