BR112012001553B1

BR112012001553B1 - Cepa do vírus da febre amarela yf 17d modificado, e, vírus da febre amarela modificado

Info

Publication number: BR112012001553B1
Application number: BR112012001553-2A
Authority: BR
Inventors: Cynthia K. Lee; Thomas P. Monath; Patrick M. Guertin; Edward G. Hayman
Original assignee: Pnuvax Inc
Priority date: 2010-01-23
Filing date: 2011-01-25
Publication date: 2021-12-07
Also published as: BR112012001553A2; TR201815652T4; CA2768866C; EP2596098A1; WO2012011969A1; EP2596098A4; CA2768866A1; AR079970A1; EP2596098B1

Abstract

vírus da febre amarela modificado, vírus da febre amarela inativado, vacina, uso do vírus da febre amarela modificado, molécula de ácido nucleico, e, métodos para intensificar a produtividade do vírus da febre amarela em células, e para fabricar uma vacina. a presente invenção fornece uma vacina inativa não-replicante que compreende vírion integral, vírus da febre amar ela quimicamente inativado que é inativado usando um método que assegura preservação de epítopos neutralizadores críticos. o vírus da febre amarela foi adaptado para propagar em células até rendimentos mais altos do que o vírus inadaptado. a invenção fornece também métodos para prevenir infecção viral de febre amarela.

Description

PEDIDO DE PATENTE RELACIONADO

[001] Este pedido de patente reivindica o benefício do pedido de patente internacional co-pendente PCT n° US 10/43010, depositado em 23 de julho de 2010. O teor inteiro do pedido de patente acima é aqui incorporado como referência.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] O vírus da febre amarela é endêmico, isto é, está continuamente presente com baixos níveis de infecção em algumas áreas tropicais da África e das Américas, onde ele expande em uma epidemia. Outras partes do mundo, incluindo regiões costeiras da América do Sul, as ilhas caribenhas, e América Central e do Norte, estão infestadas com o mosquito vetor capaz de transmitir o vírus, e são, portanto, consideradas regiões em risco para epidemia de febre amarela (Organização Mundial da Saúde, Folha Informativa Factual N° 100, revisada em dezembro de 2001).

[003] Por exemplo, apenas na África, trinta e três países com uma população combinada de 508 milhões de pessoas, estão em risco (Id.). A cada ano, a Organização Mundial da Saúde (OMS) estima que há 200.000 casos de febre amarela, com 30.000 mortes (Id.). Acredita-se que as viagens para estas regiões tropicais também resultam em um pequeno número de casos importados em países geralmente livres da febre amarela. Embora menos casos de febre amarela tenham sido relatados na Ásia, "esta região está em risco porque os primatas e mosquitos apropriados estão presentes" (Id.).

[004] O vírus da febre amarela é do gênero Flavivirus, na família Flaviviridae. Na assim denominada "mata" ou "ciclo silvestre", o vírus da febre amarela é enzoótico, mantido e transmitido por mosquitos, que se reproduzem nas copas de árvores, para macacos nas florestas tropicais. O "ciclo urbano" começa quando os seres humanos se tornam infectados por entrar nas florestas tropicais e são picados por mosquitos infectados com a febre amarela. O "ciclo urbano" continua com transmissão peridoméstica de seres humanos para mosquitos e daí para outros seres humanos, e pode resultar em epidemia de febre amarela em povoados e cidades. A enfermidade varia de gravidade desde uma enfermidade febril autolimitada até hepatite grave e doença hemorrágica fatal.

[005] Os seres humanos não vacinados, incluindo pessoas nativas e viajantes para áreas endêmicas de febre amarela estão em risco significativo de infecção de febre amarela quando as atividades ocupacionais e outras atividades os colocam em contato com mosquitos infectados no ciclo silvestre ou no ciclo urbano.

[006] Os pacientes com febre amarela podem ser virêmicos, isto é, têm vírus no seu sangue, por 3 a 6 dias durante a fase inicial da enfermidade. Esta fase pode ser seguida de um curto período de remissão dos sintomas.

[007] A fase tóxica se desenvolve à medida que a febre retorna, com sintomas clínicos, incluindo, por exemplo, febre alta e náusea, sintomas hemorrágicos, incluindo hematêmese (vômito negro), epistaxe (sangramento nasal), sangramento gengival, e hemorragias petequiais e purpúricas (contusões). Icterícia agravante e proteinúria ocorrem frequentemente em casos graves.

[008] Nos estágios avançados da doença, os pacientes podem desenvolver hipotensão, choque, acidose metabólica, necrose tubular aguda, disfunção do miocárdio, e arritmia cardíaca. Confusão, convulsões, e coma também podem ocorrer, bem como complicações tais como infecções bacterianas secundárias e insuficiência renal.

[009] Não há qualquer tratamento específico para febre amarela. As etapas para prevenir febre amarela incluem o uso de repelente de insetos, vestimentas protetoras, e vacinação com a vacina atenuada disponível, porém arriscada.

[0010] As vacinas vivas atenuadas produzidas a partir da cepa 17D estão disponíveis, mas os efeitos adversos associados à vacina atenuada podem levar a uma infecção severa com o vírus vivo 17D, e episódios adversos neurotrópicos e viscerotrópicos, sendo que estes últimos se assemelham a uma infecção grave pelo vírus da febre amarela do tipo selvagem. Assim sendo, há uma necessidade de se obter uma vacina mais segura, inativada e não-replicante, que eliciará uma resposta de anticorpos neutralizadores, e ao mesmo tempo, eliminando os episódios adversos neurotrópicos e viscerotrópicos, potenciais.

[0011] Assim sendo, existe uma necessidade contínua para se obter uma vacina eficaz, inativada, "morta" ou não-replicante, para evitar o surgimento potencial de episódios adversos neurotrópicos e viscerotrópicos, associados à vacina atenuada de febre amarela 17D atualmente disponível.

[0012] Além disso, há uma necessidade de se obter uma vacina aperfeiçoada produzida em células Vero sem proteínas derivadas de animais, uma vacina que pode ser usada de forma segura para pessoas para as quais a vacina viva é contraindicada, ou para as quais advertências aparecem no rótulo. Tais indivíduos incluem pessoas com imunossupressão, pessoas com doença tímica, recém-nascidos de pouca idade, e idosos.

[0013] Um problema com qualquer vírus inativado potencial é que ele pode precisar ser administrado em um título mais alto do que as vacinas atenuadas vivas existentes porque estas últimas podem expandir massa antigênica durante os ciclos de replicação no hospedeiro, enquanto que uma vacina inativada contém uma dose fixa de antígeno. Portanto, para desenvolver uma vacina inativada suficientemente potente, é desejável modificar o vírus da febre amarela para produzir um alto rendimento do vírus no meio condicionado (denominado também fluido sobrenadante) de uma cultura de células. É altamente desejável usar a cepa da vacina 17D atenuada para a fabricação de vacinas, pois a cepa 17D pode ser manipulada em um nível mais baixo de biocontenção do que do que o vírus da febre amarela virulento do tipo selvagem. Entretanto, os rendimentos da cepa da vacina 17D atenuada na cultura de células são inerentemente mais baixos do que os rendimentos do vírus do tipo selvagem. Por estas razões, modificações da cepa da vacina 17D para atingir rendimentos mais altos na cultura de células usada para a produção da vacina seriam úteis.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0014] A invenção fornece uma vacina que compreende uma cepa ou cepas do vírus da febre amarela, que foram adaptadas para propagar em células Vero até rendimentos mais altos do que um vírus não adaptado. O termo "vírus não adaptado" significa a vacina do vírus da febre amarela conhecida como 17D. A análise de sequências de exemplos dessas cepas demonstra que um vírus adaptado que possui uma mutação na proteína do envelope (E) que resulta em uma substituição de lisina para arginina no resíduo de aminoácido 160 tem melhores propriedades, descritas no pedido de patente PCT n° US 10/43010.

[0015] Exemplos adicionais de cepas do vírus da febre amarela atenuadas, que se propagam em células Vero até rendimentos mais altos do vírus não adaptadas foram identificadas. Elas incluem cepas do vírus da febre amarela modificadas, onde as moléculas de ácidos nucleicos das ditas cepas do vírus da febre amarela compreendem pelo menos uma mutação de aminoácido selecionada entre: uma mutação de aminoácido na proteína NS1, uma mutação de aminoácido na proteína NS2A, e uma mutação de aminoácido na proteína NS4B, opcionalmente onde a dita pelo menos uma mutação de aminoácido é em combinação adicional com uma mutação de aminoácido na proteína do envelope. As modalidades preferidas incluem (1) uma cepa que tem três mutações: (a) uma substituição de lisina para arginina no resíduo de aminoácido 160(lys160arg) na proteína E, (b) uma substituição de isoleucina no resíduo de aminoácido 317 (thr317ile) na proteína não- estrutural 1 (NS1), e (c) uma substituição de fenilalanina para leucina no resíduo de aminoácido 170 (phe170leu) na proteína não-estrutural 2A (NS2A); e (2) uma cepa com uma mutação na proteína não-estrutural 4B (NS4B), resultando em uma substituição de isoleucina para metionina no resíduo de aminoácido 113 (ile113met).

[0016] A invenção fornece vacinas que compreendem um vírus da febre amarela que contém uma ou mais mutações selecionadas entre: uma mutação na proteína NS1 opcionalmente combinada com uma mutação na proteína E; uma mutação na proteína NS2A opcionalmente combinada com uma mutação na proteína E; e uma mutação na proteína NS4B opcionalmente em combinação com uma mutação na proteína E, que resultam em maior propagação em células Vero e rendimentos mais altos do que os vírus não adaptados.

[0017] O vírus da febre amarela é a espécie protótipo no gênero Flavivirus, na família Flaviviridae. Estudos estruturais e funcionais da proteína E de vírus da encefalite veiculada por carrapato (TBE), um membro virulento de crescimento rápido do gênero Flavivirus, indicam que os Domínios I e II na proteína E da TBE participam em uma mudança de conformação dependente de pH ácido, que facilita a fusão da membrana de Flavivirus com o hospedeiro e subsequente infecciosidade. A junção dos Domínios I e II funciona como uma "articulação molecular" que resulta em um rearranjo importante destes domínios a partir da estrutura dimérica normal da proteína E em pH ácido para um estado homotrimérico (Rey, F.A. et al., "The envelope glycoprotein from tick-borne encephalitis virus at 2 Â resolution", Nature 375:291-298 (1995); Heinz, F.X. et al., "Structural changes and functional control of the tick-borne encephalitis virus glycoprotein E by the heterodimeric association with protein prM", Virology 198:109-117 (1994); Mandl, C.W. et al., "Antigenic structure of the flavivirus proteína do envelope E at the molecular level, using tick-borne encephalitis virus as a model", Journal of Virology 63(2):564-571 (1989); Harrison, S.C, "Viral membrane fusion", Nature structural and molecular biology 15(7):690-698 (2008); Stiasny, K. et al., "Molecular mechanisms of flavivirus membrane fusion", Aminoácidos DOI 10.1007/s00726-009-0370- 4, publicado on line em 1 de novembro de 2009.

[0018] Lys 160 na proteína E do vírus da febre amarela fica localizada na região da articulação molecular entre os Domínios I e II. As mutações nesta região poderiam alterar a mudança da conformação dependente de ácido na região do Domínio I da proteína E necessária para a fusão e internalização do vírus no citoplasma celular. Sem desejar se atar à teoria, os rendimentos mais altos observados com a mudança de lisina para arginina no aminoácido 160 no Domínio I da proteína E da cepa do vírus da febre amarela adaptada pode se dever a uma maior afinidade por prótons que a arginina proporciona em comparação com lisina, que resulta em fusão intensificada da membrana com o hospedeiro e infecciosidade mais eficiente. Quanto à invenção, é importante assinalar que as cadeias laterais de lisina e arginina têm valores de pKa de 10,53 e 12,48, respectivamente, indicando uma afinidade cem vezes maior por prótons em arginina do que em lisina. A maior afinidade por prótons do que a cadeia lateral de arginina indica em relação à cadeia lateral de lisina pode a velocidade e a eficiência da mudança de conformação da proteína E na articulação molecular, fusão da membrana, e infecciosidade de Flavivirus, resultando em rendimentos mais altos de vírus na cepa do vírus adaptada.

[0019] Outros membros dentro do gênero Flavivirus incluem os vírus do Nilo Ocidental, dengue, e da encefalite japonesa. As proteínas não- estruturais encontradas no Vírus do Nilo Ocidental estão reconhecidamente envolvidas direta ou indiretamente na síntese do RNA viral. As substituições de aminoácidos nas proteínas não-estruturais destes vírus demonstraram afetar os rendimentos de vírus mutantes desenvolvidos em células Vero. Por exemplo, uma substituição de prolina para leucina no aminoácido 250 na proteína NS1 do flavivírus Kunjin, um subtipo do vírus do Nilo Ocidental, cresce em títulos 100 vezes mais baixos do que o vírus do tipo selvagem. Similarmente, a mutação dos sítios do terminal C na proteína NS2A do vírus da febre amarela demonstrou ser letal para a replicação do vírus (Brinton, M.A., "The molecular biology of west nile virus: a new invader of the western hemisphere", Annual Review of Microbiology 56:371-402 (2002).

[0020] Em um primeiro aspecto, a invenção fornece uma cepa do vírus da febre amarela modificada que resulta em maior propagação em células Vero e um rendimento mais alto no meio condicionado de uma cultura de células em relação ao vírus não-adaptado, que compreende pelo menos uma mutação em relação ao vírus não-adaptado, selecionada entre: uma mutação na proteína NS1, uma mutação na proteína NS2A, e uma mutação na proteína NS4B, opcionalmente onde a dita pelo menos uma mutação é ainda em combinação com uma mutação na proteína E.

[0021] A substituição de aminoácidos básicos que estão localizados dentro de 20 aminoácidos, ou dentro de 10 angstrons, de lisina 160 na proteína E do vírus da febre amarela (incluindo a lisina 160 em si), por aminoácidos que têm valores mais altos de pKa da cadeia lateral do que os aminoácidos básicos substituídos, em combinação com pelo menos uma mutação selecionada entre uma mutação na proteína NS1, uma mutação na proteína NS2A, e uma mutação na proteína NS4B, pode resultar em cepas do vírus da febre amarela, que produzem rendimentos mais altos do vírus do que um vírus da febre amarela não adaptado. As modalidades preferidas que compreendem mutações na proteína E incluem vírus que compreendem uma proteína E modificada com uma pKa aumentada dentro de 20 aminoácidos, ou dentro de 10 angstrons, da lisina 160 na proteína E.

[0022] Em um terceiro aspecto, a invenção fornece uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência que codifica pelo menos um ácido nucleico modificado em relação ao ácido nucleico do vírus não- adaptado, onde o dito pelo menos um ácido nucleico modificado é selecionado entre: um ácido nucleico modificado da proteína NS1, um ácido nucleico modificado da proteína NS2A em um ácido nucleico modificado da proteína NSB4, opcionalmente onde o dito pelo menos um ácido nucleico modificado é em combinação adicional com um ácido nucleico modificado da proteína do envelope do vírus da febre amarela, onde o dito ácido nucleico modificado opcional da proteína do envelope compreende uma mutação de nucleotídeo no códon para o aminoácido na posição 160 da proteína do envelope. Em uma modalidade deste aspecto, a mutação de nucleotídeo no códon para o aminoácido na posição 160 da proteína do envelope resulta em uma mudança de AAG para AGG, AGA, CGC, CGA, CGG ou CGU. Adicionalmente, a invenção fornece vetores, construções, cepas do vírus da febre amarela modificado, e células que compreendem ou contêm essa molécula de ácido nucleico ou uma proteína codificada por meio disso.

[0023] Em um quarto aspecto, a invenção fornece uma cepa do vírus da febre amarela modificado, onde a molécula de ácido nucleico da dita cepa compreende uma sequência que codifica uma proteína do envelope do vírus da febre amarela, onde a dita proteína do envelope opcionalmente compreende uma mutação de mutação de aminoácido na posição 160 da proteína do envelope.

[0024] Em um quinto aspecto, a invenção fornece opcionalmente uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência que codifica uma proteína do envelope do vírus da febre amarela, onde a dita proteína do envelope compreende uma mutação de aminoácido na posição 160 da proteína do envelope. Adicionalmente, a invenção fornece vetores, construções, cepas do vírus da febre amarela modificado, e células que compreendem ou contêm essa molécula de ácido nucleico opcional ou uma proteína codificada por meio disso. As moléculas de ácidos nucleicos compreendem, de preferência, uma sequência que codifica uma proteína do envelope modificada do vírus da febre amarela, onde a dita molécula de ácido nucleico codifica a sequência de proteína em SEQ ID NO. 4, 6, ou 7.

[0025] Em um sexto aspecto, a invenção fornece um método para intensificar a propagação do vírus da febre amarela em células. Em uma modalidade deste aspecto, o método compreende opcionalmente mutar uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência que codifica a proteína do envelope do vírus da febre amarela, onde a mutação compreende uma mutação de nucleotídeo no códon para o aminoácido na posição 160 da proteína do envelope. Em outra modalidade, o método opcionalmente compreende mutar uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência que codifica a proteína do envelope do vírus da febre amarela, onde a dita mutação compreende uma mutação de aminoácido na posição 160 da proteína do envelope. O termo "mutar" significa selecionar uma mutação, ou introduzir uma mutação. Os vírus mutantes relevantes podem ser obtidos por um método de seleção e pressão evolucionária durante passagens em uma linhagem de células hospedeiras apropriadas (tais como células Vero) ou por mutagênese direcionada para sítios, usando tecnologia bem conhecida de clones infecciosos nessas técnicas. Entretanto, este último método é preferido porque ele identifica vírus mutados em virtude das características fenotípicas desejadas (rendimentos maiores em culturas de células Vero).

[0026] Em um sétimo aspecto, a invenção fornece uma cepa do vírus da febre amarela modificado, onde a molécula de ácido nucleico da dita cepa compreende opcionalmente uma mutação de nucleotídeo no códon para os aminoácidos que flanqueiam o códon E160 selecionado entre a posição 134, 137, 144, 148, 157, 160, 175, ou 177 da proteína do envelope do vírus da febre amarela. Em uma modalidade deste aspecto, o códon mutado dentro de 20 aminoácidos que flanqueiam a mutação E160 resulta em uma mutação de aminoácido na proteína do envelope naquela posição, onde o valor de pKa da cadeia lateral do aminoácido mutado é mais alto do que o valor da pKa da cadeia lateral do aminoácido origina naquela posição.

[0027] Em um oitavo aspecto, a invenção fornece vírus da febre amarela, e vacinas que os contêm, compreendendo uma molécula de ácido nucleico modificada que codifica uma proteína NS1, sendo o vírus capaz de propagar em células Vero até rendimentos mais altos do que o vírus não- adaptado. As modalidades preferidas incluem vírus que compreendem uma proteína NS1 modificada e uma proteína E modificada. Uma modalidade mais preferida inclui vírus que compreendem uma proteína NS1 modificada e uma proteína E modificada com uma pKa aumentada dentro de 20 aminoácidos, ou dentro de 10 angstrons, de lisina 160 na proteína E.

[0028] Em um nono aspecto, a invenção fornece vírus da febre amarela, e vacinas que os contêm, compreendendo uma molécula de ácido nucleico modificada que codifica uma proteína NS2A, sendo o vírus capaz de propagar em células Vero até rendimentos mais altos do que o vírus não- adaptado. As modalidades preferidas incluem vírus que compreendem uma proteína NS2A modificada e uma proteína E modificada. Uma modalidade mais preferida inclui vírus que compreendem uma proteína NS2A modificada e uma proteína E modificada com uma pKa aumentada dentro de 20 aminoácidos, ou dentro de 10 angstrons, da lisina 160 na proteína E.

[0029] Em um décimo aspecto, a invenção fornece vírus da febre amarela, e vacinas que os contêm, compreendendo uma molécula de ácido nucleico modificada que codifica uma proteína NS1 e uma proteína NS2A, sendo o vírus capaz de propagar em células Vero até rendimentos mais altos do que o vírus não-adaptado. As modalidades preferidas incluem vírus que compreendem uma proteína NS1 modificada, uma proteína NS2 modificada, e uma proteína E modificada. Uma modalidade mais preferida inclui vírus que compreendem uma proteína NS1 modificada, uma proteína NS2 modificada, e uma proteína E modificada com uma pKa aumentada dentro de 20 aminoácidos, ou dentro de 10 angstrons, da lisina 160 na proteína E.

[0030] Em um décimo primeiro aspecto, a invenção fornece vírus da febre amarela, e vacinas que os contêm, compreendendo uma molécula de ácido nucleico modificada que codifica uma proteína NS4B, sendo o vírus capaz de propagar em células Vero até rendimentos mais altos do que o vírus não-adaptado.

[0031] Em um décimo segundo aspecto, a invenção fornece uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência que codifica uma proteína 1 não estrutural modificada do vírus da febre amarela, onde a dita molécula de ácido nucleico compreende uma mutação nucleotídeo no códon para o aminoácido na posição 317 da proteína 1 não-estrutural. Em uma modalidade deste aspecto, a mutação de nucleotídeo no códon para o aminoácido na posição 317 da proteína 1 não-estrutural resulta em uma mudança de ACA para AUA. Adicionalmente, a invenção fornece vetores, construções, cepas de vírus da febre amarela modificados, e células que compreendem ou contêm essa molécula de ácido nucleico ou uma proteína codificada por meio disso.

[0032] Em um décimo terceiro aspecto, a invenção fornece uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência que codifica uma proteína 2A não-estrutural modificada do vírus da febre amarela, onde a dita molécula de ácido nucleico compreende uma mutação de nucleotídeo no códon para o aminoácido na posição 170 da proteína 2A não-estrutural. Em uma modalidade deste aspecto, a mutação de nucleotídeo no códon para o aminoácido na posição 170 da proteína 2A não-estrutural resulta em uma mudança de UUU para CUU. Adicionalmente, a invenção fornece vetores, construções, cepas de vírus da febre amarela modificados, e células que compreendem ou contêm essa molécula de ácido nucleico ou uma proteína codificada por meio disso.

[0033] Em um décimo quarto aspecto, a invenção fornece uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência que codifica uma proteína 4B não-estrutural modificada do vírus da febre amarela, onde a dita molécula de ácido nucleico compreende uma mutação de nucleotídeo no códon para o aminoácido na posição 113 da proteína 4B não-estrutural. Em uma modalidade deste aspecto, a mutação de nucleotídeo no códon para o aminoácido na posição 113 da proteína 4B não-estrutural 4B resulta em uma mudança de AUA para AUG. Adicionalmente, a invenção fornece vetores, construções, cepas de vírus da febre amarela modificados, e células que compreendem ou contêm essa molécula de ácido nucleico ou uma proteína codificada por meio disso.

[0034] Em um décimo quinto aspecto, a invenção fornece uma cepa de vírus da febre amarela modificado, onde a molécula de ácido nucleico da dita cepa compreende uma sequência que codifica proteínas do vírus da febre amarela, onde as ditas proteínas compreendem uma mutação de aminoácido na posição 160 da proteína do envelope, na posição 317 da proteína NS1, na posição 170 da proteína NS2A, ou na posição 113 da proteína NS4B.

[0035] Em um décimo sexto aspecto, a invenção fornece uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência que codifica uma proteína do envelope, uma proteína não-estrutural NS1, uma proteína não- estrutural NS2A, ou uma proteína não-estrutural NS4B do vírus da febre amarela, onde as ditas proteínas compreendem uma mutação de aminoácido na posição 160 da proteína do envelope, na posição 317 da proteína NS1, na posição 170 da proteína NS2A, ou na posição 113 da proteína NS4B.

[0036] Adicionalmente, a invenção fornece vetores, construções, cepas do vírus de febre amarela modificado, e células que compreendem ou contêm essa molécula de ácido nucleico ou proteínas codificadas por meio disso. A molécula de ácido nucleicos compreende, de preferência, uma sequência que codifica uma proteína modificada do vírus da febre amarela, onde a dita molécula de ácido nucleico codifica a sequência de proteína em SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8.

[0037] Em um décimo sétimo aspecto, a invenção fornece um método para intensificar a propagação do vírus da febre amarela em células. Em uma modalidade deste aspecto, o método compreende mutar uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência que codifica a proteína do envelope, a proteína não-estrutural NS1, a proteína não-estrutural NS2A, ou a proteína não-estrutural NS4B do vírus da febre amarela, onde as ditas mutações compreendem um mutação de aminoácido na posição 160 da proteína do envelope, na posição 317 da proteína NS1, na posição 170 da proteína NS2A, ou na posição 113 da proteína NS4B. O termo "mutar" significa selecionar uma mutação, ou introduzir uma mutação.

[0038] Em um décimo oitavo aspecto, a invenção fornece uma cepa do vírus da febre amarela, onde a molécula de ácido nucleico da dita cepa compreende uma mutação de nucleotídeo no códon para os aminoácidos 317 da proteína NS1, 170 da proteína NS2A, ou 113 da proteína NS4B, e onde a molécula de ácido nucleico compreende também uma mutação de nucleotídeo no códon para os aminoácidos que flanqueiam o códon E160 selecionado entre a posição 134, 137, 144, 148, 157, 160, 175, ou 177 da proteína do envelope do vírus da febre amarela. Em uma modalidade deste aspecto, o códon mutado dentro de 20 aminoácidos que flanqueiam a mutação E160 resulta em uma mutação de aminoácido na proteína do envelope naquela posição, onde o valor de pKa da cadeia lateral do aminoácido mutado é mais alto do que o valor da pKa da cadeia lateral do aminoácido original naquela posição.

[0039] A invenção fornece também métodos para fabricar e usar as moléculas de ácidos nucleicos, as proteínas E modificadas, as proteínas NS1 modificadas, proteínas NS2A modificadas, proteínas NS4B modificadas, vetores de vírus da febre amarela modificados, construções e células que contêm que contêm as mesmas.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0040] A figura 1 é uma representação esquemática do histórico de passagens de células Vero durante a fabricação da vacina de febre amarela descrita.

[0041] A figura 2 é uma representação esquemática da preparação de sementes de vírus.

[0042] A figura 3A é um esquema do processo usado para 10 passagens seriais (P1 até P10) para modificar a sequência de nucleotídeos do genoma viral para desenvolver um vírus-semente com crescimento intensificado em células Vero para a preparação de um candidato a vírus inativado de febre amarela.

[0043] A figura 3B é uma representação gráfica da replicação viral para a passagem 1 (um) (P1) e passagem 11 (P11) do experimento inicial, no qual o vírus de P11 difere do P1 por uma única mutação em E160 (lys^arg).

[0044] A figura 3C é uma representação gráfica de um estudo de passagens repetidas do vírus da passagem 1 (um) (Bp1, Cp1) e passagem 11 (B-p11, C-p11) realizadas em uma série de experimentos: Séries B e C.

[0045] A figura 4A-L representa o alinhamento de consenso das sequências de ácidos nucleicos de P1 e P11. A sequência de ácidos nucleicos de partida, P1, é aqui identificada como SEQ ID NO: 1. Uma comparação da passagem P1 e da passagem P11 revelou uma mutação genética no resíduo de nucleotídeo n° 211 de SEQ ID NO: 1, e uma segunda mutação no resíduo de nucleotídeo n° 1452 de SEQ ID NO: 1. Assim sendo, "consenso de P1" corresponde a SEQ ID NO.1; "consenso de P11" corresponde a SEQ ID NO: 2, tendo a mutação de códon na posição 160 de aminoácido da proteína do envelope.

[0046] A figura 5A-J representa a sequência de aminoácidos de P1 e P11, com as sequências de aminoácidos da Série B-P1 e Série B3-P11 do estudo de passagens repetidas. A sequência de aminoácidos para P1 é aqui identificada como SEQ ID NO: 3. Uma comparação da sequência de aminoácidos para P1 com aquela de P11 (SEQ ID NO. 4) revelou uma mutação no resíduo de aminoácido 160 da proteína do envelope (E160) (aminoácido 445 da sequência de aminoácidos de P1 na figura 5B). A Série B-P1 e a Série B3-P11 apresentam sequências de aminoácidos parciais do estudo de passagens repetidas. A sequência de aminoácidos para B-P1 é aqui identificada como SEQ ID NO: 5. Uma comparação da sequência de aminoácidos para B-P1 com aquela de B3-P11 (SEQ ID NO. 6) revelou uma mutação no resíduo de aminoácido 160 da proteína do envelope (E160) em B3-P11 (aminoácido 445 da sequência de aminoácidos de P1).

[0047] A figura 6 representa os títulos comparativos do teste de neutralização da redução de 50% de placas (PRNT50) entre grupos de tratamento de camundongos das cepas BALB/c e CD-1 em um estudo preliminar em camundongos (M-9003-002) da eficácia da vacina de febre amarela inativada.

[0048] A figura 7 é uma representação gráfica de títulos de anticorpo PRNT50 para o estudo preliminar em camundongos (M-9003-002). A figura 8A-EE representa o alinhamento de consenso das sequências de aminoácidos de P1, B-P1, C-P1, B3-P11 e C1-P11. A sequência de ácidos nucleicos, P1, é aqui identificada como SEQ ID NO: 15. A sequência de ácidos nucleicos, B-P1, é aqui identificada como SEQ ID NO: 9. A sequência de ácidos nucleicos, B3-P11, é aqui identificada como SEQ ID NO: 11. A sequência de ácidos nucleicos, C-P1, é aqui identificada como SEQ ID NO: 10. A sequência de ácidos nucleicos, C1-P11, é aqui identificada como SEQ ID NO: 12. Uma comparação da passagem B-P1 e a passagem B3P11 revelou uma mutação genética em B3-P11 no resíduo de nucleotídeo n° 1452 de SEQ ID NO: 15, uma segunda mutação em B3-P11 no resíduo de nucleotídeo n° 3402 de SEQ ID NO: 15, e uma terceira mutação em B3-P11 no resíduo de nucleotídeo n° 4016 de SEQ ID NO: 15. Uma comparação da passagem C-P1 com a passagem C1-P11 revelou uma mutação genética em C1-P11 no resíduo de nucleotídeo n ° 7225 de SEQ ID NO: 15. SEQ ID NO: 11 corresponde a B3-P11, e tem as mutações do códon na posição de aminoácido 160 da proteína do envelope, na posição do aminoácido 317 da proteína não-estrutural 1, e na posição de aminoácido 170 da proteína não-estrutural 2A. SEQ ID NO: 12 corresponde a C1-P11, e tem a mutação do códon na posição de aminoácido 113 da proteína não- estrutural 4B.

[0049] A figura 9A-F representa a sequência de aminoácidos de B- P1 e B3-P11 do estudo de passagens repetidas. A sequência de aminoácidos para B-P1 é aqui identificada como SEQ ID NO: 13. Uma comparação da sequência de aminoácidos para B-P1 e aquela de B3-P11 (SEQ ID NO: 7) revelou uma mutação no resíduo de aminoácido 160 da proteína do envelope (E160) (aminoácido 445 na figura 9A), uma mutação no resíduo de aminoácido 317 da proteína não-estrutural 1 (NS1-317) (aminoácido 1095 na figura 9B), e uma mutação no resíduo de aminoácido 170 da proteína não-estrutural 2A (NS2A-170) (aminoácido 1300 na figura 9C). A Série B-P1 e a Série B3-P11 presentes completam as sequências de aminoácidos do estudo de passagens repetidas.

[0050] A figura 10A-F representa a sequência de aminoácidos de C- P1 e C1-P11 do estudo de passagens repetidas. A sequência de aminoácidos para C-P1 é aqui identificada como SEQ ID NO: 14. Uma comparação da sequência de aminoácidos para C-P1 com aquela de C1-P11 (SEQ ID NO: 8) revelou uma mutação no resíduo de aminoácido 113 da proteína não- estrutural 4B (NS4B-113) (aminoácido 2369 na figura 10E). A Série C-P1 e a Série C1-P11 presentes completam as sequências de aminoácidos do estudo de passagens repetidas.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES PREFERIDAS

[0051] Uma descrição de modalidades preferidas da invenção se segue. Deve-se entender que as modalidades específicas da invenção são descritas a título ilustrativo e não limitativo da invenção. Em princípio, a invenção é descrita em seus aspectos globais mais amplos, com uma descrição mais detalhada em seguida. As características e outros detalhes das composições e métodos da invenção serão assinalados adicionalmente nas reivindicações. Visão Geral da Abordagem e Benefícios

[0052] A invenção refere-se a composições e métodos para uso na prevenção de infecção pelo vírus da febre amarela. Descreve-se aqui um método para produzir um candidato a vírus da febre amarela inativado, onde o método compreende a passagem serial do vírus 17D da febre amarela (isto é, um "vírus não-adaptado") em células renais do macaco verde africano certificadas (VERO) para aumentar o título a fim de render uma massa antigênica suficiente para induzir uma resposta imune protetora e/ou modificar a sequência de nucleotídeos do genoma viral. Este método foi repetido e demonstrou ser reprodutível.

[0053] Uma modalidade da invenção é um vírus da febre amarela modificado que crescerá até títulos elevados em células Vero. Outra modalidade da invenção é uma vacina que compreende um vírus da febre amarela com vírion integral, quimicamente inativado, preparado a partir de um meio condicionado isento de soro de células Vero infectadas com o vírus 17D. Em uma modalidade da invenção, o vírus foi purificado a partir do DNA da célula hospedeira e proteínas por filtração de profundidade, ultrafiltração, diafiltração, e separação cromatográfica. O método está descrito no pedido de patente internacional PCT n° US 2010/043013, depositado em 23 de julho de 2010, que é aqui incorporado como referência. O vírus purificado pode ser inativado usando um método que assegura a conservação de epítopos neutralizadores críticos. Por exemplo, o vírus pode ser inativado usando formol, calor, UV, irradiação gama ou beta-propiolactona. Um vírus inativado purificado pode ser formulado com um adjuvante, tal como adsorvido no adjuvante hidróxido de alumínio, e estocado como um líquido em temperaturas entre cerca de 2 graus Celsius (2°C) e cerca de 8 graus Celsius (8°C).

[0054] Acredita-se que uma vacina que contém o vírus inativado purificado seja mais segura do que a vacina do vírus vivo da febre amarela atenuado atualmente disponível porque a vacina do vírus inativado da febre amarela aqui descrita não é replicante. Os inventores da presente invenção desenvolveram agora uma vacina de febre amarela inativada não-replicante mais segura, que eliciará uma resposta de anticorpo neutralizador, e ao mesmo tempo, eliminando o potencial para episódios adversos neurotrópicos e viscerotrópicos. Além disso, a vacina aperfeiçoada pode ser fabricada por métodos modernos em células Vero sem proteínas derivadas de animais, e portanto, ela pode ser usada de forma segura em pessoas (incluindo pessoas alérgicas a ovo) para quais a vacina viva (produzidas em ovos de galinhas) é contraindicada ou para as quais advertências aparecem no rótulo. Tais advertências incluiriam, por exemplo, advertências para pessoas com imunossupressão, pessoas com doença tímica, pessoas alérgicas a ovos, recém-nascidos com < 9 meses de idade, e idosos. Adaptação do Vírus da Febre Amarela para a Produção Robusta em Células Vero:

[0055] As células Vero usadas na fase de desenvolvimento do vírus foram obtidas no lote semente da Organização Mundial da Saúde (OMS, WHO em inglês), Banco de Células Vero 10-87 WHO na Passagem 134. O Banco de Células Vero WHO 10-87 foi fabricado originalmente pelo Institut Merieux usando a linhagem de células Vero ATCC CCL81 na Passagem 129. As células foram descongeladas em OptiPRO™ SFM (meio isento de soro) suplementado com 5% de soro fetal bovino, que foi removido 24 horas depois e substituído pelo meio OptiPRO™ SFM sem soro fetal bovino. O soro, certificado como sendo de origem dos Estados Unidos da América, era submetido a irradiação gama e tinha sido testado quanto a agentes adventícios pelo fabricante; testes adicionais quanto à esterilidade, micoplasma, e vírus adventícios foram realizados neste material por WuXi AppTec. Todas passagens subsequentes de células Vero para fabricar bancos de células, vírus sementes, e vacina foram feitas em OptiPRO™ SFM sem soro. Nenhum outro material ou produto de origem animal foi usado ao produzir os bancos de células ou a vacina final de acordo com uma modalidade da invenção. Preparação de Bancos de Células Vero:

[0056] Bancos de Células Mestre e de Trabalho foram preparados de acordo com cGMP e foram testados e caracterizados de acordo com os Pontos a Considerar da FDA. As células Vero tinham proveniência estabelecida e eram isentas de preocupações normativas sobre encefalite espongiforme bovina (BSE). Um meio de crescimento isento de soro foi empregado ao propagar as células. Histórico de Passagens de Células Vero Durante a Fabricação de Vírus sementes e Lotes de Vacinas:

[0057] O histórico de passagens de células Vero durante a fabricação da vacina de febre amarela aqui descrita está ilustrado na figura 1. As células da OMS foram recebidas na Passagem 134, o Banco de Células Mestre (MCB) e o Banco de Células de Trabalho (MWCB) foram compilados nas Passagens 139 e 143 respectivamente. As células foram expandidas ainda mais até um máximo de 11 passagens até a Passagem 154 durante a expansão de células em culturas estacionárias antes da semeadura do biorreator usado para a produção do vírus. O número estimado de duplicações da população no biorreator é calculado como sendo 1 a 3. Preparação de Vírus-sementes Mestres e de Trabalho:

[0058] A figura 2 é uma representação esquemática da preparação de vírus-sementes de acordo com uma modalidade da invenção. Um fator de segurança importante para a vacina descrita é o uso da vacina de febre amarela 17D atenuada para a fabricação. O vírus atenuado usado como material de partida era uma vacina comercial YF-VAX® (Sanofi Pasteur, Swiftwater PA) que tinha sofrido vários testes quanto a agentes adventícios. O material YF-VAX® original usado para inocular células Vero foi derivado a partir de ovos de galinhas embrionados, e continha gelatina porcina hidrolisada como estabilizador. Entretanto, a probabilidade de contaminação cruzada por um agente adventício a partir dos ovos foi mitigada pelo uso de transfecção de RNA, para produzir o Vírus-semente Pré-Mestre.

[0059] As células foram propagandas em meio OptiPro-SFM (Invitrogen, Grand Island, NY). Para desenvolver o vírus da febre amarela modificado que crescerá até títulos altos em células Vero, inicialmente o vírus YF-17D em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 0,01 foi usado para infectar um frasco T-25 com uma camada confluente de células Vero. A cultura de células foi incubada a 37°C e 5% de CO2.

[0060] Depois que o efeito citopático (CPE) foi observado em cerca de 2 + (50%) das células, frações da cultura foram preparadas, rotuladas como passagem um (P1) e estocadas a -80°C para uso como inóculo para continuar as passagens seriais. Um esquema do procedimento usado para efetuar P1 até P10 está ilustrado na figura 3A.

[0061] Uma fração do vírus da Passagem 1 (P1) foi diluída 10-1 até 10-8 e cada diluição foi inoculada em cima de monocamadas confluentes de três (3) culturas de células Vero propagadas em placas estéreis com 12 poços das quais o meio de crescimento tinha sido removido.

[0062] Diluições log10 foram preparadas transferindo 0,2 mL do vírus para 1,8 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) para se igualar a uma diluição 10-1. O vírus mais PBS foi misturado e depois uma nova pipeta foi usada para transferir 0,2 mL para 1,8 mL de PBS = 10-2, e depois repetiu- se até uma diluição 10-8. Monocamadas confluentes de doze poços da cultura de células Vero foram rotuladas e diluições log10 do material P1 (controle negativo), 10-1 (3 poços), 10-2 (3 poços), 10-3 (3 poços), 10-4 (3 poços), 10-5 (3 poços), 10-6 (3 poços), 10-7 (3 poços) e 10-8 (3 poços) foram preparadas e inoculadas em cima das culturas isentas de meio usando uma nova pipeta para cada diluição do inóculo. As culturas de controle negativo foram inoculadas com um volume similar de PBS. Depois de inocular as culturas, elas foram incubadas a 37°C por 1 hora com vascolejamento intermitente e depois 1,0 mL de meio de manutenção foi adicionado a cada cultura. As células foram observadas cada dia quanto ao efeito citopático (CPE) e registradas como 1+ (25% da monocamada de células afetados), 2+ (50% da monocamada de células afetados), 3+ (75% da monocamada de células afetados) e 100% (totalidade da monocamada de células afetados). As estimativas de CPE basearam-se em uma comparação com as células de controle. O ensaio com placas também foi realizado nas mesmas diluições de inóculo para verificar que o CPE representava infecciosidade viral.

[0063] Depois que o CPE (2 +) se desenvolveu nestas culturas, cinco frações de 0,5 mL do meio foram colhidas a partir das culturas que receberam a diluição mais alta ou perto da diluição mais alta do inóculo. As cinco frações foram preparadas e estocadas como passagem 2 (P2) a - 80°C. A estratégia foi selecionar a população de vírus que replicou na diluição log10 mais alta ou perto dela, baseado no aparecimento de CPE nas células. Assim sendo, a população viral selecionada seria a população que melhor se adaptou para replicar nas células com possíveis mudanças genéticas que permitirão um aumento no título viral.

[0064] Subsequentemente, diluições log10 foram preparadas como uma fração do vírus P2 e usadas para infectar culturas de células Vero propagadas em placas com 12 poços como descrito para o vírus da febre amarela da passagem um. Métodos similares foram empregados para completar 10 passagens seriais do vírus. P10 e P11:

[0065] Em cada passagem serial, cada uma das frações usadas como inóculo foi testada também para determinar os títulos de infecciosidade pelo ensaio de placas em células Vero. Na passagem 10, cinco placas individuais isoladas, cada uma representando a progênie de uma única partícula viral infecciosa, foram selecionadas na diluição mais alta que produziu as placas. Cada placa foi colocada em suspensão em 0,3 mL de meio contendo Albumina de Soro Humano (HSA) para proteger a infecciosidade do vírus durante o congelamento e estocada a -80°C.

[0066] As séries de passagens (P1 a P10) do vírus da febre amarela 17D em culturas de células Vero estáticas em diluições de 10-1 a 10-8 foram realizadas no Departamento Médico da Universidade do Texas (Galveston, Texas). A estratégia foi selecionar a população de vírus que replicou na diluição log10 mais alta ou perto dela, baseado no aparecimento microscópico de CPE nas células Vero. A população viral que apresentou efeitos citopáticos na diluição mais alta, a colheita P10, foi selecionada como o vírus otimizado de "alto rendimento". A população de vírus de alto rendimento que apresentou CPE na diluição mais alta foi sequenciada. O Vírus de Alto Rendimento:

[0067] O vírus de "alto rendimento" foi adaptado para replicação aumentada em células Vero por 10 passagens seriais do vírus na diluição terminal em células Vero. Na Passagem 10 do vírus, uma única unidade formadora da placa foi pegada e passada na cultura fluida para produzir um mini-insumo de sementes na Passagem 11 do vírus. O gráfico na figura 3B ilustra curvas de crescimento comparativo de vírus P1 e P11, que tinham sido inoculados em multiplicidade de infecção (MOI) alta; os dados indicam que o vírus P11 tem um título de pico mais alto do que o vírus P1. Este vírus (P11) apresentou uma capacidade de replicação 3-7 vezes maior em células Vero em comparação com YF 17D na Passagem 1 do vírus. O insumo do vírus da Passagem 11 foi usado para extração do RNA, e o RNA foi usado para produzir vírus-sementes grau cGMP. Sequência do RNA do Vírus 17D (P11) Adaptado em Vero

[0068] As sequências genômicas de consenso completas dos vírus em P1 e P11 a partir de YF-VAX® original foram determinadas. Duas mutações genéticas ou diferenças de nucleotídeos foram encontradas, como indicado na Tabela 1 abaixo. Uma diferença de nucleotídeo reside no gene do capsídeo (C) e uma no gene do envelope (E). O termo "capsídeo", como aqui utilizado, refere-se à casca da proteína que circunda e protege o ácido nucleico de um vírus. A mudança no gene de C era silenciosa (nenhuma mudança de aminoácido), enquanto que a mutação do gene de E resultou em uma mutação de aminoácido (Lys^Arg). Tabela 1. Sequência do RNA e mutações no vírus YF 17D adaptado para células Vero

[0069] A primeira mutação foi uma conversão de A em G no resíduo de nucleotídeo n° 211, de acordo com SEQ ID NO: 1, que resultou em uma mudança no códon para o aminoácido na posição 31 da proteína do capsídeo (C31) de ACA para ACG. Esta mutação, entretanto, não mudou o resíduo de aminoácido nesta posição. A segunda mutação foi uma conversão de A em G no resíduo de nucleotídeo n° 1452, de acordo com SEQ ID NO: 1, que resultou em uma mudança no códon para o aminoácido na posição 160 da proteína do envelope (E160) de AAG para AGG. Esta mutação resultou em uma substituição de Lisina para Arginina nesta posição. Um alinhamento de consenso das sequências de ácidos nucleicos e aminoácidos para P1 e P11 está representado nas figuras 4 e 5. Purificação por Placas da Colheita de P10:

[0070] Como descrito acima, o vírus de P10 foi purificado pela formação de placas. O vírus isolado de uma placa foi inoculado dentro de um frasco T 150. O meio condicionado a partir deste frasco foi colhido quando 50% das células apresentavam CPE. Este material foi dividido em frações de 1 mL e designado P11. O vírus P11 foi então usado como a fonte de RNA para a transfecção de células Vero. O título de P11 de unidades formadoras de placas foi determinado como sendo 8,5 X 107 unidades formadoras de placas (PFU). O RNA isolado do vírus P 11 foi usado para transfectar células para produzir uma Semente Pré-Mestre. O vírus-semente pré-Mestre foi passado em culturas adicionais de células Vero para produzir um insumo de vírus-semente Mestre e de Trabalho. Fabricação de Vírus-semente Mestre:

[0071] O vírus-semente Mestre (MVS) foi produzido em células Vero sob condições isentas de soro, usando um único frasco da Semente Pré- Mestre como inóculo de vírus, como representado esquematicamente na figura 2. As células do Banco de Células de Trabalho do Fabricante (MWCB) de células Vero na Passagem 143 foram expandidas até (11) em frascos T de 225 cm3. Depois que as células se tornaram confluentes, um frasco foi tripsinizado e usado para determinar o número de células e também para semear frascos adicionais para produzir o Vírus-semente de Trabalho. O meio The OptiPRO™ SFM foi removido dos 10 frascos T remanescentes e as células foram inoculadas com o Vírus-semente Pré-Mestre em uma multiplicidade de infecção (MOI) ~0.01 PFU/célula. O vírus foi deixado adsorver por 60 (± 5) minutos a 37°± 2°C, após o que o meio OptiPRO™ SFM preaquecido foi adicionado aos frascos. A cultura infectada foi então incubada a 37°± 2°C com ~5% de CO2.

[0072] Depois de 3 dias, quando o CPE foi observado em > 80% da população de células, o processo de propagação do vírus foi terminado colhendo o fluido de cultura de células. O fluido de cultura que contém o vírus foi colecionado a partir de todos frascos, centrifugado para remover detritos de células, e misturado com sorbitol a 70% estéril até uma concentração final de sorbitol de 7%. Esta mistura foi envasada em criofrascos de 4 mL a 2 mL por frasco e congelada a < -60°C. O insumo de vírus congelado constitui o YF 17D MVS.

[0073] Como ilustrado na figura 2, o nível de passagem mais alto em células Vero usado para a produção do MVS foi 147. Fabricação do Vírus-semente de Trabalho:

[0074] O Vírus-semente de Trabalho (WVS) foi produzido como ilustrado na figura 2, a partir de um único frasco do MVS sob condições de cGMP.

[0075] Começando com células no 11° frasco T225 usado para determinar a densidade celular na produção de MVS, quatro frascos T225 foram semeados em uma densidade celular de 1 x 106 células viáveis por frasco, Passagem 147. As células foram passadas dentro de 4 novos frascos T225 para dar tempo para a produção do Insumo de Semente-Mestre. As células na Passagem 148 foram então semeadas dentro de onze frascos T225 para a produção do WVS.

[0076] Quando as células estavam mais do que 80% confluentes, a densidade celular em um frasco foi determinada. Esta densidade celular foi usada para estimar a densidade celular nos dez frascos remanescentes, e as células nos 10 frascos foram infectadas com o MVS em uma MOI de 0,01 PFU/célula. Para realizar a infecção, o meio foi removido dos frascos e depois o vírus diluído foi adicionado em solução salina tamponada com fosfato. Depois de uma hora, meio fresco foi adicionado a cada frasco e as células foram devolvidas para a incubadora. As células foram observadas de forma microscópica quanto ao CPE. Quando o CPE era maior do que 80% o vírus foi colhido. O meio dos 10 frascos foi centrifugado para remover os detritos celulares e o sobrenadante clarificado foi colecionado dentro de um recipiente. Sorbitol (concentração final de 7%) foi adicionado ao sobrenadante que contém o vírus como um crioconservante. O vírus colecionado foi dividido em frações em criofrascos de 4 mL, 2 mL por frasco. Os frascos cheios foram estocados a < -60°C. Depois de congelado, um frasco do final do banco foi testado em um ensaio de placas em células Vero para determinar o título do vírus. Aumento no Título Atingido em P11 Comparado com P1:

[0077] O vírus da febre amarela (YF) original e a colheita P11 do vírus da febre amarela foram titulados pelo ensaio de placas em células Vero para determinar os títulos de infecciosidade expresso como unidades formadoras de placas (PFU) (Tabela 1). A vacina original YF-VAX 17D continha 103.7 log10 por mL em células Vero. O título do pico para a passagem um (1) foi 6,68 log10 por mL e permaneceu em cerca do mesmo título até P6 e depois aumentou significativamente para 7,67 log10 para P10. Assim sendo, neste experimento, houve um aumento de 1,0 log10 (10 vezes) no título da passagem 10 (7,67 log10) sobre o título (6,68 log10) do vírus P1 (vide Tabela 2).

[0078] As curvas de crescimento do vírus também foram realizadas concomitantemente nos vírus P1 e P11. A curva de crescimento foi realizada infectando frascos de 75 cm2 em duplicata de células Vero em alta MOI de 1,0 e uma segunda curva de crescimento foi realizada usando uma baixa MOI de 0,001. Em alta MOI espera-se que todas células estejam infectadas no início da cultura, enquanto que em baixa MOI, o vírus liberado por um pequeno número de células inicialmente infectadas infectaria as células remanescentes da cultura; assim sendo, espera-se que o vírus em uma curva de crescimento com baixa MOI seja um tanto retardada em comparação com uma cultura de alta MOI. Nos tempos 0, 6, 18, 24, 30, 48, 54 e 72 h após a inoculação, o meio condicionado (2 mL) foi removido das culturas, estabilizado com 2% de HSA e congelado (amostras de 1 mL em duplicata) a -80°C. Diluições log10 de cada amostra foram testadas em células Vero para determinar o título de infecciosidade, e as curvas de crescimento foram plotadas em função do tempo. Tabela 2. Título de pico da infecciosidade para cada passagem sequencial do vírus da febre amarela.

Tabela 2. Título de pico da infecciosidade para cada passagem sequencial do vírus da febre amarela.

[0079] Os resultados da curva de crescimento usando uma MOI de 1,0 indicaram que o vírus da febre amarela P1 aumentou de um título de 4,09 log10 à 0 hora; ou no tempo de inoculação até um título máximo de 6,28 log10 em 48 horas após a inoculação (PI) e os títulos indicaram um ligeiro decréscimo de 6,21 e 6,18 log10 em 60 e 72 horas PI, respectivamente. Os resultados para a passagem 11 (P11) indicaram um aumento em títulos sobre o vírus da passagem 1 (um) (P1). Na hora da inoculação, o título era 4,15 log10 e atingiu um título máximo de 6,83 log10 em 48 horas P.I. e tinha diminuído para um título de 6,54 log10 em 72 horas P.I (vide Tabela 3). O título viral de pico em aproximadamente 48 horas para o vírus P11 foi 0,55 log10 ou 3,5 vezes mais alto do que o vírus P1. Tabela 3. Curva de crescimento do vírus da febre amarela 17D Passagem 1 e Passagem 11 em alta MOI (1,0)

[0080] Em comparação com a curva de crescimento que usa alta MOI, o padrão da curva de crescimento que usa uma MOI de 0,001 indicou retardamento na replicação, mas os títulos máximos foram mais altos. Na hora da inoculação, os títulos foram 1,7 e 0,57 log10 para a passagem 1 e 11, respectivamente. Houve um aumento linear nos títulos e em 72 horas PI, títulos máximos de 7,35 e 8,17 log10 tinham sido atingidos por P1 e P11, respectivamente. O título de pico do vírus em aproximadamente 72 horas para o vírus P11 foi 0,82 log10 ou 6,6 vezes mais alto do que para o vírus P1. Estes resultados indicaram que a passagem serial de YF-VAX produziu um aumento substancial no título e que esta abordagem parece ser promissora para desenvolver uma vacina de febre amarela inativada (vide Tabela 4). Tabela 4. Curva de crescimento do vírus de febre amarela 17D de Passagem 1 e Passagem 11 em baixa MOI (0,001).

[0081] Estes resultados indicaram que a passagem serial do vírus da febre amarela produziu um aumento substancial no título. A seguir, como descrito acima, a análise de sequências de P1 e P11 foi realizada, cujos resultados comparativos indicam que as passagens seriais podem ter resultado em duas mutações genéticas no vírus da febre amarelas, uma das quais resultou em uma mudança de aminoácido.

[0082] O vírus da febre amarela modificado descrito, produzido pela passagem serial da vacina do vírus da febre amarela 17D atenuado em células (Vero) certificadas do rim do macaco verde africano, indicou maior produtividade em células. Os métodos da invenção envolvem a vacinação de indivíduos com o vírus da febre amarela inativado modificado para produzir imunidade contra febre amarela. Produção da Vacina em Biorreatores:

[0083] Biorreatores contendo aproximadamente 5 g/L de microcarreadores Cytodex 1 foram semeados com aproximadamente 5 x 105 células Vero/mL em meio OptiPRO™ SFM. As células foram deixadas propagar por 3 a 4 dias até que as células afixadas aos microcarreadores atingissem uma densidade > 7 x 105 núcleos por mL. Para inoculação do vírus, os controles da agitação e de parâmetros são desligados e os microcarreadores e as células são deixados decantar. Aproximadamente 75% do volume do meio são removidos através de um tubo de peneira de 90 μm que é projetado para reter microcarreadores no reator. O vírus WVS é introduzido em uma MOI de ~0,01 PFU/célula. Baixa agitação foi aplicada neste baixo volume por cerca de 1 hora para permitir que seja adsorvido em células e as infecte. Meio fresco foi adicionado ao volume inteiro antes que os controles da agitação e de parâmetros sejam voltados para seus ajustes originais. No dia 3 ou 4 após a infecção, 75% do meio condicionado foram removidos e o reator foi realimentado com meio fresco. A cultura foi deixada prosseguir por mais 2 ou 3 dias, e no Dia 5, 6, ou 7 após a infecção, o meio condicionado foi colhido. Para assegurar biossegurança, as amostras colhidas foram retiradas do biorreator imediatamente antes da remoção dos microcarreadores, e testadas quanto à esterilidade, micoplasma, retrovírus e vírus adventícios (ensaio IN VITRO).

[0084] A misturação do reator foi interrompida para permitir a decantação dos microcarreadores. A cultura é transferida do biorreator através de um tubo de peneira de 90 μm para dentro de uma bolsa de bioprocesso. A peneira de 90 μm impede que uma quantidade de microcarreadores e partículas grandes seja transferida para a colheita. Isto foi a Colheita de Vírus. A Colheita do Vírus foi amostrada e testada quanto à infecciosidade, potência, identidade, endotoxina, esterilidade, DNA residual de células Vero, e proteínas residuais de células Vero. Purificação e Inativação do Vírus:

[0085] O meio de cultura condicionado foi colhido, clarificado em duas etapas, digerido com BENZONASE®, purificado por ultrafiltração e diafiltração e depois filtrado sob condições estéreis, para gerar o Vírus Vivo a Granel. O Vírus Vivo a Granel foi então inativado pelo tratamento com β- propiolactona (BPL) que permeia o envelope do vírus e rompe o envelope rompe o RNA viral por resíduos de purina alquilantes, tornando o vírus inativo. O vírus inativado é purificado ainda mais por cromatografia de coluna de sulfato de celulina, e diluído até a concentração viral desejada, para formar a Substância Farmacológica Vacínica a Granel. Repetição do Estudo de Passagem do YFV 17D:

[0086] Foram realizados experimentos para repetir a passagem do vírus de febre amarela a partir do insumo de vírus não passado até P11 usando técnicas similares àquelas usadas na série de passagens originais. Preparação de Insumos do Vírus:

[0087] Células Vero foram mantidas sob condições isentas de soro no estudo inteiro, usando OptiPRO SFM.

[0088] A fonte inicial do vírus YFV 17D foi a partir de um único frasco de YF-VAX® (Sanofi Pasteur, Swiftwater PA). O frasco foi originalmente reconstituído e guardado em frações. Uma destas frações foi usada para repetir os experimentos. A passagem serial repetida foi realizada em duplicata, de tal modo que houve duas corridas do estudo, realizadas em paralelo, aqui referidas como séries B e C.

[0089] Em cada passagem do vírus, a amostra do vírus foi diluída em diluições serias de 10 vezes, e o vírus diluído foi usado para inocular células Vero semeadas em placas com 12 poços. As diluições seriais realizadas em cada passagem foram inoculadas em duplicata de tal modo que um conjunto de placas foi usado para preparar a próxima passagem do vírus, inoculando 4 poços por diluição, e o outro conjunto de placas foi usado para determinar o título do vírus passados, inoculando 2 poços por diluição.

[0090] Para as passagens seriais do vírus, a diluição selecionada para passar o vírus foi a última diluição na qual um efeito citopático (CPE) generalizado foi observado, três a quatro dias depois da infecção. O meio dos quatro poços foi colecionado para a próxima passagem. O título do vírus foi determinado pelo ensaio de placas, usando uma imunocoloração para visualizar e contar as placas. O método de imunocoloração permitiu determinar o título 3 dias depois da infecção.

[0091] Para a passagem inicial do vírus, 0,3 mL da fração de YF- VAX foi diluído até 3 mL final, usando OptiPRO SFM, para uma diluição 10-1. O vírus diluído foi dividido igualmente em três frações. A partir de cada uma destas frações, diluições seriais de 10 vezes foram feitas até 10-5, fazendo duas séries de diluição (B e C). Isso é aqui referido como passagem P0 ^ P1. A partir do ensaio de placas inoculado usando a série de diluições do vírus P0 fi determinado e para as placas inoculadas para passagem, o vírus P1 foi gerado. Cada rodada de passagem está resumida na Tabela 5. Tabela 5: Passagens Seriais de YFV 17D (Resultados iguais para séries B e C)

N/A = não aplicável

[0092] A passagem foi repetida para 10 passagens seriais do vírus. Depois que o vírus foi colhido a partir da última passagem, os títulos foram gerados para o vírus P10 de cada séries. Os vírus P10 foram então diluídos para inocular células de tal modo que apenas uma placa por poço se desenvolvesse depois da inoculação. As placas isoladas do poço puderam ser então pegadas dos poços. A partir da série B, seis placas isoladas do poço foram pegadas, e a partir de C, duas foram pegadas. As placas pegadas foram usadas para inocular frascos T25 para gerar insumos do vírus P11 para estudos de curvas de crescimento. Análise da Curva de Crescimento:

[0093] Para estudos da curva de crescimento, o vírus do insumo P1 de cada série foi comparado com os insumos de P11 para cada série. Como o volume dos insumos P1 teria sido limitativo para isto, uma fração do vírus P1 de cada série foi diluída três vezes, e depois frações foram feitas a partir do vírus diluído para gerar insumos de P1 para a curva de crescimento. Para insumos de P11, três insumos da série B foram analisados, e os dois da série C. Antes dos estudos da curva de crescimento, frações dos insumos do vírus foram testadas para confirmar o nível de infecciosidade.

[0094] A análise da curva de crescimento foi realizada infectando células Vero em frascos T25, em baixa MOI de 0,001 PFU/célula. O estudo foi conduzido sob condições isentas de soro, usando OptiPRO SFM como meio de cultura. Depois de diluir os insumos de vírus para atingir a MOI-alvo de 0,001, uma amostra foi reservada para confirmar o título do inóculo. Os inóculos do vírus foram deixados adsorver às células por aproximadamente uma hora. Depois da adsorção, as monocamadas foram lavadas três vezes, e depois as culturas foram alimentadas com 8 mL de meio. Em cada ponto no tempo, 1 mL foi removido de cada cultura, e 1 mL de meio fresco foi adicionado de volta. Aquele um mililitro reservado de meio foi clarificado por centrifugação e estocado a -80°C na presença de sorbitol, até ficar pronto para o ensaio. Os pontos no tempo para os quais as amostras foram retiradas foram 0, 24, 30, 48, 54, 72, e 81 horas depois da infecção. Um ensaio de placas foi realizado em todas amostras. Os resultados do estudo estão detalhados na figura 3C.

[0095] Para ambas séries B e C, houve um insumo de vírus P11 que demonstrou replicar até títulos mais altos do que o insumo do vírus P1 da série. Os insumos de P1 para B e C, e o insumo de B3-P11 e o insumo de C1-P11 foram selecionados para análise de sequência. A análise de sequências ilustra que o insumo B3 usufrui da mesma mutação Lys^Arg em E160 que aquela observada na série de passagens originais, bem como uma mutação de Treonina (Thr) ^ Isoleucina (Ile) na posição de aminoácido 317 in proteína não-estrutural 1 (NS1-317),e uma mutação de Fenilalanina (Phe) ^ Leucina (Leu) na posição de aminoácido position 170 na proteína não-estrutural 2A (NS2A-170). Embora o insumo C1 não portasse a mesma mutação no gene de E, um estudo adicional do genoma do insumo C1 está em andamento, e revelou uma mutação na posição de aminoácido 113 na proteína não-estrutural NS4B (NS4B-113).

[0096] A Tabela 6 resume as mudanças de nucleotídeos e aminoácidos encontradas nos vírus de febre amarela modificados obtidos a partir dos estudos de passagens originais e repetidas. Tabela 6:

Aspectos Não-limitativos da Invenção:

[0097] Uma cepa viral de febre amarela foi produzida para desenvolver uma vacina não-replicante inativada mais segura que eliciará uma resposta de anticorpo neutralizador, e ao memo tempo, eliminando o potencial para episódios adversos neurotrópicos e viscerotrópicos para a prevenção de doença humana. Cepas adicionais do vírus da febre amarela são produzidas para desenvolver vacinas não-replicantes inativadas mais seguras que eliciarão uma resposta de anticorpo neutralizador, e ao mesmo tempo, eliminando o potencial para episódios adversos neurotrópicos e viscerotrópicos para a prevenção de doença humana. Estas modalidades da invenção estão enunciadas acima no Sumário da Invenção.

[0098] A invenção fornece uma cepa do vírus da febre amarela, onde a molécula de ácido nucleico da dita cepa compreende pelo menos uma mutação de aminoácido selecionada entre: uma mutação de aminoácido na proteína NS1, uma mutação de aminoácido na proteína NS2A, uma mutação de aminoácido na proteína NS4B, opcionalmente onde a dita pelo menos uma mutação de aminoácido é ainda em combinação com uma mutação de aminoácido em uma ou mais posições que flanqueiam a mutação 160, por exemplo os resíduos 134, 137, 144, 148, 157, 160, 175, 177 da proteína do envelope. Em uma modalidade deste aspecto, a mutação de aminoácido(s) na posição 157 é lisina para arginina; na posição 148 é lisina para arginina; na posição 144 é histidina para arginina, tirosina ou lisina; na posição 137 é tirosina para arginina ou lisina, na posição 175 é tirosina para arginina ou lisina; e/ou na posição 177 é lisina para arginina.

[0099] A invenção fornece também uma cepa do vírus da febre amarela modificado, onde a molécula de ácido nucleico da dita cepa compreende uma mutação de aminoácido em uma ou mais posições que flanqueiam a mutação 160, por exemplo, os resíduos 134, 137, 144, 148, 157, 160, 175, 177 da proteína do envelope, em combinação com mutações em uma ou mais posições 317 de NS1, 170 de NS2A, 113 de NS4B. Em uma modalidade deste aspecto, a mutação de aminoácido(s) na proteína do envelope na posição 157 é lisina para arginina; na posição 148 é lisina para arginina; na posição 144 é histidina para arginina, tirosina ou lisina; na posição 137 é tirosina para arginina ou lisina; na posição 175 é tirosina para arginina ou lisina; e/ou na posição 177 é lisina para arginina; e a mutação de aminoácido em NS1 na posição 317 é treonina para isoleucina, em NS2A na posição 170 é fenilalanina para leucina, em NS4B na posição 113 é isoleucina para metionina. Em certas modalidades de acordo com certos aspectos da invenção, as células são selecionadas entre células Vero. Outras células apropriadas para propagação do vírus da febre amarela podem ser utilizadas, incluindo, porém sem limitações, embrião primário de pinto, embrião primário do pato, rim primário canino, rim primário do coelho, WI- 38, MRC-5, ou pulmão fetal do macaco reso.

[00100] Em algumas modalidades destes aspectos, a mutação de nucleotídeo opcional no códon para o aminoácido na posição 160 da proteína do envelope resulta em uma mudança de AAG para AGG, AGA, CGC, CGA, CGG ou CGU. Em outras modalidades destes aspectos, a mutação de aminoácido na posição 160 é lisina para arginina.

[00101] Em ainda outras modalidades destes aspectos, a mutação de nucleotídeo no códon para o aminoácido na posição 317 de NS1 resulta e uma mudança de ACA para AUA, a mutação de nucleotídeo no códon para o aminoácido na posição 170 de NS2A resulta em uma mudança de UUU para CUU, a mutação de nucleotídeo no códon para o aminoácido na posição 113 de NS4B resulta em uma mudança de AUA para AUG. Em outras modalidades destes aspectos, a mutação de aminoácido na posição 317 de NS1 é treonina para isoleucina, na posição 170 de NS2A é fenilalanina para leucina, na posição 113 de NS4B é isoleucina para metionina.

[00102] Nos métodos de acordo com os vários aspectos da invenção, o vírus ou vacinas de febre amarela da invenção podem ser administrados em quantidades e usando métodos que podem ser facilmente determinados pelos versados nessas técnicas. As vacinas virais quimicamente inativadas podem ser administradas e formuladas, por exemplo, como uma solução aquosa estéril que contém entre 102 e 108, por exemplo, ou entre 106 e 107, equivalentes inativados de unidades infecciosas (por exemplo, unidades formadoras de placas (PFU) ou doses infecciosas da cultura de tecidos) em um volume da dose entre cerca de 0,1 e cerca de 1,0 mL, ou cerca de 0,5 mL a ser administrado, por exemplo, por via subcutânea, intramuscular, epidérmica, ou intradérmica. Além disso, em uma formulação apropriada, uma via pela mucosa, tal como a via intranasal oral, pode ser selecionada. A seleção de uma quantidade apropriada a administrar pode ser determinada pelos versados nessas técnicas, e esta quantidade pode variar devido a inúmeros fatores, por exemplo, o porte e saúde geral do indivíduo ao qual o vírus vai ser administrado. O indivíduo pode ser vacinado uma única vez ou, caso necessário, uma imunização de reforço pode ocorrer.

[00103] Como assinalado acima, as vacinas podem ser administradas como agentes profiláticos primários a um indivíduo que está em risco de infecção pelo vírus da febre amarela. Além disso, embora não necessário, adjuvantes podem ser usados para intensificar a imunogenicidade das vacinas de febre amarela. A seleção de adjuvantes apropriados pode ser conduzida facilmente pelos versados nessas técnicas.

[00104] Também como assinalado acima, o vírus vivo pode ser inativado pelo tratamento com 1-propiolactona (BPL), tornando o vírus inativo. Outros métodos apropriados para inativação do vírus incluem, porém sem limitações, formol, radiação ultravioleta, etilenoimina, acetil- etilenoimina, etilenoimina binária. EXEMPLOS

[00105] Os exemplos abaixo pretendem ilustrar ainda mais certas modalidades preferidas da invenção, e não são intencionados para limitar o âmbito da invenção. Respostas de Anticorpo em Camundongos:

[00106] As respostas de anticorpos neutralizantes em camundongos BALB/C e CD-1 fêmeos heterogêneos depois da imunização com a vacina de febre amarela inativada em comparação com vírus vivo foram avaliadas. O vírus da febre amarela (YF) foi inativado com beta-propiolactona (BPL), formulado com o adjuvante alume e injetado pela via intramuscular com duas ou três doses, cada uma com intervalo de 14 dias. Dois níveis de dose foram testados em camundongos BALB/c, o nível mais alto da dose foi testado apenas em camundongos CD1. Os soros em 14 dias depois da última imunização foram testados quanto à atividade de anticorpos neutralizantes. Procedimentos de Pré-imunização:

[00107] Camundongos fêmeos das cepas BALB/c e CD-1 (6 semanas de idade) foram aclimatados em uma instalação isolada com barreira contra vírus. As amostras de soro foram coletadas no Dia do Estudo 28 ou 42 após o sacrifício. Os camundongos foram alojados a 5 camundongos por gaiola e cada animal foi identificado singularmente nas fichas das gaiolas, e por anilha de orelha. Os camundongos foram aclimatados por uma semana antes do início dos tratamentos. Os camundongos receberam ração e água esterilizadas e foram alojados em gaiolas de policarbonato esterilizadas com cama esterilizada sob um ciclo de iluminação de 12 horas (ligado às 6:00h e desligado às 18:00h). A saúde geral foi avaliada pelo pessoal técnico e por um veterinário semanalmente e conforme necessário quanto a problemas de saúde. Os pesos corporais foram registrados no Dia 0 antes da imunização e nos Dias 28 e 42. Procedimento de Imunização: O peso corporal foi determinado no Dia 0 antes da imunização. A imunização foi proporcionada por via intramuscular (formulações com alume) ou subcutânea (vírus vivo ou vacina inativada com adjuvante de Freund). As injeções foram dadas com os camundongos sob anestesia leve com dose abaixo da ótima da mistura de cetamina/xilazina. Para a via subcutânea com vírus vivo, um volume de 100 J.L de vacina em uma seringa de 1 mL equipada com uma agulha de calibre 27 é injetado entre a pele e as camadas subjacentes de tecido na região escapular sobre as costas dos camundongos. Para administração intramuscular, um volume de 100 μL de vacina em uma seringa de insulina de 0,5 mL é injetado dentro de feixes musculares de 2 pernas traseiras superiores de camundongos (50 μL /perna). Sacrifício:

[00108] Os camundongos foram sacrificados 28 ou 42 dias depois da primeira vacinação. O peso corporal de todos camundongos foi determinado no Dia do Estudo 28 e antes do sacrifício. O sangue foi coletado para teste de anticorpos neutralizantes. O sangue (0,7-1,0 mL) foi removido por punção cardíaca de camundongos anestesiados com tratamento leve de cetamina/xilazina antes de eles serem executados humanamente por overdose de cetamina/xilazina. Desenho Experimental:

[00109] A vacina formulada com alume foi preparada no dia anterior à imunização como uma suspensão, e a vacina foi bem misturada antes de encher cada seringa. As preparações formuladas com alume foram administradas por via intramuscular em um volume de 100 μL de vacina em uma seringa de insulina de 0,5 mL injetada dentro de feixes musculares de 2 pernas traseiras superiores de camundongos (50 μL /perna).

[00110] A vacina de febre amarela (YF) viva foi reconstituída com 0,6 mL de solução salina até uma concentração do vírus de aproximadamente 1,1 x 105 pfu/mL. Uma dose de 1 x 104 PFU (isto é, 1/10 da dose humana) foi aplicada em um volume de 100 μL de solução salina estéril, administrado no dia 0 por via subcutânea.

[00111] A vacina com adjuvante de Freund foi formulada no dia da vacinação colocando 2 mL da solução de antígeno dentro de uma seringa de vidro e 2 mL do adjuvante dentro de outra seringa de vidro. As seringas foram conectadas através do encaixe de Luer à válvula de 3 vias. O êmbolo da solução de antígeno foi cuidadosamente empurrado para baixo em primeiro lugar, empurrando o antígeno para dentro do óleo do adjuvante. Os êmbolos foram empurrados alternadamente, para misturar o adjuvante e a solução de antígeno em uma emulsão (aproximadamente 8 a 10 minutos). Um volume de 0,5 mL foi administrado por via subcut|ânea entre a pele e as camadas subjacentes de tecido na região escapular sobre as costas dos camundongos (Formulação com adjuvante de Freund).

[00112] A vacina de vírus vivo de febre amarela (YF Vax™) foi reconstituída com 0,6 mL de solução salina suprida até uma concentração do vírus de aproximadamente 1,1 x 105 PFU/mL.

[00113] A vacina de vírion integral inativado adsorvida sobre o adjuvante hidróxido de alumínio a 0,2% ("alume") foi preparada não mais do que 2 semanas antes da dosagem. Estudos Preliminares em Camundongos

[00114] Grupos de 5 camundongos receberam dose como delineado na Tabela 7. Amostras de soro foram coletadas por punção cardíaca 14 ou 28 dias depois da última vacinação. Tabela 7

Ab = anticorpo Atividade de neutralização com redução de placas em soros de camundongos

[00115] O teste de neutralização com redução de placas foi realizado usando uma diluição do vírus 17D que, na ausência de neutralização, produz 10-40 unidades formadoras de placas por poço em placas com 12 poços.

[00116] Um volume igual de soro de camundongo diluído serialmente foi incubado com vírus por 16-20 h a 4°C e depois o inoculado dentro de poços em duplicata de células Vero em placas com 12 poços. Depois da adsorção do vírus por 60 minutos a 37°C, os poços são sobrepostos com meio contendo 0,75% de metil-celulose, incubados por 4 dias a 37°C, fixados e corados com cristal violeta e as placas foram contadas usando um estereomicroscópio sobre caixa de iluminação. O título com redução de placa de 50% representa a diluição final do soro de camundongo que resulta em menos do que 50% das contagens médias de placas no soro adicionadas.

[00117] As respostas e títulos do teste de neutralização com redução de placas (PRNT) estão indicados na Tabela 8 e nas figuras. 6 e 7. O teste PRNT é atualmente o padrão genericamente aceito para anticorpos contra o vírus da febre amarela. Todos camundongos, independentemente da cepa, que receberam 2 ou 3 doses de vacina inativada dada sem adjuvante (Grupo 7), com alume (Grupos 1, 2, 3, 4, 9, 10, 11), ou com adjuvante de Freund (Grupos 5, 6) desenvolveram respostas de anticorpos neutralizantes. Títulos maiores do que 4096 foram encontrados em 5 entre 5 camundongos BALB/c imunizados com 3 doses de vírus inativado ligado a alume na 107 EU/dose. Estes títulos foram mais altos do que dos camundongos BALB/c imunizados com 3 doses de vírus inativado administrado co-adjuvante de Freund (Grupo 6, títulos 16-128). Camundongos CD1 imunizados com 2 doses de vírus inativado ligado a alume no nível de 108 EU/dose atingiram títulos mais altos (Grupo 9; títulos 512-1024) do que o fizeram os camundongos BALB/c similarmente imunizados (Grupo 3; títulos de 32-64). Apenas 1 em 5 camundongos que receberam YF Vax® viva (Grupo 8) somaram uma resposta de anticorpo neutralizante que era acima dos níveis da linha basal nos camundongos que receberam apenas alume (Grupo 11).

[00118] Na figura 7, cada símbolo representa um camundongo individual. Os grupos de tratamento estão indicados nas Tabelas 7 e 8. Para o Grupo 6 (*) a diluição mais alta do soro testada foi 1:128. Para o Grupo 9 (**) a diluição mais alta de soro testada foi 1:2048.

[00119] Este estudo demonstra que títulos robustos de anticorpos neutralizantes podem ser atingidos em camundongos imunizados com 2 ou mais inoculações do vírus da febre amarela inativado descrito administrado com alume. Os camundongos CD1 heterogêneos tiveram respostas de anticorpos mais altas do que a cepa endógama (BALB/c). O alume foi um adjuvante melhor do que Freund, mas este resultado poderia estar relacionado também à via de imunização (subcutânea para adjuvante de Freund versus intramuscular para alume). Estudos adicionais serão realizados para determinar se a imunogenicidade pode ser conseguida com uma única dose da vacina. Tabela 8 Camundongos com atividade de neutralização com redução de placas

EQUIVALENTES

[00120] Embora esta invenção tenha sido ilustrada e descrita particularmente fazendo referência a suas modalidades preferidas, os versados nessas técnicas devem entender várias mudanças na forma e detalhes podem ser feitas nela sem fugir do âmbito da invenção englobado pelas reivindicações apensadas. Adicionalmente, as referências, patentes e publicações de patente aqui citadas são incorporadas como referência em sua totalidade.

Claims

1. Cepa do vírus da Febre amarela YF 17D modificado, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que tem pelo menos uma mutação de ácido nucleico em relação à sequência de ácidos nucleicos do vírus da Febre Amarela YF 17D, em que pelo menos uma mutação de ácido nucleico é uma mutação na sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína não-estrutural 4B, no códon correspondendo ao aminoácido na posição 113 de uma proteína não-estrutural 4B de SEQ ID NO: 14, resultando em uma mudança de AUA para AUG.

2. Cepa do vírus da Febre Amarela modificado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a mutação de ácido nucleico no códon para o aminoácido na posição 113 de uma proteína não-estrutural 4B resulta em uma mudança de códon de isoleucina para metionina.

3. Vírus da Febre Amarela modificado, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que compreende um ácido nucleico de SEQ ID NO: 12 e/ou uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.

4. Cepa de Vírus da Febre Amarela YF 17D modificado, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos tendo três mutações de ácido nucleico em relação à sequência de ácido nucleico da cepa de vírus da Febre Amarela YF 17D, em que ditas três mutações são uma mutação na sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína não-estrutural 1 uma mutação na sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína não-estrutural 2A e uma mutação na sequência de ácidos nucleicos que codifica a proteína do envelope de acordo com a SEQ ID NO: 11, em que a mutação na sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína não-estrutural 1 compreende uma mutação no códon correspondente à treonina na posição 317 de uma proteína não-estrutural 1 e em que a mutação na sequência de ácidos nucleicos que codifica uma proteína não-estrutural 2A compreende uma mutação no códon correspondente à fenilalanina na posição 170 de uma proteína não-estrutural 2A e em que a mutação na sequência de ácidos nucleicos que codifica a proteína do envelope compreende uma mutação no códon correspondente à lisina na posição 160 da proteína do envelope, em que a dita cepa do vírus da Febre Amarela tem maior propagação em células e um rendimento mais alto no meio condicionado de uma cultura de células em relação ao vírus da Febre Amarela YF 17D não adaptado.

5. Vírus da Febre Amarela modificado, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a mutação no códon para o aminoácido na posição 317 da proteína não-estrutural 1 resulta em uma mudança de códon de treonina para isoleucina, e em que a mutação no códon para o aminoácido na posição 170 da proteína não-estrutural 2A resulta em uma mudança de códon de fenilalanina para leucina e em que a mutação no códon para o aminoácido na posição 160 da proteína do envelope resulta em uma mudança de códon de lisina para arginina.

6. Vírus da Febre Amarela modificado, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a mutação na sequência de ácidos nucleicos que codifica a proteína do envelope compreende um códon mutado a dic i o n al dentro de 10 Angstrons ou vinte aminoácidos a partir do aminoácido 160 e resulta em um valor de pKa da cadeia lateral do aminoácido mutado naquela posição que é mais alto do que o valor da pKa da cadeia lateral do aminoácido original naquela posição, ou em que a sequência de ácidos nucleicos que codifica a proteína do envelope compreende um códon mutado adicional na região de articulação molecular entre o Domínio I e II da proteína do envelope e resulta em um valor de pKa da cadeia lateral do aminoácido mutado naquela posição que é mais alto do que o valor de pKa da cadeia lateral do aminoácido original naquela posição.

7. Vírus da Febre Amarela modificado, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que compreende um ácido nucleico da SEQ ID NO: 11 e/ou uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7.