TR201816028T4 - Pirazolopiridazinler ve retinal-dejeneratif hastalıkların ve Usher Sendromu ile ilişkili işitme kaybının tedavi edilmesine yönelik yöntemler. - Google Patents

Abstract

Retinitis pigmentoza, Leber konjenital Amorozisi, Sendromik retinal dejenerasyonlar, yaşa bağımlı maküler dejenerasyon ve Usher Sendromu ve Usher Sendromu ile ilişkili duyma kaybı gibi retinal dejeneratif hastalıkların tedavisine yönelik bileşikler, bileşimler ve yöntemler burada açıklanır.

Description

TARIFNAME PIRAZOLOPIRIDAZINLER VE RETINAL-DEJENERATIF HASTALIKLARIN VE USHER SENDROMU ILE ILISKILI ISITME KAYBININ TEDAVI EDILMESINE YÖNELIK YÖNTEMLER BULUSUN ALTYAPISI Nadir görünen genetik bir bozukluk ve sagirlik ve körlügün baslica nedeni olan Usher Sendromu, on genden herhangi birindeki bir mutasyon ile iliskilidir.

Sendroma yönelik diger isimler Hallgren Sendromu, Usher-Hallgren Sendromu, RP-Dysacusis Sendromuve Dystrophia Retinae Dysacusis Sendromunu içerir.

Usher Sendromu, sagirlik ve önemli görme kaybi ile karakterize edilir. Duyma kaybi, iç kulak kusurlari ile iliskilidir ancak görme kaybi, retinitis pigmentoza (RP), retinal hücrelerin dejenerasyonu ile iliskilidir. Genel olarak retinanin çomak hücreleri, erken gece körlügü ve çevresel görmede önemli kayba neden olacak sekilde birinci olarak etkilenir. Bazi durumlar, merkezi akuiti kaybina neden olan, lekenin koni hücrelerinin erken dejenerasyonunu içerir. Bazi durumlarda muzdarip olan kisinin foveal görüsü ayrilir, merkezi ve çevresel görüsün saglam kaldigi ancak bir körlük halkasi ile engellendigi “donut görüsüne” neden olur.

Usher Sendromu, asagidaki gibi gösterilen üç klinik alt tipe sahiptir: I, II ve III.

Usher l özneleri, sagir olarak dogar, on yik içinde görme kaybina baslar ve denge bozukluklari gösterir. Vestibüler anormallikler nedeniyle çocukken yürümeyi ögrenmeleri yavastir. Usher II özneleri, daha az duyma kaybindan muzdariptir, fiziksel dengesizlikten muzdarip degildir ve ergenlikte görme kaybi baslar.

Duymalarinin çogu orta yasta muhafaza edilebilir. Usher III özneleri, önemli derecede duyma ve görme kaybindan muzdariptir ve fiziksel dengesizlikten muzdarip olabilir.

Usher Sendromu, degisken bir durumdur; siddet derecesi tam olarak alt tipe bagli 02078-P-0002 degildir. Örnegin bir Usher III öznesi, çocuklukta asemptomatik olabilir ancak ergenligin basi ila ortalarinda sagirlik ve görme kaybi gelisebilir. 50 yasindan önce büyük oranda göre bozuklugu, Usher III öznelerinde yaygindir. Diger taraftan bir Usher l öznesi, dogustan sagir olabilir ancak yaslilik döneminde iyi referans yapilabilir.

BULUSUN KISA AÇIKLAMASI Bulus, asagidaki yapilara sahip bilesikleri: 1`, ` - ". I. ._ 02078-P-0002 ve farmasötik olarak kabul edilebilir tuzlarini saglar. Ancak bununla birlikte Bilesik 14, bulusa ait degildir.

Yukaridaki Bilesikler 1-14”ün her biri veya bunun farmasötik olarak kabul edilebilir bir tuzu (bir "Pirazolopiridazin bilesigi” veya “bulusun bir bilesigi”), Usher Sendromu ile iliskili bir retinal dejeneratif hastalik veya duyma kaybinin tedavi edilmesine yönelik faydalidir. 02078-P-0002 Bulus ayrica bir Pirazolopiridazin bilesiginin ve farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyici veya aracin etkili bir miktarini içeren bilesimleri saglar. Bilesiinler, retinal dejeneratif hastalik veya Usher Sendromu ile iliskili duyma kaybinin tedavi Bulus ayrica Pirazolopiridazin bilesiginin etkili bir miktarinin buna ihtiyaci olan bir özneye uygulanmasini içeren, bir retinal dejeneratif hastaligin tedavi edilmesine yönelik bir yöntemleri açiklar.

Bulus yine ayrica bir Pirazolopiridazin bilesiginin etkili bir miktarinin buna ihtiyaci olan bir özneye uygulanmasini içeren, Usher Sendroinu ile iliskili duyma kaybinin tedavi edilmesine yönelik yöntemleri açiklar.

SEKLIN KISA AÇIKLAMASI Sekil 1, hücrelerde N48K Clarin-l ifadesinin yogunlugunu gösterir.

BULUSUN DETAYLI AÇIKLAMASI Bulus, bulusa ait bilesikleri, bulusa ait bir bilesigi içeren bilesimleri ve bir Pirazolopiridazin bilesiginin veya bunun farmasötik olarak kabul edilebilir tuzunun uygulanmasini içeren, bir retinal dejeneratif hastaligin veya Usher Sendromu ile iliskili duyma kaybinin tedavi edilmesine yönelik yöntemleri saglar.

Bulusun Bilesikleri Bir sayisal degerden önce geldiginde “yaklasik” kelimesi, bu degerin %10 fazlasi veya azi araligi anlamina gelir, örnegin “yaklasik 100 mg”, 90 mg ila 110 mg anlamina gelir, “yaklasik 300 mg”, 270 mg ila 330 mg, Vb. anlamina gelir. 02078-P-0002 Kisaltmalar: APCI Atmosferik Basinçta Kimyasal Iyonizasyon DAPI 4',6-diamidino-Z-fenilindol DlPEAdiizopropiletilamin DMEM Dulbecco°nun Modifiye Eagle Ortami DMF dimetilformamid DMSODimetil sülfoksit EDAC 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilkarbodiimid hidroklorid ESI Elektrospreyiyonizasyon ESI-TOF Elektrosprey iyonizasyonu-Uçus-süresi HATU 2-(7-Aza-1H-benzotriazol- 1-il)-1, 1,3 ,3-tetrametiluronyum hekzaflorofosfat HPLC Yüksek performansli sivi kromatografisi LCMS Sivi kromatograIîsi-kütle spektrometresi LDA lityum diizopropil amid m/z Kütle-ila-yük orani MALDl-TOF Matriks Destekli Lazer Desorpsiyon Iyonizasyonu-Uçus-süresi MS Kütle spektrometrisi PBS fosfat-tamponlu salin Rt Retansiyon süresi SDS sodyum dodesilsülfat THF tetrahidrofuran 02078-P-0002 Bulus, asagidaki yapilara sahip bilesikleri: 02078-P-0002 ve farmasötik olarak kabul edilebilir tuzlarini saglar.

Burada açiklanan bilesiklerden bazilari örnegin Bilesikler 1-4 ve 14; mutlak stereokimyaya gösteren, bir koyu veya tarali kamaya sahip olarak gösterilir.

Herhangi bir belirli mekanizmaya bagli kalinmaksizin Pirazolopiridazin bilesiklerinin bisfenil pirazolopiridazin parçasinin, Usher III Sendromunda mutasyona ugrayan gen tarafindan kodlanana Clarin I°in aktivitesi ve trafiginin restorasyonunda yer aldigi düsünülür (Adato et al., Eur J Hum Genet. 2002 Bulusun bilesikleri, bir tuz formunda olabilir. Bazi düzenlemelerde tuz, farmasötik olarak kabul edilebilir bir tuzdur. Farmasötik olarak kabul edilebilir tuzlar örnegin asit eklentili tuzlar ve baz eklentili tuzlari içerir. Bir asit eklentili tuzu olusturan asit, bir organik asit veya organik olmayan bir asit olabilir. Bir baz eklentili tuzu olusturan baz, bir organik baz veya organik olmayan bir haz olabilir. 02078-P-0002 Bazi düzenlemelerde farmasötik olarak kabul edilebilir bir tuz, bir metal tuzudur.

Bazi düzenlemelerde farrnasötik olarak kabul edilebilir bir tuz, bir amonyum Asit eklentili tuzlar, bulusun bir bilesiginin baz içermeyen bir formuna bir asit eklenmesinden olusabilir. Bazi düzenlemelerde asit, organiktir. Bazi düzenlemelerde asit, organik degildir. Uygun asitlerin sinirlayici olmayan örnekleri hidroklorik asit, hidrobromik asit, hidroiyodik asit, nitrik asit, nitröz asit, sülfürik asit, sülfürik asit, bir fosforik asit, nikotinik asit, izonikotinik asit, laktik asit, salisilik asit, 4-aminosalisilik asit, tartarik asit, askorbik asit, gentisinik asit, glukonik asit, glukaronik asit, sakkarik asit, formik asit, benzoik asit, glutamik asit, pantotenik asit, asetik asit, propiyonik asit, bütirik asit, fumarik asit, süksinik asit, sitrik asit, oksalik asit, maleik asit, hidroksimaleik asit, metilmaleik asit, glikolik asit, malik asit, sinamik asit, mandelik asit, 2-fen0ksibenzoik asit, 2- asetoksibenzoik asit, embonik asit, fenilasetik asit, N-siklohekzilsülfamik asit, metansülfonik asit, etansülfonik asit, benzensülfonik asit, p-toluensülfonik asit, 2- hidroksietansülfonik asit, etan-1,2-disülf0nik asit, 4-metilbenzensülf0nik asit, naftalen-Z-sülfonik asit, naftalen-1,5-disülfonik asit, 2-fosfogliserik asit, 3- fosfogliserik asit, glukoz-6-fosforik asit ve an amino asit içerir.

Uygun asit eklentili tuzlarin sinirlayici olmayan örnekleri bir hidroklorid tuzu, bir hidrobromid tuzu, bir hidroiyodid tuzu, bir nitrat tuzu, bir nitrit tuzu, bir sülfat tuzu, bir sülfit tuzu, bir fosfat tuzu, bir hidrojen fosfat tuzu, bir dihidrojen fosfat tuzu, bir karbonat tuzu, bir bikarbonat tuzu, bir nikotinat tuzu, bir izonikotinat tuzu, bir laktat tuzu, bir salisilat tuzu, bir 4-aminosalisilat tuzu, bir tartrat tuzu, bir askorbat tuzu, bir gentisinat tuzu, bir glukonat tuzu, bir glukaronat tuzu, bir sakkarat tuzu, bir format tuzu, bir benzoat tuzu, bir glutamat tuzu, bir pantotenat tuzu, bir asetat tuzu, bir propiyonat tuzu, bir bütirat tuzu, bir fumarat tuzu, bir süksinat tuzu, bir sitrat tuzu, bir oksalat tuzu, bir maleat tuzu, bir hidroksimaleat tuzu, bir metilmaleat tuzu, bir glikolat tuzu, bir malat tuzu, bir sinamat tuzu, bir mandelat tuzu, bir 2-fen0ksibenzoat tuzu, bir 2-aset0ksibenzoat tuzu, bir embonat 02078-P-0002 tuzu, bir fenilasetat tuzu, bir N-siklohekzilsülfamat tuzu, bir metansülfonat tuzu, bir etansülfonat tuzu, bir benzensülfonat tuzu, bir p-toluensülfonat tuzu, bir 2- hidroksietansülfonat tuzu, bir etan-1,2-disülfonat tuzu, bir 4-metilbenzensülfonat tuzu, bir naftalen-Z-sülfonat tuzu, bir naftalen-1,5-disülfonat tuzu, bir 2- fosfogliserat tuzu, bir 3-fosfogliserat tuzu, bir glukoz-ö-fosfat tuzu ve bir amino asit tuzunu içerir.

Metal tuzlari, bir karboksil grubuna sahip olan bulusun bir bilesigine organik bir baz eklenerek olusturulabilir. Organik olmayan baz, örnegin hidroksit, karbonat, bikarbonat veya fosfat gibi bir bazik karsi iyon ile çiftlestirilen bir metal katyondan olusur. Metal, bir alkali metal, toprak alkalin metal, geçis metali veya ana grup metal olabilir. Uygun metallerin sinirlayici olmayan örnekleri lityum, sodyum, potasyum, sezyum, seryum, magnezyum, manganez, demir, kalsiyum, strontiyum, kobalt, titanyum, alüminyum, bakir, kadmiyum ve çinkoyu içerir.

Uygun metal tuzlarinin sinirlayici olmayan örnekleri bir lityum tuzu, bir sodyum tuzu, bir potasyum tuzu, bir sezyum tuzu, bir seryum tuzu, bir magnezyum tuzu, bir manganez tuzu, bir demir tuzu, bir kalsiyum tuzu, bir strontiyum tuzu, bir kobalt tuzu, bir titanyum tuzu, bir alüminyum tuzu, bir bakir tuzu, bir kadmiyum tuzu ve bir çinko tuzunu içerir.

Amonyum tuzlari, bir karboksil grubuna sahip olan bulusun bir bilesigine amonyak veya organik bir amin eklenerek olusturulabilir. Uygun organik aminlerin sinirlayici olmayan örnekleri trietil amin, diizopropil amin, etanol amin, dietanol amin, trietanol amin, morfolin, N-metilmorfolin, piperidin, N- metilpiperidin, N-etilpiperidin, dibenzil amin, piperazin, piridin, pirrazol, imidazol, pirazin, pipirazin, etilendiamin, N,N'-dibenziletilen diamin, prokain, kloroprokain, kolin, disiklohekzil amin ve N-metilglukamin içerir.

Uygun amonyum tuzlarinin sinirlayici olmayan örnekleri bir trietilamonyum tuzu, bir diizopropilamonyum tuzu, bir etanolamonyum tuzu, bir dietanolamonyum 02078-P-0002 tuzu, bir trietanolamonyum tuzu, bir morfolinyum tuzu, bir N-metilmorfolinyum tuzu, bir piperidinyum tuzu, bir N-metilpiperidinyum tuzu, bir N-etilpiperidinyum tuzu, bir dibenzilamonyum tuzu, bir piperazinyum tuzu, bir piridinyum tuzu, bir pirrazolyum tuzu, bir imidazolyum tuzu, bir pirazinyum tuzu, bir etilendiamonyum tuzu, bir N,N'-dibenziletilendiamonyum tuzu, bir prokain tuzu, bir kloroprokain tuzu, bir kolin tuzu, bir disiklohekzilamonyum tuzu ve bir N- metilglukamin tuzunu içerir.

Pirazolopiridazin Bilesiklerinin Yapimina yönelik Yöntemler Pirazolopiridazin bilesikleri, asagidakileri içerir. i2, Hio3 Ad 1 , i R"_: R aq. NaOH R. NaN02 R» / Pd(PPh3)2Cl2, Cul HN Nr EIOH, 35°C H2N N'N c. Hci, RT NeN DMF` Et3N, 85°C H C CIJH i -15°Cna RT Adim 4 3 O 3 Ad'm 5 CH3 Adime Sema 1 genellikle bir l-N-metil grubuna sahip Pirazolopiridazin bilesiklerinin hazirlanmasini açiklar ve burada R' ve R" bagimsiz olarak bir sübstitüe edilmemis veya bir sübstitüe edilmis fenil grubudur. Örnegin R”nin sübstitüe edilmemis veya sübstitüe edilmis fenil oldugu bir 2-siyan0karb0nil bilesigi, bir 3-sübstitüe edilmis-1-metil-lH-pirazol-S-amin saglamak üzere N-metilhidrazin ile yogunlastirilir. 5-amin0 grubu, örnegin, bir S-amido bilesigi saglamak üzere piridin gibi bir baz varliginda asetik anhidrit ile asile edilir. 5-amido bilesigi, örnegin, bir N-(3-sübstitüe edilmis-4-iy0d0-l-metil-1H-pirazol-5-i1)asetamid saglamak üzere etanol (EtOH) gibi bir solvent içerisinde bir iyodin ve iyodik asit 02078-P-0002 karisimi ile iyodine edilir. Trietilamin gibi bir baz ile dimetilformamid (DMF) gibi bir solvent içerisinde bakir (I) iyodid varliginda, örnegin, paladyum (II) bistrifenilfosfin diklorid gibi bir paladyum komplesi ile katalize edilen bir R"- sübstitüe edilmis terminal alkin ile asetamidin, bir Sonagashira çapraz baglantisi gibi bir paladyum aracili çapraz baglantisi, R"°nin sübstitüe edilmemis veya sübstitüe edilmis fenil oldugu bir disübstitüe edilmis alkin saglar. Etanol gibi bir solvent içerisinde sodyum hidroksit gibi bir baz ile alkin asetamidin sabunlasmasi, primer amini saglar. Konsantre edilmis hidroklorik asit içinde sodyum nitrik ile primer aminin diyazolama islemi bir diazo ara ürününü saglar, bu bir 1-N-metil grubuna sahip bir Pirazolopiridazin bilesigini saglamak üzere siklize olur ve burada R' ve R" bagimsiz olarak bir sübstitüe edilmemis veya bir sübstitüe edilmis fenil grubudur.

LDA, THF tolüen Sema 2 genellikle bir R3 grubuna sahip Pirazolopiridazin bilesiklerinin hazirlanmasini açiklar ve burada R' bir sübstitüe edilmemis veya bir sübstitüe edilmis fenil grubudur. R' ve R3 ayni veya farkli olabilir. Örnegin 4,6-dik10r0-3- fenilpiridazin, tetrahidrofuran (THF) gibi bir solvent içerisinde lityum tetrahidrofuran (THF), gibi bir baz ile protonsuz birakilir ve ortaya çikan 5-1itiyo türü, ikincil bir alkol saglamak üzere bir sübstitüe edilmemis veya bir sübstitüe edilmis benzaldehit ile yogunlastirilir. Alkol, tolüen gibi bir solvent içerisinde 02078-P-0002 manganez dioksit gibi bir oksidize edici ajan ile bir ketona oksidize edilir. Keton, bir l-N- R3 grubuna sahip bir Pirazolopiridazin bilesigi saglamak üzere siklize olan bir ara ürün hidrazon saglamak üzere etanol gibi bir solvent içerisinde bir R3- sübstitüe edilmis hidrazin ile yogunlastirilir, burada R3, Formüllerde (Il ve [11) oldugu gibi taniinlanir ve burada R', bir sübstitüe edilmemis veya bir sübstitüe edilmis fenil grubudur.

Sema 3 genellikle bir l-N-metil grubuna sahip Pirazolopiridazin bilesiklerinin hazirlanmasini açiklar ve burada R', bir siyano grubu, bir alkin, bir alken veya bir aril grubudur. Örnegin l-metil-3-iyodofenil-4-kloro-5-fenil-lH-pirazolo[3,4- c]piridazin, bir l-N-metil grubuna sahip ve R'Snin bir siyano grubu, bir alkin, bir alken veya bir aril grubu oldugu bir Pirazolopiridazin bilesigini saglamak üzere, istege bagli olarak paladyum kompleksi gibi uygun bir katalizörün varliginda, istege bagli olarak çinko veya bakir tuzu gibi paladyum disi geçis metali tuzunun varliginda, istege bagli olarak trifenilfosfin gibi bir katki maddesi veya bir organik amin baz varliginda bir siyanür tuzu, bir terminal alkin, bir alkenil haloj enür veya bir aril halojenür gibi uygun bir birlestirme partneri ile birlestirilir. Üründeki R' pozisyonu, diger bir ifadeyle orta, meta veya para, baslangiç materyalindeki iyodo grubunun pozisyonu ile aynidir. 02078-P-0002 i %10Pd/C` Cul a) ACCI. NMM O PN '2. H|03 o FN NEt3: PPh3 b) MeOH= NaOH ”30 H H Adim ch H H ph_: 3) AO& s H3C H H )`OEI Adim 5 Adim4 H3C Rl-OH. DEAD RZ-B(0R)2 Ph3P veya: PdCl2(dppf)_CH2C32 NaH' R`CI, DMF K3p04 Sema 4 genellikle Pirazolopiridazin bilesiklerinin hazirlanmasini açiklar.

Terapötik Kullanimlar Bulusun bir bilesigi, bir retinal dejeneratif hastaliginin tedavisine yönelik buna ihtiyaci olan bir özneye uygulanabilir. Retinal dejeneratif hastaliklarin sinirlayici olmayan örnekleri asagidakileri içerir: retinitis pigmentoza, Leber konjenital Amorozisi, Sendromik retinal dejenerasyonlar, yas ve kuru yasa bagimli maküler dejenerasyon dahil olmak üzere yasa bagimli maküler dejenerasyon ve Usher Sendromu. Bazi düzenlemelerde Usher Sendromu, Usher Sendromunun bir alt tipidir. Bazi düzenlemelerde alt tip, Usher I°dir. Bazi düzenlemelerde alt tip, Usher II”dir. Bazi düzenlemelerde alt tip, Usher IlI°tür.

Bulusun diger bir düzenlemesinde bulusun bir bilesigi. Usher Sendromu ile iliskili duyma kaybinin tedavisine yönelik buna ihtiyaci olan bir özneye uygulanabilir.

Bazi düzenlemelerde Usher Sendromu, Usher Sendromunun bir alt tipidir. Bazi 02078-P-0002 düzenlemelerde alt tip, Usher lidir. Bazi düzenlemelerde alt tip, Usher H”dir. Bazi düzenlemelerde alt tip, Usher III”tür.

Bir “özne”, bir memeli örnegin bir insan, fare, siçan, gine domuzu, köpek, kedi, at, inek, domuz veya insan olmayan bir primat, örnegin bir maymun, sempanze, babun veya rhesustur. Bir düzenlemede özne, bir insandir.

Bulusun bilesikleri, farmasötik olarak kabul edilebilir bir tasiyici veya araci içeren bir bilesimin bir bileseni olarak bir özneye uygulanabilir. Uygun fannasötik tasiyicilar veya araçlarin sinirlayici olmayan örnekleri nisasta, glukoz, laktoz, sakaroz, jelatin, malt, pirinç, un, kireç tasi, silika jel, magnezyum karbonat, magnezyum stearat, sodyum stearat, gliserol monostearat, talk, sodyum klorid, kurutulmus yagsiz süt, gliserol, propilen, glikol, su, etanol, tamponlu su ve fosfat tamponlu salini içerir. Bu bilesimler, örnegin damlalar, solüsyonlar, süspansiyonlar, tabletler, haplar, kapsüller, tozlar ve yavas salinimli formülasyonlar olarak uygulanabilir. Bazi düzenlemelerde bilesimler örnegin laktoz, dekstoz, sakaroz, sorbitol, mannitol, nisastalar, akasya sakizi, kalsiyum fosfat, aljinatlar, kitre, jelatin, kalsiyum silikat, mikrokristalin selüloz, polivinilpirrolidon, selüloz, su surubu, metil selüloz, metil ve propilhidroksibenzoatlar, talk, magnezyum stearat ve mineral yagini içerir.

Bilesimler ayrica yaglayici ajanlari, islatma ajanlarini, emülsiye edici ve süspanse edici ajanlari, koruyucu ajanlari, tatlandirici ajanlari veya tatlandirici ajanlari içerebilir.

Bilesimler, bulusun bir bilesiginin etkili bir miktarini içerebilir. Bulusun “etkili bir miktari”, bir öznede bir retinal dejeneratif hastaligi veya Usher Sendromu ile iliskili duyma kaybini tedavi etmek üzere etkili olan miktardir. Bilesimler, bulusun bir bilesiginin etkili bir miktarini içeren bir birim dozaj formunda formüle edilebilir. Bazi düzenlemelerde bilesimler örnegin bulusun bir bilesiginin yaklasik lmg ila yaklasik 1,000 mg9sini içerir. Bazi düzenlemelerde bilesimler, bulusun bir bilesiginin yaklasik 100 mg ila yaklasik 1,000 mg”sini içerir. Bazi düzenlemelerde 02078-P-0002 bilesimler, bulusun bir bilesiginin yaklasik 100 mg ila yaklasik 500 ing'sini içerir.

Bazi düzenlemelerde bilesimler, bulusun bir bilesiginin yaklasik 200 mg ila yaklasik 300 mg”sini içerir.

Bulusun bir bilesiginin dozaji, semptomlara, öznenin yasi ve Vücut agirligina ve retinal dejeneratif hastaligin veya Usher Sendromu ile iliskili duyma kaybinin yapisina ve siddetine, uygulama yoluna ve bilesimin formuna bagli olarak degisiklik gösterebilir. Burada açiklanan bilesimler, tek bir toz veya bölünmüs dozlar halinde uygulanabilir. Bazi düzenlemelerde bulusun bir bilesiginin dozaji, öznenin kg cinsinden vücut kütlesi basina yaklasik 0.01 ng ila yaklasik 10 g, kg basina yaklasik 1 ng ila yaklasik 0.1 g veya kg basina yaklasik 100 ng ila yaklasik mg araligindadir.

Uygulama örnegin topikal, intraaural, intraoküler, parenteral, intravenöz, intra- arteriyel, subkütanöz, intrainasküler, intrakraniyal, intraorbital, intraventriküler, intrakapsüler, intraspinal, intrasisternal, intraperitoneal, intranazal, aerosol, süpozituar veya oraldir. Oral kullanima yönelik formülasyonlar, toksik olmayan farmasötik olarak kabul edilebilir eksipiyanlar ile bir karisim içinde bulusun bir bilesigini içeren tabletleri içerir. Bu eksipiyanlar örnegin inert seyrelticiler veya dolgu maddeleri (örnegin, sakaroz ve sorbitol), yaglayici ajanlar, akiskanligi güçlendiriciler ve yapisma önleyiciler (örnegin, magnezyum stearat, çinko stearat, stearik asit, silikalar, hidrojenli bitkisel yaglar veya talk) olabilir. Oküler kullanima yönelik formülasyonlar, göz damlasi formunda olabilir.

Bulusun bir bilesigi veya bunun bilesimi, parental, subkütanöz, intradermal, intramasküler veya intravenöz uygulamaya yönelik örnegin izotonik, aköz veya salin tamponlarin yeniden olusturulmasina yönelik liyofilize edilmis formda saglanabilir. Bulusun bir bilesimi ayni zamanda oral, intraaural, nazal veya sublingual uygulamaya yönelik faydali olan bir sivi hazirlanis formunda. örnegin bir süspansiyon, surup veya eliksir olabilir. Bulusun bir bilesimi ayni zamanda oral uygulamaya yönelik uygun bir formda, örnegin bir kapsül. tablet, hap ve 02078-P-0002 çignencbilir kati formülasyon olabilir. Bulusun bir bilesimi ayni zamanda bir sivi, bir Viskoz sivi, bir macun veya bir toz gibi dermal uygulamaya yönelik bir krem olarak hazirlanabilir. Bulusun bir bilesimi ayni zamanda aerosollestirici bir bilesen ile veya bu olmayan pulmoner uygulamaya yönelik bir toz olarak hazirlanabilir.

Bilesimler, kan-beyin bariyerini geçebilmesinin yani sira oral, intraaural, intranazal` sublingual, intraduodenal, subkutanöz, bukkal, intrakolonik. rektal, vajinal, mukozal, pulmoner, transdermal, intradermal, parenteral, intravenöz, intramasküler ve oküler dozaj formlarinda olabilir.

Bulusun bilesimleri, teknikte bilinen çesitli araçlar ile uygulanabilir. Örnegin bulusun bilesimleri, oral olarak uygulanabilir ve tabletler, kapsüller, granüller, tozlar veya suruplar olarak formüle edilebilir. Alternatif olarak bulusun formülasyonlari enjeksiyonlar (örnegin, intravenöz, intramasküler veya subkütanöz), damla infüzyon hazirlanislari veya süpozituarlar olarak parenteral olarak uygulanabilir. Oftalmik uygulamaya yönelik bulusun bilesimleri, göz damlalari veya göz merhemleri olarak formüle edilebilir. Aura] bilesimler, içsel olarak veya yüzeysel olarak olmak üzere kulaga uygulamaya yönelik göz damlalari, merhemler, kremler, sivilar, jeller veya yatistiricilar olarak formüle edilebilir. Bu formülasyonlar klasik araçlar ile hazirlanabilir ve bilesimler bir eksipiyan, bir baglayici, bir dagitici ajan, bir yaglayici, bir çözücü ajan, bir süspansiyon yardimcisi, bir emülsifiye edici ajan veya bir kaplaina ajani gibi herhangi bir klasik katki maddesi ile karistirilabilir.

Bulusun bilesimleri, islatma ajanlarini, emülsiye edici maddeleri ve yaglayicilari, renklendirici ajanlari, serbest birakma ajanlarini, kaplama ajanlarini, tatlandiricilari` tat verme ve koku verme ajanlarini, koruyuculari ve antioksidanlari içerebilir. 02078-P-0002 Bilesimler örnegin oral, intraaural, intraoküler, nazal, topikal (bukal ve sublingual dahil olmak üzere), rektal, vajinal, aerosol ve/veya parenteral uygulamaya yönelik uygun olabilir. Bilesimler, bir birim dozaj formunda saglanabilir ve teknikte bilinen herhangi bir yöntem ile hazirlanabilir.

Oral uygulamaya yönelik uygun olan formülasyonlar, kapsüller, kaseler, haplar, tabletler, pastiller, tozlar, granüller formunda veya aköz veya aköz olmayan sivi içinde bir solüsyon veya bir süspansiyon olarak veya su içinde yag veya yag içinde su sivi emülsiyonu olarak veya bir eliksir veya surup olarak veya pastiller (jelatin ve gliserin veya sakaroz ve akasya gibi inert bir baz kullanilarak) olabilir.

Bulusun bilesimleri ayrica bir bolus, elektuar veya macun olarak uygulanabilir.

Farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyicilar veya araçlarin ilave örnekleri asagidakileri içerir: (1) nisastalar, laktoz, sakaroz, glukoz, mannitol ve/veya silisik asit gibi dolgu maddeleri veya uzaticilar; (2) karboksimetil selüloz, aljinatlar, jelatin, polivinil pirolidon, sakaroz ve/veya akasya gibi baglayicilar; (3) gliserol gibi nemlendiriciler; (4) agar-agar, kalsiyum karbonat, patates veya tapyoka nisastasi, aljinik asit, belirli silikatlar ve sodyum karbonat gibi parçalayici ajanlar; (5) parafin gibi solüsyon geciktirici maddeler; (6) kuaterner amonyum bilesikleri gibi absorpsiyon hizlandiricilari; (7) asetil alkol ve gliserol monostearat gibi islatici ajanlar; (8) kaolin ve bentonit kil gibi absorbanlar; (9) bir talk, kalsiyum stearat, magnezyum stearat, kati polietilen glikoller, sodyum lauril sülfat ve bunlarin karisimlari gibi yaglayicilar; ve (11) tamponlayici ajanlar. Benzer bilesimler, yumusak- veya sert-dolgulu jelatin kapsüller içindeki dolgu maddeleri olarak kullanilabilir.

Oral uygulamaya yönelik sivi dozaj formlari, farmasötik olarak kabul edilebilir emülsiyonlar, mikroemülsiyonlar, jeller, solüsyonlar, süspansiyonlar, suruplar ve eliksirleri içerir. Sivi dozaj formu, teknikte yaygin olarak kullanilan inert seyrelticileri, örnegin su veya diger solventler, çözücü ajanlari ve emülsiyonlastiricilari, örnegin etil alkol., izopropil alkol, dietil karbonat, etil asetat, 02078-P-0002 benzil alkol, benzil benzoat, propilen glikol, 1,3-bütilen glikol, yaglari örnegin, pamuk çekirdegi, yer fistigi, misir, jerm, zeytin, kastor ve susam yaglari, gliserol, tetrahidrofüril alkol, polietilen glikoller, sorbitanin yag asidi esterleri ve bunlarin karisimlarmi içerebilir.

Süspansiyon dozaji formlari, süspanse edici, örnegin etoksilli izostearil alkoller, polioksietilen sorbitol ve sorbitan esterler, mikrokristalin selüloz, alüminyum metahidroksit, bentonit, agar-agar ve kitre ve bunlarin karisimlarini içerebilir.

Söz konusu bir bilesimin transdermal uygulamasina yönelik dozaj formlari damlalar, tozlar, Spreyler, merhemler, macunlar, kremler, losyonlar, jeller, solüsyonlar ve yamalari içerir. Merhemler, macunlar, kremler ve jeller hayvansal ve bitkisel kati yaglar, sivi yaglar, vakslar, parafm, nisasta, kitre, selüloz türevleri, polietilen glikoller, silikonlar, bentonit, silisik asit, talk ve çinko oksit veya bunlarin karisimlari gibi eksipiyanlari içerebilir.

Tozlar ve Spreyler laktoz, talk, silisik asit, alüminyum hidroksit, kalsiyum silikatlar, poliamid toz veya bunlarin karisimlari gibi eksipiyanlari içerebilir.

Spreyler ayrica klorotlorohidrokarbonlar gibi klasik iticileri ve bütan ve propan gibi uçucu sübstitüe edilmemis hidrokarbonlari içerebilir.

Bilesimler, kati partiküllerin aerosolü araciligiyla uygulanabilir. Aköz olmayan bir (örnegin, florokarbon itici) süspansiyon kullanilabilir. Sonik nebülizörler, degradasyona neden olabilecek sekilde kaymaya maruziyeti minimuma indirmeleri nedeniyle kullanilabilir.

Bir aköz aerosol, bir aköz solüsyon veya bulusun bir bilesiginin süspansiyonunun geleneksel herhangi bir farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyici veya araç örnegin iyonik olmayan sürfaktanlar (Tweenler, Pluronikler veya polietilen glikol); serum albumin gibi proteinler; sorbitan esterleri; yag asitleri; lesitin; 02078-P-0002 amino asitler; tamponlar; tuzlar; sekerler veya seker alkolleri ile formüle edilmesiyle yapilabilir.

Parenteral uygulamaya yönelik uygun bilesimler, fomiülasyonu öznenin kani veya süspanse edici veya koyulastirici ajanlar ile izotonik hale getiren antioksidanlar, tamponlar, bakteriyostatlar, çözünmüs maddeleri içerebilen, kullanilmadan hemen önce steril enjekte edilebilir solüsyonlar veya dispersiyonlarda sulandirilabilen bulusun bir bilesigini veya farmasötik olarak kabul edilebilir bir veya daha fazla steril izotonik aköz veya aköz olmayan solüsyon, dispersiyon, süspansiyon veya emülsiyon veya steril tozu içerir.

Bulusun belirli düzenlemelere referans ile açiklanmasina ragmen diger düzenlemeler, tarifname göz önünde bulunduruldugunda teknikte uzman bir kisiye yönelik açik olacaktir. Bulus ayrica asagidaki örneklere referans ile tanimlanir. Bulusun kapsami disina çikilmadan materyallere ve yöntemlere yönelik birçok modifikasyonun gerçeklestirilebilecegi teknikte uzman kisi tarafindan anlasilacaktir. ÖRNEKLER Genel Sentetik Yöntemler Aksi belirtilmedikçe tüm kimyasal maddeleri ticari tedarikçilerden satin alinmistir ve ilave saflastirma olmaksizin kullanilmistir.

Standart bazik LC-MS kosullari: (10cm ESCI Bicarb MeCN): mM amonyum bikarbonat (amonyum hidrojen karbonat) gradyani ile bir asetonitril (Far UV derecesi): su (PureLab Option birimi araciligiyla yüksek satlik) kullanilarak bir Waters Xterra MS Sum C18, 100 x 4.6mm (arti koruyucu kartus) kullanilmistir. Akis hizi, 2 mL/dakikadir. UV tespiti, bir Waters diyot 02078-P-0002 dizisi dedektörü (baslangiç Araligi 210 nm, bitis Araligi 400 nm, aralik süresi 4 nm) kullanilarak yapilmistir. Kütle tespiti, bir tek kuadrapol LC-MS aleti ile gerçeklestirilmistir. Iyonizasyon, bilesik türlerine bagli olarak ESI veya APCPdir.

Kullanilan gradyan, 0.00 dakika süresinde aköz solventin %95°i ila 4.0 dakikada aköz solventin %5°ini çalistirmistir. Bu yüzde akabinde 1.5 dakika daha tutulmustur.

Standart asidik HPLC kosullari: (1 0cm Formi'k ACE 3 CIS AR HPLC CH3CN2 araciligiyla yüksek saflik) ile bir asetonitril (Far UV derecesi) kullanilarak bir Hichrom ACE 3 CIS-AR karisik mod 100 x 4.6 mm kolonu kullanilmistir. Akis hizi, 1 mL/dakikadir. UV tespiti, bir Agilent diyot dizisi dedektörü (300 nm, bant genisligi 200 nm; ref. 450 nm, bant genisligi 100 nm) kullanilarak yapilmistir. dakikada aköz solventin %100”ünü çalistirmistir. Bu yüzde akabinde 2.4 dakika daha tutulmustur.

Standart bazik HPLC kosullari: ( mM amonyum bikarbonat gradyani ile bir asetonitril (Far UV derecesi): su (PureLab Option birimi araciligiyla yüksek saflik) kullanilarak bir, Phenomenex, Gemini NX, 3pm C18, 150 x 4.6mm kolon kullanilmistir. Akis hizi, 1 mL/dakikadir. UV tespiti, bir Agilent diyot dizisi dedektörü (300 nm, bant genisligi 200 nm; ref. 450 nm, bant genisligi 100 nm) kullanilarak yapilmistir.

Kullanilan gradyan, 0.00 dakika süresinde aköz solventin %95.5”i ila 900 dakikada aköz solventin %0`ini çalistirmistir. Bu yüzde akabinde 4.5 dakika daha tutulmustur. 02078-P-0002 Standart asidik HPLC kosullari: (I5cm Formi'k AS CEN TIS HPLC) araciligiyla yüksek satlik) ile bir asetonitril (Far UV derecesi) kullanilarak bir mm kolonu kullanilmistir. Akis hizi, 1 mL/dakikadir. UV tespiti, bir Agilent diyot nm) kullanilarak yapilmistir. Kullanilan gradyan, 0.00 dakikada %96 aköz solvent ila 3.00 dakikada %0 aköz solventini çalistirmistir. Bu yüzde akabinde 4.5 dakika daha tutulmustur.

Bulusa ait Örnekleyici Bilesiklerin Sentetik Hazirlanisi Adim 1: N-(IH-pi'razol-S-il)asetami'd ( solüsyonuna O°C”de bir nitrojen atmosferi altinda damlatilarak asetil klorid (99 mL, 1.38 mol) eklenmistir. Reaksiyon karisimi, 1 gün oda sicakliginda karistirilrnistir. Bazi di-asillestirilmis ürün, bir LCMS”de gözlemlenmistir. Reaksiyon karisimi, vakum ile konsantre edilmistir ve ortaya çikan kati. MeOH (2 L) içinde süspanse edilmistir ve 0°C”ye sogutulmustur. 4 M NaOH solüsyonu (aköz, yavasça eklenmistir ve karisim 1.5 saat boyunca oda sicakligi na isitilmistir. MeOH, vakum ile uzaklastirilmistir ve kati, filtrasyon ile toplanmistir, az miktarda soguk su ile yikanmistir ve bir kati (60 g) olarak basliktaki bilesigi saglamak üzere vakum ile kurutulmustur. 02078-P-0002 Adim 2: N-(4-iyodo-IH-pi'razol-S-i'l)asetamid H3C H H Etanol (1.6 L) içinde bir N-(1H-pirazol-5-il)asetamid (60 g, 0.48 mol), iyodik asit isitilmistir ve oda sicakligi na sogutulmustur. Reaksiyon karisimi, vakum ile konsantre edilmistir ve etil asetat ve 2 M NazSzO3 aköz solüsyon arasinda bölünmüstür. Katmanlar ayrilmistir ve aköz, etil asetat ile özütlenmistir. Kombine organik fazlar, kurutulmustur (MgSO4), ûltrelenmistir ve bir kati (105 g) olarak basliktaki bilesigi saglamak üzere vakum ile konsantre edilmistir: Adim 3: N-(4-(feni'letini'l)-IH-pirazol-S-ibasetamid Nitrojen, 20 dakika boyunca etanol ( içinde bir N-(4-iyod0-1H-pirazol-5- mmol), bakir(I) iyodid (1.14 g, 6 mmol), trifenilfosfin (6.3 g, 24 mmol) ve trietilamin (50 mL, 360 ininol) süspansiyonu ile köpürtülmüstür. Fenil asetilen (18.3 g, 179 mmol) eklenmistir ve nitrojen, 25 dakika boyunca karisim ile köpürtülmüstür. Reaksiyon karisimi akabinde isitilmistir ve 3 gün boyunca bir nitrojen atmosferinde retlüks kosullari altinda karistirilmistir ve oda sicakligi na sogutulmustur. Reaksiyon karisimi celite araciligiyla filtrelenmistir ve filtrat, vakum ile konsantre edilmistir. Kalinti, bir kati (17.6 g) olarak basliktaki bilesigi 02078-P-0002 saglayacak sekilde kolon kromatografisi (silika jel, izohekzan/etil asetat 911 ila 021) ile saflastirilinistir.

Adim 4: I -(1 -etoksietiD-4-(feniletinil)-IH-pi'mzol-5-am in HQNHSCioa CH2C12 (asetamid (17.6 g, 78 mmol), etoksieten ( içinde HCl solüsyonu 1 saat boyunca oda sicakliginda karistirilmistir ve vakum ile konsantre edilmistir. Kalinti, etanol ( ve %25 aköz NaOH solüsyonu ( içinde çözünmüstür ve reaksiyon karisimi, 4 saat boyunca 75°C°ye isitilmistir ve oda sicakligi na sogutulmustur. Etanol, vakum ile kismi olarak konsantre edilmistir ve ortaya çikan kati, filtrasyon ile toplanmistir, su ve az miktarda soguk etanol ile yikanmistir ve bir kati (16 g) olarak basliktaki bilesigi saglamak üzere vakum ile kurutulmustur.

Adim 5: 4-klor0-5-fenil-IH-pi'razolo/3,4-cjpiridazin Sodyum nitrit (4.3 g, 63 mmol), -15°C°de 10 dakika boyunca konsantre HClSya mmol) eklenmistir ve karisim 10 dakika boyunca -10°C”de ve 1 gün boyunca oda sicakliginda karistirilmistir. Reaksiyon karisimi, 0°C`ye sogutulmustur ve CH2C12 ( eklenmistir. Iyice karistirilarak pH 7 olana ve baz eklentisi 02078-P-0002 üzerine herhangi bir köpük kalmayana kadar 2 saatlik bir periyot üzerinde dikkatli bir sekilde NazC03 (160 g) akabinde doymus aköz NaHCO3 solüsyonu eklenmistir. Katmanlar ayrilmistir ve aköz faz, CHzClz ile özütlenmistir. Kombine organik katmanlar kurutulmustur (MgSO4), tiltrelenmistir ve vakum ile konsantre edilmistir. Kalinti, bir kati (3.43 g) olarak basliktaki bilesigi saglayacak sekilde kolon kromatografisi (silika jel, izohekzan/dietil eter 1:0 ila 021) ile saflastirilmistir.

Asetonitril ( içinde bir 4-kloro-5-fenil-lH-pirazolo[3,4-c]piridazin (244 boyunca reIlükse isitilmistir. Sari kati, basliktaki bilesik ve baslangiç materyalinin (9: 1, 4 g) bir karisimini saglamak üzere isitilirken filtrasyon ile toplanmistir. floropirolidin- I-il]etan0n Kloroasetil klorid (- 3-floropirrolidin (1 g, 7.94 mmol) ve trietilamin ( solüsyonuna damlatilarak eklenmistir. Reaksiyon karisimi 1 saat boyunca oda sicakliginda 02078-P-0002 karistirilmistir. Su ve CH2C12 eklenmistir. Katmanlar ayrilmistir ve aköZ, CH2C12 ile özütlenmistir. Kombine edilen organikler kurutulmustur (MgSO4), filtrelenmistir ve 2-klor0-l-[(3R)-3-flor0pirrolidin-l-i1]etan0n (4.7 g) vermek üzere vakum ile konsantre edilmistir.

Sodyum hidrit (mineral yagi içinde %60, 240 mg, 6 mmol), oda sicakliginda kutu minol) solüsyonuna eklenmistir. Reaksiyon karisimi 16 saat boyunca oda sicakliginda karistirilmistir. %4 LiCI aköz solüsyon ve etil asetat eklenmistir.

Katmanlar ayrilmistir ve aköz, etil asetat ile özütlenmistir. Kombine edilen organikler kurutulmustur (MgSO4), filtrelenmistir ve vakum ile konsantre edilmistir. Kalinti, kolon kromatografisi (silika je1,i`20hekzan/etil asetat 120 ila 3:7) ile kismi olarak saflastirilmistir. Ortaya çikan kati, minimum miktarda CH2C12 içinde çözünmüstür ve bir kati çökeltilene kadar dietil eter eklenmistir.

Kati, bir kati (846 mg) olarak basliktaki bilesigi saglamak üzere filtrasyon ile toplanmistir.

Nitrojen, 20 dakika boyunca DMF ( içinde bir 2-(4-kloro- 02078-P-0002 mg, 0.43 mmol) süspansiyonu yoluyla kabarciklandirilmistir. 1,1'- Bis(difenilfosfino)ferrosen-paladyum(Il)diklorid diklorometan kompleksi (12 mg, 0.014 mmol) eklenmistir ve tüp kapatilmistir ve 30 dakika boyunca mikrodalga irradyasyonu kullanilarak 60°C1ye isitilmistir. Ham reaksiyon karisimi filtrelenmistir ve kismen preparatif HPLC ile saflastirilmistir. Kalinti, Bilesik lsi (20 mg) saglamak üzere kromatografi (silika jel, izohekzan/etil asetat [:0 ila 723) ile saflastirilmistir.

LCMS (lûcm_ESCI_Bicarb_MeCN) oda sicakligi 3.97 dakika; m/z 454 [M+H] Bilesik 2, Örnek lse göre ancak Adim 8,de 4-florofenilb0ronik asit yerine 3,4- diflorofenilboronik asit kullanilarak sentezlenmistir. 02078-P-0002 LCMS (15cm_Formic_ASCENTIS_HPLC_CH3CN) Oda sicakligi 10.32 dakika; m/z 472 [M+H] %996 saflik. diflorofenilboronik asit kullanilarak sentezlenmistir.

LCMS (15cin_Bicarb_GeminiNX_HPLC_CH3CN) oda sicakligi 10.51 dakika; m/z 472 [M+H] %93.72 saflik. 02078-P-0002 Bilesik 4, Örnek 1”e göre ancak Adini 8`de 4-florofenilb0r0nik asit yerine 2,3- dillorofenilboronik asit kullanilarak sentezlenmistir.

LCMS (15cm_Bicarb_GeminiNX_HPLC_CH3CN) oda sicakligi 10.52 dakika; m/Z 472 [M+H] %955 saflik. pirazolol3,4-c]piridazin (Bilesik 5) mmol) ve trifenil fosfin (2.07 g, 7.9 mmol) solüsyonu, 1 saat boyunca 85°C°ye isitilmistir ve daha sonra oda sicakligi na sogutulmustur ve vakumda konsantre edilmistir. Kalinti 4-klor0-3-iy0d0-1-(2-(4-metilpiperazin-l-il)etil)-5-fenil-lH pirazolo[3,4c] piridazin (761 mg) saglamak üzere kolon kromatografisi (silika jel, NH3 ile baslanarak) ile saflastirilmistir. 02078-P-0002 inetilpiperazin-l-il)etil)-5-fenil-1H pirazolo[3,4c] piridazin kullanilarak sentezlenmistir. Preparatif HPLC, bir diformat tuzu olarak Bilesik 5”i saglamistir.

LCMS (lOcm_Formic_ACE 3 C18 AR_HPLC_CH3CN) oda sicakligi 9.94 dakika; m/z 469 [M+H] %95.98 saflik. Örnek 6: 2-[4-klor0-3-(2-flor0fenil)-5-feni'l-pi'razoloß,4-clpiri'dazi'n-I-iII-I- piroli'din-I-il-etanon (Bilesik 6) Sodyum hidrit (mineral yagi içinde %60, 32 mg, 1.75 mmol), oda sicakliginda kuru DMF ( içinde bir 4-klor0-3-iyodo-5-fenil-1H-pirazolo[3,4- mmol) solüsyonuna eklenmistir. Oda sicakliginda 1.5 saat sonra ilave sodyum hidrit (mineral yagi içinde %60, 27 mg) eklenmistir ve süspansiyon, 2 saat karistirilmistir. %4 LIG] aköz solüsyon ve etil asetat eklenmistir. Katmanlar ayirilmistir ve aköz, etil asetat ile özütlenmistir. Kombine edilmis organikler kurutulmustur (MgSO4), filtrelenmistir ve vakumda konsantre edilmistir. Kalinti, kolon kromatografisi (silika jel, izohekzan/etil asetat 120 ila Ozl) ile saflastirilmistir. Ortaya çikan kati, minimum CHzClz içinde çözünmüstür ve bir kati çökelene kadar dietil eter eklenmistir. Kati, 2-(4-klor0-3-iyodo-5-fenil-1H- filtrasyon yoluyla toplanmistir. 02078-P-0002 Bilesik 6, Örnek 1”e göre ancak Adim 87de 4-flor0feni1b0ronik asit yerine 2- Horofenilboronik asit ve 2-(4-klor0-3-iyodo-S-fenil-pirazolo [3,4-c]piridazin-l-il)- LCMS (15cm_Bicarb_GeminiNX_HPLC_CH3CN) oda sicakligi 10.62 dakika; m/z 436 [M+H] %95.36 saflik. Örnek 7: 4-klor0-3,5-di'feni'I-1H-pirazolol3,4-clpi'ri'dazin için sentez semasi: Acci. NMM, I2, HI03, i CH2C|2 o \ EtOH o \ N Adim 1 ch N ch N H2N H H %CHg Adim 2 H CH3 0 C a) NaN02, cHCl, Pd(PPh3)2Cl2, Cul 40°C ila RT NEt3, DMF `s b) CH2CI2, Naci.

Ph : HZN H Adim 5 02078-P-0002 Adim 1: N-(2-asetil-57f'enil-pirazol-3-il)asetamid CH2C12 ( ve N- metilmorfolin ( solüsyonuna 0°C°de bir nitrojen atmosferi altinda damlatilarak asetil klorid (20 mL, 0.281 mol) eklenmistir. Reaksiyon karisimi, 3 saat boyunca oda sicakliginda karistirilmistir. Reaksiyon karisimi, CH2C12 ve su ile seyreltilmistir. Katinanlar ayrilmistir ve organik katman, su ve tuzlu su ile yikanmistir, kurutulmustur (faz ayirici kartus) ve vakum ile konsantre edilmistir. Dietil eter, kalintiya eklenmistir ve kati, bir kati (25.] g) olarak basliktaki bilesigi saglayacak sekilde filtrasyon ile toplanmistir.

Adim 2: N-(2-asetil-4-iy0d0-5-fenil-pirazol-3-i0asetamid saat 50°C°de isitilmistir ve oda sicakligi na sogutulmustur. Reaksiyon karisimi, vakum ile konsantre edilmistir ve CHzClz ve 2 M NazSzOg aköz solüsyon arasinda bölünmüstür. Katmanlar ayrilmistir ve organik, tuzlu su ile yikanmistir, kurutulmustur (faz ayirici kartus) ve basliktaki bilesik ve baslangiç materyalinin bir karisimini (2.21, 303 g) saglamak üzere vakum ile konsantre edilmistir.

Karisim, bir kati (31.9 g) olarak basliktaki bilesigi saglamak üzere ayni kosullar 02078-P-0002 altinda etanol ( ve iyodin (9.7 g, 0.038 mol) kullanilarak tekrar reaksiyona sokulmustur.

Adim 3: N-[3-fem'l-4-(2-feni'leti'nil)-IH-pi'razol-5-i'IIasetamid Nitrojen, 15 dakika boyunca bir N-(2-asetil-4-iyodo-5-fenil-pirazol-3-il)asetamid bis(trifenilfosfin)paladyum(ll) diklorid (3.0 g, 4.3 mmol) eklenmistir ve reaksiyon karisimi, 3 saat boyunca 90°C°de karistirilmistir. Reaksiyon karisimi, oda sicakligi na sogutulmustur, etil asetat ve su ile seyreltilmistir. Organik faz, su ve tuzlu su ile yikanmistir, kurutulmustur (MgSO4), filtrelenmistir ve vakum ile konsantre edilmistir. Kalinti, bir kati (12.5 g) olarak basliktaki bilesigi saglayacak sekilde kolon kromatograf'isi (silika jel, izohekzan/etil asetat 5:] ila lzl) ile saflastirilmistir.

Adim 4: 3-fenil-4-(2-feniletinil)-1H-pirazol-5-amin Bir N-[3-fenil-4-(2-feniletinil)-lH-pirazol-S-il]asetamid (12.5 g, 42 mmol), etanol ( karisimi karistirilmistir ve 1 saat boyunca 90°C”ye isitilmistir ve oda sicakligi na sogutulmustur. Reaksiyon karisimi, etil asetat ve su ile seyreltilniistir. Organik faz, su ve tuzlu su ile 02078-P-0002 yikanmistir, kurutulmustur (faz ayirici kartus) ve vakum ile konsantre edilmistir. Dietil eter, kalintiya eklenmistir ve kati, filtrasyon ile toplanmistir, dietil eter ile yikanmistir ve bir kati (5.4 g) olarak basliktaki bilesigi saglamak Sodyum nitrit (2.88 g, 42 mmol) parçalar halinde -15°C°de cHCl`ya ( eklenmistir ve 15 dakika boyunca karistirilmistir. Bir kati olarak 3-fenil-4-(2- mL) eklenmistir. Reaksiyon karisimi isitilmistir ve 1 saat boyunca oda sicakliginda karistirilmistir. Reaksiyon karisimi, CH2C12 (44 mL) ile seyreltilmistir ve NaCl (2.7 g) eklenmistir. Reaksiyon karisimi, 1 gün boyunca 50°C”ye isitilmistir. Katmanlar ayrilmistir ve organik katman, su ile yikanmistir, kurutulmustur (faz ayirici kartus) ve vakum ile konsantre edilmistir. Kalinti, bir kati (3.0 g) olarak basliktaki bilesigi saglayacak sekilde kolon kromatografisi safîastirilmistir. 02078-P-0002 AcCi. NMM, i2` Hio3` i HQN ü Adim 1 Hac H H Adim 2 Hac ” H F ç: 3) NaN02. cHCI. -10°C ila RT Pd(PPh3)2CI2, Cul \ \ b) CH2CI2, NaCI.

Ph_:~ N Adimtt H N N im Adim3 HSC H H 2 H Adim 1: N-[3-(3-flor0fenil)-IH-pirazoI-S-ilasetamid H3C H H CH2C12 ( ve N-metilmorfolin ( solüsyonuna 0°Cide bir nitrojen atmosferi altinda damlatilarak asetil klorid (6 mL, 85 mmol) eklenmistir. Reaksiyon karisimi, 1 gün boyunca oda sicakliginda karistirilmistir. Reaksiyon karisimi vakum ile konsantre edilmistir. MeOH (50 mL) ve THF (50 mL) kalintiya eklenmistir akabinde 0°Cide NaOH solüsyonu (aköz 25 M, eklenmistir.

Reaksiyon karisimi, 15 dakika boyunca oda sicakliginda karistirilmistir ve pH ~6 olana kadar HCI solüsyonu eklenmistir. Organik solventler vakum ile buharlastirilmistir. Ortaya çikan aköZ süspansiyondan kati, bir kati (7.6 g) olarak basliktaki bilesigi saglayacak sekilde filtrasyon ile toplanmistir. 02078-P-0002 Adim 2: N-[3-(3-jlor0fenil)-4-iyodo-lH-pi'razol-S-i'ljasetamid saat 60°C`de isitilmistir ve oda sicakligi na sogutulmustur. Reaksiyon karisimi, vakum ile konsantre edilmistir ve CH2C12 ve 2 M NazSzO3 aköz solüsyon arasinda bölünmüstür. Katmanlar ayrilmistir ve organik, tuzlu su ile yikanmistir, kurutulmustur (MgSO4) ve bir kati (10.8 g) olarak basliktaki bilesigi saglamak üzere vakum saglamak üzere vakum ile konsantre edilmistir.

Adim 3: N-[3-(31florqfenil)-4-(2-feni`letinil)-IH-pirazol-S-illasetamid Nitrojen, 15 dakika boyunca bir N-[3-(3-florofenil)-4-iyodo-lH-pirazol-S- mmol) ve bis(trifenilfosfin)paladyum(ll) diklorid (1.5 g, 2.1 mmol) eklenmistir ve reaksiyon karisimi, 6 saat boyunca 90°C”de karistirilmistir. Reaksiyon karisimi, oda sicakligi na sogutulmustur, etil asetat ve su ile seyreltilmistir. Organik faz, su ve tuzlu su ile yikanmistir, kurutulmustur (MgSO4), filtrelenmistir ve vakum ile konsantre edilmistir. Kalinti, bir kati (4 g) olarak basliktaki bilesigi saglayacak sekilde kolon kromatografisi (silika jel, izohekzan/etil asetat 1:0 ila Ozl) ile saflastirilniistir. 02078-P-0002 Adim 4: 3-(37florqfênil)-4-(2-feniletinil)-lH-pirazol-5-ami'n Bir N-[3-(3-florofenil)-4-(2-feniletinil)-1H-pirazol-5-il]asctamid (2 g, 6.2 mmol), etanol (22 mL) ve %25 aköz NaOH solüsyonu (22 mL) karisimi karistirilmistir ve 1 saat boyunca 80°Ciye isitilmistir ve oda sicakligi na sogutulmustur. Reaksiyon karisimi, etil asetat ve su ile seyreltilmistir. Organik faz, su ve tuzlu su ile yikanmistir, kurutulmustur (faz ayirici kartus) ve bir kati (1.2 g) olarak basliktaki bilesigi saglamak üzere vakum ile konsantre edilmistir. eklenmistir ve 15 dakika boyunca karistirilmistir. Bir kati olarak 3-(3-I10rofenil)- 4-(2-feni1etinil)-lH-pirazol-S-amin (1 g, 3.6 mmol) eklenmistir akabinde CH2C12 (10 mL) eklenmistir. Reaksiyon karisimi isitilmistir ve 1.5 saat boyunca oda sicakliginda karistirilmistir. Reaksiyon karisimi, CH2C12 (20 mL) ile seyreltilmistir ve NaCl (0.5 g) eklenmistir. Reaksiyon karisimi, 1 gün boyunca 50°C”ye isitilmistir. Katmanlar ayrilmistir ve organik katman, su ile yikanmistir, kurutulmustur (faz ayirici kartus) ve vakum ile konsantre edilmistir. Kalinti, bir kati (500 mg) olarak basliktaki bilesigi saglayacak sekilde kolon kromatogratisi (silika jel, etil asetat/izohekzan 0:] ila 723) ile satlastirilmistir. 02078-P-0002 (Bilesik 72 periyot boyunca 85 ve 120°C arasinda bir sicaklikta mikrodalga irradyasyonu kullanilarak isitilmistir. Reaksiyon karisimi, vakumda konsantre edilmistir ve kalinti, Bilesik 7°yi saglamak üzere preparatif HPLC ile saflastirilmistir.

LCMS (lOcm_F0rrnic_ACE 3 C18 AR_HPLC_CH3CN) oda sicakligi 13.18 dakika; m/z 393 [M+H] %93.65 saflik.

Qi'razolol3i4-c12iridazin (Bilesik 8! 02078-P-0002 karisimi, 30 ila 90 dakikalik bir periyot boyunca 85 ve 120°C arasinda bir sicaklikta mikrodalga irradyasyonu kullanilarak isitilmistir. Reaksiyon karisimi, vakumda konsantre edilmistir ve kalinti, Bilesik 8°i saglamak üzere preparatif HPLC ile saflastirilmistir.

LCMS ( oda sicakligi 9.93 dakika; m/z 451 [M+H] %99.18 saflik. illetillmorfolin (Bilesik 9) c]piridazin (0.33 mmol), 2-m0rpholin0etanol (0.65 mmol), dietil azodikarboksilat dakikalik bir periyot boyunca 85 ve 120°C arasinda bir sicaklikta mikrodalga irradyasyonu kullanilarak isitilmistir. Reaksiyon karisimi, vakumda konsantre edilmistir ve kalinti, Bilesik 9°u saglamak üzere preparatif HPLC ile saflastirilmistir. 02078-P-0002 LCMS (15cm_Bicarb_GeminiNX_HPLC_CH3CN) oda sicakligi 11.16 dakika; m/z 438 [M+H] %97.23 saflik. lH-pirazol-S-amin kullanilarak sentezlenmistir. pirazolol3,4-c]piridazin (Bilesik 10) mmol) karisimi, 30 ila 90 dakikalik bir periyot boyunca 85 ve 120°C arasinda bir sicaklikta mikrodalga irradyasyonu kullanilarak isitilmistir. Reaksiyon karisimi, 02078-P-0002 vakumda konsantre edilmistir ve kalinti, Bilesik 10”u saglamak üzere preparatif HPLC ile saflastirilmistir.

LCMS (lOcm_ESCI_Bicarb_MeCN) oda sicakligi 4.27 dakika; m/z 469 [M+H] Örnek 14: 4-klor0-5-(3-flor0fenil)-3-fenil-IH-pirazoloß,4-clpiridazin ancak Adim 3°te fenil asetilen yerine 3-flor0fenil asetilen kullanilarak sentezlenmistir.

Qi'roli'din-I-il-etanon (Bilesik 112 02078-P-0002 karisimi, 30 ila 90 dakikalik bir periyot boyunca 85 ve 120°C arasinda bir sicaklikta mikrodalga irradyasyonu kullanilarak isitilmistir. Reaksiyon karisimi, vakumda konsantre edilmistir ve kalinti, Bilesik 11”i saglamak üzere preparatif HPLC ile saflastirilmistir.

LCMS (lOcm_ESCI_Bicarb_MeCN) oda sicakligi 3.69 dakika; m/z 436 [M+H] (Bilesik I 2 2 Izobütil 2-(4-klor0-3,5-di'fenil-pi'razoloß,4-c]piri'dazi'n-1-i'l)asetat için sentez semasi: Ac20` [2, HIO3, I HZN N Adimi 3 H Adim2 3 H (NEtshDMQF s NaNOQ, cHCI. 1 NaOH. EtOH l \ Ü°C ila RT Ph : Adim4 H2N N Adim5 izobütiî kloroformat NaBH4, Eth, THF 02078-P-0002 Adim 1: etil 2-(5-asetami'd0-3-fenil-pi'razol-I-i'l)asetat Piridin (asetat (49 g, 0.17 mol) solüsyonuna bir nitrojen atmosferi altinda 0°C`de damlatilarak asetik anhidrit (17.4 g, 0.17 mol) eklenmistir. Reaksiyon karisimi, 16 saat oda sicakliginda karistirilmistir. Reaksiyon karisimi vakumda konsantre edilmistir.

Kalinti, CHzClz ve su ile seyreltilmistir. Katmanlar ayirilmistir ve organik katman, su ve tuzlu su ile yikanmistir, kurutulmustur (MgSO4) ve vakumda konsantre edilmistir. Kalintiya CH2C12 eklenmistir ve kati, bir kati olarak basliktaki bilesigi (22 g) vererek filtrasyon yoluyla toplanmistir. Ana çözeltiler vakumda konsantre edilmistir ve 15 g,lik ikinci bir yigin saglamak üzere soguk CH2C12 ile yikanmistir.

Adim 2: etil 2-(5-asetamid0-4-iy0d0-3-fenil-pimzol-I -i1)asetat Etanol (asetat (37 g, süspansiyonu 2 saat 50°C°de isitilmistir ve oda sicakligi na sogutulmustur.

Reaksiyon karisimi vakumda konsantre edilmistir ve kalinti, CH2C12/ dieti] eter 02078-P-0002 NazSzOz aköz solüsyon arasinda parçalara ayrilmistir. Katmanlar ayirilmistir ve organik katman kurutulmustur (MgSO4) ve kromatografi (silika jel, saflastirilan bir kalintiyi saglamak üzere vakumda konsantre edilmistir, daha sonra beyazimsi bir kati (43 g) olarak basliktaki bilesigi saglamak üzere dietil eter ile tritüre edilmistir.

Adim 3: etil 2-/5-asetamid0-3-fenil-4-(2feniletinil)pirazol-I-il]asetat Nitrojen, 15 dakika bir etil 2-(5-asetamido-4-iyodo-3-fenil-pirazol-1-il)asetat mmol), trietilamin ( karisimi yoluyla kabarciklandirilmistir.

Bis(trifenilfosfin)paladyum(lI) diklorid (1.6 g, 2.25 mmol) eklenmistir ve reaksiyon karisimi, 4.5 saat nitrojen altinda 90°C”de karistirilmistir. Reaksiyon karisimi oda sicakligi na sogutulmustur, etil asetat ve su ile seyreltilmistir.

Organik faz su ve tuzlu su ile yikanmistir, kumtulmustur (MgSO4), Iiltrelenmistir ve vakumda konsantre edilmistir. Kalinti, kolon kromatografisi (silika jel, CH2C12, daha sonra izohekzan/etil asetat 1:] akabinde CHzClz/etil asetat 921 ila 8:2) ile kismen saIlastirilmistir, daha sonra bir kati olarak basliktaki bilesigi (13 g) saglamak üzere dietil eter ile tritüre edilmistir. 02078-P-0002 Adim 4: sodyum 2-[5-amin0-3-fenil-4-(2-fêniletinil)pirazol-I-il]asetat Bir etil 2-[5-asetamido-3-fenil-4-(2-feniletinil)pirazol-l-il]asetat (13 g, 34 mmol), etanol ( karisimi karistirilmistir ve 8 saat 80°C,ye isitilmistir ve oda sicakligi na sogutulmustur. Sogutma üzerine bir çökelti olusmustur. Çökelti filtrelenmistir ve sogutulmus etil asetat/su (121) karisimi ile yikanmistir. Kati dietil eter ile ayrica tritüre edilmistir, Iiltrelenmistir ve 98 g basliktaki bilesigi saglamak üzere kurutulmustur.

Adim 5: 2-(4-klor0-3,5-di'fenil-IHpimzolo[3,4-c]piridazin-I-il)asetik asit eklenmistir ve 15 dakika karistirilmistir. Sodyum 2-[5-amino-3-fenil-4-(2- feniletinil)pirazol-1-il]asetat (3 g, 8.85 mmol) bir kati olarak parçalar halinde eklenmistir. Süspansiyon daha sonra oda sicakliginda 16 saat karistirilmistir.

Reaksiyon karisimi CH2C12 ile seyreltilmistir ve su ve tuzlu su ile yikanmistir.

Organik katman kurutulmustur (MgSO4) ve vakumda konsantre edilmistir.

Kalinti, bir kati olarak basliktaki bilesigi (1.7 g) saglayarak kolon kromatografîsi (silika jel, dietil eter/ CH2C12 l:9) ile saflastirilmistir. 02078-P-0002 Adim 6: izobütil2-(4-klor0-3,5-di'feni'l-pirazolo[3,4-c]piridazin-I-i'l)asetat (Bilesik 12) Trietilamin ( içinde 2-(4-kloro-3,5- difenil-lHpirazolo[3,4-c]piridazin-1-il)asetik aside (700 mg, 1.92 mmol) eklenmistir, akabinde izobütilkloroformat (342 mg, 2.9 mmol) eklenmistir.

Reaksiyon karisimi 1 saat karistirilmistir. Sodyum borohidrit (220 mg, 5.8 mmol) daha sonra parçalar halinde eklenmistir ve reaksiyon karisimi 3 saat oda sicakliginda karistirilmistir. Reaksiyon karisimi, 0.5 M HC] ile seyreltilmistir ve aköz katman, etil asetat ile iki kez özütlenmistir. Kombine organik fazlar su ve tuzlu su ile yikanmistir, kurutulmustur (faz ayirici) ve vakumda konsantre edilmistir. Kalinti, bir kati olarak Bilesik 129yi (50 mg) saglamak üzere kromatografi (silika jel, etil asetat/i'zohekzan 021 ila 120) ile saIlastirilmistir.

LCMS ( oda sicakligi 4.24 dakika; m/Z 421 [M+H] 02078-P-0002 4-Kloro-3-iy0d0-5-fenil-1-(2-pirolidin-l-iletil)pirazolo[3,4-c]piridazin, basliktaki bilesigi saglamak üzere Örnek 1 ila Adim 63ya göre ancak Adim 7”da 2-k10r0-1- sentezlenmistir.

(Bilesik 132 floropirolidin-1-il]etan0n yerine 4-klor0-3 -iy0d0-5 -fenil-l -(2-pirolidin- l - iletil)pirazolo[3,4-c]piridazin kullanilarak ve 4-flor0fenilb0r0nik asit yerine fenilboronik asit kullanilarak Örnek 1, Adim 87e göre sentezlenmistir.

LCMS (lOcm_F0rmic_ACE 3 C18 AR_HPLC_CH3CN) oda sicakligi 9.98 dakika; ni/z 404 [M+H] %95.91 saflik. 02078-P-0002 Referans örnek Bilesik 14, 4-f10rofenilboronik asit yerine 3-florofenilb0r0nik asit kullanilarak Örnek 1, Adim 8°e göre sentezlenmistir. (1 H, m), 250-200 (2 H, m).

LCMS (15cm_Formi0_ASCENTIS_HPLC_CH3CN) oda sicakligi 10.25 dakika; m/z 454 [M+H] %96.13 saflik. Örnek 20: N48K Clarin-lü'n Ifadesi'ni Restore Eden Bulus Bilesiklerim'n Aktivitesini Gösteren Analiz Yöntemi (24 saatlik inkübasvon) Clarin-l, Usher III Sendromunda mutasyona ugraya gen tarafindan kodlanan proteindir (Adato et al., 2002). Kuzey Amerikaada Clarin-Pdeki en yaygin mutasyon, glikosilasyon kaybina ve kusuruna neden oldugu rapor edilen N48K°dir (Tian et al., 2009). Sonuç olarak N48K proteini, plazma membranina ulasmaz ve proteazom tarafindan degrade edilir. Bu nedenle N48K Clarin-liin hücre yüzeyine trafiginin restore edilmesinin, Usher III Sendromuna yönelik bir müdahale yolu sagladigi düsünülür. 02078-P-0002 N48K Clarin-17in ifadesini restore eden bulusa ait bilesiklerin faydasini göstermek üzere faydali bir hücresel model, HEK293 -Clarin-l N48K-HA D9 hücre hattidir (Tian et al., 2009) Tipik bir deneyde bu hücreler, 37°C, %5 COzide nemlendirilmis bir inkübatörde %10 fetal bovin serumu içeren Dulbeccoinun Modifiye Eagle Ortaminda göz basina 20,000 hücrelik bir hücre yogunlugunda kollajen kapli 96-gözlü plakalara yerlestirilmistir. Bir gecelik inkübasyondan sonra bilesikler, 37°C, %5 C02°de nemlendirilmis bir inkübatörde %10 fetal bovin serumu içeren DMEM ortaminda 24 saatlik bir inkübasyona yönelik eklenmistir. Bir negatif kontrol olarak DMSO, %025 nihai konsantrasyonlarda kullanilmistir. Bilesikler tipik olarak üç tekrar seklinde test edilmistir. Bilesikler ile 24 saatlik inkübasyondan sonra hücreler, %4 forinalinin nihai konsantrasyonunu elde etmek üzere gözlere %10 tamponlu forinalin eklenmesiyle sabitlenmistir. Oda sicakliginda 20 dakikalik bir sabitlemeden sonra gözler, Triton X-100 (0.02 fosfat, içeren fosfat-tamponlu salin (PBS) ile üç kere yikanmistir.

HA-etiketli N48K Clarin-l, Triton X-lOO içeren PBS içinde 1:1000°lik seyreltmede HA etiketine (HA.11 Klon 16B12 Monoklonal antikor, Covance inkübasyondan sonra gözler, Triton X-100 içeren PBS ile üç kere yikanmistir ve ikinci bir antikor (Keçi anti-fare IgG-Cy3 (1.5mg/ml), Jackson IR Europe boyunca gözlere eklenmistir. Gözler akabinde Triton X-100 içeren PBS ile üç kere yikanmistir ve çekirdeklere yönelik nihai bir boyama, 1:10,000'1ik bir seyreltmede DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol) eklenerek gerçeklestirilmistir.

Boyanan hücrelerin görüntülenmesi, N48K Clarin-1`e yönelik Cy3 ve çekirdeklere yönelik DAPI kanalini sesli okuyarak, bir InCell 1000 Yüksek Içerik Görüntüleyici (GE Healthcare) üzerinde gerçeklestirilmistir. Görüntüler, spesifik bir algoritma kullanilarak analiz edilmistir ve ölçülmüstür. Bu algoritma, DAPI sinyalinin ilave nükleer bölünmesine bagli olarak her bir hücreye yönelik HA- Clarin-l boyamasini ölçmüstür (Sekil 1). Bu algoritma, hücre basina yogunlugu 02078-P-0002 ölçrnüstür ve bu nedenle bu, hücre sayisindaki degisiklige yönelik daha az duyarlidir. Göz basina yaklasik olarak 2,000 hücre, hücre ölçümü basina ortalama bir yogunluk elde etmek üzere ölçülmüstür. Örnek 21: N48K CIarin-Iû'n ifadesini Restore Eden Bulasan Bilesiklerinin Aktivitesini Gösteren Bir Analiz Yöntemi (2 saatlik inkübasvon) Clarin-l, Usher lll Sendromunda mutasyona ugraya gen tarafindan kodlanan proteindir (Adato et al., 2002). Kuzey Amerika”da Clarin-lsdeki en yaygin mutasyon, glikosilasyon kaybina ve kusuruna neden oldugu rapor edilen N48K”dir (Tian et al., 2009). Sonuç olarak N48K proteini, plazma membranina ulasmaz ve proteazom tarafindan degrade edilir. Bu nedenle N48K Clarin-17in hücre yüzeyine trafiginin restore edilmesinin, Usher III Sendromuna yönelik bir müdahale yolu sagladigi düsünülür.

N48K Clarin-l°in ifadesini restore eden bulusun bilesiklerinin faydasini göstermek üzere faydali bir hücresel model, HEK293 -Clarin-l N48K-HA D9 nemlendirilmis bir inkübatörde %10 fetal bovin serumu içeren Dulbecco°nun Modifiye Eagle Ortaminda göz basina 20,000 hücrelik bir hücre yogunlugunda kollajen kapli 96-gözlü plakalara yerlestirilinistir. Bir gecelik inkübasyondan sonra bilesikler, 37°C, %5 COzide nemlendirilmis bir inkübatörde %10 fetal bovin serumu içeren DMEM ortaminda 2 saatlik bir inkübasyona yönelik eklenmistir. Bir negatif kontrol olarak DMSO, %025 nihai konsantrasyonlarda kullanilmistir. Bilesikler tipik olarak üç tekrar seklinde test edilmistir. Bilesikler ile 2 saatlik inkübasyondan sonra hücreler, 22 saat boyunca yeni ortamda inkübe edilmistir. Hücreler akabinde %4 formalinin nihai konsantrasyonunu elde etmek üzere gözlere %10 tamponlu formalin eklenmesiyle sabitlenmistir. Oda sicakliginda 20 dakikalik bir sabitlemeden sonra gözler, Triton X-IOO (0.02 fosfat, ile üç kere yikanmistir. 02078-P-0002 HA-etiketli N48K Clarin-l, Triton X-lOO içeren PBS içinde l:lOOO°lik seyreltmede HA etiketine (HA.11 Klon 16B12 Monoklonal antikor, Covance inkübasyondan sonra gözler, Triton X-100 içeren PBS ile üç kere yikanmistir ve ikinci bir antikor (Keçi anti-fare IgG-Cy3 (1.5mg/m1), Jackson IR Europe boyunca gözlere eklenmistir. Gözler akabinde Triton X-lOO içeren PBS ile üç kere yikanmistir ve çekirdeklere yönelik nihai bir boyama, 1:10,000°lik bir seyreltmede DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol) eklenerek gerçeklestirilmistir.

Boyanan hücrelerin görüntülenmesi, N48K Clarin-1`e yönelik Cy3 ve çekirdeklere yönelik DAPI kanalini sesli okuyarak, bir InCell 1000 Yüksek Içerik Görüntüleyici (GE Healthcare) üzerinde gerçeklestirilmistir. Görüntüler, spesifik bir algoritma kullanilarak analiz edilir ve ölçülür. Bu algoritma, DAPI sinyalinin ilave nükleer bölünmesine bagli olarak her bir hücreye yönelik HA-Clarin-l boyamasini ölçmüstür (Sekil 1). Bu algoritma, hücre basina yogunlugu ölçmüstür ve bu nedenle bu, hücre sayisindaki degisiklige yönelik daha az duyarlidir. Göz basina yaklasik olarak 2,000 hücre, hücre ölçümü basina ortalama bir yogunluk elde etmek üzere ölçülmüstür. Örnek 22: B ulusun Örneklevici Bilesikleri için I C 50 Verileri Bulusa ait Bilesikler 5-12 için IC50 degerleri, Örnek 203nin analiz yöntemine göre elde edilmistir. Bilesikler 5-12 için elde edilen IC50 degerleri, 2 mikromolardan daha az veya buna esittir. mikromolardan daha az veya buna esittir. Bilesikler 1-3, 11, 13 ve 14 için elde edilen IC50 degerleri, 6 mikromolardan daha az veya buna esittir. Bilesikler 2, 1 1 ve 13 için elde edilen IC50 degerleri 4 mikromolardan daha az veya buna esittir.

Bilesik 13 için elde edilen IC50 degeri 1 mikromolardan daha az veya buna esittir. 02078-P-0002 Örnek 20 yöntemine göre analiz edilen Bilesik 11 için elde edilen IC50 degeri, 2 mikromolardan daha az veya buna esittir. Örnek 2] yöntemine göre analiz edilen Bilesik 1 1 için elde edilen ICso degeri, 3 mikromolardan daha az veya buna esittir.

Bu basvuruda açiklanan her bir referans, buraya bütün yönleriyle referans yoluyla eklenir. 02078-P-0002 DAPI (çekirdekler) N48K-Clarin1 ayri hücrelere bölünme hücre basina yogunluk Yüksek içerik analizi. DAPI-boyali çekirdekler, ayri hücrelerde göiüntünün bölünmesini gerçeklestinnek üzere kullanilir. N48K Clarin-l kanalinda (CyS) gözlemlenen yogunluk akabinde hücre basina hesaplanii' ve bir alan üzerinde ortalamasi alinir.

Claims (1)

ISTEMLER

1. Asagidaki yapiya sahip bir bilesiktir: veya farmasötik olarak kabul edilebilir bir tuzudur. . istem Ve göre bir bilesigin etkili bir miktarini veya farmasötik olarak bunun kabul edilebilir bir tuzunu ve farmasötik olarak kabul edilebilir bir tasiyici veya araç içeren bir bilesimdir. . lstem l°e göre bir bilesiktir, bunun farmasötik olarak kabul edilebilir bir tuzu veya istem 2”ye göre bir bilesimdir, istem 1`e göre bir bilesigin veya farmasötik olarak bunun kabul edilebilir bir tuzunun etkili bir miktarini buna ihtiyaci olan bir özneye uygulanmasini içeren, bir retinal dejeneratif hastaligin tedavi edilmesine yönelik bir yöntemde kullanima yöneliktir. . istem lie göre bilesiktir, farmasötik olarak bunun kabul edilebilir bir tuzu veya istem 3*e göre kullanima yönelik istem 2”ye göre bir bilesimdir, burada retinal dejeneratif hastalik retinitis pigmentoza, Leber konjenital Amorozisi, bir sendromik retinal dejenerasyon, yasa bagimli maküler dejenerasyon veya Usher sendromudur. . Istem 1°e göre bilesiktir, farmasötik olarak bunun kabul edilebilir bir tuzu veya istem 4°e göre kullanima yönelik istem 2°ye göre bir bilesimdir, burada retinal dej eneratif hastalik Usher sendromudur. lstem 1”e göre bilesiktir, farmasötik olarak bunun kabul edilebilir bir tuzu veya istem 5”e göre kullanima yönelik istem ?ye göre bir bilesimdir, burada Usher sendromu Usher I sendromu, Usher II sendromu veya Usher Istem lie göre bilesiktir, farmasötik olarak bunun kabul edilebilir bir tuzu veya istem 6,ye göre kullanima yönelik istein 2°ye göre bir bilesimdir, burada Usher sendromu Usher [ll sendromudur. Istem 1°e göre bir bilesiktir, farmasötik olarak bunun kabul edilebilir bir tuzu veya istem 2°ye göre bir bilesimdir, istem 1”e göre bir bilesigin veya farmasötik olarak kabul edilebilir bir tuzunun etkili bir miktarinin buna ihtiyaci olan bir özneye uygulanmasini içeren, Usher sendromu ile iliskili isitme kaybinin tedavi edilmesine yönelik bir yöntemde kullanima yöneliktir. Istem 1°e göre bilesiktir, farmasötik olarak bunun kabul edilebilir bir tuzu veya istem 89e göre kullanima yönelik istem 2°ye göre bir bilesimdir, burada Usher sendromu Usher I sendromu, Usher II sendromu veya Usher Istem 1”e göre bilesiktir, farmasötik olarak bunun kabul edilebilir bir tuzu veya istem 9,21 göre kullanima yönelik istem 2”ye göre bir bilesimdir, burada Usher sendromu Usher [ll sendromudur.