TR201815652T4 - Hücrelerde artırılmış çoğaltımla yüksek verilmli sarı humma virüsü suşu. - Google Patents
Hücrelerde artırılmış çoğaltımla yüksek verilmli sarı humma virüsü suşu. Download PDFInfo
- Publication number
- TR201815652T4 TR201815652T4 TR2018/15652T TR201815652T TR201815652T4 TR 201815652 T4 TR201815652 T4 TR 201815652T4 TR 2018/15652 T TR2018/15652 T TR 2018/15652T TR 201815652 T TR201815652 T TR 201815652T TR 201815652 T4 TR201815652 T4 TR 201815652T4
- Authority
- TR
- Turkey
- Prior art keywords
- virus
- mutation
- nucleic acid
- amino acid
- protein
- Prior art date
Links
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 title claims 2
- 241000710772 Yellow fever virus Species 0.000 title abstract 3
- 229940051021 yellow-fever virus Drugs 0.000 title abstract 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 191
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 53
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 46
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 39
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 29
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 19
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 16
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 15
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 14
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 claims description 11
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 claims description 11
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 11
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 11
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 8
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 101710188653 Non-structural protein 4b Proteins 0.000 claims description 6
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 5
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 5
- 101710189818 Non-structural protein 2a Proteins 0.000 claims description 5
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 4
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 3
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 102100021696 Syncytin-1 Human genes 0.000 claims 5
- 101710128560 Initiator protein NS1 Proteins 0.000 claims 4
- 101710144127 Non-structural protein 1 Proteins 0.000 claims 4
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims 1
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 20
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 abstract description 9
- 208000003152 Yellow Fever Diseases 0.000 abstract description 8
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 abstract description 4
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 abstract description 3
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 abstract 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 abstract 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 59
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 33
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 32
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 29
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 29
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 23
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 20
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 17
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 17
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 16
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 15
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 15
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 13
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 11
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 9
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 9
- 229940124928 YF-Vax Drugs 0.000 description 8
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 8
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 8
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N beta-propiolactone Chemical compound O=C1CCO1 VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 7
- 229960000380 propiolactone Drugs 0.000 description 7
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 6
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 6
- 230000036541 health Effects 0.000 description 6
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 6
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 6
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 5
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 5
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Substances N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 4
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 230000002276 neurotropic effect Effects 0.000 description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 3
- 101710204837 Envelope small membrane protein Proteins 0.000 description 3
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 3
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 3
- YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N Ketamine Chemical compound C=1C=CC=C(Cl)C=1C1(NC)CCCCC1=O YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 3
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 3
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 3
- 229960003299 ketamine Drugs 0.000 description 3
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N xylazine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960001600 xylazine Drugs 0.000 description 3
- VQKFNUFAXTZWDK-UHFFFAOYSA-N 2-Methylfuran Chemical compound CC1=CC=CO1 VQKFNUFAXTZWDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZOOGRGPOEVQQDX-UUOKFMHZSA-N 3',5'-cyclic GMP Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=C(NC2=O)N)=C2N=C1 ZOOGRGPOEVQQDX-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 2
- 125000003974 3-carbamimidamidopropyl group Chemical group C(N)(=N)NCCC* 0.000 description 2
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 2
- 241000282552 Chlorocebus aethiops Species 0.000 description 2
- 101150013191 E gene Proteins 0.000 description 2
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 2
- 241000726306 Irus Species 0.000 description 2
- 101710145006 Lysis protein Proteins 0.000 description 2
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 2
- 101800001019 Non-structural protein 4B Proteins 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 2
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 2
- -1 amino acid sequence amino acid Chemical class 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 206010003119 arrhythmia Diseases 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000013211 curve analysis Methods 0.000 description 2
- 208000001780 epistaxis Diseases 0.000 description 2
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 239000013630 prepared media Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 230000002992 thymic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 125000004042 4-aminobutyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])N([H])[H] 0.000 description 1
- BSFODEXXVBBYOC-UHFFFAOYSA-N 8-[4-(dimethylamino)butan-2-ylamino]quinolin-6-ol Chemical compound C1=CN=C2C(NC(CCN(C)C)C)=CC(O)=CC2=C1 BSFODEXXVBBYOC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000010444 Acidosis Diseases 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 241000272525 Anas platyrhynchos Species 0.000 description 1
- NOWKCMXCCJGMRR-UHFFFAOYSA-N Aziridine Chemical compound C1CN1 NOWKCMXCCJGMRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 101150111062 C gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- 206010010071 Coma Diseases 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 208000034656 Contusions Diseases 0.000 description 1
- 206010010904 Convulsion Diseases 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000001490 Dengue Diseases 0.000 description 1
- 206010012310 Dengue fever Diseases 0.000 description 1
- 101100366918 Dictyostelium discoideum StlB gene Proteins 0.000 description 1
- 208000004739 Egg Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 206010014596 Encephalitis Japanese B Diseases 0.000 description 1
- 206010016946 Food allergy Diseases 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 206010018276 Gingival bleeding Diseases 0.000 description 1
- 208000034507 Haematemesis Diseases 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 208000001953 Hypotension Diseases 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 201000005807 Japanese encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 241000710842 Japanese encephalitis virus Species 0.000 description 1
- 206010027417 Metabolic acidosis Diseases 0.000 description 1
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 description 1
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 description 1
- 206010028813 Nausea Diseases 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 208000031816 Pathologic Dilatation Diseases 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 101710088839 Replication initiation protein Proteins 0.000 description 1
- 108010034546 Serratia marcescens nuclease Proteins 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000710771 Tick-borne encephalitis virus Species 0.000 description 1
- 206010044565 Tremor Diseases 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 1
- 241000710886 West Nile virus Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000006793 arrhythmia Effects 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- OXJUJQDEISSCTB-UHFFFAOYSA-N but-3-en-2-imine Chemical compound CC(=N)C=C OXJUJQDEISSCTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 1
- 238000012754 cardiac puncture Methods 0.000 description 1
- 238000013354 cell banking Methods 0.000 description 1
- 239000012930 cell culture fluid Substances 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 239000012297 crystallization seed Substances 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 208000025729 dengue disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011118 depth filtration Methods 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 201000010860 egg allergy Diseases 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 208000031169 hemorrhagic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002008 hemorrhagic effect Effects 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 208000021760 high fever Diseases 0.000 description 1
- 230000036543 hypotension Effects 0.000 description 1
- 235000015243 ice cream Nutrition 0.000 description 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008676 import Effects 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000000077 insect repellent Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000034217 membrane fusion Effects 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 210000004688 microtubule Anatomy 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 230000002107 myocardial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008693 nausea Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 231100001223 noncarcinogenic Toxicity 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 230000036407 pain Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 230000007505 plaque formation Effects 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 201000001474 proteinuria Diseases 0.000 description 1
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000001846 repelling effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000006748 scratching Methods 0.000 description 1
- 230000002393 scratching effect Effects 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 235000020046 sherry Nutrition 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000004460 silage Substances 0.000 description 1
- 239000010802 sludge Substances 0.000 description 1
- 239000004299 sodium benzoate Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000013060 ultrafiltration and diafiltration Methods 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 241001308709 unidentified virus Species 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 230000007444 viral RNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 230000005727 virus proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 238000004383 yellowing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
- C12N2770/24121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
- C12N2770/24122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
- C12N2770/24134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
- C12N2770/24161—Methods of inactivation or attenuation
- C12N2770/24164—Methods of inactivation or attenuation by serial passage
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Buluş, kritik, nötrleştirici epitopların korunmasını temin eden bir yöntem kullanılarak pasifleştirilen kimyasal bütün viriyon, kimyasal olarak pasifleştirilmiş Sarı Humma virüsü içeren pasif, yinelemeyen bir aşı sağlamaktadır. Sarı Humma virüsü, adapte edilmemiş virüsten daha yüksek verimlere hücrelerde çoğalması için adapte edilmiştir. Buluş aynı zamanda Sarı Humma viral enfeksiyonunu önlemeye yönelik yöntemler sunmaktadır.
Description
TARIFNAME
HÜCRELERDE ARTIRILMIS ÇOGALTIMLA YÜKSEK VERILMLI SARI HUMMA
VIRÜSÜ susu
ÖNCEKI TEKNIK
SarElilumma virüsü, sürekli salgIEb dönüstügü Afrika ve Amerika'nlEl bazEliropikal bölgelerinde
düsük seviyelerde enfeksiyonla devamllîcllarak mevcut olan endemiktir. Güney Amerika'nE km:
bölgelerini, Karayip adalarIlSle Orta ve Kuzey Amerika'ylîçeren, dünyanI diger yerleri, virüsü
taslýbbilen sivrisinek vektörüyle istila edilmistir ve bu yüzden sariEUmma saIgIarEiçin risk
aItIa oldugu düsünülmektedir (Dünya Saglilgörgütü Bilgi Formu NumarasiîlÜO, düzenlenme
AraliEl 2001).
Örnegin yalnîta Afrika'da, 508 milyonluk birlestirilmis nüfusa sahip otuz üç Ülke risk altlEUadE
vakasII oldugunu tahmin etmektedir (Id). Bu tropikal bölgelere seyahat edilmesinin ayniZl
zamanda, genellikle sarEliiummanI olmad[g]Eüilkelerde az saylîlh önemli vakayla sonuçlandigilîi
düsünülmektedir. Asya'da sarühumma vakalarII rapor edilmemesine ragmen, "uygun
primatlar ve sivrisinekler bulundugu için bu bölge risk altlElzladlEl (fal).
SarEI-Iumma (YF) virüsü, Flavivirid ailesinde, Hay/'Virus türündedir. "Orman" veya "silvan
döngüsü" denilende, YF virüsü, yagmur ormanlarlütla sivrisineklerin maymunlara kanopi
üremesiyle saglanan ve tas-n enzootiktir. "Kentsel döngü", insanlar, yagmur ormanlar-
girerek ve YF-enfekte sivrisinekler tarafldan Eiîilârak enfekte oldugunda baslamaktadE
taslEl'nayla devam etmektedir ve köylerde ve sehirlerde sarEI humma saIgIarisîla
sonuçlanabilmektedir. HastaliEi kendini sIlEiayan bir febril hastaliiîtan siddetli hepatit ve
ölümcül hemorajik hastaligb siddet bakIi Ian degisim gösterebilmektedir.
Hem yerlileri hem de YF salgI bölgelerine seyahat edenleri içeren, asliânmamlglinsanlar, is
veya diger etkinliklerden dolayl3ilvan döngüsünde veya kentsel döngüde sivrisineklerle temas
haline geçtiginde önemli YF enfeksiyon riski altIda olmaktadE
SarEihummalEliiastalar viremik olabilmektedir, yani hastal[g]I erken fazlîstüresince 3 ila 6 gün
boyunca kanlarIia virüs olmaktadlEI Bu fazÇI kisa süreli bir semptom gerilemesi takip
edebilmektedir.
Toksik faz, örnegin, yüksek ates ve bulantüigeren klinik semptomlar, hematemez (kan kusma),
epistaksis (burun kanamasm dis eti kanamasEie petesiyal ve purpurik hemorajlarlîamorarma)
içeren hemorajik semptomlarla, ates döndükçe gelismektedir. Derinlesen sarHJElve proteinüri
siEliEla siddetli vakalarda meydana gelmektedir.
HastaligiIgeç asamalarIa, hastalar; hipotansiyon, sok, metabolik asidoz, akut tubuler ektazi,
miyokardiyal islev bozuklugu ve kardiyak aritmi gelistirebilmektedir. Ayn Eamanda kofüzyon,
nöbetler ve koma, bunun yanlis& ikincil bakteriyel enfeksiyonlar ve böbrek yetmezligi gibi
komplikasyonlar olusabilmektedir.
SarEhummaya yönelik belirli bir tedavi bulunmamaktadlB SarEhummanI önlenmesi için
adIiIar, böceksavarül, koruyucu giysinin kullanilhîasIÜ/e ticari olarak temin edilebilen fakat
riskli olan atenüe aslsîla aslEnmayEiçermektedir.
17D alt sustan üretilen canlßtenüe asilâr ticari olarak temin edilebilmektedir, fakat atenüe asEl
ile iliskilendirilen yan etkiler, canIEl7D virüsle siddetli enfeksiyona ve siddetli ve ölümcül advers
nörotropik ve viserotropik olaylara yol açabilmektedir, viserotropik olay yaban tip YF virüsünün
yol açt[g]ßiddetli enfeksiyonuna benzemektedir. Bu yüzden, nörütropik ve viserotropik advers
olaylara yönelik potansiyeli ortadan kald EIElken bir nötrlestirici antikor yan- yol açacak olan
daha güvenli, pasiflestirilmis, yinelemeyen asiyla ihtiyaç duyulmaktadIB
Bu yüzden, mevcut olan ticari olarak temin edilebilir atenüe YF 17D asEIîLIa iliskilendirilmis
nörptropik ve viserotropik advers olaylara yönelik potansiyelden kaçlElllB1asEliçin etkili,
pasiflestirilmis, "öldürülmüs" veya tekrarlamayan aslýh hala ihtiyaç vardE AyrlEt-i, hayvandan
elde edilen proteinleri olmadan Vero hücrelerinde üretilen gelistirilmis bir aslýb, canIIsII
kontrandike oldugu veya etikette uyarilâr göründügü kisiler için güvenilir olarak kullan iiâbilen
bir aslîla ihtiyaç duyulmaktadlEI Bu tür bireyler; immünsüprese kisileri, timik hastallgiüa sahip
kisileri, yumurtaya alerjisi olanlarüküçük çocuklarEl'e yaslllârüiçermektedir.
Herhangi bir potansiyel pasiflestirilmis virüsle ilgili bir sorun, mevcut canllltenüe asüârdan
daha yüksek titrede verilmesinin gerekli olabilmesidir çünkü canlüatenüe asliâr, konakç-
replikasyonun döngüleri sßisütla antijenik kütleyi genisletebilirken bir pasiflestirilmis asÇI
antijenin sabit bir dozunu içermektedir. Bu yüzden, yeterince kuwetli pasiflestirilmis bir asIlEl
gelistirilmesi için, bir hücre kültürünün iyilestirilmis ortamda (aynllamanda süpernatant
akSkan olarak adlandlEEnaktadlE) virüsün bir yüksek veriminin üretilmesi için YF virüsünün
modifiye edilmesi arzu edilmektedir. AsEüretimine yönelik olarak atenüe 17D asII kullan UEnasEl
oldukça arzu edilmektedir çünkü 17D sus, yaban tip YF virüsünden biyolojik önlemenin daha
düsük bir seviyesinde manipüle edilebilmektedir. Bununla birlikte, hücre kültüründeki atenüe
17D aslîisus verimleri, dogaslîgeregi yaban tip virüsünün verimlerinden daha düsüktür. Bu
sebeplerden ötürü, asEüretimine yönelik olarak hücre kültüründe daha yüksek verimlere
ulasüöîasülçin 17D asßusunun modifikasyonlarüiaydalEblabilmektedir.
Galler, R. ve ark. (1997), zarf protein, NSl ve/veya N53 proteininde amino asit mutasyonlarlsîla
modifiye edilmis YF 17D suslarülgçüîlamaktadlîlve asljblarak gelisime baglljblarak bunlarI
faydaliEfgJIEtiartlgnaktadE
BULUSUN KISA AÇIKLAMASI
SarEEiumma virüsü, Flavivirid ailesinde, F/aw'vi'rustüründe prototip türlerdir. Flavivirus türünün
hlZIElbüyüyen, virülent bir üyesi olan, keneyle tas-n ensefaliti /TBE) virüsünün E proteinin
yaplîial ve islevsel çalEinalarüTBE'nin E proteininde Domenler I ve II'nin, konakçül/e sonraki
infektiviteyle flavivirus zar füzyonunu kolaylastlgin bir asidik pH-bagIiIEüç boyutlu yapEl
degisikligine kat [g]l:l1›elirtmektedir. Domenler I ve II'nin bileskesi, asit pH'Ida E proteininin
normal dimerik yaplgElEl bir homotrimerik duruma bu domenlerin basllEh yeniden
düzenlenmesiyle sonuçlanan bir 'moleküler mentese“ olarak islev görmektedir. Rey FA ve ark.
The envelope glycoprotein from tick-borne encephalitis virus at 2 Ã resolution. Nature 375:
encephalitis virus glycoprotein E by the heterodimeric association with protein prM. Virology
E at the molecular level, using tick-borne encephalitis virus as a model. Journal of Virology
SarEöumma virüsünün E proteinindeki Lys 160, Domenler I ve II arasIdaki moleküler mentese
bölgesinde bulunmaktadlB Bu bölgedeki mutasyonlar, füzyon ve hücre sitoplazmas- virüs içe
alIiEiçin gerekli olan E proteininin bölge Domen I'deki asit-bagIiIEüç boyutlu yaplîclegisikligini
degistirebilmektedir. Teoriye bagllealmadan, adapte edilmis SarEl-lumma virüs susunun E
proteininin Domen I'indeki amino asit 160'ta lisinden arjinine degisimle görülen daha yüksek
verimler, konakçlsîla artlElInlglzar füzyonu ve daha etkin infektivite ile sonuçlanan, Iisine klýlasla
arjininin protonlara yönelik olarak saglad [gllErtmEh Eafiniteden dolaylîllabilmektedir. Bulus göz
önünde bulunduruldugunda, lisin ve arjinin yan zincirlerinin; lisinden oldugundan arjininde
protonlara yönelik olarak yüz kat daha büyük afinite belirten, süsü-da, 10.53 ve 12.48'lik pKa
degerlerine sahip oldugu belirtilmelidir. Arjininin yan zincirinin, lisinin yan zincirine gösterdigi
protonlara yönelik artlElllBilstl afinite, adapte edilmis virüs susunda virüsün daha yüksek
verimleriyle sonuçlanan, moleküler mentese, zar infüzyonu ve flavivirus infektivitede E proteini
üç boyutlu yapÜlegisikliginin h-Ele etkililigini artßbilmektedir.
F/avi'i/irus türündeki diger üyeler, BatENil, dang ve Japon Ensefalitini içermektedir. BatENil
Virüsünde bulunan yapgl olmayan proteinler, viral RNA sentezine dogrudan veya dolaylEl
olarak dâhil edildigi bilinmektedir. Bu virüslerin yaplgl olmayan proteinlerindeki amino asit
ikamelerinin, Vero hücrelerinde yetisen mutant virüslerinin verimlerini etkiledigi gösterilmistir.
Örnegin, flavivirus Kunjinin, bir Batlllil Virüs alt türü, NSl proteininde amino asitte 250 bir
prolinden Iösine ikame, yaban tip virüsten 100-kat daha düsük titrelerde büyümektedir. Benzer
sekilde, sarEhumma virüsünün NSZA proteininde C-uç bölgelerinin mutasyonunun, virüs
replikasyonu için ölümcül oldugu gösterilmistir. Brinton MA. The molecular biology of west nile
virus: a new invader of the western hemisphere. Annual Review of Microbiology 56: 371-402
(2002).
Bir birinci yönde, bulus, SarEElumma virüsünün modifiye edilmis yaplglal olmayan proteini 4B'yi
kodlayan bir sekansElçeren bir nükleik asit saglamaktadlîl burada söz konusu nükleik asit
molekülü, AUA'dan AUG'a bir degisimle sonuçlanan, SEKANS KIMLIK NUMARASI: 14'ün
yapisal olmayan proteini 4B'nin konumunda (113) amino aside karsUJKl gelen kodonda bir
nükleotid mutasyonunu içermektedir.
Bir ikinci yönde, bulus, SarEl-Iumma virüsünün, bir zarf proteini, bir N51 yapisal olmayan
proteini, bir NSZA yaplgl olmayan proteinini içeren SEKANS KIMLIK NUMARASI 11'in nükleik
asit molekülü saglamaktadlE burada söz konusu proteinler, zarf proteininin konumunda (160),
NS 1 proteinin konumunda ( bir amino asit mutasyonu
içermektedir.
SEKILLERIN KISA AÇIKLAMASI
Sekil 1, açIEIanan sarElIiumma as-I üretimi sßsia Vero hücrelerinin geçis geçmisinin
bir sematik gösterimidir.
Sekil 2, virüs tohumlar.. preparasyonunun bir sematik gösterimidir.
Sekil 3A, bir pasiflestirilmis SarEI-Iumma virüs adayII preparasyonuna yönelik Vero
hücrelerinde artlEIÜiE büyümeyle bir tohum virüsünün gelistirilmesi için viral genom
virüsünün nükleotid sekansllîrnodifiye etmesi için 10 seri geçise (P10'dan PI) yönelik
olarak kullanllân prosesin bir sematigidir.
Sekil BB, P11 virüsünün, E160'da tek bir mutasyonla P1'den farkIIIâstIgIÇI baslangEI
deneyinin geçis bir (P1) ve geçis 11'e (P11) yönelik virüs replikasyonunun bir grafik
gösterimidir (Iysaarg)
Sekil 3C, bir dizi deneyde: Seri B ve C, gerçeklestirilen geçis bir (Bpl, Cpl) ve geçis 11
(B-p11, C-p11) virüsünün bir tekrar geçis çallgnasII bir grafik gösterimidir.
Sekil 4A-L, P1 ve P11 nükleik asit sekanslarII konsensus hizalanmasEElIasvir etmektedir.
Baslatma nükleik asit sekanslîl(P1), burada SEKANS KIMLIK NUMARASI: 1 olarak
tannlanmaktadE P1 geçisi ve Pil geçisinin bir karsIIâstlEInasÇl SEKANS KIMLIK
NUMARASI: 1'in nükleotid kallEt-da (#211) bir genetik mutasyonu ve SEKANS KIMLIK
NUMARASI: 1'in nükleotid kallEt-a (#1452) bir ikinci mutasyonu ortaya çlElarmlgtlEl Bu
yüzden, "P1 konsensus", SEKANS KIMLIK NUMARASI. 1'e karsIIIIZl gelmektedir; "P11
konsensus" zarf protein amino asit konumunda (160) kodon mutasyonuna sahip olan
SEKANS KIMLIK NUMARASI.2'ye karsIIJKlgelmektedir.
Sekil 5A-J, tekrarlügeçis çallgh'iasldan Seriler B-Pl ve Seriler B3-P11 amino asit
sekanslarlüla sahip, P1 ve P11'in amino asit sekansIlZlIasvir etmektedir. P1'e yönelik amino
asit sekanslZlburada SEKANS KIMLIK NUMARASI: 3 olarak tanIiIanmaktadEl P1'e yönelik
amino asit sekanlelEle P11'inkinin (SEKANS KIMLIK NUMARASI.4) bir karsllastiîiinasmzarf
proteininin (E160) (Sekil SB'deki P1 amino asidinin amino asidi (445)) amino asit
kallEt-a (160) bir mutasyonu ortaya koymaktadlB Seri B-Pl ve Seri B3-P11, tekrarIEl
geçis çallgfnasian kElni amino asit sekanslarlmöstermektedir. B-Pl'e yönelik amino asit
sekanslÇburada SEKANS KIMLIK NUMARASI: 5 olarak tanIilanmaktadIE B-P1'in amino asit
sekanlellEl ve B3-P11'inkinin (SEKANS KIMLIK NUMARASI.6) bir karsüâstlîilnasEBB-Pll'de
(PI amino asit sekans amino asidi (445)) zarf proteininin (E160) amino asit kallEtlîlEtla
(160) bir mutasyon ortaya çIIZlarmIStlE
Sekil 6, pasiflestirilmis SarEl-lumma as-I aktivitesinin bir preliminer fare deneyinde
(M-9003-002) BALB/c'nin deney grubu ve CD-l sus fareleri arasIia karsüâstlîilnalEWoSO
plak azaltIilIrliötrlestirme testi (PRNTSO) titrelerini tasvir etmektedir.
grafik gösterimidir.
Sekil 8A-EE, P1, B-Pl, C-P1, B3-P11 ve C1-P11 nükleik asit sekanslarII konsensus
hizalanmalelütasvir etmektedir. Nükleik asit sekanslZl(P1), burada SEKANS KIMLIK
NUMARASI: 15 olarak tanIilanmaktadEl Nükleik asit sekansüB-Pl), burada SEKANS
KIMLIK NUMARASI: 9 olarak tanIilanmaktadE Nükleik asit sekansE(B3-P11), burada
SEKANS KIMLIK NUMARASI: 11 olarak tanIilanmaktadE Nükleik asit sekansüC-Pl),
burada SEKANS KIMLIK NUMARASI: 10 olarak tanIilanmaktadlIl Nükleik asit sekanslIl
(C-P11), burada SEKANS KIMLIK NUMARASI: 12 olarak tanIilanmaktadlB B-P1 geçisi ve
BB-Pll geçisinin bir karsllâstülnasl: SEKANS KIMLIK NUMARASI: 15'in nükleotid
kallEt-a (#1452) BB-Pll'de bir genetik mutasyonunu, SEKANS KIMLIK NUMARASI:
'in nükleotid kallEt-a (#3402) B3-P11'de bir ikinci mutasyonu, ve SEKANS KIMLIK
NUMARASI: 15*in nükleotid kallEt-da (#4016) B3-P11'de bir üçüncü mutasyonu ortaya
koymustur. C-Pl geçisi ve C1-P11 geçisinin bir karsllâstülnasüSEKANS KIMLIK NUMARASI:
'IN nükleotid kallEt-a (#7225) C1-P11'de bir genetik mutasyon ortaya koymustur.
SEKANS KIMLIK NUMARASI: 11, BB-Pll'e karslUE gelmektedir ve zarf protein amino asit
konumu (160), yaplglal olmayan protein (1) amino asit konumunda (317) ve yaplgal
olmayan protein 2A amino asit konumunda (170) kodon mutasyonlarüa sahiptir. SEKANS
KIMLIK NUMARASI.12, C1-P11'e karslmögelmektedir ve yaplîlal olmayan protein 4B amino
asit konumunda (113) kodori mutasyonuna sahiptir.
Sekil 9A-F, tekrarlEgeçis çalglnasldan B3-P11 ve B-P1'in amino asit sekansIEtasvir
etmektedir. B-Pl'e yönelik amino asit sekansüburada SEKANS KIMLIK NUMARASI: 13
olarak taniiianmaktadiîi B-Pl'in amino asit sekansEl/e B3-P11'inkinin (SEKANS KIMLIK
NUMARASI: 7) karsliâstlünasüzarf proteininin (E160) (Sekil 9A'da amino asit (445)) amino
asit kaIlEt-da (160) bir mutasyonu, yapElal olmayan proteinin (1) (NSl-317) (Sekil 9B'de
amin asit bir mutasyonu ve yapgl olmayan proteinin
ortaya koymaktadlîl Seriler B-Pl ve Seriler BB-Pll, tekrarlgeçis çalgnasüljan tam amino
asit sekanslarlüliöstermektedir.
Sekil 10A-F, tekrarlEgeçis çallgtnasHan C-P1 ve C1-P11'in amino asit sekanlelEtasvir
etmektedir. C-Pl'e yönelik amino asit sekansüburada SEKANS KIMLIK NUMARASI: 14
olarak tanIilanmaktadlEl C-P1'e yönelik amino asit sekansIü/e C1-P11'inkinin (SEKANS
KIMLIK NUMARASI.8) bir karsüâstünasüyaplîlal olmayan proteinin (4B) (NS4B-113) (Sekil
tekrarllgeçis çallSlnaleldan tam amino asit sekanslarIlîgiöstermekteclir.
TERCIH EDILEN YAPILANDIRMALARIN AYRINTILI AÇIKLAMASI
Bulusun tercih edilen yapDândlElnalarEEl bir açlElamasEiasag-ki sekildedir. Bulusun özel
yapüândlülnalarlillil örnek yoluyla gösterildigi anlasliâcaktlEI Baslanglgta, bulus, asag-ki
açlKIamayla daha ayrlEtiIJIblmak üzere, ekli istemlerle belirlenmektedir. Burada açiElanan
bilesimlerin ve yöntemlerin özellikleri ve diger ayrlîitilârüsaglöla özetlenmektedir.
Yaklasn ve Avantailara Genel Baklîl
Burada açiIZIanan, pasiflestirilmis SarEIi-Iumma virüs adayII üretilmesinin bir yöntemidir, bu
yöntem, koruyucu bir immün yanilîliiindüklemesi ve/veya viral genomun nükleotid sekanlellZi
modifiye etmesi için yeterli antijenik kütle verimi vermesi için titreyi artlîilnasEiçin sertifikallZl
Afrika yesil maymun böbrek hücrelerinde (VERO) YF 17D virüsünün (yani, bir "adapte
edilmemis virüs") seri geçisini içermektedir. Bu yöntem, tekrar edilmektedir ve uyarllîrbldugu
gösterilmistir.
Virüs, derinlik filtrasyonu, ultrafiltrasyon, diafiltrasyon ve kromatografik ayrlsmayla konakçEl
dokümanIa açllîlanmaktadlîl Saflastülfnlgl virüs, kritik, nötrlestirme epitoplarII
korunmasIlZiiemin eden bir yöntem kullan [lârak pasiflestirilmektedir. Örnegin, virüs; formalin,
ELIlUV, gama Iglînlasüveya beta-propiolakton kullanilarak pasiflestirilmistir. SafiastEllBilgl
pasiflestirilmis virüs, alüminyum hidroksit adjuvana emilecek ve yaklasilîl 2 Celsius derecesi
(2°C) ila yaklasilîl 8 Celsius derecelik (8°C) sElakIHZta bir slîlîblarak saklanacak sekilde, bir
adjuvanla formüle edilmektedir.
SaflastlEllBilgl pasiflestirilmis virüs içeren bir asIlEl, açiElanan pasiflestirilmis YF virüs asEIl
yinelemeyen oldugu için, günümüzde ticari olarak elde edilebilen atenüe, canlEiYF virüs
as-dan daha güvenli oldugu düsünülmektedir. Iyilestirilmis aslÇI hayvandan elde edilen
proteinler olmadan Vero hücrelerinde modern yöntemlerle üretilebilmektedir ve bu yüzden
canlElasII (tavuk yumurtasIa üretilen) kontrandike oldugu veya etikette uyarIIârlEl
göründügü kisilerde güvenli bir sekilde kullanilâbilmektedir. Bu tür uyarilâr; örnegin
immünsüprese kisilere, timik hastallgil sahip kisilere, yumurtaya alerjisi olanlara, çocuklar <9
aylllîlve yaslilâra uyarilârEiÇermektedir.
Vero Hücrelerde Kuwetli Üretime Yönelik SarEli-lumma Virüsünün Adaotasvonu
Virüs gelisim fazIa kullanllân Vero hücreleri, Dünya SaglllZlÖrgütü (WHO) tohum lotundan,
Geçis 129'da ATCC Vero hücre hattEICCLSl kullanllârak Institut Merieux taraflEldan
yapllîhaktadB Hücreler, 24 saat sonra çEElarllân %5 oranübla fetal bovinserumuyla takviye
edilen OptiPROTM SFM'ye (serumsuz ortam) eritilmistir ve fetal bovin serum olmadan OptiPROT'V'
SFM ortamüla degistirilmistir. ABD menseli olarak sertifikalandlEllân, serum, gamma lâlEhalela
tutulmustur ve üretici tarafIdan arlîi etken için test edilmistir; sterillik, mikoplazma ve arlîi
virüsler için ilave testler WuXi AppTec tarafüdan bu malzeme üzerinde gerçeklestirilmistir.
Hücre bankalarEÇlvirüs tohumlarIlZlve aslýlîlyapmaslîiçin Vero hücrelerinin tüm sonraki
geçisleri, serum olmadan OptiPROTM SFM'de yapllüilgtlü Diger hayvandan elde edilen
malzemeler veya Ürünler, bulusun bir yapllândlElnas- göre hücre bankalarIEl'eya nihai asEEl
üretmede kullanilIhlgtlB
Vero Hücre Bankalar.. Preparasyonu:
Ana ve Çallglna Hücre bankalarÇtGMP'ye göre hazlEIlanmlStlEl/e FDA Dikkat Edilecek Hususlar'a
göre test edilmistir ve karakterize edilmistir. Vero hücreleri, kurulu bir kökene sahipti ve Bovin
spongiform ensefalit (BSE) hakkIa düzenleyici hususlardan bag IislîtlDSerumsuz büyüme
ortamÇlçogaIan hücrelerde kullanliîhlstlEl
Tohum hücrelerinin ve asßerilerinin üretimi lealelda Vero hücrelerinin ciecis ciecmisi:
AçlKlanan sarEhumma as-I üretimi lelisIda Vero hücrelerinin geçis geçmisi, Sekil 1'de
sematik olarak gösterilmektedir. WHO hücreleri, Geçis 134'te alülnlgtlEl Ana Hücre BankaslZl
(MCB) ve Çallîma Hücre BankasHMWCB), sßslýla, Geçisler 139 ve 143'te depolanmlSIlEl
Hücreler ayrlEla, virüs üretimine yönelik olarak kullan[lân biyoreaktörün tohumlanmas-an
önce duragan kültürlerde hücre genislemesi süslda Geçis 154'e maksimum 11 geçisle
genislemistir. Biyoreaktördeki popülasyon ikiye katlanmasliîlül tahmin edilen saylîlZll ila 3
olarak hesaplanmaktadE
Ana ve al a Virüs TohumlarII Pre aras onlarü
Sekil 2, bulusun bir yönüne göre Virüs tohumlari& preparasyonunun bir sematik gösterimidir.
AçiKlanan aslsîla yönelik önemli bir güvenlik faktörü, üretime yönelik olarak atenüe YF 17D
as-I kullanIiIE Bir baslangümalzemesi olarak kullanilân atenüe virüs, arlZI etkenler için
çesitli testlerden geçen bir ticari asIlB YF-VAX® (Sanofi Pasteur, Swiftwater PA). Vero
hücrelerinin asllâmasEliçin kullanllân orijinal YF-VAX® malzeme, embriyonlasmEl tavuk
yumurtasIan elde edilmektedir ve bir stabilizatör olarak hidrolize domuz jelatini olarak
muhafaza edilmistir. Yumurtalardan gelen bir arlîi etkeninin taslEma olasillglüÖn-Ana Virüs
Hücresi üretmesi için RNA transfeksiyonunun kullanIilsîla azaltilIhStIE
Hücreler, OptiPro-SFM ortamIia (Invitrogen, Grand Island, NY) çogaltilIhlIstlEl Vero
hücrelerinde yüksek titrelere büyüyecek olan modifiye SarIZIHumma (YF) virüsünün
gelistirilmesi için, ilk olarak YF-17D virüs, Vero hücrelerinin
bir leIasmEtabakalea sahip bir T-25 siseyi enfekte etmesi için kullanllîr'ilstlü Hücre kültürü,
37°C ve yüzde 5 COz'de inkübe edilmistir.
Sitopatik etki (CPE) yaklasHZI 2 + (%50) hücrede gözlemlendiginde, kültürün alikuotlarEl
hazlEIlanmlStEl geçis bir (P1) olarak etiketlenmistir ve seri geçislerine devam etmesi için
inokülüm olarak kullanIia yönelik olarak -80°C'de depolanmlgtEl P10 araclIJIjJEIa P1'in
yapiIB1asEiÇIn kullanilân prosedürün bir sematigi, Sekil 3A'da gösterilmektedir.
Geçis 1 (P1) virüsünün bir alikuotÇllO”1 ila 10i8'de seyreltilmistir ve her bir seyreltme, büyüme
ortamII çiElarI[g]l3teril 12 kuyucuklu plakasIda çogaltuân üç (3) Vero hücre kültürlerinin
lelasmEtek tabakalarEE üzerine asüânmlSIE
Logw seyreltmeleri, 10'l seyreltmeye esit olmasülçin 0.2 mI'Iik virüsü 1.8'lik fostat tamponlu
saline (PBS) aktararak hazlEIlanmaktadlB Virüs artIZlPBS, karlsîtlEllIhlstEve sonrasIda yeni bir
edilmistir. Vero hücre kültürünün on iki kuyu s[lZIasmISl tek tabakalarElatiketlenmistir ve P1
kuyucuk) hazlEllanmlgtlEl ve inokülümün her bir seyreltmesi için yeni bir pipet kullanllârak
ortamslîlkültürlerin üzerine asllânmlgtß Negatif kontrol kültürleri, PBS'nin benzer bir hacmiyle
asilânmlgtlî.] Kültürlerin asllânmaleldan sonra, kültürler, aralllZIElsallamayla 1 saat boyunca
37°C'de inkübe edilmistir ve sonrasIa 1.0 ml'lik idame ortamÇlkültür basi eklenmistir.
Hücreler, Sitopatik etki (CPE) için her gün gözlemlenmistir ve 1+ (etkilenen hücre tek
tabakasi& %25'i), 2+ (etkilenen hücre tek tabakalellEl %50'si), 3+ (etkilenen hücre tek
tabakasi& %75ii) ve %100 (etkilenen hücre tek tabakalellEl tümü) olarak kaydedilmistir.
CPE'nin tahminleri, kontrol hücreleriyle karslEstBnaya dayanmaktadE Plak tahlili aynEI
zamanda, CPE'nin viral infektivite gösterdigini dogrulamaslZI için inokülümün aynEl
seyreltmelerinde gerçeklestirilmistir.
CPE (2 +) bu kültürlerde gelistirildiginde, ortamI bes tane 0.5 ml'lik alikuotlarünokülümün en
yüksek seyreltmesini veya en yüksek seyreltmesine yakI olanlîlalan kültürlerden hasat
edilmistir. Bes alikuot hazlEllanmlgtlElve -80°C'de geçis 2 (PZ) olarak depolanmßtlîl Strateji,
hücrelerde CPE'nin görünümüne dayanan en yüksek logw seyreltmesinde veya yakIIda
yinelenen virüs popülasyonunu seçmekti. Böylelikle, seçilen virüs popülasyonu, viral titrede bir
artßla olanak saglayacak olan olasEgenetik degisikliklerde hücrelerde yinelemesi için en iyi
sekilde adapte edilmis olan popülasyon olacaktlB
SonrasIa, logio seyreltmeler, PZ virüsünün bir alikuotlEdan hazEllanmlStlEve geçis bir YF
virüsüne yönelik olarak açilZlandlgiEüzere 12-kuyucuklu plakada çogaltilân Vero hücrenin
kültürlerini enfekte etmesi için kullanlEnEtE Benzer yöntemler, virüsün 10 seri geçisini
tamamlamasEiçin kullanliüîlgtlü
P10 ve P11:
Her bir seri geçiste, inokülüm olarak kullanllân alikuotlarI her biri aynElzamanda, Vero
hücrelerinde plak tahliliyle infektivite titrelerinin saptanmasüçin test edilmistir. Geçis 10'da, her
birinin tek enfeksiyöz virüs partikülünden genetik temsil ettigi, bes tek, tamamen izole edilmis
plaklar, plakalara verim getiren en yüksek seyreltmede seçilmistir. Her bir plak, dondurma
süsülda virüs infektivitesini korumasüçin Insan Serumu Albumin (HSA) içeren 0.3 ml'lik
ortamda süspansiyon halinde tutulmustur ve -80°C'de depolanmlgtE
'1 ila 10'8'Iik seyreltmelerde Vero statik kültürlerde YF 17D virüsünün geçislerinin serisi (PI ila
P10), Teksas Üniversitesi TlEl AlanIa (Galveston, Teksas) gerçeklestirilmistir. Strateji, Vero
hücrelerinde CPE'nin mikroskopik görünümüne dayanan en yüksek log 10 seyreltmesinde veya
yalelEtla yinelenen virüs popülasyonunu seçmekti. En yüksek seyreltmede, P10 hasadÇl
sitopatik etkiler gösteren virüs popülasyonu, optimize edilmis, "yüksek verimli" virüs olarak
seçilmistir. En yüksek seyreltmede CPE gösteren yüksek verimli virüs popülasyonu,
sekanslanmlgtlB
Yüksek Verimli Virüs:
artEllIhlgyinelemeye yönelik olarak uyarlanmlStlE Virüs Geçisi 10'da, tek pllaka olusturan birim
toplanmlgtlü ve Virüs Geçisi 11'de bir mini-tohum stogu üretmesi için aklskan kültürde
geçirilistir. Sekil BB'deki grafik, yüksek MOI'da asilânmlîl olan P1 ve P11 virüslerinin
karsllâstlülnallibüyüme egrilerini göstermektedir; veriler, P11 virüsünün P1 virüsünden daha
yüksek bir pik titresine sahip oldugunu belirtmektedir. Bu virüs (P11), Virüs Geçisi 1'de YF
17D'ye klîlasla Vero hücrelerinde 3 ila 7 kat artiEllBwlglyineleme kapasitesi` göstermistir. Virüs
Geçisi 11 virüs stogu, RNA ekstraksiyonuna yönelik olarak kullanllüilgtlElve RNA, cGMP dereceli
virüs tohumlarüliretmesi için kullanUBilStlB
Vero Adapte edilmis 17D Virüsünün RNA SekansEüPll)
Orijinal YF-VAX®'den P1 ve P11'de virüslerin tam genomik konsensus sekanslarßaptanmlgtlü
Iki genetik mutasyon veya nükleotid farklarüasagida yer alan Tablo 1'de gösterildigi üzere,
bulunmustur. Bir nükleotid farlikapsit (C) gende ve digeri de zarf (E) geride yer almaktadlE
Burada kullanIlgll haliyle "kapsit" terimii, bir virüsün nükleik asidini çevreleyen ve koruyan
proteinin kabugunu ifade etmektedir. C genindeki bu degisim çekinikken (amino asit degisimi
yok), E geni mutasyonu bir amino asit (LyssArg) mutasyonuyla sonuçlanmlStEl
Tablo 1 Vero hücrelerine adapte edilmis YF 17D virüsündeki RNA sekans ve mutasyonlarü
Nükleotid degisimi - Amino asit degisimi Kodon
NT kalItEI # P1 P11 P1 P11 Konum P1 P11
Birinci mutasyon, ACA'dan ACG'ye kapsit proteinin (C31) konumunda (31) amino asit için
kodonda bir degisiklikle sonuçlanan SEKANS KIMLIK NUMARASI: 1'e göre, nükleotid
kaliEtElnda (#211) bir A'dan G'ye dönüsümdü. Bununla birlikte, bu mutasyon, bu konumda
amino asit kaliEtEüîliegistirmemistir. Ikinci mutasyon, AAG'den AGG'ye zarf proteininin (E160)
konumunda (160) amino asit için kodonda bir degisiklikle sonuçlanan SEKANS KIMLIK
NUMARASI: 1'e göre, nükleotid kaIlEt-a #1452 bir A'dan G'ye dönüsümdü. Bu mutasyon,
bu konumda Lisinden Arjinine ikame ile sonuçlanmlgtE P1 ve P11'e yönelik nükleik asit ve
amino asit sekanslarIlEl bir konsesus hizalanmasÇlSekiller 4 ve 5'te gösterilmektedir.
P10 Hasad Plak Saflastlûnasü
Yukarßh aç[lZland lglüizere, P10'dan virüs, plak olusumuyla saflastlEIlEnStlB Bir plaktan izole
edilmis virüs, bir T 150 sisesine asilânmlgtü Bu siseye yönelik olarak iyilestirilmis ortam,
hücrelerin yüzde Sû'si CPE gösterdiginde hasat edilmistir. Bu malzeme, bir mL alikuotlarda
alikuot edilmistir ve P11 olarak belirlenmistir. P11 virüsü sonraslîida, Vero hücrelerinin
transfeksiyonuna yönelik olarak RNA'nI kaynag lîcllarak kullanliîhlStE Plak olusturan birimlerin
P11 titresi, olarak saptanmlgtlü P 11 virüsünden izole
edilen RNA, bir Ön-Ana tohum üretmesi için hücreleri transfete etmesi için kullanllüigtlîl
Ön-Ana Tohum virüsü, bir Ana ve Çallgma Virüs Tohumu stogu üretmesi Için Vero hücrelerin
ilave kültürlerinde geçirilmistir.
Ana Virüs Tohumunun Üretimi:
Ana Virüs Tohumu (MVS), Sekil 2'de sematik olarak gösterildigi üzere, virüs inokülüm olarak
Ön-Ana Tohumun tek flakonu kullanüârak serumsuz kosullar altlElda Vero hücrelerde
üretilmistir. Geçis elde
edilen hücreler, on bir (11) 225 cm3 T-siselere genisletilmistir. Hücreler siEIasmlSl hale
geldiginde, bir sise tripsinlestirilmistir ve hücre say-ßaptamasmin ve ayri Eamanda ÇallStna
Virüs Tohumu üretmesi için kullanllân ilave siseleri tohumlamasEIbin kullanilmlgtlîl OptiPROTM
SFM ortamÇlgeriye kalan 10 T-siseden çllZlarllüilStlEI ve hücreler, (MOI) ~0.01 PFU/hücre
enfeksiyonun derecesinde Ön-Ana Tohum virüsüyle asüânmlgtlE Virüs, 37°± 2°C'de 60 (± 5)
dakika boyunca adsorbe etmesine olanak saglanmlgtlîlve bundan sonra ön -iISlOptiPROTM
SFM ortamESiselere eklenmistir. Enfekte kültür sonraslda ~5% CO; ile 37°± 2°C'de inkübe
edilmistir.
3 gün sonra, CPE hücre popülasyonun 2 %80'inde gözlemlendiginde, virüs çogaItIi prosesi,
hücre kültür akEkanlElEliiasat ederek sonlandlîllIhIStE Virüs içeren kültür akSkanÇtüm siselere
havuzlanmlgtlEl hücre debrisini çilZlarmasEl için santrifüjlenmistir ve %7'lik bir nihai
konsantrasyona steril %70'Iik sorbitolle karlStlElEnIgtEl Bu karlSlEh, flakon basi 2 mL'de 4 mL
cryoviallere doldurulmustur ve 5 -60°C'de dondurulmustur. Dondurulmus virüs stogu YF 17D
MVS'yi olusturmaktadlü
Sekil 2'de gösterildigi üzere, MVS'nin üretimine yönelik olarak kullanüân en yüksek Vero hücre
geçisi 147 idi.
Calgtna Virüs Tohumunun Üretimi:
Çallgma Virüs Tohumu (WVS), cGMP kosullarElaltEda MVS'nin tek flakonundan, Sekil 2'de
gösterildigi üzere üretilmistir. MVS'nin üretiminde hücre sllîllglülElsaptamasEiçin kullanilan
canlEhücrede tohumlanmlStlEl Geçis 147. Hücreler, Ana Tohum Stogunun üretimine zaman
vermesi için 4 yeni T225 siseye geçirilmistir. Geçis 148'dekil hücreler sonrasIa, WVS'nin
üretimine yönelik olarak on bir T225 siseye tohumlanmlSIlEl
Hücreler, %80 lelasm Stan daha büyük oldugunda, bir sisedeki hücre sllîliglßaptanmlgtlîl Bu
hücre lelEglügeriye kalan ori sisede hücre siEllglülE tahmin edilmesi için kullanlliigtlîlve 10
sisedeki hücreler, 0.01 PFU/hücre oranIIa bir MOI'da MVS'den virüsle enfekte edilmistir.
Enfeksiyonun gerçeklestirilmesi için, ortam siselerden çiIZlarHII'IISIIEIve sonrasIa seyreltilen
virüs, fosfat tamponlu salinde eklenmistir. Bir saatten sonra yeni hazEllanmlglortam, her bir
siseye eklenmistir ve hücreler inkübatöre geri döndürülmüstür. Hücreler, CPE'ye yönelik olarak
mikroskopik olarak gözlemlenmistir. CPE %80'den daha fazla oldugunda, virüs hasat edilmistir.
siseden ortam, hücresel debrisi çilZlarmasETçin santrifüj edilmistir ve arlülüîlglsüpernatant bir
kaba havuzlanmßtE Sorbitol (%7 nihai konsantrasyon), bir soguk-koruyucu olarak virüs içeren
süpernatanta eklenmistir. Havuzlanmlgvirüs, flakon bas. iki mL, 4 mL cryoviallere alikuot
edilmistir. Doldurulan flakonlar, s-60°C'de depolanmlgtlB Dondugunda, bankan ucundan bir
flakon, virüs titresini saptamasEiçin Vero hücrelerde bir plak tahlilinde test edilmistir.
P1'e Klîlasla P11'de Ulasllân Titrede Art&
Orijinal YF virüsü ve YF virüsünün P11 hasadÇplak olusturan birimler (PFU) olarak ifade edilen
infektivite titrelerini saptamaslîiçin Vero hücrelerde plak tahlili ile titre edilmistir (Tablo 1).
Orijinal YF-VAX 17D aslgÇll/ero hücrelerde ml bas.103'7Iogmiçermistir. Geçis bire yönelik pik
7.67 logio'a büyük ölçüde artlEllBilStlB Bu yüzden, bu deneyde, P1 virüsünün titresine (6.68
Virüs büyüme egrileri aynElzamanda, es zamanlEblarak P1 ve P11 virüsleri üzerinde de
gerçeklestirilmistir. Büyüme egrileri, 1.0'IlEIyüksek MOI'da Vero hücrelerin çift 75 cm2 siselerini
enfekte ederek gerçeklestirilmistir ve ikinci büyüme egrisi, 0.001'lik düsük MOI kullanuârak
gerçeklestirilmistir. Yüksek MOI'da, tüm hücrelerin kültürün baslatllîhasüla enfekte edilmesi
beklenmektedir, buna karsi düsük MOI'da, ilk olarak enfekte edilen birkaç hücre tarafIan
serbest blEiklEn virüs, kültürün geriye kalan hücrelerini enfekte etmektedir; bu yüzden,
düsük-MOI büyüme egrisindeki virüsün, yüksek-MOI kültüre klýlasla bir sekilde geciktirilmesi
ortam (2 mL), kültürlerden çilîlarilIhlSIB %2 HSA ile stabilize edilmistir ve - 80°C'de
dondurulmustur (çift bir ml numuneler). Her bir numunenin Logio seyreltmeleri, infektivite
titresini saptamaslZiçin Vero hücrelerde test edilmistir ve büyüme egrileri zaman içinde
çizilmistir.
Tablo 2 YF virüsünün her bir süllîglieçisine yönelik pik infektivite titre
Vero hücrelerde Plaklara verim PlaklarE Pik infektivite Ml bas. Iogw PFU'da infektivite
YF-VAX'I geçisleri saglayan En ortalamaslîl titre (PFU/ml) titresini esitlemesi için plak
yüksek # olusturan birimlerin dönüsümü
Seyreltmeler
titreden; veya aslßma sonrasEGPI) 48 saatte 6.28 '0910 olan bir maksimum titreye asllâmanl
bir klîtnen azalma göstermistir. Geçis 11'e (P11) yönelik bulgular, geçis bir virüsüne (P1) göre
titrelerde bir artlglgöstermistir. Asilâma zamanlElzla, titre 4.15 logm'du ve 48 saat P.I.'da 6.83
logio olan bir maksimum titreye ulasmlgtlEli/e 72 saat P.I.'da 6.54 '0910 olan bir titreye azalmlStiEl
(bkz Tablo 3). P11 virüsüne yönelik olarak yaklasllîl48 saatte pik virüs titresi, 0.55 Iogio'du veya
P1 virüsüne yönelik olarak 3.5 kat daha fazlaydEi
Tablo 3 Yüksek MOI'da (1.0) Sarüilumma 17D Geçis 1 ve Geçis 11'in büyüme egrisi
Yüksek MOI kullanan büyüme egrisine kiyasla, 0.001'Iik bir MOI kullanan büyüme egrisinin
örüntüsü, yinelemede bir gecikme göstermistir fakat maksimum titreler daha yüksekti. Asliâma
sEasIa, titreler, süsüla, geçis 1 ve 11'e yönelik olarak 1.7 ve 0.57 Iogio'du. Titrelerde lineer
ile ulasilmlsuîl P11 virüsüne yönelik olarak yaklas[lZl72 saatte pik virüs titresi, 0.82 Iogio'du veya
P1 virüsüne yönelik olarak 6.6 kat daha fazlayd EIBu bulgular, YF-VAX'I seri geçisinin, titrede
büyük ölçüde bir artlg ürettigini ve bu yaklasnE pasiflestirilmis YF as-I gelistirilmesine
yönelik olarak umut verici olarak göründügünü belirtmektedir (bkz Tablo 4).
Bu bulgular, YF virüsünün seri geçisinin titrede büyük ölçüde bir artEIa üretildigini
belirtmektedir. Sonraslîitla, yukarlflia açiElandIgiElüzere, P1 ve P11'in sekans analizi
gerçeklestirilmistir, bunun karsüâstünalübulgularü seri geçislerinin, birinin amino asit
degisimiyle sonuçland[gil:l YF virüsünde iki genetik mutasyonda sonuçlanabilecegini
göstermektedir.
Sertifikalülfrika yesil maymun böbregi hücrelerinde (Vero) atenüe YF 17D virüs as-I seri
geçisleriyle üretilen açilZlanan modifiye YF virüsü, hücrelerde aitlEIlBilSlverimlilik göstermistir.
Bulusun yöntemleri, SarEH-Iummaya baglgilElilgüretilmesi için sujelerin modifiye, pasiflestirilmis
YF virüsle asiiânmasllîiçermektedir.
Bivoreaktörlerde AsElTJretimi:
Yaklasilg olarak 5 g/L Cytodex 1 mikrotaslsîlîllâr içeren biyoreaktörler, OptiPROTM SFM
ortamIa yaklas[lZl olarak 5 x 105 Vero hücre/mL ile tohumlanmlStE Hücrelerin,
miktotasülölâra baglanan hücreler mL basi 27 x 105çekirdege ulasana kadar, 3 ila 4 gün
boyunca çogalmasülai izin verilmistir. Virüs astlâmaya yönelik olarak, çalkalama ve parametre
kontrolleri kapatlEhaktadEl ve mikrotaslîlüßr ve hücrelerin çökelmesine olanak
saglanmaktadE Ortam hacminin yaklasElZlolarak %75'i, mikrotasülalârlîeaktörde tutmasübin
tasarlanan 90 pm'lik elekli tüp araclIJgJEIa çüZlarllBiaktadE WVS virüsü, ~0.01 PFU/hücrenin bir
MOI'sinde sokulmaktadIB Düsük çalkalama, virüsün hücrelere adsorbe edilmesi ve enfekte
etmesine olanak saglanmasüljn yaklasilîll saat boyunca bu düsük hacimde uygulanmlStlEl Yeni
hazEllanmlîortam, çalkalamadan önce tam hacme eklenmistir ve parametre kontrolleri orijinal
ayarlar. geri döndürülmektedir. Enfeksiyondan sonra gün 3 veya 4'te, iyilestirilmis ortamI
daha fazla gün boyunca islenmesine olanak saglanmlgtlîlve enfeksiyondan sonra Gün 5, 6 veya
7'de iyilestirilmis ortam hasat edilmistir. Biyogüvenlik temin edilmesi için, hasat numuneleri,
mikrotaslsîlaillzarmasian hemen önce biyoreaktörden allEtnlgtlEve sterilite, mikoplazma,
retrovirüsler ve arlîi virüslere yönelik olarak test edilmistir (in vitro tahlil).
Reaktör karlgtülnasümikrotaslîlîlßrl çökelmesine olanak saglanmaslîiçin durdurulmustur.
Kültür, 90 pm'lik bir elekli tüp aracüglgla biyoreaktörden bir biyoproses torbas-
aktariiüiaktadm 90 um'lik elek, mikrotasmîilârl miktarIIZiie büyük partikülatlarI hasada
aktarlßiaslßzaltmaktadîl Bu Virüs HasadlýUEIBu Virüs Hasad Bnumune olarak aIlEmlSIlEve
infektivite, güçlülük, kimlik, endotoksin, sterilite kallEtürero hücre DNA'sEle kallütül'ero hücre
proteinlerine yönelik olarak test edilmistir.
Virüs Saflastlüna ve Pasiflestirme:
Kültür iyilestirilmis ortam, hasat edilmistir, iki ad Iida ar[EllB1lStlI,i BENZONASE® ile
parçalanmlStlE ultrafiltrasyon ve diafiltrasyonla saflastEllBiStEli/e sonrasIa CanliIl'irüs Kütlesi
üretilmesi için steril olarak filtrelenmistir. Canlü/irüs Kütlesi sonrasIa, virüs zarfIlIglieçen ve
virüsü pasif hale getiren pürin kallEtHErIlElkillestirerek viral RNA'yEEiölen ß-propiolakton (BPL)
ile tedaviyle pasif hale getirilmektedir. Pasiflestirilmis virüs ayrlElsi, selüloz sülfat kolon
kromatografiyle saflastlElBiStlElve Kütle AslZIIaç Maddesi olusturmasEiçin arzu edilen viral
konsantrasyona seyreltilmistir.
YFV 17D Gecis Calgnasülû TekrarEl
Deneyler, orijinal geçis serilerindekine benzer teknikler kullanilârak P11'den geçissiz virüs
stogundan YF virüsünün geçisini tekrar etmesi için gerçeklestirilmis.
Virüs StoklarII Preparasyonu:
Vero hücreleri, OptiPRO SFM kullanilârak, çalisma boyunca serumsuz kosullar altlElda
tutulmustur.
YFV 17D virüsünün ilk kaynagÇIYF-VAX® (Sanofi Pasteur, Swiftwater PA) markasII bir tek
flakonundan elde edilmistir. Flakon baslang Igta yeniden yapilândüllüilStE ve alikuotlara
dagll'JlBîlStiE Bu alikuotlardan biri, tekrar deneylerine yönelik olarak kullanllBiEtB Tekrarlßeri
geçis, burada seri B ve C olarak ifade edilen paralel sekilde gerçeklestirilen çallginanl iki
yürütmesi olacak sekilde çift sekilde gerçeklestirilmistir.
Virüsün her bir geçisinde, virüs numunesi, seri 10-kat seyreltmede seyreltilmistir ve seyreltilmis
virüs, 12 kuyucuklu plakada tohumlanmlglVero hücrelerini asllâmaslîçin kullanllîhlgtlü Her bir
geçiste gerçeklestirilen seri seyreltmeler, plakalardan biri, seyreltme basi 4 kuyucuk
asllâyarak virüsün sonraki asamasllil haziEllanmasEmin kullanllâcak sekilde ve plakalar. diger
seti, seyreltme baslîila 2 kuyucuk asllâyarak, geçen virüsün titresini saptamaslîçin kullanilâcak
sekilde çift halinde asllânmßtü
Virüsün seri geçislerine yönelik olarak, virüsün geçisine yönelik olarak seçilen seyreltme,
genellestirilmis sitopatik etkinin (CPE), enfeksiyondan sonra üç ila dört günde gözlemlendigi
son seyreltmedir. Dört kuyucuktan elde edilen ortamlar, sonraki geçise yönelik olarak
havuzlanmlgtlü Virüsün titresi, plaklarI görsellestirilmesi ve sayilihasljçin immüno boyama
kullanilârak plak tahliliyle saptanmßtm Immüno boyama tekniginin, enfeksiyonun 3 gün
sonrasIa titreyi saptamasIEla olanak saglanmlStlEl
Virüsün ilk geçisine yönelik olarak, 0.3 ml'lik YF-VAX alikuot, 10'l seyreltme için, OptiPRO SFM
kullan [lârak, 3 mL nihaiye seyreltilmistir. Seyreltilmis virüs, esit olarak üç alikuota bölünmüstür.
Bu alikuotlarI her birinden, seri 10-kat seyreltmeler, iki seyreltme serisi (B ve C) yapan 10'5'e
yapllBilStiEl Bu durum, burada PO -iii P1 geçisi olarak ifade edilmektedir. Seyreltme serileri
kullanllârak asllânan plak tahlillerinden, PO virüsü saptanmlStEve geçis için asllânan plakalar
yönelik olarak, P1 virüsü üretilmistir. Geçisin her bir turu Tablo 5'te özetlenmektedir.
Tablo 5: YFV 17D'nin Seri Geçisleri (Seri B ve C için bulgular aynm
Geçis KaplanmEl Sonraki geçis için hasat edilmis
seyreltmeler seyreltme
PO (ilk flakon) N/A N/A
P7 #PS 10'3 ila 10'7 10'“
Geçis, virüsün 10 seri geçisine yönelik olarak tekrar edilmistir. Virüs son geçisten hasat
edildiginde, titreler, her biri seriden P10 virüsüne yönelik olarak üretilmistir. P10 virüsleri
sonrasIa, kuyucuk baslEa yalnEta bir plak asüâmadan sonra gelisecek sekilde asilâma
hücrelerine yönelik olarak seyreltilmistir. Tamamen izole edilmis plaklar sonrasIa,
kuyucuklardan toplanabilmektedir. B serisinden, altEtlamamen izole edilmis plaklar toplanmlStlEl
ve C'den iki plak toplanmßtlîl Toplanan plaklar, büyüme egrisi çallgnalarlüla yönelik olarak P1
1 virüs stoklarEiüretmesi için T25 siselerini asüâmasüçin kullanlEnStE
Büyüme egrisi analizi:
Büyüme egrisi çallgnalarliîa yönelik olarak, her bir seriden elde edilen P1 stok virüsü, her bir
seriye yönelik olarak P11 stoklarlgla karsliâstlîlllfhßtü P1 stoklarII hacmi, bunun için sIlElilZI
olabilecegi için, her bir seriden elde edilen P1 virüsünün bir alikuotÇlüç kat seyreltilmistir,
sonrasIa alikuotlar, büyüme egrisine yönelik olarak P1 stoklarEüretmesi için seyreltilmis
virüsten yapllE'iIStlE P11 stoklari yönelik olarak, B serisinden üç stok ve C serisinden iki stok
analiz edilmistir. Büyüme egrisi çallgmalarldan önce, virüs stoklarEE alikuotlarünfektivitenin
seviyesinin onaylanmasüçin tahlil edilmistir.
Büyüme egrisi analizi, 0.001 PFU/hücre oranlEUa düsük MOI'da, T25 siselerinde Vero
hücreleriyle gerçeklestirilmistir. Çalisma, kültür ortamlZlolarak OptiPRO SFM kullanilârak
serumsuz kosullar aItIa yürütülmüstür. Hedef 0.001 MOI'ya ulasilBiasülçin virüs stoklarII
seyreltilmesinden sonra, bir numune, inokülümün titresini onaylanmasEiçin ayrlEhlStlE Virüs
inokülasIlEl, yaklasllîlolarak bir saat boyunca hücrelere adsorbe etmesine olanak saglanmlgtlEl
Adsorpsiyondan sonra, monotabakalar üç defa ylElanmlgtElsonrasIa kültürler 8 ml'lik ortamla
beslenmistir. Her bir zaman noktasIa, 1 mL her bir hücre kültüründen çllZlarlIBHStlElve 1 mL
yeni hazlEllanmlglortam tekrar eklenmistir. Ortamlayrllân mL'si, santrifüjleme ile arlElIIhlSIIElve
tahlile hazlElolana kadar, sorbitolün varlig1Ia -80°C'de depolanmlgtlü Numunelerin alIlglEl
numuneler üzerinde gerçeklestirilmistir. Çalgnanl bulgulari: Sekil 3C'de ayrlEtllBZlolarak
gösterilmistir.
Hem B hem de C serisine yönelik olarak, serilerden P1 virüs stogundan daha yüksek titrelere
yinelendigi gösterilen bir P11 virüs stogu vardIE Hem B hem de C, ve B3-P11 stogu ve C1-P11
stoguna yönelik olarak P1 stoklari: sekans analizi için seçilmistir. Sekans analizi, yaplgial
olmayan protein 1'de (NSl-317) amino asit konumunda (317) Treonin (Thr) s Izolösin (Ile)
mutasyonu ve yaplîial olmayan protein 2A'da (NSZA-170) amino asit konumunda (170)
Fenilalanin (Phe) _› Lösin (Leu) mutasyonun yanlîsüi, orijinal geçis serilerinde gözlemlendigi
üzere B3 stogunun E160'da aynELyssArg mutasyonunu yararland@IEgöstermektedin C1
stogunun E geninde aynIZlnutasyonu tasnamaslüla karslEl, C1 stok genomunun ayrlEla bir
çalgnasüjevam etmektedir ve yapisal olmayan protein NS4B'de (NS4B-113) amino asit
konumunda (113) bir mutasyon ortaya çlElarmStE
Tablo 6, orijinal ve tekrarlljgeçis çallsmalarian elde edilen modifiye SarEHlumma virüslerinde
bulunan nükleotid ve amino asit degisikliklerini özetlemektedir.
Vero hücrelerde sarElîiumma 17D asII (YF-VAX®) üç ayrlîijieçis serisinde geçis 1 (Pl) ve P11 arasIEUaki konsensus
sekansIa nükleotid ve amino asit degisimleri. Belirlenen viral proteininde (veya kodlamayan bölge, NCR) degistirilmis
nükleotid veya amino asidin konumu gösterilmektedir. BazElnükleotid degisimleri çekiniktir (ilgili amino asit
mutasyonlarlElda sonuçlanmamEIlE).
Protein Orijinal geçis serisi Tekrar serisi B Tekrar serisi C
Nükleotid Amino asit Nükleotid Amino asit Nükleotid Amino asit
'NCR
E 211 AsG 211 AsG
1507 TsC
1897 GsA
N51 3402 (LT 317 Tsl
4016 T_.C 170 F_›L
7225 AQG 113 LM
9343 GHA
9670 CaT
Bir SarEHlumma viral sus, insan hastalllZlarII önlenmesine yönelik nörotropik ve viskerotropik
advers olaylara yönelik bir olas[[[g]|:lortadan kaldlEElken bir nötrlestirici antikor yan-El
saglayacak olan daha güvenli, pasiflestirilmis, yinelenmeyen bir asi. gelistirilmesi için
üretilmistir. Ilave SarEHlumma viral suslar, insan hastalllZlarlilI önlenmesine yönelik nörotropik
ve viskerotropik advers olaylara yönelik bir olasüfglßrtadan kald lElEken bir nötrlestirici antikor
yan Eaglayacak olan daha güvenli, pasiflestirilmis, yinelenmeyen bir as gelistirilmesi için
üretilmistir.
Hücreler, Vero hücrelerden seçilmektedir. SarEl-lumma virüsünün çogaltIiEiçin uygun olan
diger hücreler, birincil tavuk embriyosu, birincil ördek embriyosu, birincil köpek böbregi, birincil
tavsan böbregi, WI-38, MRG-5 veya fetal rhesus akcigeri içererek, fakat bunlarla sIlEllEl
olmayarak kullan llâbilmektedir.
Kimyasal olarak pasiflestirilmis viral asllâr; örnegin, subkütan, intramüsküler, epidermal veya
intradermal yollarla uygulanacak olan yaklasllg 0.1 ila yaklasElZl 1.0 ml. veya 0.5 ml'lik bir doz
olusturan birimler (PFU) veya doku kültürü enfeksiyöz dozlarD] pasiflestirilmis esdegerlerini
içeren, örnegin bir steril sulu çözelti olarak formüle edilebilmektedir ve uygulanabilmektedir. Ek
olarak, uygun bir formülasyonda, intranasal oral yol gibi bir mukozal yol seçilebilmektedir.
Uygulanacak olan virüsün uygun bir miktar.. seçimi teknikte uzman kisilerce
saptanabilmektedir ve bu miktar çesitli etmenlerden, örn., virüsün uygulanacag Eujenin bedeni
ve genel sagl[glÇldolayEljegisebilmektedir. Suje, tek seferde asllânabilmektedir veya gerekli
oldugunda, takip immunizasyonu gerçeklestirilebilmektedir.
Yukari belirtildigi üzere, asllâr, SarlZHiumma virüs enfeksiyonu riski altIda olan sujeye birincil
profilaktik ajanlar. olarak uygulanabilmektedir. Aynüamanda, gerekli olmamasi ragmen,
adjuvanlar, SarlZI Humma virüsü asllârllil immunojenesitesinin artlEEnasEl için
kullanüâbilmektedir. Uygun adjuvanlarI seçimi, teknikte uzman kisiler tarafIan kolaylllîla
gerçeklestirilebilmektedir.
AyrlEla yukarlöh belirtildigi üzere, canlÜirüs, virüsü pasif hale getiren, ß-propiolakton (BPL) ile
tedaviyle pasiflestiriIebilmektedir. Virüs pasiflestirmesinin diger uygun yöntemleri; formalin,
ultraviyole radyasyon, etilenimin, asetiletilenimin ve ikili etilenimin içerebilmektedir fakat
bunlarla sIlIllIIcllegildir.
ÖRNEKLENDIRME
Asagßhki örneklerin, bulusun belirli tercih edilen yapllândünalarllîlayrlîla göstermesi
amaçlanmaktad lü
Fa relerde Antikor YanlElîl
CanlElvirüse klîlasla pasiflestirilmis sarEhumma asEla immünizasyondan sonra disi, karsEl
döllenmis BALB/c ve CD-l farelerde antikor nötrlestirme degerlendirilmistir. SarEIi-Iumma (YF)
virüsü, beta propiolakton (BPL) ile pasiflestirilmistir, alüm adjuvanla formüle edilmistir ve her
birinin 14 güne ayrIfgÇlki veya üç doz olarak intramüsküler yolla enjekte edilmistir. Virüsün iki
doz seviyesi, BALB/c farelerde test edilmistir, yüksek doz seviyesi yalnlîta CD1 farelerde test
edilmistir. Immünizasyondan 14 gün sonra allEIan serum, nötrlestirici antikor aktivitesine
yönelik olarak test edilmistir.
Preimmünizasvon Prosedürleri:
Disi BALB/c ve CD-l sus fareleri (6 haftalllg) kElHEinmlgl virüs hayvan tesisinde belirlenmis
aylEEErda ortama alIStEIlhilstIE Serum numunesi, feda etmeden sonra Çalgma Günü 28 veya
42'de toplanmlStlEl Fareler, her bir kafeste 5 fare olacak sekilde yerlestirilmistir ve her bir
hayvan kafes kartlarüre kulak çentigiyle benzersiz olarak belirlenmistir. Fareler, herhangi bir
tedavinin baslamasIan önce bir hafta boyunca ortama allgtlElBilgtlB Fareler, sterilize edilmis
yiyecek ve su almlStlEve 12 saatlik ElEldöngÜsüyle (ögleden önce saat 6'da açllZl ve ögleden
sonra saat 6'da kapalmsterilize edilmis yataklamayla sterilize edilmis polikarbonat kafeslere
yerlestirilmistir. Genel sagllEl günlük olarak teknik personel ve haftalllîl olarak bir veteriner
taraflEUan ve saglllîl konularEliçin gerekli oldugunda degerlendirilmistir. Vücut aglElllElarÇl
immünizasyondan önce Gün 0'da ve Gün 28 ve 42'de toplanmlStIE
Immünizasvon Prosedürü:
Vücut aglEIlfg]l,`_limmünizasyondan önce Gün 0'da saptanmlStlEl Immünizasyon, ya ilm (alüm
formülasyonlarmya da 5.c(canll:virüs veya Freund adjuvanElIe pasiflestirilmis asLIIyoluyIa
verilmistir. Enjenksiyonlar, ketamin/ksilazin karglînl uygun olmayan dozuyla hafif anestezi
altlEUa verilmistir. Canlüliirüsle $.C yoluna yönelik olarak, 27 numara igneyle uydurulan 1 ml
slEIEgada asII100 ul'lik bir hacmi, farelerin skapular bölgesinde deri ve dokunun altta
uzanan katmanlarljraslia enjekte edilmektedir. [Im uygulamaya yönelik olarak, bir 0.5 ml
insülinin 100 ul'lik hacminde, farelerin 2 arka üst bacagII kas demetine (50 uI/bacak) enjekte
edilmektedir.
Farelerin Feda Edilmesi:
Fareler, birinci asilâmadan 28 veya 42 gün sonra feda edilmistir. Vücut aglîllig]l,__IDeney Günü
28'de ve feda edilmeden önce tüm farelerde saptanmßtlîl Kan, antikor testinin
nötrlestirilmesine yönelik olarak toplanmlîstü Kan (0.7-1.0 ml), asiEithlozda ketemin/ksilazinle
insana son verilmeden önce hafif ketamin/ksilazin tedavisiyle anestezi yapilân farelerden
kardiyak delinmeyle çilîtirlmîlSIIE
Deneysel tasarIi:
Alümla formüle edilmis asÇbir süspansiyon olarak Immünizasyondan önceki gün haziIlEinmlStEl
ve asüher slEEgaya doldurulmadan önce iyice karlStlElBilStlEl Alümle formüle edilmis
preparasyonlar, ilmyoluyla uygulanmlgtm 0.5 ml insülinde 100 ul'lik bir hacim, farelerin 2 arka
üst bacag kas demetine (50 uI/bacak) enjekte edilmistir.
CanIElSarElHumma (YF) aslîl: yaklasilZl olarak 1.1 x 105 pfu/ml oranIa salin virüs
konsantrasyonunun 0.6 ml'si ile yeniden olusturulmustur. 1x 104 PFU'Iuk (yani 1/10'uncu insan
dozu) bir doz, gün 0 s.c'de uygulanan steril sakinin 100 ul'lik hacminde verilmistir.
Freund adjuvanIEsÇbir cam slElElgaya 2 ml antijen çözelti ve diger cam slEliîlgaya 2 ml adjuvan
yerlestirilerek asllâmanl gününü formüle etmistir. SEIEIgalar, 3 yönlü valfe Iuer yerlestirmeyle
baglanmßtlB Antijen çözeltiden pistonlar, adjuvanIyag. antijen iterek, ilk olarak dikkatli bir
sekilde bastlEiIBNStlEl Pistonlar, adjuvan ve antijen çözeltiyi bir emülsiyona (yaklasüîlolarak 8 ila
dakika) karlîstlElnasÜgin, slßyla itilmistir. 0.5 ml'lik bir hacim, farelerin sIEüzerinde skapular
bölgede dokunun alttaki katmanlarüle deri aralela 5.6. olarak verilmistir (Freund adjuvanlîda
formülasyon).
CanlE'BarEIl-Iumma aslgIJYF VaxTM), yaklasiEI olarak 1.1 x 105 pfu/ml oranlElzla tedarik edilmis
salin virüs konsantrasyonunun 0.6 ml'si ile yeniden olusturulmustur.
gününden önce 2 haftadan fazla olmayan bir sürede hazlElhnmlgtlEl
Birincil Fare Deneyleri
fare gruplarÇlTablo 7'de özetlenen sekilde dozlanmlgtE Serum numuneleri, son asllâmadan
14 veya 28 gün sonra kardiyak delmeyle toplanmlStE
Grup # Fareler Sus AsHHacim = 0. 1 ml) Yol Asüîima Nötr. Ab
programEl
tamamlanmgtamamlanmamßta
pasiflestirilmis
tamamlanmgltamamlanmamgl
8 5 BALB/c CanlD/F Vax® sc Gün 0 Gün 28
Fare serumunda plak azaltIi nötrlestirme aktivitesi
Plak azaltIi nötrlestirme testi, nötrlestirme olmadlgiIa, 12 kuyucuklu plaka bas. 10 ila 40
plaka olusturan birim üreten, 17D virüsünün bir çözeltisi kullanüârak gerçeklestirilmistir. Seri
olarak seyreltilmis fare serumunun esit bir hacmi, 4°C'de 16 ila 20 sa boyunca virüsle inkübe
edilmistir ve sonrasIa 12 kuyucuklu plakada Vero hücrelerinin çift kuyucuklaria
asHBnmlgtlE 37°C'de 60 dakika boyuca virüs absorpsiyonundan sonra, kuyucuklar %0.75
oranübla metilselüloz içeren ortamla kaplanmlgtü 4 gün boyunca 37°C'de inkübe edilmistir,
kristal viyole ile sabitlenmis ve boyanmlStIE ve lgiKl kutusu üzerinde bir stereomikroskop
kullanüârak sayHBilStlEl %50 plak azaltn titresi, serum eklenmediginde, ortalama plak
sayIiIarIlEl %50'sinden aziýla sonuçlanan nihai fare serum seyreltmesini temsil etmektedir.
Plak azaItIi nötrlestirme test (PRNT) yanifIiarIZiie titreleri, Tablo 8 ve Sekiller 6 ve 7'de
gösterilmistir. PRNT testi, SarEI-iumma virüsüne karsüantikorlara yönelik günümüzde genel
olarak kabul edilmektedir. Susa bakilIhaksiîlEl, ya adjuvanslîl(Grup 7), alümle (Gruplar 1, 2, 3,
tüm fareler, nötrlestirici antikor yanlflhr gelistirmistir. 4096'da daha büyük titreler, 107
EU/dozda alüm bagllîpasiflestirilmis virüsün 3 dozuyla immünlestirilmis 5 BALB/c farelerden
'inde bulunmustur. Bu titreler, Freund adjuvanüla (Grup 6, titreler 16-18) verilen
pasflestirilmis virüsün 3 dozuyla immünlestirilmis BALB/c farelerden daha yüksekti. 108 EU/doz
seviyesinde alüm bagllîiiiasiflestirilmis virüsün 2 dozuyla immünlestirilen CD1 fareler (Grup 9;
daha yüksek titrelere uIasmEtlEl CanIDKF Vax® (Grup 8) alan 5 farede yalnlîta 1'i, yalnlîta
alüm alan farelerdeki (Grup 11) baslangü seviyelerinin üzerinde olan nötrlestirici antikor
ku rmustur.
Sekil 7'de, her bir sembol ayrEbir fareyi göstermektedir. Deney gruplarüTabIolar 7 ve 8'de
gösterilmektedir. Grup 6'ya (*) yönelik olarak test edilen serumun en yüksek seyreltmesi
Bu çallgina, güçlü nötrlestirici antikor titrelerine, alümle verilen açlEIanan pasiflestirilmis YF
virüsünün 2 veya daha fazla asilâmasüla immünize edilen farelerde ulasilâbilecegini
göstermektedir. KarsEdölIenmis CD1 fareler, dogustan olan sustan (BALB/c) daha yüksek
antikor yanlflhr- sahipti. Alüm, Freund'dan bir üstün adjuvandü fakat bu bulgu,
immnizasyonun yolu ile ilgili olabilmektedir (Freund için SC'ye karsßlüm için IM). Ek çalismalar,
immünojenisiteye asII tek bir dozuyla ulasilâbilip ulasilâmayacagIEisaptamasEliçin
gerçeklestirilecektir.
Claims (1)
1. SarEl-lumma virüs susu YF 17D'nin nükleik asit sekans- göre en az bir nükleik asit mutasyonuna sahip olan bir nükleik asit sekansEiçeren modifiye edilmis bir SarEI-Iumma virüs susu YF 17D olup, burada söz konusu en az bir nükleik asit mutasyonu, AUA'dan AUG'a bir degisimle sonuçlanan SEKANS KIMLIK NUMARASI: 14'ün bir yaplgal olmayan proteini 4B'nin konumunda (113) amino aside karsiülggelen kodonda, bir yaplgal olmayan protein 4B kodlayan nükleik asit sekansIa bir mutasyondur. . Bir yaplâlal olmayan protein 4B'nin konumunda (113) amino aside yönelik kodonda nükleik asit mutasyonunun, izolösinden metiyonine bir kodon degisimiyle sonuçland[g]l:lIstem 1*e göre modifiye edilmis SarEH-Iumma virüs susu. . SEKANS KIMLIK NUMARASI: 12'nin bir nükleik asidini ve/veya SEKANS KIMLIK NUMARASI: 8'in bir amino asit sekansllleren, Istem 2'ye göre modifiye edilmis SarEIi-Iumma virüsü. . SarEElumma virüs susu YF 17D'nin nükleik asit sekans- göre Üç nükleik asit mutasyonuna sahip olan bir nükleik asit içeren, söz konusu üç nükleik asit mutasyonunun, SEKANS KIMLIK NUMARASI: 11'e göre bir yapgal olmayan protein 1 kodlayan nükleik asit sekansIa bir mutasyon, yaplgl olmayan protein 2A kodlayan nükleik asit sekansIa bir mutasyon ve zarf protein kodlayan nükleik asit sekanslîida bir mutasyon oldugu, yapElal olmayan protein 1 kodlayan nükleik asit sekansia mutasyonun, yapßal olmayan protein 1'in konumunda (317) treonine karslElKl gelen kodonda bir mutasyon içerdigi ve bir yaplglal olmayan protein 2A kodlayan nükleik asit sekansIda mutasyonun, yaplglal olmayan protein 2A'nlEl konumunda (170) fenilalanine kars[[[El gelen kodonda bir mutasyon içerdigi ve zarf protein kodlayan nükleik asit sekanleda mutasyonun, zarf proteinin konumunda (160) lisine karsiIJKJgelen kodonda bir mutasyon içerdigi, söz konusu modifiye edilmis SarEElumma virüs susunun, adapte edilmemis SarEIl-Iumma virüsü YF 17D'ye göre bir hücre kültürünün iyilestirilmis ortamIda daha yüksek bir verime ve hücrelerde artEllBISlçogaltIia sahip oldugu, modifiye edilmis SarEIHumma virüs susu YF 17D. . YapEal olmayan protein 1'in konumunda (317) amino aside yönelik kodonda mutasyonun, treoninden izolösine bir kodon degisimiyle sonuçlandlgiülre yaplîal olmayan protein 2A'nI konumunda (170) amino aside yönelik kodonda mutasyonun, fenilalaninden lösine bir kodon degisimiyle sonuçlandlgiljl/e zarf proteinin konumunda (160) amino asidine yönelik kodonda mutasyonun, lisinden arjinine bir kodon degisimiyle sonuçland [glÇlIstem 4'e göre modifiye edilmis bir SarEIHumma virüsü. . Zarf proteini kodlayan nükleik asit sekansEtla mutasyonun, 10 Angstrom veya amino asit 160'dan yirmi amino asitte ayrlEla mutasyona ugramlglkodon içerdigi ve bu konumda orijinal amino asidin yan zincirinin pKa degerinden daha yüksek olan bu konumda mutasyona ugramlgl amino asidin yan zincirinin bir pKa degeriyle sonuçland[g]l:l/eya zarf proteinin kodlayan nükleik asit sekansIlEl, zarf proteinine ait Domen 1 veya II arasEUa moleküler mentese bölgesinde ayrEa mutasyona ugramlglkodon içerdigi ve bu konumdaki orijinal amino asidin yan zincirinin pKa degerinden daha yüksek olan bu konumda mutasyona ugramlgl amino asidin yan zincirinin pKa degeriyle sonuçlandlgiüîstem 4'e göre modifiye edilmis SarEH-lumma virüsü. . SEKANS KIMLIK NUMARASI: 11'in bir nükleik asidini ve/veya SEKANS KIMLIK NUMARASI: 7'nin bir amino asit sekansIIIÇeren, Istem 5'e göre modifiye edilmis SarEIi-lumma virüsü.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/US2010/043010 WO2011014416A2 (en) | 2009-07-31 | 2010-07-23 | High yield yellow fever virus strain with increased propagation in cells |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| TR201815652T4 true TR201815652T4 (tr) | 2018-11-21 |
Family
ID=45497513
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| TR2018/15652T TR201815652T4 (tr) | 2010-07-23 | 2011-01-25 | Hücrelerde artırılmış çoğaltımla yüksek verilmli sarı humma virüsü suşu. |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP2596098B1 (tr) |
| AR (1) | AR079970A1 (tr) |
| BR (1) | BR112012001553B1 (tr) |
| CA (1) | CA2768866C (tr) |
| TR (1) | TR201815652T4 (tr) |
| WO (1) | WO2012011969A1 (tr) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014031480A1 (en) * | 2012-08-24 | 2014-02-27 | Xcellerex, Inc. | Virus purification and formulation process |
| EP3549603A1 (en) * | 2018-04-06 | 2019-10-09 | Sanofi Pasteur | Live-attenuated yellow fever virus strain adapted to grow on vero cells and vaccine composition comprising the same |
| DE102022114042A1 (de) | 2022-06-02 | 2023-12-07 | Gehring Technologies Gmbh + Co. Kg | Vorrichtung und Verfahren zum Ausrichten und/oder Maskieren von Steckspulen |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7227011B2 (en) * | 1998-06-04 | 2007-06-05 | United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention | Nucleic acid vaccines for prevention of flavivirus infection |
| WO2003101397A2 (en) * | 2002-05-31 | 2003-12-11 | Acambis, Inc. | Tetravalent dengue vaccines |
| EP1546176A4 (en) * | 2002-07-19 | 2006-01-11 | Univ Texas | METHODS AND COMPOSITIONS ASSOCIATED WITH ALTERED YELLOW FEVER VIRUS STEM |
| JP2008500984A (ja) * | 2004-05-28 | 2008-01-17 | グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム | ヴィロソームとサポニンアジュバントを含むワクチン組成物 |
| CA3150404A1 (en) * | 2009-07-31 | 2011-02-03 | Pnuvax Inc. | High yield yellow fever virus strain with increased propagation in cells |
-
2011
- 2011-01-24 AR ARP110100224A patent/AR079970A1/es active IP Right Grant
- 2011-01-25 TR TR2018/15652T patent/TR201815652T4/tr unknown
- 2011-01-25 CA CA2768866A patent/CA2768866C/en active Active
- 2011-01-25 WO PCT/US2011/022347 patent/WO2012011969A1/en active Application Filing
- 2011-01-25 BR BR112012001553-2A patent/BR112012001553B1/pt active IP Right Grant
- 2011-01-25 EP EP11809985.2A patent/EP2596098B1/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BR112012001553B1 (pt) | 2021-12-07 |
| BR112012001553A2 (pt) | 2020-07-21 |
| CA2768866C (en) | 2018-07-24 |
| EP2596098A1 (en) | 2013-05-29 |
| WO2012011969A1 (en) | 2012-01-26 |
| EP2596098A4 (en) | 2014-01-22 |
| CA2768866A1 (en) | 2012-01-26 |
| AR079970A1 (es) | 2012-02-29 |
| EP2596098B1 (en) | 2018-09-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9655960B2 (en) | High yield yellow fever virus strain with increased propagation in cells | |
| CN111437384A (zh) | 用于预防covid-19的蝙蝠源性冠状病毒疫苗 | |
| US20120294889A1 (en) | Chimeric Flavivirus Vaccines | |
| CN108210921A (zh) | 一种寨卡病毒疫苗及其制备方法 | |
| Pletnev et al. | Chimeric Langat/Dengue viruses protect mice from heterologous challenge with the highly virulent strains of tick-borne encephalitis virus | |
| CN111556896A (zh) | 交叉免疫抗原疫苗及其制备方法 | |
| TR201815652T4 (tr) | Hücrelerde artırılmış çoğaltımla yüksek verilmli sarı humma virüsü suşu. | |
| CN102337248B (zh) | 表达乙型脑炎病毒PrM/M-E蛋白的重组BHK细胞系及其应用 | |
| KR20120027381A (ko) | 일본뇌염 백신 및 그것의 제조 방법 | |
| WO2005014803A1 (ja) | 西ナイルウイルスワクチン | |
| RU2288266C2 (ru) | ИНФЕКЦИОННЫЕ КЛОНЫ ПОЛНОМЕРНОЙ кДНК КЛЕЩЕВОГО ФЛАВИВИРУСА | |
| KR20210082306A (ko) | 지카바이러스 재조합 서브유닛 백신의 개발 및 이의 제조방법 | |
| To | Insect Cell-Expressed Recombinant Viral Glycoproteins Are Effective Immunogens | |
| AU2016360487C1 (en) | Live virus having a bank of dengue virus attenuated strains, and a dengue vaccine containing same as antigens | |
| Venugopal et al. | Heterologous resistance to superinfection by louping ill virus persistently infected cell cultures | |
| NZ742683B2 (en) | Live virus having a bank of dengue virus attenuated strains, and a dengue vaccine containing same as antigens | |
| AU2012216852A1 (en) | Vaccination against dengue virus infection | |
| MX2008001978A (en) | Vaccination against dengue virus infection |