TR201810532T4 - Floresan konjügatlar. - Google Patents

Abstract

Buluşta, bir hedefleyici gruba (T) kenetli bir florokrom grubuna (F) sahip bir konjügat sağlanır. F grubu formül (I) ile gösterilir ve hedefleyici grup (T) bir tümör belirtecine, örneğin bir antikor veya antikor fragmanına karşı afinite sergilemesi ile karakterize edilir. Konjügat, rezeksiyon cerrahisi esnasında tümör nodüllerinin fotodeteksiyonu da dahil olmak üzere tümör tanısında kullanılabilir.

Description

TARIFNAME FLORESAN KONJÜGATLAR BULUS SAHASI Mevcut bulus biyomedikal arastirma alanina yönelik olup, daha özel bir ifadeyle, tani alaninda, örnegin tümörlerin in vitro veya in vivo tanisinda faydali bilesikler ve yöntemler ile BULUSUN ALTYAPISI Günümüzde kanser dünya genelinde tüm ölümlerin yaklasik olarak ragmen kanser yüksekr düzeyde gelismis ülkelerde ikinci önde gelen ölüm nedeni olmayi sürdürmektedir ve ölümlerin yaklasik olarak %25'inden sorumludur. Birçok kanser türü için çogu kez kemoterapi, radyasyon tedavisi veya hipertermi ile kombinasyon halinde uygulanan cerrahi müdahale terapötik müdahalenin temelini olusturur.

Bir kanser ayrica bir Halign neoplazm veya bir malign tümör olarak ifade edilir. Bir neoplazm dokunun anormal düzeyde büyümesidir. Neoplazmlar farklilasarak benign neoplazmlara, prekanseröz veya in situ neoplazmlara ve Hßlign neoplazmlara dönüsebilir. Tümü olmasa da çogu neoplazm ayrica anatomik olarak etkilenmemis dokudan farklilasabilen kati veya içi sivi dolu lezyonlar olan tümörleri meydana getirir. Neoplazmlar gibi tümörler de benign, prekanseröz veya malign olabilir.

Ancak yaygin dilde ve ayrica mevcut bulusun açiklamasinda kullanilabilir.

Kanser hastalarinin yasamsal prognozu, ilk tani koyuldugunda hastaligin evresine baglidir. Gastrointestinal kanserlerden mustarip hastalarin yüzde yirmi ila otuzunda essiz bir relaps olarak lokal-bölgesel nüks gelisir. Epitelyal over tümörleri de III. evreye ulastiklarinda lokal-bölgesel gelisim sergiler.

Birkaç yil önce tam cerrahi rezeksiyonun, hastalarin prognozunda iyilesme için çok Önemli bir faktör oldugu gösterilmistir. Bu maksimal sitoredüksiyon stratejisi, muhtemelen hipertermi ile iliskili sistemik veya intraperitoneal kemoterapi içeren terapötik protokollerin bir parçasidir.

Bir sagaltici cerrahi müdahalenin düzenlenmesi, hastalarin gelecegi için önemli bir parametredir. Tümör nodüllerinin bütünlügünün ve yayilimlarinin saptanmasi, ameliyat sonrasi prognozu etkileyen önemli bir noktadir. Tümör dokularinin ve normal dokularin ayirt edilmesi her zaman kolay degildir (özellikle hastalara neo-adjuvan tedavileri uygulandiginda).

Bu tip durumlarda cerrahlar sadece görme ve dokunma duyulariyla ve deneyimleriyle hareket eder; günümüzde cerrahlarin tümör yayilimlarini görüntülemesine yardimci olacak herhangi bir intraoperatif teknik mevcut degildir.

Kanser rezeksiyon cerrahisinin in situ fotodeteksiyon kullanilarak iyilestirilebilecegi önerilmistir.

Fotodeteksiyon, potansiyel olarak etkilenmis dokularin, bir tümöre karsi afinite sergileyen ve seçilen bir isik dalgaboyunda optik olarak görüntülenebilen bir bilesikle açiga çikarilmasini esas alir.

Tümör fotodeteksiyonu ilk olarak l980'lerde fotofrin gibi hematoporfirin türevleri kullanilarak gelistirilmistir. Bu moleküllerle gerçeklestirilen fotodinamik taninin temel kisitlamalari, bu moleküllerin kanseröz dokular için düsük seçicilige sahip olmasi ve kimyasal olarak reaksiyona girme ve yüksek fotosensitizasyon veya nekroz uyarma kapasitesine sahip olmasidir. Bu ikinci kisitlama aslinda bu bilesiklerin ayrica önerildigi fotodinamik tedavide bir avantajdir.

Folli Vd., karsinoembriyonik (CEA) antijene yönelik bir antikorun floresin ile konjügatini kolorektal karsinomlu hastalarda tümörleri görüntülemek için kullanmistir (Proc. karsinomu LSl74T lezyonlarinin bir anti-CEA MAb 35A7 ve indosiyanin (Cy5) konjügati ile immün fotodeteksiyonu Gutowsky vd. tarafindan bir fare modelinde gösterilmistir (Clin. Cancer Ancak bu konjügatlarin klinik kullanimi oldukça sinirlidir.

Antikorlarin floresin ile konjügatlarinin oldukça düsük bir uyarim ve yayinim dalgaboyuna sahip olmasi, düsük doku penetrasyonu ve kanseröz olmayan dokularda boya bilesenini uyarmak için kullanilan lazer isigi ile uyarilan önemli derecede spesifik olmayan bir otofloresans ile sonuçlanir. Cy5 konjügatlarinin toksikolojisi bilinmemektedir ve literatürde henüz saglam bir temele oturtulmamistir.

Mevcut bulus tümör fotodeteksiyonunun bu ve iliskili diger problemlerini ve dezavantajlarini ele alir. Bulusun amaçlarindan biri, klinik olarak Viyabl olan malign veya prekanseröz tümörlerin fotodeteksiyonu için faydali olan, önceki teknigin bir veya daha fazla dezavantaji ortadan kaldiran ve su özelliklerin bir veya daha fazlasina sahip olan iyilestirilmis konjügatlarin saglanmasidir: yüksek derecede tümör spesifikligi, çok küçük tümör lezyonlarinin saptanmasini saglayacak derecede yüksek duyarlilik, iyi klinik tolere edilebilirlik, yüksek stabilite, diger boyalarla çok düsük girisim ve iyi imal edilebilirlik.

Bulusun. baska. bir amaci, bu tip konjügatlar` kullanilarak. in Vitroda tümörler için iyilestirilmis tani yöntemlerinin ve in vivoda tümörler için tanisal kullanimlarin saglanmasidir. In vivoda bu tanisal kullanimlar yeni tedavilerin, örnegin iyilestirilmis tümör rezeksiyon yöntemlerinin bir parçasi olabilir.

Bulusun baska bir amaci, bu tip konjügatlarin hazirlanmasina yönelik yöntemlerin saglanmasidir.

Bulusun diger amaçlari bulusun asagidaki açiklamasi ve patent istemleri üzerinden açikça anlasilacaktir.

BULUSUN KISA AÇIKLAMASI Özet olarak bulusta, bir hedefleyici gruba (T) kenetli bir florokrom grubu (F) içeren bir floresan konjügat saglanir, burada E` grubuv ilerleyen kisimlarda tanimlananv formül (I)'e sahiptir, burada Y her durumda bagimsiz olarak SOgH, 803- ve SO3M arasindan seçilir; M bir tek degerlikli katyondur; X, 2 ve y bagimsiz olarak 1 ila 8 araliginda bir tamsayidan seçilir ve burada T grubu bir tümör belirtecine karsi afinite sergiler.

Bir yapilanmada florokrom grubu (F), ilerleyen kisimlarda tanimlanan formül (II)'ye sahip olabilir.

Hedefleyici grubun (T) afinite sergiledigi tümör belirteci bir tümör antijeni, örnegin belirli tümör hücreleri tarafindan eksprese edilen veya asiri düzeyde eksprese edilen bir antijen olabilir. Böylesi bir antijen örnegi karsinoembriyonik antijendir (CEA). Hedefleyici grubun (T) kendisi bir peptit disi ligand, bir antikor, bir antikor fragmani veya bir antikorun en az bir degisken bölgesini içeren bir füzyon proteini olabilir. Bir yapilanmada hedefleyici grup (T) bir antikordur, özellikle bir kimerik, hümanize veya insan kökenli monoklonal antikordur.

Baska bir yönü itibariyla bulusta, böylesi bir konjügati istege bagli olarak diger etken veya etken olmayan Haddeler ile kombinasyon halinde içeren bir bilesim saglanir. Örnegin bilesim steril olabilir ve enjeksiyonluk su, tampon bilesenleri, bir veya daha fazla stabilizör, örnegin amino asitler, liyofilizasyon yardimcilari, örnegin monosakkaritler, disakkaritler veya oligosakkaritler, izotoniklik ayarlayici maddeler ve benzeri etken olmayan maddeler içerebilir. Bilesim ayrica konjüge edilmemis formda az Haktarda hedefleyici grup (T) içerebilir.

Daha baska bir yönü itibariyla bulusta, konjügatin hazirlanmasina yönelik bir yöntem saglanir. Yöntem, (a) ilerleyen kisimlarda tanimlandigi üzere Y'nin her durumda bagimsiz olarak SO3H, 803- ve SOd4 arasindan seçildigi, M'nin tek degerlikli bir katyon oldugu, x, 2 ve y'nin bagimsiz olarak l ila 8 araliginda bir tamsayidan seçildigi ve Z'nin bir karsit iyon, hidrojen, süksinimidil, sülfosüksinimidil ve nitrofenil arasindan seçildigi formül (III)'e sahip bir florokromun saglanmasi; (b) bir tümör belirtecine karsi afinite sergileyen bir hedefleyici maddenin saglanmasi ve (c) florokrom ile hedefleyici maddenin kenetlenmesi adimlarini içerir. Bir yapilanmada florokrom, ilerleyen kisimlarda tanimlanan formül (IV)'e sahiptir.

Bulusta ayrica konjügatin ve konjügati içeren bilesimin klinik ve klinik olmayan kullanimlari saglanir. In vitro kullanim, bir numunede bir tümör hücresini veya tümör hücrelerini saptamaya ya da bir tümörü in vitro olarak tanilamaya ve/veya izlemeye yönelik kullanimi kapsar. Konjügat ve/Veya konjügati içeren bilesim klinik olarak bir hastada tümör belirteci eksprese eden bir tümörün fokuslarini saptamak veya tümör belirteci eksprese eden bir tümörün yerini belirlemek için kullanilabilir. Örnegin rezeksiyon cerrahisi uygulanan veya uygulanmis bir hastada rezeksiyon sinirindaki tümör hücrelerinin veya tümör dokusunun saptanmasi için kullanilabilir. Bir yapilanmada, konjügati içeren bir bilesim, hedefleyici grubun (T) afinite sergiledigi tümör belirtecini eksprese eden bir tümöre sahip bir hastaya örnegin intravenöz, intraperitoneal, subkütanöz veya intramusküler enjeksiyon veya perfüzyon yoluyla ya da inhalasyon veya topikal uygulama yoluyla, Örnegin bir sprey formunda verilir; en fazla yaklasik 72 saat sonra hastanin tümör rezeksiyon cerrahisi baslatilir ve rezeksiyon cerrahisi uygulanan hastanin rezeksiyon bölgesinde yer alan bir doku, yaklasik 660 ila 700 nm'lik bir dalgaboyuna sahip bir isik ile aydinlatilir. Bu sayede, aksi takdirde çiplak insan gözüyle görülemeyen çok küçük nodüllerin veya lezyonlarin lokalizasyonu. da dahil olmak. üzere tümörün lokalizasyonu, cerrahin tümör dokusunu tamamen rezekte etmesini ve/Veya rezeksiyonun tamamlandigini dogrulamasini saglamak üzere cerrahi yönlendirecek sekilde görüntülenir.

SEKILLERIN KISA AÇIKLAMASI Sekil 1, bir LS-l74T peritoneal karsinomatoz fare modelinde Örnek 3'e göre 20 ug floresan konjügat uygulandiktan sonra 700 nm'de görüntülendigi üzere in situ (sütun A) ve rezekte edilmis (sütun B) tümöral mikronodüllerin floresansini gösterir.

Sekil 2A, CEA'yi asiri düzeyde eksprese eden insan kolorektal kanserinin (HT-29) subkütanöz tümör fare modelinde 30 ug'lik floresan konjügatlar (A - Örnek 3'e göre floresan konjügat; B - kontrol konjügati) uygulandiktan 48 saat sonra alinan tümör görüntülerini gösterir. Sütunlar soldan saga dogru beyaz isik altinda alinan görüntüleri, floresans (700 nm'de görüntüleme) görüntülerini ve örtüsmeli görüntüleri gösterir.

Sekil 2B, CEA'yi asiri düzeyde eksprese eden insan kolorektal kanserinin (HT-29) ortotopik tümör fare modelinde Örnek 3'e göre 30 ug floresan konjügat uygulandiktan 48 saat sonra alinan tümör görüntülerini gösterir (A - insizyondan önce, B - insizyondan sonra, C - tümör açiga çikarildiktan sonra).

Sütunlar soldan saga dogru beyaz isik altinda alinan görüntüleri, floresans (700 nm'de görüntüleme) görüntülerini ve örtüsmeli görüntüleri gösterir.

Sekil 3, Örnek 3'e göre 5 mg floresan konjügat uygulandiktan 48 saat sonra bir hastada bir primer pankreas tümörü cerrahisi esnasinda alinan görüntüleri gösterir (A, beyaz isik altinda alinan görüntüdür ve B, floresans örtüsmeli görüntüdür). Kesik çizgi, sadece görüntüleme ve elle muayene esasinda önerilen rezeksiyon sinirini gösterir, düz çizgi ise floresans görüntülemesi esasinda önerilen rezeksiyon sinirini gösterir.

Noktali çizgi, floresans ile görüntülendigi üzere tümörün yaklasik konturunu gösterir.

Sekil 4, bir pankreas kanseri hastasinda Örnek 3'e göre 5 mg floresan konjügat uygulandiktan 48 sa sonra bir peritoneal metastazin görüntülerini gösterir. A sirasindaki görüntüler operasyon esnasinda in Vivo olarak elde edilmistir ve B sirasindaki görüntüler rezeksiyondan sonra ex Vivo olarak elde edilmistir (soldaki sütun beyaz isik altinda elde edilmistir ve sagdaki sütun floresans ile bir örtüsmeli görüntü olarak elde edilmistir).

BULUSUN DETAYLI AÇIKLAMASI Birinci yönü itibariyla mevcut bulusta, bir hedefleyici gruba (T) kenetli bir florokrom grubu (F) içeren bir floresan konjügat saglanir, burada F grubu formül (I) ile gösterilir: (715%). (9), (THE) burada Y her durumda bagimsiz olarak SOsH, 803- ve 803M arasindan seçilir; M tek degerlikli bir katyondur; x, 2 ve y bagimsiz olarak 1 ila 8 araliginda bir tamsayidan seçilir ve burada T grubu bir tümör belirtecine karsi afinite sergiler.

Tek degerlikli katyonlara dair örnekler, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, Na, K 'veya. amonyumu kapsar. Tercih. edilen yapilanmalarin birinde Y, 803- ve SO3Na arasindan seçilir.

Bulus konusu floresan konjügatta bir floresan boya veya isaret veya bir florofor grubu olarak adlandirilabilen florokrom grubu (F), tercihen morötesi, görünür spektrum veya kizilötesi dalgaboyu araliginda elektromanyetik enerjiyi sogurur ve genel olarak daha genis bir dalgaboyu araliginda, tercihen görünür veya yakin kizilötesi aralikta yayinim yapar. Burada kullanildigi haliyle uyarim dalgaboyu (nm cinsinden ifade edilir) terimi, florokromun ya da. bir hedefleyici gruba (T) kenetli florokrom grubu içeren floresan konjügatin pik, yani maksimal veya spesifik sogurum dalgaboyunu ifade eder. Yayinim dalgaboyu (nm cinsinden ifade edilir) terimi, florokromun veya bulus konusu bir hedefleyici gruba kenetli florokrom grubu içeren floresan konjügatin pik, yani maksimal veya spesifik yayinim dalgaboyunu ifade eder.

Florokrom grubu (F) yukarida tarif edildigi üzere Formül (I) ile gösterilen bir siyanin türevidir ve tercihen 650 ila 750 nm'lik bir pik yayinini dalgaboyu araligi ile birlikte uzak görünür veya yakin kizilötesi (NIR) spektrumda yayinim yapar.

Hedefleyici gruba (T) kenetlendiginde elde edilen konjügat da tercihen 650 ila 750 nm'lik bir pik yayinim araliginda yayinim Bu florokrom gruplarinin özellikle sönümlenme, kuantum verimi ve bilhassa floresans yitimine ("photobleaching") karsi dayaniklilik gibi elverisli floresan karakteristiklerine sahip oldugu ve dolayisiyla antijenlere karsi aktif olan hedefleyici gruplar ile konjügasyonda güvenilir sekilde kullanilabilecegi bulus sahipleri tarafindan kesfedilmistir.

Y ile ilgili olarak, ilgili alanin uzmanlari, konjügatin kimyasal ortamina bagli olarak, SO3H, 8033 SOüd ve/veya SO3Na gruplarinin ayrica dinamik olarak birbirlerine dönüsebilecegini takdir edecektir. Örnegin bir sulu ortamda çözündügünde ve pH seviyesine ve diger katyonlarin kullanilabilirligine bagli olarak, Y ile gösterilen ve 8033 SO3M 've/veya SOaNa arasindan seçilen bir grup ayrica proton alip SOaH'ye dönüsebilir veya baska bir tuz formuna, örnegin SOsNa'dan SOaK'ye veya tam tersine dönüsebilir. Dolayisiyla mevcut bulus, formül (I) bilesiginin bu tip alternatif formlarini kapsar. Özellikle tercih edilen konjugatlar, Formül (II) ile gösterilen bir florokrom grubuna (F) sahip olanlardir: Floresan konjügatlarda florokrom grubu (F) bir hedefleyici gruba (T) kenetlenir; tercihen hedefleyici gruba (T) kovalent olarak, yani amid veya ester bagi gibi bir kovalent bag üzerinden baglanir.

Formül (I) baglaminda belirtildigi üzere, formül (II) ayrica Y ile gösterilen gruplar bakimindan örnegin konjügatin içinde çözündügü bir sulu ortamin bilesimine ve/Veya pH degerine bagli olarak kimyasal denge altinda in situ olarak üretilen SO3H veya 803K gibi alternatif sülfonik asit formlari içerdigi yönünde yorumlanabilir. Ayrica, Formül (ll)'de dört sülfonik asit grubundan her birinin Na tuzu veya iç tuz formunda olabilecegi ve gösterildigi haliyle Formül (II)'nin, bilesigi göstermeye yönelik çesitli olasiliklardan sadece birini temsil ettigi anlasilmalidir.

Floresan konjügatlarin hedefleyici gruplari (T) tümör belirteçlerine karsi afinite sergiler ve bir tümör belirtecine baglanabilir veya bununla birlesebilir. Bir tümör belirtecinden kasit, bir tümör tarafindan üretilen veya bir tümörde bulunan ya da bir tümörün varligina yanit olarak bir hastanin normal hücre mekanizmalari tarafindan üretilen› bir ürün veya leeküldür. Burada kullanildigi haliyle bir tümör, spesifik baglamdan farkli bir anlam çikmamasi kaydiyla, anormal veya kontrolsüz hücre büyümesinden kaynaklanan bir hücre veya doku grubu veya kitlesi olan bir neoplazm anlamina gelir. Tümör belirteci özellikle kanseröz veya malign bir tümörde üretilir.

Tümör belirteci örnegin bir protein, bir glikoprotein, bir reseptör, bir hormon, bir enzim, bir antijen ya da bir onkogen veya bunun bir ürünü formunda bulunabilir. Tümör belirteci normal hücrelere kiyasla tümör hücreleri tarafindan asiri düzeyde eksprese edilebilir veya tümör hücreleri tarafindan essiz olarak üretilen tümöre özgü bir madde olabilir.

Hedefleyici grubun (T) hedeflenebilecegi veya yönlendirilebilecegi özellikle tercih edilen tümör belirteçleri, tümör hücresi yüzeyinde bulunan hücre yüzeyi proteinleri veya reseptörleri tipinde olanlardir ve/veya özellikle epitelyal hücrelerde veya karsinomlar veya sarkomlar gibi kati tümörlerde eksprese edilenlerdir.

Bulusun tercih edilen bir yapilanmasinda, tümör belirteci bir tümör antijenidir. Bir tümör antijeni, tümör hücrelerine özgü veya tümör hücreleri ile iliskili olan (örnegin tümör hücrelerinde asiri düzeyde eksprese edilen) ve antikorlarin ve T hücrelerinin üretimi ve/veya B hücre yaniti gibi bir immün sisteni reaksiyonunu baslatabilen veya uyarabilen bir Inolekül veya üründür. Tümör antijeni bir proteinden veya bir lipitten olusabilir veya bir protein veya bir lipit içerebilir.

Glikosillenmis olabilir (örnegin bir glikoprotein) ve bir veya daha fazla epitopa, yani bir antikorun, B hücresinin veya T hücresinin tercihli olarak baglanabilecegi veya belirli bir afinite sergiledigi bölgelere veya domenlere sahip olabilir. Örnek tümör antijenleri, onkoviral proteinlerden türetilen veya üretilen tümör antijenler, normalde sadece fetüs gelisimi esnasinda yüksek düzeylerde üretilen onkofetal antijenler, normal bir hücreye kiyasla tümör hücresinde asiri düzeyde eksprese edilen veya biriken antijenler veya mutasyona ugramis veya translasyondan sonra degisime ugramis antijenleri kapsar.

Tümör belirteci tercihen karsinoembriyonik antijen (CEA), epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR) ve insan epidermal büyüme faktörü reseptörü 2 (HERZ) arasindan seçilen bir tümör antijenidir.

Bulusun tercih edilen bir yapilanmasinda, tümör antijeni karsinoembriyonik antijendir (CEA). CEA, epitelyal hücrelerde eksprese edilen 180-200 kDa'lik bir molekül agirligina sahip bir onkofetal glikoproteindir. CEA özellikle kolon ve rektumun malign tümörlerinde (kolorektal kanserlerin %95'inde asiri düzeyde eksprese edilir) ve ayrica mide, ince bagirsak, pankreas, karaciger, meme, over, serviks, mesane, safra kesesi ve akcigerin malign tümörlerinde hücre yüzeyinde yüksek düzeylerde eksprese edilir. CEA tipik olarak lokalize degildir ve tüm hücre yüzeyinde ve ayrica intraglandular lümen ve intraselüler lümende eksprese edilebilir. CEA antijeni tanimlandigi üzere GOLD-1 ila GOLD-5 olarak siniflandirilan bes majör epitop içerir ve bir anti-CEA antikor veya antikor fragmani veya füzyon proteini bunlara karsi baglanma spesifikligi sergileyebilir.

Tercih edilen yapilanmalarin birinde, bulus konusu floresan konjügatin hedefleyici grubu (T), bir hastada kolon, rektum, mide, ince bagirsak, pankreas, karaciger, meme, over, serviks, mesane, safra kesesi, akciger ve özofagus arasindan seçilen bir veya daha fazla dokuda veya organda yerlesik olabilen bir CEA antijeni eksprese eden tümörü hedef alir ve bu tümöre baglanir.

Tercih edilen baska bir yapilanmada, floresan konjügatin hedefleyici grubu (T), reseptör tipi bir tümör belirtecine baglanabilir. Reseptör tümör hücresine özgü olabilir veya tümör hücrelerinde asiri düzeyde eksprese edilebilir ve daha yüksek düzeylerde bulunabilir. Hedefleyici grup (T) bu tip reseptörler için bir ligand olarak islev görebilir ve bir küçük peptit disi molekül, yani herhangi bir amino asit sekansi içermeyen veya herhangi bir amino asit sekansindan olusmayan bir kimyasal unsur veya bilesik olabilir.

Tercih edilen bir yapilanmada, bulus konusu floresan konjügat, formül (I) veya (IT) ile gösterilen bir florokrom ile birlikte, bir peptit disi ligand, bir antikor, bir antikor fragmani ve bir antikorun en az bir degisken bölgesini içeren bir füzyon proteini arasindan seçilen bir hedefleyici grup (T) içerir. Tercih edildigi haliyle, bu tip herhangi bir hedefleyici grup, CEA, HERZ veya EGFR gibi bir tümör antijenine spesifik olarak baglanma kapasitesine sahiptir.

Floresan konjügat, spesifik bir yapilanmada, formül (I) veya (II) ile gösterilen bir florokrom ile birlikte, bir peptit disi ligand, bir antikor, bir antikor fragmani ve bir antikorun en az bir degisken bölgesini içeren bir füzyon proteini arasindan seçilen ve CEA'ya spesifik olarak baglanan bir hedefleyici grup (T) içerir.

Belirli bir yapilanmada, hedefleyici grup (T) bir antikor veya bir antikor fragmani veya bir antikorun en az bir degisken bölgesini içeren bir füzyon proteinidir. Bu durumda, antikor, antikor fragmani veya bir füzyon proteininde bir antikorun en az bir degisken bölgesi, IgG, IgA, IgD veya IgM immünglobülin izotipleri veya siniflarinin herhangi birinde türetilebilir veya buna ait olabilir. Bir tam uzunluklu antikor tipik olarak bir Fc (kristallesebilen fragman) domenine ve bir Fab (antijen baglayici fragman) domenine sahip Y seklinde bir glikoproteindir. Bunlar, Y seklindeki yapiyi olusturmak üzere disülfit baglari üzerinden birbirine baglanan bir çift agir zincir (H) ve hafif zincir (L) polipeptit yapisindan olusur.

Her bir zincir bir degisken bölge (V) ve bir sabit bölge (C) içerir. Agir zincir, bir degisken zincir` bölgesine (vm ve çesitli sabit bölgelere (CHl, CH2 vs. seklinde kisaltilir) sahiptir; hafif zincir ise sadece bir degisken zincir bölgesine (V9 ve bir sabit bölgeye (Cm sahiptir. Degisken bölgeler, antikorun antijendeki belirli bir epitopu tanima ve bu epitopa baglanma spesifikligine karisir ve antijen baglayici Fab domenlerini olusturur.

Antikor fragmanlari, bir antikorda ya da bunun herhangi bir konstrakti, stabilize formu veya konjügatinda, bir antijen ile etkilesime geçme ve bu antijene spesifik olarak baglanma kapasitesine sahip herhangi bir bölgeyi, zinciri veya domeni ifade eder. Örnek antikor fragmanlari, fragman tipi antijen baglayici domenler (Fab veya Fab'), Fab konstraktlari, tek Zincirli degisken fragmanlar (scFv), tekr domenli antikorlar, örnegin VHH, minikorlar, diakorlar ve benzerlerini kapsar.

Füzyon proteini, baska bir biyoaktif protein veya polipeptit ile kaynastirilmis bir antikor fragmanindan olusan bir konstrakti ifade eder.

Tercih edilen bir yapilanmada, bulus konusu floresan konjügatin hedefleyici grubu (T) bir monoklonal antikordur (mAb). Bu, ilgili alanda bilinen yöntemlerle üretilebilir.

Kimerik monoklonal antikorlar özellikle tercih edilir. Bunlar, birden fazla türden, örnegin insan ve murin antikorlarindan türetilen agir veya hafif zincirlerin domenlerini veya bölgelerini içeren hibrit monoklonal antikorlardir. Istege bagli olarak, floresan konjügatin hedefleyici grubu (T) bir hümanize antikor (genelde agirlikli olarak en az %85-95 oraninda insan kökenli sekanslar içerir) veya sadece insan gerni hatti antikor sekansindan türetilen bir insan antikoru olabilir.

Tercih edildigi haliyle, bu tip herhangi bir hedefleyici grup (T), CEA tümör antijenine spesifik olarak baglanma kapasitesine sahiptir.

Bir yapilanmada, formül (I) ile gösterilen bir florokrom grubuna (F) sahip floresan konjügatin hedefleyici grubu (T), CEA antijenindeki epitoplarin, örnegin GOLD-l, GOLD-2, GOLD-3, GOLD-4 veya GOLD-5 epitoplarinin bir veya daha fazlasina karsi baglanma spesifiklikleri sergileyen bir kimerik monoklonal antikordur. Spesifik bir yapilanmada hedefleyici grup (T), GOLD-2 epitopuna karsi afinite ve/veya spesifiklik sergiler.

Baska. bir yapilanmada, bu tip konjügatlarin florokroni grubu (F), yukarida tarif edilen formül (II)'ye sahiptir. Özellikle tercih edilen bir yapilanmaya göre bulusta, bir hedefleyici gruba (T) kenetli bir florokrom grubu (F) içeren bir floresan konjügat saglanir, burada F grubu formül (II)'ye sahiptir ve burada T grubu, G1m3 allotipinin agir Zincirlerini ve km3 allotipinin hafif Zincirlerini içeren CEA'nin GOLD-2 epitopuna yönelik bir kimerik mAb'dir, her bir agir zincir ve her bir hafif zincir en az bir fare kökenli lgGl degisken domenine ve en az bir insan kökenli sabit domene sahiptir. Bu kimerik monoklonal antikor, ilgili alanda. bilinen rekabetçi baglanma/inhibisyon testleriyle belirlendigi üzere, CEA'nin GOLD-2 epitopuna karsi baglanma spesifikligi sergiler.

Daha özel bir ifadeyle, floresan konjügat, eksprese edilen CEA'ya yönelik olan ve asagidaki nükleotit sekanslarindan hazirlanan bir kimerik mAb'ye kenetlenebilir: (A) Agir Zincir (SEQ ID NO: 1): GGTACCGCCGCCACCATGGACTCCAGACTGAACCTGGTGTTCCTGGTGCTGATCCTGAAG GGCGTGCAGTGCGACGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGC TCCAGAAAGCTGTCTTGTGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCAACTTCGGCATGCACTGG ATCCGGCAGGCCCCTGAGAAGGGCCTGGAATGGGTGGCCTATATCTCCGGCGGCTCCTCC ACCATCTACTTCGCCGACACCCTGAAGGGACGGTTCACCATCTCCCGGGACAACCCCAAG AACACCCTGTTTCTGCAGATGACCTCCCTGCGGAGCGAGGACACCGCCATCTACTACTGC GCCAGAGACTACTACATCAACAACTACTGGTACTTCGACGTGTGGGGCGCTGGCACCACC (B) Hafif Zincir (SEQ ID NO: 2): GTCGACGCCGCCACCATGGAATTTCAGACCCAGGTGTTCGTGTTCGTGCTGCTGTGGCTG TCTGGCGTGGACGGCGACATCGTGATGACCCAGTCCCAGAAATTCATGTCCACCTCCGTG GGCGACCGGGTGTCCATCACATGCAAGGCCTCTCAGAACGTGCGGAGCGCCGTGGCCTGG TATCAGCAGACACCTGGCCAGAGCCCCAAGGCCCTGATCTACCTGGCCTCCAACAGATAC ACCGGCGTGCCCGATCGGTTCACCGGCTCTGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGACCATC TCCAACGTGCAGTCCGAGGACCTGGCCGACTACTTCTGTCTGCAACACTGGAACTACCCC CTGACCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGGAACTGAAGCGTACG Yukaridaki degisken agir zincir nükleotit sekansi (A) 5' ve 3' uçlarinda sirasiyla Kpnl ve Nhel restriksiyon bölgeleri için sekanslar içerir. Degisken hafif zincir nükleotit sekansi (B) sekansin 5' ve 3' ucunda sirasiyla SalI ve BSiWI restriksiyon bölgesi sekanslari içerir.

Bu mAb'nin degisken bölgelerinin amino asit sekansi asagidaki sekanslara karsilik gelir: (A) Agir Zincir (SEQ ID NO: 3): Ala Arg Asp Tyr Tyr Ile Asn Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Va] Trp Gly Ala Gly Thr Thr ValThrValSerSer (B) Hafif Zincir (SEQ ID NO: 4): Bulusun tercih edilen bir yapilanmasinda, floresan konjügat, bir hedefleyici gruba (T) kenetli formül (II)'ye sahip bir F grubu içerebilir, burada T, SEQ ID NO: 4 ile gösterilen bir degisken hafif zincir bölgesine ve SEQ ID NO: 3 ile gösterilen bir degisken agir zincire sahip CEA'ya yönelik bir kimerik mAb'dir.

Bulus konusu floresan konjügat, bir hedefleyici gruba (T) kenetli birden fazla floresan F grubu, örnegin bir hedefleyici grup (T) için 1 ila yaklasik 10 El grubu içerebilir. Tercih edildigi haliyle, bir hedefleyici gruba (T) kenetli florokrom gruplarinin (F) sayisi 1 ila 4 arasindan seçilir. Baska bir ifadeyle, bu tercih edilen konjügatin bir molekülünde, bir T grubuna n adet F grubu kenetlenir ve burada n, 1 ila 4 arasindan seçilen bir tamsayidir.

Tek bir konjügat molekülü n'nin bir tamsayi olmasi ile karakterize edilebilir, ancak çok sayida konjügat molekülü içeren bir bilesik bir konjügasyon derecesine sahip olabilir veya her bir T grubu için F gruplarinin ortalama sayisinin bir tamsayi olmasi gerekmez, ancak tercihen yaklasik 1 ila yaklasik 4 araliginda herhangi bir deger olabilir.

Bu baglamda, hedefleyici grup (T) tercihen bir antikor, bir antikor fragmani ve bir antikorun en az bir degisken bölgesini içeren bir füzyon proteini arasindan seçilir ve formül (I) ile gösterilen bir ila dört florokrom grubuna (F) kenetlidir.

Bulusun bir yapilanmasinda hedefleyici grup (T), formül (II) ile gösterilen` n florokroni grubuna (F) kenetli. bir anti-CEA kimerik monoklonal antikordur, burada n, 1 ila 4 araligindadir.

Bulusun baska bir yönü, yukarida tarif edilen floresan konjügati içeren bir bilesimi kapsar.

Bir yapilanmada bilesim, konjügasyon derecesi bakimindan münferiden veya agirlikli olarak farklilik gösteren farkli floresan konjügatlarinin bir karisimini içerir. Baska bir spesifik yapilanmada bilesim, her biri CEA'nin GOLD-2 epitopuna karsi afinite sergileyen bir kimerik mAb'ye kenetli formül (II)'ye sahip bir florokrom grubu (F) içeren en az 3 veya 4 konjügatin bir karisimini içerir ve burada en az 3 veya 4 konjügatin birbirlerinden farki, bir hedefleyici gruba (T) kenetli florokrom gruplarinin (F) sayisinin sirasiyla 1, 2 ve 3 olmasi veya sirasiyla 1, 2, 3 ve 4 olmasidir.

Bilesim ilaveten hedefleyici grubu (T) konjüge edilmemis formda saglayan bir bilesik (veya teorik olarak sübstitüsyon derecesi sifir olan bir konjügat) içerebilir. Örnegin bu tip bir bilesim, yukarida tarif edilen yapilanma ile kombinasyon halinde, CEA'nin GOLD-2 epitopuna karsi afinite sergileyen konjüge edilmemis kimerik mAb'yi, ayni mAb'nin formül (II) ile gösterilen sirasiyla 1, 2, 13 ve istege bagli olarak 4 veya daha fazla florokrom grubu (F) ile kenetli en az üç veya dört konjügati ile birlikte içerir. Bu karisimin konjügat popülasyonlari ilgili alanda bilinen kütle spektrometrisi (örnegin MALDl-TOF) gibi yöntemlerle belirlenebilir.

Bilesimdeki konjügatlarin ortalama konjügasyon derecesi tercihen yaklasik 0.5 ila yaklasik 3'tür. Konjügasyon derecesi, spektrofotometrik olarak belirlenebilen florokromzantikor mol oranidir. Dolayisiyla söz konusu sayinin bilesimde bulunan konjügatlarin ve herhangi bir konjüge edilmemis antikorun ortalama konjügasyon derecesini yansittigi anlasilmalidir. Baska bir yapilanmada, ortalama› sübstitüsyon derecesi yaklasik 1 ila yaklasik 2'dir. Bulus sahipleri, daha yüksek bir sübstitüsyon derecesinin iyilestirilmis görüntüleme saglayabilmesine ragmen, hedefleyici gruba kenetli florokrom gruplarinin sayisi arttikça, hedefleyici grubun tümör belirtecine karsi afinitesinin azaldigini bulmustur. Yaklasik 0.5 ila yaklasik 3'lük bir sübstitüsyon derecesinin, özellikle CEA'nin GOLD-2 epitopüna karsi afinite sergileyen bir kimerik mAb'nin formül (II) ile gösterilen bir florokrom ile konjügatlarini içeren bilesimler için en iyi sekilde islev gördügü ve bu baglamda cerrahi esnasinda CEA eksprese eden bir tümörün küçük nodüllerinin bile mükemmel düzeyde görüntülenmesini sagladigi belirlenmistir.

Bulus konusu bilesim ilaveten tamponlar, stabilizörler, kriyoprotektanlar ve izotonik maddeler, pH düzenleyici maddeler gibi eksipiyanlar içerebilir. Özellikle tercih edilen eksipiyanlar, bazik amino asitler, örnegin L-arginin ve bunun tuzlari, tuzlar, örnegin sitrat, sodyum veya potasyum fosfat tuzlari, sodyum klorür, potasyum klorür, sakkaritler, örnegin trehaloz, mannitol, maltoz, sakaroz veya dekstran ya da bir iyonik olmayan yüzey aktif, örnegin bir polisorbat veya bir poloksameri kapsar. Bilesimin pH seviyesi tercihen 5.2 ila 7.2 araligindadir. Bilesini tercihen ilgili alanda› bilinenr steril kosullar altinda hazirlanir ve sterildir.

Belirli bir yapilanmada, yukarida tanimlanan floresan konjügatlardan herhangi birini içeren bilesim sterildir ve ilaveten bir sulu tampon ve L-arginin içerir ve/veya F grubuna kenetli olmayan bir T grubuna sahip bir bilesik içerir. Baska bir yapilanmada, yukarida tanimlanan floresan konjügatlardan herhangi birini içeren bilesim sterildir ve pH seviyesi yaklasik 6.0 olarak ayarlanmis bir sulu tampon, L-arginin hidroklorür ve bir polisorbat, tercihen polisorbat 20 içerir.

Bu bilesimlere istege bagli olarak bir sakkarit, örnegin trehaloz, mannitol, maltoz veya sakaroz da dahil edilebilir.

Baska bir belirli yapilanmada, bilesimdeki floresan konjügatin konsantrasyonu, hedefleyici grup, örnegin anti-CEA mAb içerigi esasinda (ilgili alanda bilinen spektrofotometri veya HPLC yöntemleriyle belirlendigi üzere) 1 mg/mL ila 10 mg/mL araligindadir.

Bulusun daha baska bir yönü itibariyla, bir floresan konjügatin hazirlanmasina yönelik bir yöntem saglanir, bu yöntem su adimlari içerir: (a) formül (III) ile gösterilen bir florokromun saglanmasi, burada Y her durumda bagimsiz olarak SOgH, 803- ve SOü4 arasindan seçilir, burada M tek degerlikli bir katyondur; x, 2 ve y bagimsiz olarak 1 ila 8 araliginda bir tamsayidan seçilir ve Z bir karsit iyon, hidrojen, süksinimidil, sülfosüksinimidil ve nitrofenil arasindan seçilir; (b) bir tümör belirtecine karsi afinite sergileyen bir hedefleyici maddenin saglanmasi ve (c) florokromun hedefleyici maddeye kenetlenmesi.

Tek degerlikli katyonlara dair örnekler, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla, Na, K 'veya amonyumu kapsar. Tercih. edilen yapilanmalarin birinde Y, 803- ve SO3Na arasindan seçilir.

Bir tümör belirtecine karsi afinite sergileyen bir hedefleyici gruba (T) kenetli formül (I) ile gösterilen bir florokrom grubuna (F) sahip bulus konusu floresan konjügatlar bu hazirlama yöntemleriyle elde edilebilir. Önceki paragraflarin herhangi birinde konjügatin kendisi baglaminda tarif edildigi üzere hedefleyici grup (T) ve florokrom grubu (F) ile ilgili seçenekler ve tercihler, yöntemde kullanilacak hedefleyici madde ve florokrom için de geçerlidir. Dolayisiyla, hedefleyici madde tercihen konjügatin hedefleyici grubunu (T) içeren bir bilesiktir ve yöntemde kullanilan florokrom tercihen konjügatin florokrom grubunu (F) içeren veya saglayan bir bilesiktir. Hedefleyici madde tercihen bir tümör antijenine, örnegin karsinoembriyonik antijene (CEA) karsi afinite sergiler. CEA'ya karsi afinite, bu antijenin bilinen epitoplarindan herhangi birine, örnegin GOLD-2 epitopuna yönelik olabilir. Özellikle tercih edilen bir yapilanmada, hedefleyici madde, CEA'ya karsi afinite sergileyen bir kimerik monoklonal antikordur.

CEA'ya karsi afinite sergileyen kimerik monoklonal antikor (mAb), kimerik mAb'yi kodlayan bir ekspresyon vektörü ile transfekte edilmis CHO hücrelerinden ekspresyon yoluyla üretilebilir. Ekspresyon vektörü tercihen antikor insan sabit domenleri ve anti-CEA antikor murin degisken domenleri, tercihen yukarida tarif edilen sekansa sahip degisken domenler için kodlama yapan nükleotit sekanslarina sahiptir.

Konjügatlarin hazirlanmasinda faydali florokromlar, US 8,034,626'da açiklanan yöntemlere ve Diyagram Ia'nin reaksiyon semasina benzer sekilde hazirlanabilir. Florokromlar örnegin gerekli sülfonat ve (alkil)oksi sübstitüsyonlarini içeren iki indolenin türevinin kondenzasyonu üzerinden sentezlenebilir, burada indolenin türevlerinden biri bir asetanilodo türevi formundadir. Bir indolenin ara ürünü, bir yapilanmada, diazotasyon/indirgenme adimlari ve akabinde sülfonasyon, hidroksilasyon, bir keton. ile Fischer siklizasyonu. üzerinden indolenine dönüsüm, hidroksil sübstitüentinin karboksilialkilasyonu ve bir sülton ile kuarternizasyon adimlari araciligiyla bir amino-aromatik öncülden hazirlanabilir.

Baska bir yapilanmada florokrom, bir formül (IV) bilesigidir: Bulus konusu florokromlar, bir hedefleyici grup (T) ile konjügasyon için tercihen bir aktif ester (örnegin süksinimidil ester) formunda aktiflestirilebilir. Bir yapilanmada, formül (I) veya (II) ile gösterilen florokrom, ilgili alanda bilinen kovalent kenetleme yöntemlerine göre amid, ester, tioester, disülfit veya karbamat baglantilari üzerinden hedefleyici gruba (T) kenetlenir. Hedefleyici grubun (T) bir antikor, antikor fragmani veya peptidik sekans oldugu bulusun baska bir yapilanmasinda florokrom tercihen bir amid bagi araciligiyla hedefleyici grubun (T) serbest amino gruplari üzerinden konjüge edilir.

Bulusun baska bir yönüne göre, bir numunede bir tümör hücresinin saptanmasina veya bir tümörün tanilanmasina ve/Veya izlenmesine yönelik olarak, bir tümör belirtecine karsi afinite sergileyen bir hedefleyici gruba (T) kenetli formül (I) veya (II) ile gösterilen bir florokrom grubuna (F) sahip floresan konjügatlarin in vitro kullanimi veya bahsedilen floresan konjügatlarini içeren bir bilesimin in vitro kullanimi saglanir.

Daha özel bir ifadeyle, floresan konjügatlar, CEA gibi bir tümör antijenini eksprese eden tümör hücrelerinin ve tümörlerin saptanmasi için kullanilabiliru Bu tip durumlarda hedefleyici grup (T), tercih edildigi haliyle, örnegin yukarida tarif edilen tercihlerin ve seçeneklerin herhangi birinde tanimlandigi üzere bir peptit disi ligand, bir antikor, bir antikor fragmani ve bir antikorun en az bir degisken bölgesini içeren bir füzyon proteini arasindan seçilir. Floresan konjügat bir tümör hücresinin saptanmasi için kullanilabilir veya bir hastada kan serumu gibi bir beden sivisindan veya bir doku biyopsisinden elde edilen bir numunenin in vitro olarak test edilmesi yoluyla bir kanser durumunun tanilanmasi veya tanisina yardimci olmak için kullanilabilir. Tümör, tercih edildigi haliyle, örnegin kolon, rektum, mide, bagirsak, safra kanali, pankreas, özofagus, over, meme, prostat, karaciger veya akcigerden elde edilen veya türetilen bir kati doku tümörüdür. Ayrica, floresan konjügatlar bir tümörün varligini veya ilerlemesini izlemek için, örnegin rezeksiyon cerrahisinden ve/Veya kemoterapötik tedaviden sonra geriye kalan tümör hücrelerinin veya tümör dokusunun degerlendirilmesi için faydali olabilir.

Baska bir yönü itibariyla bulusta, burada tarif edilen konjügatin ve/veya konjügati içeren bilesimin bir ilaç olarak kullanimi saglanir. Burada kullanildigi haliyle bir ilaç, herhangi bir tibbi amaçla, örnegin bir insanda veya bir hayvanda bir hastaligin veya durumun profilaktik tedavisi de dahil olmak üzere tanisi veya tedavisi için uygulanan bir materyali veya ürünü ifade eder. Daha özel bir ifadeyle bulusta, burada tarif edilen konjügatin ve/veya konjügati içeren bilesimin bir tanisal ilaç veya ajan olarak kullanimi saglanir. Kullanim, konjügatin veya bilesimin ihtiyaci olan bireye tekli veya tekrarli sekilde uygulanmasini içerir. Bir yapilanmada, konjügata veya bilesime ihtiyaç duyan birey, bir kansere yakalanmis olan veya bir kansere yakalanma riski tasiyan bir bireydir.

Bulusta ayrica floresan konjügatin ve/Veya bunun bilesimlerinin bir hastada tümör belirteci eksprese eden bir tümörün fokuslarinin saptanmasinda veya tümör belirteci eksprese eden bir tümörün yerinin belirlenmesinde kullanimi saglanir. Kullanim özellikle nüks, metastazlar veya ekilme gibi bir hastalik ilerlemesi ile karakterize bir kanserden etkilenmis hastalarda avantajli olabilir. Bu tip kanser ilerlemeleri tümör hücrelerinin veya doku kitlelerinin daha çok dagilmasina neden olabilir. Daha özel bir ifadeyle, floresan konjügat veya bilesim, tercihen hücre yüzeyinde tümör belirteci veya tümör antijeni eksprese eden, yani T grubunun afinite sergiledigi bir tümör belirtecini eksprese eden bir tümörün fokuslarini saptamak veya yerini belirlemek için kullanilabilir. Burada kullanildigi haliyle fokuslar terimi, bir tümörü veya geliserek bir tümöre dönüsebilen bir lezyonu tanimlayan ve bunlari çevredeki normal dokudan ayiran hücre veya doku gruplarini veya kümelerini ifade eder.

Tercih edilen bir yapilanmada tümör, CEA eksprese eder. Tercih edilen baska bir yapilanmada hasta, kolorektal veya gastrointestinal kansere sahiptir. Bu tip kanserlerin ilerlemis tablosunda hasta, peritoneal boslugun iç yüzeyinde kanseröz tümörlerin yaygin metastazlarinin görüldügü peritoneal karsinomatoza sahip olabilir. Bulusun belirli bir yapilanmasinda, formül (I) veya (II) ile gösterilen bir florokrom grubuna ve bir kimerik monoklonal antikor olan bir hedefleyici gruba (T) sahip floresan konjügat, bir hastada CEA eksprese eden bir tümörün fokuslarini saptamak veya CEA eksprese eden bir tümörün yerini belirlemek için kullanilir.

Tümör dokusunun cerrahi rezeksiyonunda cerrah, tümör dokusu ile normal dokuyu birbirinden ayirt etmek için görsel görünümü ve elle muayeneyi esas alir. Cerrahi rezeksiyon, bir hastanin dokusunda, yapisinda veya organinda bulunan tümör dokusunun cerrahi olarak tamamen veya kismen çikarilmasidir. Kanseröz ve malign tümör dokusu çogu kez çiplak gözle görülemeyen küçük (örnegin milimetre alti boyutta) nodüller veya lezyonlar halinde bulunur. Tam tümör rezeksiyonu çogu kez bir hastanin prognozu için kritiktir ve dolayisiyla bir cerrahin bir hastada tümörün cerrahi olarak çikarilmasi ve/veya sitoredüktif cerrahi tedavisi esnasinda malign tümör dokusunun sinirlarini ve konturlarini dogru bir sekilde belirlemesi ve saglikli dokudan ayirt etmesi ve bahsedilen tümör dokularini rezekte etmesi ve ayrica saglikli doku veya yapilari gereksiz bir sekilde çikarmaktan veya bunlara zarar vermekten kaçinmasi önemlidir.

Yukarida tarif edilen floresan konjügatin ve/veya bu konjügati içeren bilesimin özellikle tümör belirteci eksprese eden bir tümör için rezeksiyon cerrahisi uygulanan veya uygulanmis bir hastada bir rezeksiyon sinirinda tümör hücrelerinin veya tümör dokusunun saptanmasi bakimindan faydali oldugu bulunmustur.

Burada kullanildigi haliyle rezeksiyon siniri terimi, tümör dokusunu çevreleyen dokunun bir sinirini veya kenarini ifade eder. Rezekte edilen tümörü çevreleyen dokunun siniri normalde tüm malign tümör dokusunun yeterli düzeyde uzaklastirilmasini saglamak üzere tümör ile birlikte rezekte edilen kanseröz olmayan doku olmalidir, ancak yukarida tarif edildigi üzere normal dokuya göre sinirin büyüklügünü ve/veya tümörün büyüklügünü belirlemek zor olabilir. Istege bagli olarak, rezeksiyon siniri ayrica bulus konusu yöntemin kullanimina bagli olarak belirlenebilen veya degisebilen hedefli rezeksiyon sinirini ifade edebilir.

Bir tümör belirteci ve tercihen bir tümör antijeni eksprese eden bir tümör için rezeksiyon cerrahisi uygulanan veya uygulanmis olan bir hastada bir rezeksiyon sinirinda veya bir rezeksiyon sinirinin yakininda tümör hücrelerinin veya tümör dokusunun bulus konusu floresan konjügat veya bunun bilesimi kullanilarak saptanmasina yönelik yöntem, cerrahi, örnegin sitoredüktif cerrahi esnasinda ve cerrahiden sonra tüm tümör dokusunun çikarilmasini ve temiz (veya negatif) sinirlarin, yani herhangi bir tümör hücresinin saptanmadigi sinirlarin elde edilebilmesini saglamak üzere cerrahlara destek olmak için faydalidir. Tercih edilen bir yapilanmada rezeksiyon cerrahisi, CEA eksprese eden veya asiri düzeyde CEA eksprese eden bir tümöre yöneliktir. Önceki paragraflarin herhangi birinde tarif edilen bulus konusu floresan konjügat veya bilesim, tümör hücrelerinin veya tümör` dokusunun saptanmasi, örnegin bir tümörün fokuslarinin saptanmasi ve/Veya bunlarin yerinin (yerlerinin) belirlenmesi için ve ayrica bir hastanin cerrahi rezeksiyonu esnasinda veya cerrahi rezeksiyondan sonra bir hastaya ait bir tümörün bir rezeksiyon sinirinda kullanilabilir, burada hasta kolorektum, mide, safra, pankreas, özofagus, over, meme, prostat, karaciger veya akciger kanserine sahiptir. Saptanacak veya konumlandirilacak tümör hücresi veya dokusu, CEA eksprese eden bir karsinom veya sarkom formu olabilir. Floresan konjügatlar, tercih edildigi haliyle, örnegin peritoneal karsinomatozdan mustarip hastalarda milimetre alti boyut araligindaki tümör nodüllerinin veya lezyonlarinin saptanmasi için kullanilir.

Bulus konusu floresan konjügatin. veya bilesimin, tümör hücresini veya tümör dokusunu saptamaya veya konumlandirmaya veya rezeksiyon cerrahisi esnasinda veya rezeksiyon cerrahisinden sonra bir tümörün rezeksiyon sinirlarini saptamaya yönelik kullanimi ile ilgili belirli bir yapilanmada, tümör bir malign gastrointestinal tümördür ve floresan konjügat, Glm3 allotipinin agir Zincirlerini ve km3 allotipinin hafif Zincirlerini içeren ve her bir agir zincirde ve her bir hafif zincirde en az bir fare IgGl degisken domenine ve en az bir insan sabit domenine sahip olan CEA'nin GOLD-2 epitopuna yönelik bir kimerik monoklonal antikor olarak bir hedefleyici grup (T) ile kenetli formül (I) veya tercihen formül (II) ile gösterilen bir florokrom grubuna (F) sahiptir.

Gastrointestinal tümör, gastrointestinal sistemin herhangi bir kisminda, örnegin özofagus, mide, ince bagirsak, kalin bagirsak, rektum. ve ayrica sindirim. ile iliskili pankreas, karaciger ve safra kesesi gibi organlarda yerlesik bir tümörü ifade edebilir ve milimetre alti boyut araliginda olabilir. Bu kullanim için özellikle bahsedilen kimerik monoklonal antikorun SEQ ID NO: 4 ile gösterilen bir degisken hafif zincir bölgesine ve SEQ ID NO: 3 ile gösterilen bir degisken agir zincire sahip oldugu konjügatlar tercih edilir.

Bulus konusu floresan konjügatlarin, tümör hücresini veya tümör dokusunu saptamaya veya konumlandirmaya veya rezeksiyon cerrahisi esnasinda veya rezeksiyon cerrahisinden sonra bir tümörün rezeksiyon sinirlarini saptamaya yönelik kullanimi ile ilgili belirli bir yapilanmada, tümör bir (malign) meme tümörüdür ve floresan konjügat, Glm3 allotipinin agir Zincirlerini ve km3 allotipinin hafif Zincirlerini içeren ve her bir agir zincirde ve her bir hafif zincirde en az bir fare olan CEA'nin GOLD-2 epitopuna yönelik bir kimerik monoklonal antikor olarak bir hedefleyici grup (T) ile kenetli formül (1) veya tercihen formül (II) ile gösterilen bir florokrom grubuna (F) sahiptiru Bu kullanini için özellikle bahsedilen. kimerik monoklonal antikorun SEQ ID NO: 4 ile gösterilen bir degisken hafif zincir bölgesine ve SEQ ID NO: 3 ile gösterilen bir degisken agir zincire sahip oldugu konjügatlar tercih edilir.

Meme tümörü, burada kullanildigi haliyle, bez dokusu veya duktal doku da dahil olmak *üzere meme veya meme dokusu ile iliskili herhangi bir dokuda yerlesik bir tümörü ifade edebilir ve ayrica örnegin aksillada bulunan bölgesel lenf dügümlerini kapsayabilir. Bu tip tümörler milimetre alti boyut araliginda olabilir.

Bulusun baska bir yönü itibariyla, bulus konusu floresan konjügatlarin veya bilesimlerin, örnegin tümörlerin fokuslarinin saptanmasina ve bunlarin konumunun belirlenmesine ya da bir tümör için rezeksiyon cerrahisi uygulanan veya uygulanmis olan bir hastada bir rezeksiyon sinirinda tümör hücrelerinin veya tümör dokusunun saptanmasina yönelik kullanimi su adimlari içerir: (a) konjügatin veya bilesimin bir tümörden mustarip bir hastaya verilmesi; (b) bahsedilen hastada tümör rezeksiyon cerrahisinin baslatilmasi; (c) rezeksiyon cerrahisi uygulanan hastanin rezeksiyon bölgesinde yer alan bir dokunun yaklasik 660 ila 700 nm'lik bir dalgaboyuna sahip bir isik ile aydinlatilmasi, burada (b) adimi (a) adimindan sonra en fazla yaklasik 96 saatlik veya 72 saatlik bir süre içerisinde gerçeklestirilir.

Baska bir alternatif olarak, burada tarif edilen konjügatin veya bilesimin tüm tanisal ve/veya terapötik kullanimlari, konjügatin veya bilesimin, belirtilen tanisal ve/veya terapötik kullanimlar için (faydali) bir ilacin veya tanisal ajanin üretiminde kullanimi olarak da ifade edilebilir.

Bir tümörden mustarip hastalara uygulanan tedavinin (a) adiminda, floresan konjügatlar veya bunlarin bilesimleri, ilgili alanda bilinen enjeksiyon veya perfüzyon yöntemleriyle verilebilir. Daha özel bir ifadeyle, konjügatlar veya bilesimler intravenöz, intraperitoneal, subkütanöz veya intramuskülerf enjeksiyon veya perfüzyon yoluyla verilebilir.

Alternatif olarak, floresan konjügatlar veya bunlarin bilesimleri inhalasyon yoluyla veya topikal olarak verilebilir. Bu baglamda topikal uygulama, cilde ya da bir dis veya iç mukoz membrana dogrudan uygulamayi kapsar. Inhalasyon, solunum sisteminde, Örnegin akcigerde bir tümörden mustarip hastalarin tedavisi için faydali olabilir. Floresan konjügatlar veya bunlarin bilesimleri topikal olarak uygulandiginda tercihen bir sprey formunda verilir.

Konjügat tercihen hastaya 0.1 ila 50 mg'lik bir dozda veya 5 mg ila 100 mg'lik bir dozda verilir. Bu baglamda doz, Örnegin bir cerrahi veya tanisal prosedürden önce verilen konjügatin ve mevcutsa konjüge edilmemis antikorun miktarini ifade eder.

Doz istege bagli olarak bölünmüs olabilir ve aralikli olarak verilebilir. Kolorektum, mide, safra, pankreas, özofagus, over, meme, prostat, karaciger veya akciger kanserine sahip olan ve rezeksiyon cerrahisi uygulanan bir hastaya enjeksiyon yoluyla uygulama söz konusu oldugunda, doz tercihen yaklasik araligindadir. Uygulanan doz tercihen en az 5 mg'dir. Bu doz araliklari özellikle yukarida tarif edilen tercihli sübstitüsyon derecelerine sahip konjügatlar ve bilesimler için geçerlidir. (b) adimi tercihen (a) adimindan sonra en fazla yaklasik 96 saatlik bir süre içerisinde gerçeklestirilir. Diger yapilanmalarda, (b) adimi, (a) adimi tamamlandiktan sonrar en fazla 72 saat veya en fazla 48 saat veya en fazla 36 saat veya en fazla 24 saat veya en fazla 12 saatlik bir süre içerisinde gerçeklestirilir.

Tedavinin (c) adiminda, rezeksiyon cerrahisi uygulanan hastanin rezeksiyon bölgesindeki doku, yakin kizilötesi bölge içerisinde bir dalgaboyunda aydinlatilir. (c) adiminda aydinlatma için kullanilan optik cihazlar tercih edildigi haliyle floresan konjügatlarin uyarim dalgaboyunu, tercihen 660 ila 700 nm araliginda bir dalgaboyunu hedefler. Yöntemin bir yapilanmasinda ün adimi, rezeksiyon cerrahisi uygulanan hastanin rezeksiyon bölgesindeki dokunun 680 nm'lik bir uyarim dalgaboyunda aydinlatilmasi yoluyla gerçeklestirilir.

Bir tümörden mustarip bir hastanin tedavisine iliskin özellikle tercih edilen bir yapilanmada, tümör bir malign gastrointestinal tümördür ve floresan konjügat, Glm3 allotipinin agir Zincirlerini ve km3 allotipinin hafif Zincirlerini içeren ve her bir agir zincirde ve her bir hafif zincirde en az bir fare IgGl degisken domenine ve en az bir insan sabit domenine sahip olan CEA'nin GOLD-2 epitopuna yönelik bir kimerik monoklonal antikor olarak bir hedefleyici grup (T) ile kenetli formül (I) veya tercihen formül (II) ile gösterilen bir florokrom grubuna (F) sahiptir.

Bulusun daha baska bir yönü itibariyla, yukaridaki yapilanmalarin. herhangi birinde tanimlanan floresan konjügat ayrica bir radyoaktif izotop, bir radyoaktif isaret veya bir radyoaktif izleyici içerebilir veya ihtiva edebilir.

Radyoaktif isaretli floresan konjügat örnegin konjügatin dogrudan radyoaktif olarak isaretlenmesi yoluyla veya radyoaktif isaretin konjügasyondan önce hedefleyici gruba (T) uygulanmasi yoluyla elde edilebilir. Radyoaktif isaretli floresan konjügatlar ve bunlarin bilesimleri terapötik ve/veya tanisal uygulamalarda ilaç olarak kullanilabilir. Bir yapilanmada, radyoaktif isaretli konjügatin veya bunun bilesiminin uygulandigi birey, bir kansere yakalanmis olan veya bir kansere yakalanma riski tasiyan bir bireydir. ÖRNEKLER Örnek 1 - Anti-CEA kimerik monoklonal antikorun hazirlanisi Gen tasarimi ve sentezi Sirasiyla dogal murin VE ve V1 degisken domenleri için kodlama yapan asagidaki nükleotit sekanslari (A ve B) bir murin anti- CEA antikor hibridomasindan elde edilmistir ve de novo olarak sentezlenir ve konakçi pVVS Tandem ekspresyon vektörlerine klonlanir. Bu sekanslar, optimum düzeyde klonlamayi ve CHO hücrelerinde optimum düzeyde ekspresyonu saglamak için birtakim nükleotit degisiklikleri (dogal protein sekansini degistirmemek kaydiyla) içerir. VH domeni için kodlama yapan sekansin 5' ve 3' uçlarina sirasiyla Kpnl ve Nhel restriksiyon bölgeleri yerlestirilir. Benzer bir sekilde, VL domeni için kodlama yapan sekansin 5' ve 3' ucuna iki restriksiyon bölgesi sekansi (sirasiyla SalI ve BSiWI) yerlestirilmistir.

(A) Agir Zincir (SEQ ID NO: 1): GGTACCGCCGCCACCATGGACTCCAGACTGAACCTGGTGTTCCTGGTGCTGATCCTGAAGG GCGTGCAGTGCGACGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCTC CAGAAAGCTGTCTTGTGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCAACTTCGGCATGCACTGGATCC GGCAGGCCCCTGAGAAGGGCCTGGAATGGGTGGCCTATATCTCCGGCGGCTCCTCC ACCATCTACTTCGCCGACACCCTGAAGGGACGGTTCACCATCTCCCGGGACAACCCCAAG AACACCCTGTTTCTGCAGATGACCTCCCTGCGGAGCGAGGACACCGCCATCTACTACTGC GCCAGAGACTACTACATCAACAACTACTGGTACTTCGACGTGTGGGGCGCTGGCACCACC (B) Hafif Zincir (SEQ ID NO: 2): GTCGACGCCGCCACCATGGAATTTCAGACCCAGGTGTTCGTGTTCGTGCTGCTGTGGCTG TCTGGCGTGGACGGCGACATCGTGATGACCCAGTCCCAGAAATTCATGTCCACCTCCGTG GGCGACCGGGTGTCCATCACATGCAAGGCCTCTCAGAACGTGCGGAGCGCCGTGGCCTGG TATCAGCAGACACCTGGCCAGAGCCCCAAGGCCCTGATCTACCTGGCCTCCAACAGATAC ACCGGCGTGCCCGATCGGTTCACCGGCTCTGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGACCATC TCCAACGTGCAGTCCGAGGACCTGGCCGACTACTTCTGTCTGCAACACTGGAACTACCCC CTGACCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGGAACTGAAGCGTACG Vektör sentezi VH ve V1 genleri için konakçi vektör olarak islev görmek üzere seçilen pVVS Tandem vektörü, SalI/BsiWI ve KpnI/NheI ile sirali ikili kesimler üzerinden hazirlanmistir- Bu ekspresyon vektörü agir zincir için insan IgGl allotipi Glm3'ün ve insan Vektör ilaveten su fonksiyonel ögeleri içerir: bir pCMV promotörü (hem agir hem de hafif zincir için), promotör ile translasyon için baslangiç kodonu arasinda bir kimerik intron, pUC replikasyon orijini, bir BGH poliadenilasyon bölgesi, HS4 TK polyA insülatörü, bir SV4O promotörü ve vektör amplifikasyonu esnasinda ve transfeksiyondan sonra hücre seleksiyonu için kanamisin/neomisin direnç genleri. Kesimden sonra elde edilen vektör omurga fragmanlari jel saflastirma Yukarida tarif edildigi üzere dogal murin VH ve VL domenleri için kodlama yapan sentetik VH ve VL gen eklentilerini içeren eklenti fragmanlari sirasiyla KpnI/Nhel ve Sall/BsiWl kullanilarak ilgili PVVS tandem ekspresyon vektörlerinden ekstrakte edilir ve jel saflastirma yöntemiyle geri kazanilir.

Geri kazanilan tüm fragmanlar birlikte havuzlanmistir ve transfeksiyon için nihai vektörü üretmek üzere ligasyon yoluyla baglanmistir.

Transfeksiyon/seleksiyon Yukarida tarif edilen vektör ile transfekte edilen CHO hücreleri, Avrupa Hücre Kültürü Koleksiyonundan (ECACC) temin edilen CHO (proteinsiz) hücre dizisinden (referans no. türetilir. Ilk olarak ECACC tarafindan 1985'te elde edilen bu hücre dizisi, hamster over dokusundan türetilen ve ilk olarak Puck vd. (1958) tarafindan yayinlanan ana CHO hücre dizisinin bir alt klonudur.

ECACC flakonundan türetilen banka Bkl998 olarak adlandirilmistir. Hücreler Fetal Bovin Serumu olmadan büyüyecek sekilde adapte edilmistir ve akabinde sinirli seyreltilerle klonlanmistir. PF 3B9 alt klonu büyüme özelliklerine ve transfeksiyonr kapasitesine göre seçilmistir ve depolanmistir (Bk4l64 hücre bankasi). Antikor üretimi için hücre substratini üretmek üzere kullanilan BK4164 hücre bankasi, bir Bk21l46 flakonundan hazirlanmistir. 3B9 alt klonundan elde edilen CHO hücreleri baslangiçta 4 mM L-glutamin ile takviye edilmis EX-CELL® ACF CHO ortaminda eritilmistir ve 37°C'de bir nemlendirilmis %5 CO2 atmosferi altinda orbital çalkalama esliginde büyütülmüstür.

Transfeksiyon besinci pasajdan 2 gün sonra gerçeklestirilmistir. Yukaridaki gibi hazirlanan ekspresyon vektörü, SWal restriksiyon enzimiyle kesime ugratilarak dogrusallastirilmistir. Transfeksiyon, lO üg DNA ile birlikte NucleofectionTM (Amaxa) kullanilarak üç kopya halinde gerçeklestirilmistir ve 37°C'de %5 COz altinda çalkalama olmadan 3 gün inkübasyon yapilmistir. 3 günlük bir geri kazanim. süresinden sonra genetisin (0.5 g/L) ilave edilerek seleksiyon baslatilmistir. DNA'siz NucleofectionTM kosullarina tabi tutulmus hücreler, antibiyotik seleksiyonu için bir Genetisin seleksiyon basinci altinda hücre Viyabilitesi en az gerçeklestirilmistir. 3 transfeksiyon havuzundan her biri için, kirk adet 96 gözlü› plaga 0.5 hücre/göz'lük bir hedef hücre yogunlugunda ekim yapilmistir. Bu havuzlarda, bir tekli hücreden türetilmis 475 klon üretilmistir. Yaklasik olarak 18 günlük kültürden sonra, 24 gözlü plaklarda ölçek büyütme için en verimli 150 klonu seçmek. amaciyla antikor konsantrasyonu ELISA ile degerlendirilmistir. Hücreler yeterli yogunluga ulastiktan sonra 6 gözlü plaklara aktarilmistir. 10 günlük kesikli kinetikler ve çalkalama siseli ölçek büyütme için FastELISA ile degerlendirildigi üzere mAb üretimi esasinda tekrar seleksiyon gerçeklestirilmistir. Beslemeli kesikli kinetikler ve protein A HPLC ile degerlendirilen (2 L'lik biyoreaktörlerde ölçek büyütme) mAb üretimi esasindar tekrar seleksiyon, antikor üretimi için bir öncü klonun seleksiyonu ile sonuçlanmistir.

Antikor üretimi Öncü klona. ait hücreler eritilir` ve revitalizasyon ortamina (EX-CELL® ACF CHO ortami, 4 mM L-glutamin) aktarilir. Viyabl hücre yogunlugu belirlenir ve santrifüjün ardindan hücre peleti 75 cnß'lik bir siseye ekildikten sonra ortam içerisinde 2 x 106 hücre/mL'lik bir yogunlukta yeniden süspansiyon haline getirilir. Hücreler 37°C ± 1°C sicaklikta %8 i %2 COz altinda orbital çalkalama esliginde büyütülür. 2. günden itibaren kültür, artan kapasiteli çalkalama siselerinde EX-CELL® ACF CHO ortaminda (4 mM L-glutamin) 37°C ±1°C sicaklikta %8 ±%2 COz altinda orbital çalkalama esliginde ölçek büyütme islemine tabi tutulur. Her bir pasajda hücre viyabilitesi, yogunluk ve büyüme degerlendirilir ve kirleticilerin mevcut olmadigi mikroskobik inceleme yoluyla kontrol edilir. 17. günde, 7 pasajdan sonra, çalkalama siselerinin içerikleri havuzlanir.

Hücreler sayilir ve 15 L'lik iki biyoreaktöre 7 L'lik bir hacimde 0.5 xlO6 Viyabl hücre/mL'lik bir yogunlukta ekilir.

Hücreler beslemeli kesikli kültürde EX-CELL® ACF CHO ortaminda (5 mM L-glutamin, %O.2 pluronik) 37°C'de pH ve oksijen regülasyonu esliginde 20 gün büyütülür. Gerekli görüldügü takdirde BalanCDTM CHO Feed 3, glikoz ve L-glutamin ilave edilir. Hücre yogunlugu, Viyabilite, pH günlük olarak degerlendirilir; ayrica 6. günden itibaren glikoz konsantrasyonunu belirlemek için ve 10. günden itibaren antikor konsantrasyonunu (protein A HPLC) degerlendirmek için günlük olarak numuneler alinir. . günde her bir biyoreaktördeki hücre süspansiyonunun paralel üç derinlik filtresinden ve akabinde dogrudan 0.2 um'lik bir filtreden geçirilmesi suretiyle berraklastirma gerçeklestirilir. Berraklastirilan yigin ürün toplanir ve antikor içerigi (protein A HPLC), rekombinant protein özdesligi (Western blot analizi), biyolojik yük, mikoplazma ve spiroplazma kontaminasyonu için test edilir. Yigin ürün 2 L'lik PET siselere dagitilir ve -70°C ila -90°C'de saklanir.

Yigin ürün ile ilgili diger islemler su sekilde gerçeklestirilir: Berraklastirilan yigin ürün 15-25°C'de 24 sa eritilir ve çesitli siselerin içerikleri havuzlanir ve manyetik karistirma yoluyla homojenlestirilir. Havuzlanan yigin ürün ilk önce bir 50 mM sodyum fosfat, 300 mM NaCl (pH 7.0) tamponu ile dengelenmis bir protein A afinite kromatografisi kolonu üzerinde saflastirilir. Dengeleme tamponu ve akabinde bir 25 mM sodyum fosfat (pH 7.0) tamponu ile yikama islemlerinden sonra antikor bir 25 mM sodyum asetat (pH 3.5) tamponu ile ayristirilir. Antikor piki (280 nm'de elüent sogurumu esasinda) toplanir ve antikor elüati pH ayarlama adimindan önce 15-25°C'de tutulur.

Antikor elüatinin pH seviyesi 0.2 M sitrik asit ile 3.8 olarak ayarlanir ve 15-25°C'de karistirma esliginde 60-65 dk inkübasyon gerçeklestirilir. pH seviyesi 0.5 M NazHP04 ile 6.5 olarak nötrlestirildikten sonra solüsyon 0.2 um'lik bir filtre ile filtrelenir, toplanir ve 2-8°C'de saklanir. pH ile pasiflestirilmis antikor solüsyonu bir sülfonat ligand reçinesi kullanilarak katyon degistirme kromatografisiyle tekrar saflastirilir. Solüsyonun pH seviyesi 0.2 M sitrik asit ile 5.0 olarak ayarlanir ve solüsyon önceden. 25 mM sodyum asetat (pH 5.0) tamponuyla dengelenmis bir kolona yüklenir.

Dengeleme tamponu ile yikama islemlerinden sonra antikor 25 mM sodyum asetat, tamponuyla ayristirilir.

Toplama, 280 nm'de sogurum esasinda yapilir.

Elde edilen antikor solüsyonu, 24 mM sodyum fosfat, 53.4 mM NaCl (pH 7.0) tamponunda dengelenmis kuaterner amonyum iyon degistirme membranlari kullanilarak anyon degistirme kromatografisiyle tekrar saflastirilir. Katyon degistirme kromatografisi elüatinin pH seviyesi 0.5 M NazHPO4 ile 7.0 olarak ayarlanir ve elüat ll Hß/cm'lik bir final iletkenlige ulasmak üzere bir 25 mM sodyuni fosfat (pH 7.0) tamponu ile seyreltilir. Solüsyon membranlara yüklenir ve antikor 280 nm'de sogurum esasinda sürekli akistan toplanir. Toplanan solüsyon 0.2 um'lik bir filtre üzerinden tek kullanimlik steril bir PET kabin içine filtrelenir ve 2-8°C'de saklanir.

Antikor solüsyonu akabinde ultrafiltreleme yoluyla konsantre edilir ve 30 kDA esikli membranlar kullanilarak bir 10 mM Tris-HCl (pH 7.2) tamponuna karsi diafiltrelemeye tabi tutulur. Filtre retentati toplanir ve 15-25°C'de saklanir.

Retentat akabinde bir` 10 mM Tris-HCl (pH 7.2) tamponuyla l mg/mL oraninda seyreltilir ve 0.2 um'lik bir filtreden ve akabinde önceden ayni tamponla dengelenmis nanofiltreden (Planova 15 N membrani) geçirilir. Süzüntü 15-25°C'de saklanir. Son adimda, elde edilen saflastirilmis yigin antikor solüsyonu 0.2 um'lik bir filtreden filtrelenir, steril PET siselere dagitilir ve -70 ila 90°C'de saklanir.

Saflastirma adimlarinin her birinde protein A HPLC ile antikor konsantrasyonu tayini için numuneler alinir.

Elde edilen antikor ürünü, ilgili alanda. bilinen UPLC-UV-MS gibi yöntemlerle karakterize edilmistir. Antikorun molekül agirligi MALDI-TOF kütle spektrometrisi ile belirlendigi üzere 148.6 kDA'dir. Örnek 2 - Formül (IV)'e Sahip Florokromun Hazirlanisi Asetanilid Ara Ürünü (B): Sülfonlu indolenin (A), 1,4-bütan sülton ile reaksiyona sokulur. Elde edilen ara ürün, asetanilid ara ürününü (B) vermek üzere beta-anilinoakrolein ile reaksiyona sokulur.

Ara Bilesik (D): SOSNa 1) VWlliamson û D ara ürünü, indolenin öncülünün (C) bir karboksialkiloksi türevini olusturmak için Williamson kondenzasyon reaksiyonu ve akabinde 1,4-bütan sülton ile kuarternizasyon üzerinden hazirlanir. indolenin (C), bir aminli aromatik öncülün diazotasyonu/indirgenmesi ve akabinde sülfonat olusumu, hidroksilasyon ve keton ile Fischer siklizasyonu üzerinden 1) Bilesik D i Formül (IV) Ph 2) DCC, NHS B bilesigi ile indol bilesigi (D) kondenzasyona tabi tutulur.

Elde edilen dikarbosiyanin bilesigi, Formül (IV)'e sahip florokromu vermek üzere N-hidroksisüksinimid (NHS) ile aktiflestirilmistir. Örnek 3 - Florokrom ile anti-CEA kimerik mAb'nin konjügasyonu Örnek 1'de saflastirilan antikor 15-25°C'de yaklasik olarak 24 saat eritilir. Bir tampon degisimi (0.1 M sodyum fosfat/karbonat, pH 9.3) yapmak için 30 kDa esikli membranlarla ultrafiltreleme/diafiltreleme gerçeklestirilir.

Florokroni (Örnek. 2'de Formül (IV)), 15-25°C'de gece boyunca karistirma esliginde DMF içinde 2.25 mg/mL'lik bir konsantrasyonda çözülür. Antikor solüsyonuna (0.1 M sodyum fosfat/karbonat tamponu (pH 9.3) ile 1 mg/mL'lik bir nihai konsantrasyonda seyreltilmistir) %10'luk (h/h) bir nihai konsantrasyonda DMF ilave edilir. Florokrom solüsyonu akabinde antikor solüsyonuna 20 mL/dk'lik bir akis hizinda 4.5'lik bir molar fazlalikta ilave edilir. Elde edilen reaksiyon karisimi yaklasik 45 dk boyunca ortam sicakliginda orbital çalkalama esliginde inkübe edilir.

Ilk önce %10 (h/h) DMF ile takviye edilmis PBS-l35mM L-Arginin ve akabinde DMF'yi uzaklastirmak için formülasyon tamponu PBS- 135mM- L-arginin ile ikinci bir ultrafiltreleme/diafiltreleme adimi gerçeklestirilir (30 kDa esikli membranlar). Daha sonra retentat, formülasyon tamponu ile 1.0-1.1 mg/mL'lik (spektrofotometri analiziyle belirlendigi üzere) bir nihai konsantrasyonda seyreltilir ve filtrelenir (0.2 um).

Elde edilen floresan konjügat, yüksek yogunluklu polietilen kapaklarla kapatilan 0.5 L PET siselere doldurulur, amber plastik torbalara yerlestirilir ve -20°C ± 5°C'de saklanir.

Florokrom/antikor` mol orani spektrofotometri ile belirlenir. l.5-1.6'lik bir ortalama konjügasyon orani gözlemlenir.

Florokrom ile antikorun konjügasyonu alternatif sekilde konjügasyon solventi olarak DMSO ile gerçeklestirilebilir. birlikte florokromun antikora 4'lük bir molar fazlalikta ilave edilmesi (solüsyon konsantrasyonu: l mg/mL) ve 5 ila l20 dk araliginda bir reaksiyon süresi sonucunda, spektrofotometri ile belirlendigi üzere 1.5-l.6 arasinda bir ortalama konjügasyon oranina sahip bir konjügat elde edilir. Benzer konsantrasyonlar ve kosullar altinda DMF içinde hazirlanan konjügatlara kiyasla, DMSO içinde hazirlanan bu floresan konjügatlar için elde edilen floresans yayinim siddeti, floresans yitimi ve kuantum verimi ölçümleri bakimindan anlamli herhangi bir fark gözlenmemistir. Örnek 4 - Formülasyon Örnek 3'e göre hazirlanan floresan konjügatin formülasyonu için kullanilan tampon ihtiyaç duyuldugu takdirde bulus kapsamindaki kullanimlar ve yöntemler için uyarlanabilir. Örnegin floresan konjügat tercihen 10 mM KH lO mM Na3Sitrat/Sitrik asit (Fluka), 300 mM Arginin HCl (Sigma), %0.02 (a/h) Tween 20 (Merck) (pH 6.0) içeren bir tamponda formüle edilebilir. Örnek 5 - Konjügat karakterizasyonu Floresans Çalismalari Formül (IV) ile gösterilen florokromun ve Örnek 3'e göre hazirlanan bir floresan konjügatin sönümlenme, floresans yitimi ve floresan kuantum verimi, klinik kullanimla alakali bir dalgaboyu olan 680 nm'lik uyarim dalgaboyunda (Fluobeam700 Optik Cihaziyla saglanir) belirlenmistir.

Formül (IV) ile gösterilen florokromun DMF içindeki numuneleri ve Örnek 3'e göre hazirlanan floresan konjügatin PBS 135 mM- Arginin içindeki numuneleri 0.05-500 uM arasinda degisen çesitli konsantrasyonlarda hazirlanmistir.

Sönümlenme (yani yayilan floresansin belirli bir konsantrasyonda florokromun kendisi tarafindan engellenmesi) tayininden önce florokromun maksimum floresans siddeti ve maksimum konsantrasyonu bir florometre yardimiyla belirlenmistir.

Floresans degerleri, tamponlarin arkaplan floresans degerleri çikarildiktan sonra elde edilmistir. Floresan konjügat için sönümlenme gözlemlenmeden önce 5 uM'lik bir maksimum konsantrasyon ile birlikte maksimum floresans siddeti 70 AU (itibari birim) olarak ölçülmüstür. Florokrom için 10 uM'lik bir maksimum konsantrasyonda maksimum floresans siddeti 120 AU olarak ölçülmüstür.

Sogurulan isigin yayilan isiga dönüsme veriminin. bir ölçüsü olan kuantum verimi numuneler için 5 uM'lik bir konsantrasyonda 680 nm'lik klinik dalgaboyunda hesaplanmistir.

Konjüge edilmemis Formül (IV)'e sahip florokrom için kuantum verimi 0.26 olarak ölçülmüstür, konjüge florokrom için kuantum verimi ise sadece %43'lük bir düsüse karsilik geldigi üzere 0.15 olarak gözlemlenmistir.

Klinik kullanim açisindan, Özellikle tümör rezeksiyon ameliyatlarinda, floresan konjügattaki florokromun kararli ve yeterli bir floresans siddeti düzeyini olabildigince uzun bir Florokroni ve konjügat numuneleri ve ayrica Formül (IV) ile gösterilen florokroni ile benzer maksimum soguruni ve yayinim dalgaboylarina sahip (679 nm'lik maksimum sogurum ve 702 nm'lik maksimum yayinim) bir uzak kirmizi yayilim yapan boya olarak piyasadan temin edilebilen bir karbosiyanin florokrom (Alexa Fluor® 680) için 680 nm'lik klinik uyarim dalgaboyunda floresans yitimi veya floresan aktivite kaybi da degerlendirilmistir. Örnek 3'te tarif edilen konjügasyon yöntemine benzer sekilde hazirlanan bir anti-CEA kimerik mAB (Örnek 1) ve Alexa Fluor® 680 konjügati (yaklasik 1.46'lik bir ortalama florokromzantikor orani elde edilmistir) için floresans yitimi de degerlendirilmistir. Bu konjügatlarin numuneleri PBS (xl) içinde hazirlanmistir.

Numuneler 5 uM'lik konsantrasyonlarda hazirlanmistir ve 680 nm'lik isiga maruz birakilmistir. Yayilan floresans siddeti, isik maruziyetinin baslangicindan itibaren () saat, 30 dakika ve 1, 1.5 ve 2 saat sonra ölçülmüstür.

Tablo 1: Zaman içerisinde floresans yayinimi (AM = 680 nm) 00 13 22 4 l Konjügati 00 4 7 8 2 680 nm'lik klinik dalgaboyunda 30 dakikalik sürekli maruziyetten sonra, floresan konjügatin floresansi yaklasik floresansi ise sadece yaklasik %9'dur. 1 saat sonra ticari boyanin ve ayrica konjügatinin floresans siddeti neredeyse sifirdir, floresan konjügatin ve konjüge edilmemis florokromun floresansi ise hala korunmaktadir.

Doku çapraz reaktivitesi Örnek› 3'teki gibi hazirlanan floresan konjugat için. biyotin isaretli konjügat kullanilarak gerçeklestirilen doku çapraz reaktivite çalismasi, standart immünohistokimya teknikleriyle 42 adet dondurulmus insan dokusu ve alakasiz üç bireyden alinan kan simirlerinden olusan bir panel üzerinde gerçeklestirilmistir. Antikor konjügati için spesifik boyanmanin, literatürde CEA ekspresyonu yaptigi seklinde tarif edilen epitelyal bilesenlerde, agirlikli olarak apikal hücre sinirinda veya luminal tarafta sindirim kanali ve birkaç baska doku ile sinirli oldugunun bulunmasi, antikorun sadece hedefe baglandigini dogrulamistir.

Antijen Afinitesi Bir BIACORE kullanilarak, Örnek 3'teki gibi hazirlanan floresan konjügatin hedef karsinoembriyonik antijene yönelik afinitesi de belirlenmistir. Karsinoembriyonik antijen, tiol gruplari üzerinden (Surface Thiol Coupling GE healthcare; Yönerge 22- 0618-10AB) bir CMS çipine kenetlenmistir. Akista 6 farkli konsantrasyonda (50 nM ila kimerik monoklonal antikor (Örnek 1), monoklonal antikor mSll (Örnek 1'deki kimerik monoklonal antikorun degisken bölgelerinin temelini olusturan orijinal murin antikoru) ve floresan konjügat kullanilarak birlesme ve ayrisma hizlari ölçülmüstür. Veri edinimi ve parametre hesaplamalari, Bia software ve Bia evaluation programlariyla gerçeklestirilmistir. Örnek l'deki kimerik monoklonal antikorun CEA'ya yönelik afinitesi (3.27XlO-ll nM), ana murin 511 antikorunun afinitesine (3.82xlO-ll nM) oldukça yakindir ve yakin kizilötesi florokrom boya ile isaretlemeden sonra degismemistir (Örnek 3'teki floresan konjügatin KD degeri 3.21x. Örnek 6 - In vivo çalismalar Örnek 3'teki floresan konjügatin etkinligi in vivo olarak insan kökenli CEA ekspresyonu yapan dört farkli fare modelinde degerlendirilmistir.

Floresan konjügatin doku dagilimi, bilinen protokollere göre düzenlenen bir LS-174T peritoneal karsinomatoz fare modelinde bilgisayarli tek foton yayinim tomografisi (SPECT) kullanilarak radyoaktivite ölçümleriyle degerlendirilmistir.

Immün sistemi baskilanmis NMRI çiplak fareleri, asiri düzeyde CEA eksprese eden LS-l74T hücreleri ile intraperitoneal enjeksiyon yoluyla LS-l74T hücre transplantina tabi tutulmustur. Farelere 10 gün sonra intravenöz olarak 30 ve 50 ug 125I isaretli floresan konjügat (floresan konjügatin bir radyoaktif isaretli iyodinasyon reaktifiyle inkübasyonu üzerinden hazirlanmistir) enjekte edilmistir. 50 in; konjügat ile muameleden 48 saat sonra farelerin görüntülemesi (bir Nano-SPECT-CT (Bioscan®) kamerasiyla gerçeklestirilmistir), radyoaktivitenin esasen farelerin peritoneal boslugunda bulunan tümör nodülleri ile sinirli oldugunu göstermistir. Bu sonuç, hayvanlar feda edildikten sonra elde edilen farkli organlardaki radyoaktivite biyodagilim ölçümleri ile çakisir.

Ayrica, asiri düzeyde CEA eksprese eden LS-l74T insan tümör hücrelerinin intraperitoneal enjeksiyonlarindan sonra peritoneal karsinomatoz gelisimi gösteren immün sistemi baskilanmis NMRI çiplak farelerine isaretsiz floresan konjügatin enjekte edilmesi yoluyla in vivo floresans görüntüleme çalismalari yapilmistir. 12 günlük karsinomatoz gelisiminden sonra hayvanlara intravenöz olarak 20 veya 30 ug floresan konjügat verilmistir; 48 saat sonra hayvanlar feda edilmistir ve floresans sirasiyla 680 nm ve 700 nm'lik uyarim ve yayinim dalgaboylarinda bir optimal prob kullanilarak görüntülenmistir. Her iki dozda da floresans dagilimi, pankreas alani da dahil olmak üzere peritoneal bosluktaki mikronodüllerin açik bir sekilde görüntülemesini saglayacak biçimde açik. bir sekilde peritoneal tümörler` ile sinirlidir (Sekil 1, Kolon A, 700 nm'de görüntülenen in situ tümörler).

Boyutu 1 mm'den küçük ve agirligi l mg'den düsük (O.2-l.7 mg) nodüller belirlenebilmistir ve floresan niteliktedir (Sekil 1, Kolon B, Kolon A'da gösterilen hayvanlarin 700 nm'de görüntülenen bireysel rezekte edilmis tümörlerini gösterir).

Floresan konjügatin saglikli hayvanlara enjeksiyonu ve kontrol olarak alakasiz bir floresan konjügat (fare miyelomu MOPCZl'den saflastirilan bir PX antikoru, yani IgGl monoklonal antikoru (ref. Köhler vd., Eur J Immunol 1976 (6) 292)) herhangi bir spesifik boyanma saglamamistir.

Floresan konjügat, belirginr bir sekilde, tümör nodüllerinin yerinden bagimsiz olarak, asiri düzeyde CEA eksprese eden, dolayisiyla klinik kosullari taklit eden tümör nodüllerinin görüntülenmesini saglar.

Insan CEA ekspresyonu yapan insan kolorektal kanserinin ortotopik fare modelini esas alan bir model (Tseng vd., Vis.

Exp. 2007 (10) 484) kullanilmistir. Immün sistemi baskilanmis alti haftalik disi CDl-FOXnPw farelerinin sirtindaki 4 bölgeye, subkütanöz insan kolon tümörü gelisimini uyarmak için, asiri düzeyde CEA eksprese eden HT29 hücreleri subkütanöz olarak enjekte edilmistir. Akabinde küçük tümör fragmanlari (yaklasik. olarak 3 nmi çapinda) çikarilmistir ve ortotopik tümörlerin gelisimini uyarmak için hayvanlarin kör bagirsak duvarina transplante edilmistir. Bir immün reaksiyonu uyarmak ve tümör hücresi infiltrasyonunu kolaylastirmak için kör bagirsak duvarina hafif düzeyde zarar verilmistir. Bu tümörler gelistikten sonra hayvana intravenöz olarak 30 ug bulus konusu floresan konjügat (veya kontrol olarak alakasiz bir PX antikoru içeren bir floresan konjügat) enjekte edilmistir. Enjeksiyondan 0, 4, 24 ve 48 saat sonra subkütanöz tümörler için PEARL görüntüleme sistemi (Li-Cor Biosciences) veya ortotopik tümörler için FLARE intraoperatif görüntüleme sistemi (Curadel) kullanilarak yakin kizilötesinde (700 nm) floresan sinyali ölçülmüstür.

Sonuç olarak, hem subkütanöz hem de ortotopik lokasyonlarda bulunan tümörlerin 700 nm'de intraoperatif immün fotodeteksiyonü açikça gözlemlenmistir (sirasiyla Sekil 2A ve Sekil 2B). Subkütanöz tümörlerin floresansi, antikorlarin enjeksiyonundan 48 saat sonra hayvanlarin, derisinden görünür olmalarini saglayacak düzeyde yüksektir (Sekil 2A, Sira A).

Bulus konusu floresan konjügat sayesinde, asiri düzeyde CEA eksprese eden insan tümörlerinin karaciger metastazlari da gözlemlenmistir. LS-l74T hücreleri veya LoVo insan kolon adenokarsinom hücreleri, yayinlanan protokollere göre (ref. baskilanmis Balb/c çiplak farelerinin dalagina enjekte edilmistir. Her iki hücre türü de asiri düzeyde CEA eksprese eder ve karaciger metastazlarinin gelisimini uyarir, ancak farkli paternleri takip eder. LoVo hücreleri karaciger yüzeyi boyunca birçok küçük metastazin yayilimini uyarir, LS-174T hücreleri ise sadece daha büyük birkaç metastazin olusumunu uyarir. 700 nm'de floresans görüntülemesinden 48 sa önce farelere IM) ug floresan konjügat verilmistir. Kontrol olarak farelere PX antikorunu esas alan alakasiz bir konjügat enjekte edilmistir. Karaciger yüzeyinde çiplak gözle saptanabilir, yani görünür olmayan çok küçük. boyutlu tümör nodüllerinin, örnegin mikrometastazlarin, bu tümörlerin konturlarini tanimlayan floresan konjügat enjekte edilen farelerde floresans altinda saptanabilecegi bulunmustur. Ayrica, karaciger metastazlarinin görüntülenmesinin, tümör modüllerinin hücre dizisinden bagimsiz olarak saglandigi bulunmustur. Kontrol ile herhangi bir tümör tayini gözlemlenmemistir.

Pankreas tümörlerine yönelik. bir` modelle benzer bir çalisma yürütülmüstür. Çalismada immün sistemi baskilanmis alti haftalik. disi atimik CDl-Foxnlnu fareleri kullanilmistir ve tümör asilama ve görüntüleme prosedürlerinde fareler izofluran ile anestezi altina alinmistir. Ortotopik pankreas tümörleri tarif edildigi gibi elde edilmistir. Hayvanlarin dalagi ve pankreasi, pankreasin tüm uzunlugunu açiga çikarmak için bir lateral eksizyon yoluyla lateral olarak açiga çikarilmistir.

Pankreasin içine vaskülatüre paralel olarak ince bir igne geçirilmistir ve bu ignenin içinden 500 000 BXPC-3-luc2 hücreleri (lüsiferaz transfeksiyonlu hücre dizisi) enjekte edilmistir. Ortotopik tümörlerin büyümesi, IVIS spektrum görüntüleme sistemi (Perkin Elmer Life Sciences) ile görüntülemeden 10 dk önce PBS içinde 150 mg/kg'lik bir D- lüsiferin solüsyonunun (SynChem, Inc) intraperitoneal olarak 50 uL'lik bir toplam hacimde enjekte edilmesi yoluyla gerçeklestirilen biyolüminesans görüntüleme (BLI) prosdürüyle haftalik olarak izlenmistir. Ortotopik tümörler BLI ile saptanabildiginde, hayvanlarin kuyruk venine intravenöz olarak ug floresan konjügat enjekte edilmistir. Hayvanlar enjeksiyondan 48 saat sonra feda edilmistir ve 700 nm'de yakin kizilötesi isik altinda incelenmistir. Ortotopik pankreas tümörlerinin açik bir sekilde görüntülendigi gözlemlenmistir.

Spesifik olmayan konjügat veya sadece florokrom boya enjekte edilen kontrol farelerinde herhangi bir görüntüleme saglanmamistir.

Pearl Impulse küçük hayvan görüntüleme sistemi (LI-COR) kullanilarak ölçülen NIR floresan sinyalleri üzerinden sinyal:arkaplan orani hesaplanmistir. Görüntüler normalize edilmistir ve ilgili bölgeler analiz için seçilmistir.

Ortalama sinyalzgürültü oranlarini elde etmek için, tümöre spesifik. ortalama. sinyal, çevre dokuya ait ortalama sinyale bölünmüstür. Tüm zaman noktalarinda farkli gruplara ait anlamli sinyalzarkaplan oranlarini degerlendirmek için Bonferroni düzeltmesi ile iki yönlü tekrarli ölçüm varyans analizi kullanilmistir. l'e yakin sinyalzarkaplan oranlarina sahip serbest florokrom boya veya alakasiz kontrol konjügatinin aksine, floresan konjügat için sinyalzarkaplan orani 3'ten büyüktür.

BXPC-3 subkütanöz tümör rezeksiyonlarinin hematoksilin-Eosin boyamasi ile immünohistokimya analizi, tümör hücrelerinin etrafinda sadece spesifik olmayan boyanma saglayan kontrollerin aksine floresan konjügatin tümöre baglandigini dogrulamistir. Özet olarak, örnegin Örnek 3'e göre hazirlanan floresan konjügatin, tümörlerin lokasyonundan ve tümörün kökeninden (yani kolorektum ve pankreas) bagimsiz olarak, asiri düzeyde CEA eksprese eden tümör nodüllerinin in vivo olarak belirlenmesini sagladiginin bulunmasi, floresan konjügatin hedefleme becerisini dogrulamistir. Çiplak. gözle görülemeyen çok küçük nodülün saptanmasini saglayan yüksek düzeyde bir sinyalzgürültü orani gözlemlenmistir.

Ayrica, floresan konjügatin intravenöz uygulamasinin güvenilirligini ve toksisitesini degerlendirmeye yönelik farmakolojik çalismalar, Wistar siçanlarinda merkezi ve periferik sinir sistemleri üzerinden ya da Beagle köpeklerinde kardiyovasküler` ve respiratuar fonksiyonlar üzerinde anlamli herhangi bir olumsuz etkinin bulunmadigini ve konjügatin siçanlarda günde 40 mg/kg'lik (85 katlik hedeflenen klinik doz) ve köpeklerde günde 5 mg/kg'lik (10 katlik hedeflenen klinik doz) olmak üzere test edilen maksimum doz düzeylerine kadar iyi tolere edildigini göstermistir. Örnek 7 - Klinik Çalismalar (a) Peritoneal karsinomatoz - Örnek 3'teki bir konjügatin sindirim. kökenli peritoneal karsinomatozlu (metastatik tümörler) 15 insan hastada güvenilirligini ve performansini degerlendirmeye yönelik bir klinik çalisma. ila 15 mg araligindaki floresan konjügat (Örnek 3) dozlari intravenöz enjeksiyon yoluyla verilmistir. Ön sonuçlar, bu dozlarin herhangi birinde herhangi bir olumsuz reaksiyonun gözlemlenmedigini sergiler. (b) Kolorektum ve pankreas kanserleri - Örnek 3'teki floresan antikor konjügatinin rektum veya pankreas kanserine sahip 30 insan hastada güvenilirligini ve performansinin degerlendirmeye yönelik bir klinik çalisma.

Cerrahi müdahaleden 48 saat önce 5 mg'lik bir floresan konjügat dozunun intravenöz olarak enjekte edildigi bir çalisma yürütülmüstür. Incelenen hastalarda doz uygulamasi esnasinda veya doz uygulamasindan hemen sonra herhangi bir olumsuz etki bildirilmemistir. Genel olarak, yasamsal belirtilerde baslangiç degerlerine göre klinik olarak anlamli herhangi bir degisim gözlemlenmemistir. Ön sonuçlar, floresansin süpheli tümör bölgelerinde çok belirgin düzeyde lokalize oldugunu gösterir. Floresan konjügat için uygun ayarlarda yapilandirilan bir Artemis Open Imaging sistemi (Quest Medical Imaging) kullanilarak intraoperatif görüntüleme yapilmistir.

Bir` pankreas kanseri hastasinda floresan konjügat kullanimi, normalde sadece görsel inceleme ve elle muayene esasinda pankreas gövdesinde yerlesik primer tümörün etrafinda tümörsüz rezeksiyon siniri olarak düsünülecek olan (yani tümör dokusunun kalmasina neden olan) bir bölgede bulunan tümör hücrelerinin belirlenmesini saglamistir (Sekil 3 - sadece görsel inceleme ve elle muayene ile belirlendigi üzere önerilen rezeksiyon siniri tümör dokusuna çok yakin bir biçimde kesik çizgi ile gösterilir ve toplu olarak noktali çizgi ile gösterilir. Floresans ile belirlendigi üzere önerilen rezeksiyon siniri düz çizgiyle gösterilir). Birçok peritoneal metastazin varligindan dolayi sadece eksplorasyon ve evreleme gerçeklestirilmistir, yani ameliyathanede arka masa üzerinde biyopsi ve diger analizler için sadece metastazlar rezekte edilmistir. Floresan konjügat, rezeksiyondan sonra eksize edilen tümörde hem in vivo hem de ex vivo olarak metastazlarin fokuslarinin ve ayrica sinirlarinin açik demarkasyonunu saglamistir (Sekil 3, sira A: bir metastazin beyaz isik altinda ve floresans altinda (örtüsmeli görüntü) in vivo görüntüsü; Sekil 3, sira B: eksize edilen metastazin beyaz isik altinda ve floresans altinda (örtüsmeli görüntü) ex vivo görüntüsü).

Baska bir pankreas kanseri hastasinda floresan konjügat uygulamasindan sonra benzer sonuçlar gözlemlenmistir.

Floresansin pankreasin basina yakin olan süpheli tümörün sinirlarini açikça Çizdigi gözlemlenmistir.

Kolorektal metastaz tanili bir hastada, 5 mg'lik bir floresan konjügat dozu rezeksiyondan 48 saat önce uygulanmistir. Doz, herhangi bir olumsuz olay gözlemlenmeksizin iyi tolere edilmistir. Metastaz süphesi tasiyan lenf dügümü para-iliakal sol bölgede metastazin sinirlarini çizen belirgin bir floresans sinyali saptanmistir. Basarili bir rezeksiyon gerçeklestirilmistir.

Lokal olarak ilerlemis rektum karsinomuna sahip bir hastaya da mg'lik bir floresan konjügat dozu uygulanmistir. Doz, herhangi bir olumsuz olay saptanmaksizin iyi tolere edilmistir. Bir laparoskopik alt ön rezeksiyon gerçeklestirilmistir. Rezekte edilen rektum dokusu ameliyathane arka masasinda görüntülenmistir. Rezekte edilen dokuda tümör dokusunun sinirlarinin açik bir biçimde belirlendigi gözlemlenmistir.

SEKANS LISTESI <120> <130> <150> <151> <160> <170> <210> <211> <212> <213> <220> <223> <400> SurgiMab S.A.S Floresan Konjügatlar SRGlSPOlPC EP151706l7.3 2015-06-03 Yapay Sekans KpnI ve Nhel restriksiyon bölgelerine sahip Mus musculus <210> 2 <211> 402 <212> DNA <213> Yapay Sekans <220> <223> SalI ve BsiWI restriksiyon bölgelerine sahip Mus <400> 2 <210> 3 <211> 121 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 .1 -: '-Iii 'UJ '3` ; ; sa * .lz' - 2' ; i' 'c. TJ! -li **ç . n' J n h.' I .' ;1 I.i': i Si" ; .I \ i .'. A .1 .721 7. I-'i'- 2' V`. \ r'îi: " î .' '-7 i'- 5 i" r' Ft.: î f'lii* Ã' 7. i. i 4 -1 " I`ll « ' 1 ›' <210> 4 <2ll> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4

Claims (1)

1. ISTEMLER Bir hedefleyici gruba (T) kenetli bir florokrom grubuna (F) sahip bir floresan konjügat olup, özelligi; F grubunun formül (I)'e sahip olmasi, Y'nin her durumda bagimsiz olarak SOsH, 803` ve SOýâ arasindan seçilir, burada M tek degerlikli bir katyondur veya Y, 803- ve SO3Na arasindan seçilmesi; x, 2 ve y'nin bagimsiz olarak 1 ila 8 araliginda bir tamsayidan seçilmesi; ve burada T grubunun bir tümör belirtecine karsi afinite sergilemesidir. Istem 1'de tanimlanan konjügat olup, özelligi; F grubunun formül (II)'ye sahip olmasidir: Istem 1 veya 2'de tanimlanan konjügat olup, özelligi; tümör belirtecinin bir tümör antijeni olmasi ve tümör antijeninin istege bagli olarak karsinoembriyonik antijen (CEA) olmasidir. Önceki istemlerin herhangi birinde tanimlanan konjügat olup, özelligi; T grubunun bir antikor, bir antikor fragmani ve bir antikorun en az bir degisken bölgesini içeren bir füzyon proteini arasindan seçilmesi ve burada antikorun istege bagli olarak bir kimerik monoklonal antikor (mAb) olmasidir. Önceki istemlerin herhangi birinde tanimlanan konjügat olup, Özelligi; T grubunun, CEA antijeninin bir veya daha fazla epitopuna baglanan bir kimerik monoklonal antikor olmasidir. Istem 5'te tanimlanan konjügat olup, özelligi; F grubunun formül (II)'ye sahip olmasi ve kimerik monoklonal antikorun CEA'nin GOLD-2 epitopuna yönelik olmasi, Glm3 allotipinin agir Zincirlerini ve km3 allotipinin hafif Zincirlerini içermesi ve her bir agir zincirin ve her bir hafif zincirin en az bir fare IgGl degisken domenine ve en az bir insan sabit domenine sahip olmasidir. Istem 6'da tanimlanan konjügat olup, özelligi; kimerik monoklonal antikorun, SEQ ID NO: 4 ile gösterilen bir degisken hafif zincir bölgesine ve SEQ ID NO: 3 ile gösterilen bir degisken agir zincire sahip olmasidir. Önceki istemlerin herhangi birinde tanimlanan konjügat olup, özelligi; bir T grubuna n adet F grubunun kenetli olmasi ve burada n'nin 1 ila 4 araligindan. seçilen. bir tamsayi olmasidir. Önceki istemlerin herhangi birinde tanimlanan konjügati içeren bir bilesim olup, özelligi; istege bagli olarak, (a) bilesimin steril olmasi ve bir sulu tampon ve L- arginin içermesi; (b) bilesimin, E` grubu jÄiî kenetli olmayan TP grubuna sahip bir bilesik içermesi ve/veya (c) bilesimdeki konjügatin ortalama konjügasyon derecesinin yaklasik 0.5 ila 3 olmasidir. Bir floresan konjügatin hazirlanmasina yönelik bir yöntem olup, özelligi; su adimlari içermesidir: (a) formül (III) ile gösterilen bir florokromun saglanmasi, burada Y her durumda bagimsiz olarak SOaH, SOý ve SOýd arasindan seçilir, burada M tek degerlikli bir katyondur veya Y, 803- ve SOgNa arasindan seçilir; X, 2 ve y bagimsiz olarak 1 ila 8 araliginda bir tamsayidan seçilir ve Z, bir karsit iyon, hidrojen, süksinimidil, sülfosüksinimidil ve nitrofenil arasindan seçilir, (b) bir tümör belirtecine karsi afinite sergileyen bir hedefleyici maddenin saglanmasi ve (c) florokromun hedefleyici maddeye kenetlenmesi. Istem lO'da tanimlanan yöntem olup, özelligi; hedefleyici maddenin, CEA'ya karsi afinite sergileyen bir kimerik monoklonal antikor olmasi ve/Veya florokromun formül (IV) ile gösterilen bir bilesik olmasidir: 803' SO3Na Istemler 1 ila 8'de tanimlanan konjügatin veya istem 9'da tanimlanan bilesimin, bir numunede bir tümör hücresinin saptanmasina veya bir tümörün tanilanmasina ve/veya izlenmesine yönelik in vitro kullanimi. Istemler` 1 ila 8'de tanimlanan konjügat veya istem 9'da tanimlanan bilesim olup, özelligi; bir ilaç veya bir tanisal ajan olarak kullanilmaya yönelik olmasidir. 14. Istemler` 1 ila 8'de tanimlanan konjügat veya istem 9'da tanimlanan bilesim olup, özelligi; asagidaki amaçlarla kullanilmaya yönelik olmasidir: (a) bir hastada tümör belirteci eksprese eden bir tümörün fokuslarinin saptanmasi veya tümör belirteci eksprese eden bir tümörün yerinin belirlenmesi ve/veya (b) tümör belirteci eksprese eden bir tümör için rezeksiyon cerrahisi uygulanan veya uygulanmis bir hastada bir rezeksiyon sinirinda tümör hücrelerinin veya tümör dokusunun saptanmasi. 15. Istem 13 veya l4'te tanilanan kullanima yönelik konjügat veya bilesim olup, özelligi; kullanimin asagidaki adimlari içermesidir: (a) konjügatin veya bilesimin bir tümörden mustarip bir hastaya verilmesi; (b) bahsedilen hastada tümör rezeksiyon cerrahisinin baslatilmasi; (c) rezeksiyon cerrahisi uygulanan hastanin rezeksiyon bölgesinde yer alan bir dokunun yaklasik 660 ila 700 nm'lik bir dalgaboyuna sahip bir isik ile aydinlatilmasi, burada (b) adiminin, (a) adimindan sonra en fazla yaklasik 96 saatlik bir süre içerisinde gerçeklestirilmesi. 16. Istemler 13 ila l5'in herhangi birinde tanimlanan kullanima yönelik konjügat veya bilesim olup, özelligi; tümörün bir kolorektum, mide, safra, pankreas, özofagus, over, meme, prostat, karaciger veya akciger kanseri olmasi veya tümörün bir malign gastrointestinal tümör olmasi ve burada konjügatin istem 6 veya 7'de tanimlanan konjügat olmasi ve konjügatin veya bilesimin istege göre topikal olarak, inhalasyon yoluyla veya intravenöz, intraperitoneal, subkütanöz veya intramusküler enjeksiyon veya perfüzyon yoluyla uygulanmasidir.