TW201708407A - 螢光綴合物 - Google Patents
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Abstract
本發明提供了具有偶聯到靶向部分T的螢光染料部分F的綴合物。部分F由式(I)表示，並且所述靶向部分T的特徵在於其對例如抗體或抗體片段的腫瘤標誌物具有親和力。所述綴合物在切除手術過程中可以用於包括腫瘤結節的光電檢測的腫瘤診斷。
Description
本發明屬於生物醫學研究的領域，尤其涉及在診斷，例如在腫瘤的體外或體內診斷中有用的化合物和方法。
癌症目前占全世界所有死亡人數的約13％。儘管經過幾十年來的大力研究，癌症仍然是高度發達國家中死亡的第二大原因，占死亡人數的約25％。對於許多類型的癌症，手術(通常與化療、放射治療或熱療結合)是治療干預的主體。
癌症也被稱為惡性贅生物或惡性腫瘤。贅生物是組織的異常增長。贅生物區分為良性贅生物、癌症前期贅生物或原位贅生物、以及惡性贅生物。許多但不是所有的贅生物也形成腫瘤，腫瘤是可從解剖上與未受影響的組織區別開來的實體或流體填充的病變。像贅生物一樣，腫瘤可以是良性腫瘤、癌症前期腫瘤、或惡性腫瘤。然而，在通用語言中以及在本發明的說明書中，術語“腫瘤”可以與“惡性腫瘤”同義使用。
癌症患者的生命預後取決於首次診斷時疾病所處的階段。百分之二十到百分之三十的胃腸道癌症患者將發生以獨特復發形式的局部復發。卵巢上皮性腫瘤在到達第三階段時也發生局部演變。幾年前證實了完全手術切除是患者預後改善的非常重要的因素。這種最大程度細胞減滅策略是治療方案的一部分，該治療方案包括可能與熱療有關的全身或腹膜內化療。
根治性手術的構建是關係到患者的將來的主要參數。檢測出總體的瘤結節及其播散是影響術後預後的關鍵點。腫瘤與正常組織往往並不容易區分，尤其是在患者已經接受新輔助治療的情況下更難以區分。外科醫生們則只能通過他們的視覺和觸覺，以及通過他們的經驗來引導，在進行手術時沒有可用的術中技術來幫助他們直觀腫瘤的擴展。
有人建議，可以通過使用原位光電探測來改善癌症切除手術。光電檢測取決於用對腫瘤具有親和力並在選定的光波長下能夠光學可視的化合物接觸潛在受影響的組織。
腫瘤的光電檢測最初是在1980年代借助于諸如光敏素之類的血卟啉衍生物而開發的。用這些分子進行光診斷的主要限制是它們對癌組織的低選擇性以及它們發生化學反應並誘發高光敏作用或壞死的能力。後面這種限制在光動力療法中實際上算為優點，為此還推薦這些化合物。
Folli等人使用抗癌胚抗原(CEA)抗體與螢光素的綴合物使結腸直腸癌患者的腫瘤可見(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 89, pp. 7973-7977, 1992)。Gutowsky等人證明瞭在小鼠模型中使用抗-CEA MAb 35A7和靛青 (Cy5)的綴合物對結腸癌LS174T的病變進行免疫光電檢測(Clin. Cancer Res., vol. 7, pp. 1142-1148, 2001)。
然而，這些綴合物的臨床效用相當有限。抗體與螢光素的綴合物具有相當低的激發和發射波長，導致低的組織穿透和通過用於激發染料組分的鐳射誘發的相當大程度的非癌組織的非特異性的自發螢光。Cy5綴合物的毒理學是未知的，並且也未在文獻中得到證實。
本發明解決了腫瘤光電檢測的這些和其它相關的問題和缺點。本發明的目的之一是提供對惡性腫瘤或癌症前期腫瘤的光電檢測有用的改善的綴合物，其在臨床上是可行的，其克服現有技術中的一個或多個缺點，並且其具有以下性質中的一種或多種：高度的腫瘤特異性、高靈敏度(如能夠檢測非常小的腫瘤病灶)、良好的臨床耐受性、高穩定性、對其它染料的干擾小、以及良好的可製造性。
本發明的另一個目的是提供使用這樣的綴合物的用於腫瘤的改進的體外和體內診斷方法。用於體內的話，這樣的診斷方法可能是新療法的一部分，該新療法為如改進的腫瘤切除方法。
本發明的另一個目的是提供用於製備這種綴合物的方法。
本發明的其它目的將在本發明的以下描述和本請求項書的基礎上顯而易見。
簡言之，本發明提供螢光綴合物，其包括偶聯到靶向部分T的螢光染料部分F，其中部分F具有如下文中所定義的式(I)，其中Y在每次出現時獨立地選自SO3
H、SO3 -
和SO3
M；M是一價陽離子；x、z 和 y獨立地選自從1至8的整數；且其中部分T對腫瘤標誌物具有親和力。在一個實施方式中，螢光染料部分F可具有如下所定義的式(II)。
靶向部分T對其具有親和力的腫瘤標誌物可以是腫瘤抗原，例如由某些腫瘤細胞表達或過度表達的抗原。這樣的抗原的實例是癌胚抗原(CEA)。靶向部分T本身可以是非肽配體、抗體、抗體片段、或包含抗體的至少一個可變區的融合蛋白。在一個實施方式中，靶向部分T是抗體，特別是嵌合抗體、人源化抗體或人單克隆抗體。
在另外的方面，本發明提供一種組合物，其包含這種綴合物，任選與其它活性或非活性成分組合。例如，該組合物可以是無菌的並且包含諸如注射用水、緩衝液組分之類的非活性成分，諸如氨基酸之類的一種或多種穩定劑，諸如單糖、二糖或寡糖的凍幹助劑，等滲劑等。該組合物還可包含少量的非綴合形式的靶向部分T。
在又一個方面，本發明提供一種用於製備綴合物的方法。該方法包括以下步驟：(a)提供具有如下所定義的式(III)的螢光染料，其中Y在每次出現時獨立地選自SO3
H、SO3 -
和SO3
M，其中M是一價陽離子，x、z 和 y獨立地選自從1至8的整數，以及Z選自抗衡離子、氫、琥珀醯亞胺基、磺基琥珀醯亞胺基、以及硝基苯基；(b)提供對腫瘤標誌物具有親和力的靶向劑；以及(c)偶聯螢光染料與靶向劑。在一個實施方式中，所述螢光染料具有如下所定義的式(IV)。
此外，本發明提供了所述綴合物以及包含所述綴合物的組合物的臨床和非臨床用途。體外用途包括用於檢測樣品中的一個或多種腫瘤細胞，或用於體外診斷和/或監測腫瘤。臨床上，所述綴合物和/或包含所述綴合物的組合物可用於檢測表達腫瘤標誌物的腫瘤病灶或用於確定患者體內的表達腫瘤標誌物的腫瘤的位置。例如，它們可用於檢測正在接受切除手術或已經接受切除手術的患者體內切除邊緣處的腫瘤細胞或腫瘤組織。在一個實施方式中，將包含所述綴合物的組合物施用到患有表達該靶向部分T對其具有親和力的腫瘤標誌物的腫瘤的患者，該施用為例如通過靜脈內、腹膜內、皮下或肌內注射或灌注，或者通過吸入或者通過局部給藥，例如以噴霧的方式；此後在不超過約72小時內對患者進行腫瘤切除手術，並用波長為約660至700納米的光照射正接受切除手術的患者切除位元點處的組織。以這種方式，包括原本人的肉眼不可見的非常小的結節或病灶的定位的腫瘤的定位將變得可見，以指導外科醫生完全切除腫瘤組織和/或驗證切除的完全性。
在第一方面，本發明提供螢光綴合物，其包括偶聯到靶向部分T的螢光染料部分F，其中部分F具有式(I)：其中Y在每次出現時獨立地選自SO3
H、SO3 -
和SO3
M；M是一價陽離子；x、z、和y獨立地選自1至8的整數；以及其中部分T對腫瘤標誌物具有親和力。
一價陽離子的實例包括但不限於鈉、鉀、或銨。在優選的實施方式中的一個中，Y選自SO3 -
和SO3
Na。
本發明的螢光綴合物的螢光染料部分F(其也可稱為螢光染料或螢光標記物)或螢光團部分吸收波長範圍優選在紫外、可見光譜或紅外處的電磁能以及發射通常較長波長範圍的電磁能，優選在可見或近紅外範圍內。如本文所理解的，術語激發波長(以nm表示)是指峰值，即螢光染料的最大或特定吸收波長，或者包括耦聯到靶向部分T的螢光染料部分的螢光綴合物的最大或特定吸收波長。術語發射波長(以nm表示)是指峰值，即螢光染料的最大或特定發射波長，或者本發明的包括耦聯到靶向部分的螢光染料部分的螢光綴合物的最大或特定發射波長。
螢光染料部分F是如上所述的式(I)的花菁染料衍生物並且優選發射峰值發射波長範圍介於650 和 750 nm之間的遠可見或近紅外(NIR)光譜。當偶聯到靶向部分T時，所得到的綴合物也優選發射峰值發射範圍介於650 和750 nm之間的光譜。
本發明人已經發現這些螢光染料部分具有特別有利的螢光特性，例如猝滅、量子產率，以及特別是對光致漂白的穩健性（robustness），使它們能夠可靠地用於與對抗原具有活性的靶向部分綴合。
就Y而言，本領域技術人員將認識到，取決於綴合物的化學環境，SO3
H、SO3 -
、SO3
M 和/或SO3
Na基團也可動態地彼此轉化。例如，當溶解在水性介質中時，取決於pH以及其它陽離子的可用性，由Y表示並選自SO3 -
、SO3
M 和/或SO3
Na的基團也可以質子化成SO3
H，或者其可以轉化成另一種鹽的形式，例如從SO3
Na轉化成SO3
K，或者反之亦然。因此，本發明涵蓋式(I)化合物的這種替代形式。
特別優選的綴合物是包含式(II)的螢光染料部分F的那些綴合物：。
在該螢光綴合物中，該螢光染料部分F被偶聯到靶向部分T；優選地其是共價連接的，即， 通過諸如醯胺或酯鍵之類的共價鍵綴合到靶向部分T。
如在式(I)的上下文中提到的，式(II)也應參照由Y表示的基團被解釋，以包括取決於例如綴合物可溶解於其中的水性介質的組成和/或pH值，在化學平衡下原位產生的諸如SO3
H或SO3
K之類的替代的磺酸形式。此外，應該理解的是，式(II)中四個磺酸基團中的每一個可以是Na鹽或內鹽形式，以及所描述的式(II)表示所代表的化合物的各種可能性中的僅一種。
螢光綴合物的靶向部分T對腫瘤標誌物具有親和力並可以與腫瘤標誌物相結合或相締合。腫瘤標誌物應被理解為由腫瘤產生或存在於腫瘤中的產物或分子，或由患者的正常細胞機制響應於腫瘤的存在而產生的產物或分子。如本文所用，除非從特定的上下文中明顯得出不同的含義，否則腫瘤是指贅生物，其是由異常的或不受控制的細胞增長引起的成群的或成團的細胞或組織。特別地， 腫瘤標誌物是由癌性的或惡性的腫瘤產生的。
腫瘤標誌物可以是，例如，蛋白質、糖蛋白、受體、激素、酶、抗原、癌基因或其產物的形式。腫瘤標誌物可以是由腫瘤細胞相比于正常細胞過度表達的，或者它可以是唯一地由腫瘤細胞產生的腫瘤特異性物質。靶向部分T可以靶向或定向的特別優選的腫瘤標誌物是作為存在於腫瘤細胞表面上的細胞表面蛋白或受體的那些腫瘤標誌物和/或特別在上皮細胞或諸如癌或肉瘤之類的實體腫瘤中表達的那些腫瘤標誌物。
在本發明的優選實施方式中，腫瘤標誌物是腫瘤抗原。腫瘤抗原是腫瘤細胞特有的或者與腫瘤細胞相關的分子或產物(例如在腫瘤細胞中過度表達的)，其可以誘導或刺激免疫系統反應，例如抗體的產生以及T細胞和/或B細胞應答。腫瘤抗原可以表示或包含蛋白質或脂質。它可以是糖基化的(例如，糖蛋白)，並且可以具有一個或多個表位，即，抗體、B細胞或T細胞可優選地結合於或對其具有特別的親和力的部位或域。
示例性的腫瘤抗原包括衍生自或產生自腫瘤病毒蛋白、僅在胎兒發育過程中通常以較高水準產生的癌胚抗原、由腫瘤細胞相對于正常細胞過度表達或積累的抗原、或突變體或翻譯後改變的抗原的腫瘤抗原。優選地，腫瘤標誌物是選自癌胚抗原(CEA)、表皮生長因數受體(EGFR)和人表皮生長因數受體-2(HER2)的腫瘤抗原。
在本發明的優選實施方式中，腫瘤抗原是癌胚抗原(CEA)。CEA是在上皮細胞中表達的分子量為180-200 kDa的癌胚糖蛋白。 CEA在特別是在結腸和直腸的惡性腫瘤(在95％的結腸直腸癌中過度表達)、以及胃、小腸、胰腺、肝臟、乳腺、卵巢、子宮頸、膀胱、膽囊和肺的惡性腫瘤中的細胞表面上以高水準表達。 CEA通常不限於局部而可以在整個細胞表面以及腺內管腔和細胞內管腔中表達。 CEA抗原包括如在Hammarström等人的(Cancer Res 1989 (49) 4852-4858)中所定義的分類為GOLD-1至 GOLD-5的五種主要的表位，抗CEA抗體或抗體片段或融合蛋白對其可具有結合特異性。
在優選的實施方式之一中，本發明的螢光綴合物的靶向部分T靶向並結合到可以位於患者的選自結腸、直腸、胃、小腸、胰腺、肝臟、乳腺、卵巢、子宮頸、膀胱、膽囊、肺和食道中的一個或多個組織或器官中的CEA抗原表達腫瘤。
在另一個優選的實施方式中，螢光綴合物的靶向部分T可以結合到為受體的腫瘤標誌物。該受體可以是腫瘤細胞特異性的或者可以是以較高水準過度表達並存在於腫瘤細胞中的。靶向部分T可以充當這種受體的配體，並且可以是小的非肽分子，即不摻入或不包括任何氨基酸序列的化學實體或化合物。
在優選的實施方式中，本發明的螢光綴合物包含式(I)或式(II)的螢光染料和選自非肽配體、抗體、抗體片段以及包含抗體的至少一個可變區的融合蛋白的靶向部分T。優選地，任何一種這樣的靶向部分都能夠特異性地結合到諸如CEA、HER2、或EGFR的腫瘤抗原。在一個具體的實施方式中，螢光綴合物包含式(I)或式(II)的螢光染料和選自非肽配體、抗體、抗體片段以及包含抗體的至少一個可變區的融合蛋白的靶向部分T，其中靶向部分特異性地結合到CEA。
在一個具體的實施方式中，靶向部分T是抗體或抗體片段、或包含抗體的至少一個可變區的融合蛋白。在這種情況下，抗體、抗體片段或包含抗體的至少一個可變區的融合蛋白可以源自、或屬於IgG、IgA、IgD或IgM免疫球蛋白同種型或類的任何一種。全長抗體通常是Y形的糖蛋白，其包含Fc(可結晶片段)結構域和Fab(抗原結合片段)結構域。這些是由經由二硫鍵互連以形成Y形結構的一對重鏈(H)和輕鏈(L)多肽結構構建的。每條鏈包含可變區(V)和恒定區(C)。重鏈包含可變鏈區(VH
)和多種恒定區(縮寫CH
1、CH
2等)；而輕鏈僅包含可變鏈區(VL
)和恒定區(CL
)。可變區參與抗體識別並特異性結合到抗原的特定表位，並形成抗原結合Fab結構域。
抗體片段是指能夠與抗原相互作用並特異性地結合到抗原的抗體的任何區、鏈、或結構域，或者任何構建物、穩定形式或其綴合物。示例性的抗體片段包括片段抗原結合結構域(Fab，或Fab')，Fab構建物，單鏈可變片段(scFv)，諸如VHH、微型抗體，雙價抗體等單結構域抗體。融合蛋白是指包含融合到另一個生物活性的蛋白或多肽的抗體片段的構建物。
在優選的實施方式中，本發明的螢光綴合物的靶向部分T是單克隆抗體(mAb)。這可以通過本領域中已知的方法來製備。嵌合單克隆抗體是特別優選的。這些是包含源自多於一個物種(例如源自人類抗體和鼠類抗體)的重鏈或輕鏈的結構域或區的混合單克隆抗體。任選地，螢光綴合物的靶向部分T可以是人源化抗體(通常主要包括至少85-95％人衍生的序列)或僅由人胚系抗體序列衍生的人抗體。
優選地，任何一種這樣的靶向部分T能夠特異性地結合到腫瘤抗原CEA。
在一個實施方式中，包含式(I)的螢光染料部分F的螢光綴合物的靶向部分T是具有對CEA抗原的一個或多個表位(例如，GOLD-1、 GOLD-2、GOLD-3、GOLD-4或GOLD-5表位)具有結合特異性的嵌合單克隆抗體。在一個具體實施方式中，靶向部分T對GOLD-2表位具有親和力或特異性。在另一個實施方式中，這樣的綴合物的螢光染料部分F具有如上所述的式(II)。
在特別優選的實施方式中，本發明提供螢光綴合物，其包括偶聯到靶向部分T的螢光染料部分F，其中部分F具有式(II)，以及其中部分T是針對CEA的GOLD-2表位的嵌合單克隆抗體，其包含G1m3同種異型的重鏈和km3同種異型的輕鏈，每條重鏈和每條輕鏈都包含至少一個小鼠IgG1可變結構域和至少一個人恒定結構域。這種嵌合單克隆抗體對CEA的GOLD-2表位具有如通過本領域公知的競爭結合/抑制試驗測定的結合特異性。
特別地，螢光綴合物可以偶聯到針對CEA的由以下核苷酸序列表達並製備的嵌合單克隆抗體： (A)重鏈(SEQ ID NO: 1)： GGTACCGCCGCCACCATGGACTCCAGACTGAACCTGGTGTTCCTGGTGCTGATCCTGAAGGGCGTGCAGTGCGACGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCTCCAGAAAGCTGTCTTGTGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCAACTTCGGCATGCACTGGATCCGGCAGGCCCCTGAGAAGGGCCTGGAATGGGTGGCCTATATCTCCGGCGGCTCCTCCACCATCTACTTCGCCGACACCCTGAAGGGACGGTTCACCATCTCCCGGGACAACCCCAAGAACACCCTGTTTCTGCAGATGACCTCCCTGCGGAGCGAGGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAGAGACTACTACATCAACAACTACTGGTACTTCGACGTGTGGGGCGCTGGCACCACCGTGACAGTGTCATCTGCTAGC (B)輕鏈 (SEQ ID NO: 2) GTCGACGCCGCCACCATGGAATTTCAGACCCAGGTGTTCGTGTTCGTGCTGCTGTGGCTGTCTGGCGTGGACGGCGACATCGTGATGACCCAGTCCCAGAAATTCATGTCCACCTCCGTGGGCGACCGGGTGTCCATCACATGCAAGGCCTCTCAGAACGTGCGGAGCGCCGTGGCCTGGTATCAGCAGACACCTGGCCAGAGCCCCAAGGCCCTGATCTACCTGGCCTCCAACAGATACACCGGCGTGCCCGATCGGTTCACCGGCTCTGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCAACGTGCAGTCCGAGGACCTGGCCGACTACTTCTGTCTGCAACACTGGAACTACCCCCTGACCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGGAACTGAAGCGTACG
上面的可變重鏈核苷酸序列(A)在5'端和3'端分別包括用於KpnI 和NheI限制位點的序列。可變輕鏈核苷酸序列(B)在序列的5'端和3'端分別包括SalI 和BSiWI限制位點序列。
這種單克隆抗體的可變區的氨基酸序列對應於以下序列： (A)重鏈 (SEQ ID NO: 3)： Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe Gly Met His Trp Ile Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Tyr Ile Ser Gly Gly Ser Ser Thr Ile Tyr Phe Ala Asp Thr Leu Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Phe Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Tyr Ile Asn Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser (B) 輕鏈 (SEQ ID NO: 4) Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Arg Ser Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Leu Gln His Trp Asn Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
在本發明的優選的實施方式中，螢光綴合物可以包括偶聯到靶向部分T的具有式(II)的部分F，其中T是針對CEA的包含SEQ ID NO: 4的可變輕鏈區和SEQ ID NO: 3的可變重鏈的嵌合單克隆抗體。
本發明的螢光綴合物可以包括綴合到一個靶向部分T的一個以上的螢光部分F，例如每個靶向部分T綴合1至約10個部分F。優選地，偶聯到一個靶向部分T的螢光染料部分F的數目是選自從1到4。換句話說，在一分子這樣的優選綴合物中，n個部分F偶聯到一個部分T，且n是選自1到4的整數。
儘管單獨的綴合物分子的特徵在於n是整數，但是包含多個綴合物分子的所述化合物可以具有一定的綴合度，或每部分T綴合平均數目的部分F，該平均數目不必是整數，但它優選為約1至約4的範圍內的任何值。
在這樣的背景下，靶向部分T優選選自抗體、抗體片段、以及包含抗體的至少一個可變區的融合蛋白，並且有一至四個式(I)的螢光染料部分F綴合到該靶向部分T。在本發明的一個實施方式中，靶向部分T是偶聯到n個式(II)的螢光染料部分F的抗CEA嵌合單克隆抗體，其中n是在1至4範圍內。
本發明的另一個方面涉及包含如上所述的螢光綴合物的組合物。
在一個實施方式中，該組合物包含僅或主要在於其綴合度不同的不同的螢光綴合物的混合物。在另一個具體實施方式中，該組合物包含至少3或4個綴合物的混合物，所有該綴合物都包含偶聯到對CEA的GOLD-2表位具有親和力的嵌合單克隆抗體的具有式(II)的螢光染料部分F，並且其中所述至少3或4個綴合物彼此之間的不同在於偶聯到一個靶向部分T的螢光染料部分F的數目分別為1、2和3；或分別為1、2、3和4。
該組合物可以進一步包含表示處於非綴合形式的靶向部分T的化合物(或理論上，具有取代度為零的綴合物)。例如，與前述實施方式組合，這樣的組合物包含對CEA的GOLD-2表位具有親和力的未綴合的嵌合單克隆抗體以及同一個所述單克隆抗體分別與1、2、3、以及可選4個或更多個根據式(II)的螢光染料部分F相偶聯的至少三或四個綴合物。這種混合物的綴合數目可以通過本領域已知的方法確定，例如經由質譜法(例如MALDI-TOF)確定。
組合物中的綴合物的平均綴合度優選為約0.5至約3。綴合度為螢光染料與抗體的摩爾比率，該摩爾比率可以通過分光光度法測定。因此，該數字應被理解為反映存在於組合物中的綴合物和任何未綴合的抗體的平均綴合度。在另一個實施方式中，平均取代度為約1至約2。本發明人已經發現，儘管較高的取代度可提供改善的視覺化，但是靶向部分對腫瘤標誌物的親和力隨著綴合到靶向部分的螢光染料部分的數目增加而降低。已經確定，取代度為約0.5至約3時，特別是對包含對CEA的GOLD-2表位具有親和力的嵌合單克隆抗體與根據式(II)的螢光染料的綴合物的組合物而言效果最好，原因在於它能夠在手術過程中實現對表達CEA的腫瘤的甚至小結節的優秀的視覺化。
本發明的組合物可以進一步包含賦形劑，例如緩衝劑、穩定劑、冷凍保護劑、等滲劑、以及pH調節劑。特別優選的賦形劑是鹼性氨基酸例如L-精氨酸及其鹽，鹽例如檸檬酸鹽、磷酸鈉或磷酸鉀鹽、氯化鈉、氯化鉀，糖類例如海藻糖、甘露糖醇、麥芽糖、蔗糖或葡聚糖，或非離子表面活性劑例如聚山梨酯或泊洛沙姆。該組合物的pH優選介於5.2和7.2之間。優選地，該組合物在本領域中公知的無菌條件下製備並且是無菌的。
在具體的實施方式中，包含任何的上述定義的螢光綴合物的組合物是無菌的，並且其還包括緩衝水溶液和L-精氨酸，和/或包括包含沒有偶聯到部分F的部分T的化合物。在另一個實施方式中，包含任何的上述定義的螢光綴合物的組合物是無菌的並且其包括pH值調節到約為6.0的緩衝水溶液、L-精氨酸鹽酸鹽、以及聚山梨酯，優選聚山梨酯20。糖例如海藻糖、甘露糖醇、麥芽糖或蔗糖也可以任選地被包含在這些組合物中。
在另一個具體的實施方式中，在組合物中的螢光綴合物的濃度，基於靶向部分（例如抗CEA單克隆抗體）的含量(如通過本領域已知的分光光度法或HPLC所測定的)計算，為介於1 mg/mL和10 mg/mL之間。
本發明的又一方面提供了一種用於製備螢光綴合物的方法，其包括以下步驟 (a)提供具有式(III)的螢光染料：其中Y在每次出現時獨立地選自SO3
H、SO3 -
和SO3
M，其中M是一價陽離子，x、z 和 y獨立地選自從1至8的整數，以及Z選自抗衡離子、氫、琥珀醯亞胺基、磺基琥珀醯亞胺基、以及硝基苯基；(b)提供對腫瘤標誌物具有親和力的靶向劑；以及(c)偶聯螢光染料與靶向劑。
一價陽離子的實例包括，但不限於，鈉、鉀、或銨。在優選的實施方式之一中，Y選自SO3 -
和SO3
Na。
可以通過這樣的製備方法獲得包括偶聯到靶向部分T的螢光染料部分F的本發明的螢光綴合物，其中部分F具有式(I)並且其中靶向部分T對腫瘤標誌物具有親和力。
如在任何前述段落中所述綴合物本身的背景中所描述的關於靶向部分T和螢光染料部分F的相同選項和優選項也適用於在本方法中待使用的靶向劑和螢光染料。因此，靶向劑優選是包含綴合物的靶向部分T的化合物，且在本方法中使用的螢光染料優選為包含或產生綴合物的螢光染料部分F的化合物。靶向劑優選對腫瘤抗原具有親和力，腫瘤抗原為例如癌胚抗原(CEA)。對CEA的親和力可以是對CEA的已知表位中的任何一種的親和力，例如GOLD-2表位。在特別優選的實施方式中，靶向劑是對CEA具有親和力的嵌合單克隆抗體。
對CEA具有親和力的嵌合單克隆抗體(mAb)可以通過由已經用編碼嵌合單克隆抗體的表達載體轉染的CHO細胞表達來生產。優選地，表達載體包括編碼抗體人恒定結構域和抗CEA抗體鼠可變結構域的核苷酸序列，優選具有如上所述的序列的可變結構域。
可以類似於描述在US 8,034,626中的方法和圖Ia的反應方案來製備對製備綴合物有用的螢光染料。例如，螢光染料可以由包含必要的磺酸鹽和(烷基)氧基取代基的兩個假吲哚衍生物的縮合而合成，其中兩個假吲哚衍生物中的一個是乙醯苯胺（acetanilodo）衍生物的形式。在一個實施方式中，假吲哚中間體可以由氨基芳香族前體經由以下步驟製備：重氮化/還原步驟，接著是磺化、羥基化、與酮發生費歇爾環化得到假吲哚，羥基取代基的羧基烷基化以及與磺內酯發生季銨化步驟。
在另一個實施方式中，螢光染料是式(IV)化合物：。
本發明的螢光染料可被啟動，優選作為活性酯(如，琥珀醯亞胺酯)，用於與靶向部分T綴合。在一個實施方式中，使用本領域已知的共價偶聯方法通過醯胺、酯、硫酯、二硫化物或氨基甲酸酯鍵將式(I)或式(II)的螢光染料偶聯到靶向部分T。在本發明的另一個實施方式中，在靶向部分T是抗體、抗體片段或肽序列的情況下，優選經由靶向部分T的游離氨基經由醯胺鍵綴合螢光染料。
本發明的另一個方面提供了螢光綴合物的體外用途，該螢光綴合物包含偶聯到對腫瘤標誌物具有親和力的靶向部分T的螢光染料部分F，其中部分F具有式(I)或式(II)，或者提供了包含所述螢光綴合物的組合物的體外用途，其用於檢測樣本中的腫瘤細胞，或者用於診斷和/或檢測腫瘤。
特別地，螢光綴合物可以用於檢測腫瘤細胞和表達諸如CEA之類的腫瘤抗原的腫瘤。在這樣的情況下，靶向部分T優選選自非肽配體、抗體、抗體片段、以及包含抗體的至少一個可變區的融合蛋白，例如如在任何前述的優選項和選項中所定義的。螢光綴合物可以用於檢測腫瘤細胞或者可以通過對由患者的體液(例如血清)或組織活檢獲得的樣本進行體外測試用於診斷或協助診斷癌症疾病。優選地，腫瘤是實體組織腫瘤，例如由結腸、直腸、胃、腸、膽管、胰腺、食道、卵巢、乳腺、前列腺，肝臟或肺得到或衍生而來的。此外，螢光綴合物可以有助於監測腫瘤的存在或進展，例如，用於在切除手術和/或化療治療後評估任何殘餘的腫瘤細胞或腫瘤組織。
在另一方面，本發明提供如本文所述的綴合物和/或包含該綴合物的組合物作為藥物的用途。如本文所使用的，藥物是指為任何醫療目的所施用的材料或產品，例如為診斷或治療的目的，包括人類受試者或動物的疾病或病症的預防性治療。特別地，本發明提供如本文所述的綴合物和/或包含該綴合物的組合物作為診斷藥或診斷試劑的用途。該用途包括對有需要的受試者單次或重複施用該綴合物或該組合物。在一個實施方式中，需要該綴合物或組合物的受試者是已經患有癌症或處於患癌症風險的受試者。
本發明還提供了該螢光綴合物和/或其組合物在檢測表達腫瘤標誌物的腫瘤的病灶中的用途或者用於確定患者體內的表達腫瘤標誌物的腫瘤的位置的用途。該用途可對患有特徵在於例如復發、轉移或種植（seeding）的疾病進展的癌症的患者是特別有用的。這樣的癌症進展可以導致腫瘤細胞或組織塊分佈較廣。特別地，螢光綴合物或該組合物可以用於檢測表達腫瘤標誌物或腫瘤抗原的腫瘤的病灶或者用於確定該腫瘤的位置，該腫瘤標誌物或腫瘤抗原即部分T對其具有親和力的腫瘤標誌物，優選位於細胞表面。如本文所理解的，術語病灶指限定腫瘤或可發展為腫瘤的病變並使其與周圍正常組織區別開來的細胞群或細胞簇或組織。
在優選的實施方式中，腫瘤表達CEA。在另一個優選的實施方式中，患者患有結腸直腸癌或胃腸癌。在這樣的癌症的晚期表現中，患者可能患有腹膜轉移癌，其中癌性腫瘤的廣泛轉移發生在腹膜腔內襯(lining)上。在本發明的具體的實施方式中，包含式(I)或式(II)的螢光染料部分和為嵌合單克隆抗體的靶向部分T的螢光綴合物被用於檢測表達CEA的腫瘤的病灶或用於確定患者體內的表達CEA的腫瘤的位置。
在腫瘤組織的手術切除過程中，外科醫生依賴于視覺外觀和觸診來區別腫瘤組織和正常組織。手術切除是完全或部分手術除去存在于患者的組織、結構或器官內的腫瘤組織。癌性或惡性腫瘤組織可能通常存在於裸眼不可見的小(例如，亞毫米大小的)結節或病變中。完全腫瘤切除往往對患者的預後非常關鍵，並且因此同樣重要的是，在手術除去患者的腫瘤和/或患者的腫瘤細胞減滅術治療的過程中，外科醫生能夠正確地識別、區分惡性腫瘤組織與健康組織的邊界和邊緣並切除所述腫瘤組織，以及避免不必要地除去或破壞健康組織或結構。
已經發現如上所述的螢光綴合物和/或包含這樣的綴合物的組合物在正在接受或已經接受手術切除表達腫瘤標誌物的腫瘤的患者體內的切除邊緣處的腫瘤細胞或腫瘤組織的檢測中特別有用。如本文所理解的，術語切除邊緣是指圍繞腫瘤組織的組織的邊緣或邊沿。圍繞所切除的腫瘤的組織的邊緣正常應為非癌性組織，其和腫瘤一起被切除以確保充分除去所有的惡性腫瘤組織，然而如上所述，可能難以確定邊緣的範圍和/或腫瘤組織與正常組織的範圍。可選地，切除邊緣也可理解為預期的切除邊緣，其可根據本發明的方法的用途確定或修改。
使用本發明的螢光綴合物或其組合物檢測正在接受或已經接受手術切除表達腫瘤標誌物的腫瘤的患者體內的切除邊緣處或切除邊緣附近的腫瘤細胞或腫瘤組織的方法，優選地其中腫瘤標誌物為腫瘤抗原，該方法在術中和術後(例如，腫瘤細胞減滅術)有助於協助外科醫生以便確保所有的腫瘤組織都被除去並確保可以得到乾淨的(或陰性的)邊緣，即其中檢測不到腫瘤細胞的邊緣。在優選的實施方式中，切除手術針對表達或過度表達CEA的腫瘤。
本發明以及如任何前述段落中所描述的螢光綴合物或組合物可以用於檢測腫瘤細胞或腫瘤組織，例如檢測腫瘤的病灶和/或確定它們的位置，以及在患者的手術切除過程中或術後檢測患者的腫瘤的切除邊緣，其中患者患有結腸直腸癌、胃癌、膽道癌、胰腺癌、食道癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌或肺癌。待被檢測或定位的腫瘤細胞或組織可以是表達CEA的癌或肉瘤的形式。優選地，螢光綴合物用於檢測例如患有腹膜轉移癌的患者體內的亞毫米大小範圍內的腫瘤結節或病變。
在用於檢測或用於定位腫瘤細胞或腫瘤組織或用於在切除手術中或術後檢測腫瘤的切除邊緣的本發明的螢光綴合物或組合物的用途的具體實施方式中，該腫瘤是惡性胃腸腫瘤並且該螢光綴合物包含偶聯到為針對CEA的GOLD-2表位的嵌合單克隆抗體的靶向部分T的式(I)或優選式(Ⅱ)的螢光染料部分F，該靶向部分T包含G1m3同種異型的重鏈和km3同種異型的輕鏈，每條重鏈和每條輕鏈都包含至少一個小鼠IgG1可變結構域和至少一個人恒定結構域。該胃腸腫瘤可意指位於胃腸道的任何部分的腫瘤，例如在食道、胃、小腸、大腸、直腸、以及與消化相關的器官（如胰腺、肝和膽）的腫瘤，並且可以在亞毫米大小的範圍內。針對這樣的用途，特別優選是其中所述嵌合單克隆抗體包含SEQ ID NO: 4的可變輕鏈區和SEQ ID NO: 3的可變重鏈的綴合物。
在用於檢測或用於定位腫瘤細胞或腫瘤組織或用於在切除手術中或術後檢測腫瘤的切除邊緣的本發明的螢光綴合物的用途的另一個具體實施方式中，該腫瘤是(惡性)乳腺腫瘤並且所使用的該螢光綴合物包含偶聯到為針對CEA的GOLD-2表位的嵌合單克隆抗體的靶向部分T的式(I)或優選式(Ⅱ)的螢光染料部分F，該靶向部分T包含G1m3同種異型的重鏈和km3同種異型的輕鏈，每條重鏈和每條輕鏈都包含至少一個小鼠IgG1可變結構域和至少一個人恒定結構域。針對這樣的用途，特別優選是其中所述嵌合單克隆抗體包含SEQ ID NO: 4的可變輕鏈區和SEQ ID NO: 3的可變重鏈的綴合物。如本文所使用的乳腺腫瘤可以意指位於與乳房或乳腺組織相關的任何組織中的腫瘤，任何組織包括腺或導管組織並且也可以包括例如在腋窩中發現的區域性的淋巴結。這樣的腫瘤可以在亞毫米大小的範圍內。
在另外的方面，例如用於檢測腫瘤的病灶以及確定它們的位置或者用於檢測正在接受或已經接受手術切除腫瘤的患者體內的切除邊緣處的腫瘤細胞或腫瘤組織的本發明的螢光綴合物或組合物的應用包括以下步驟： （a） 向患有腫瘤的患者施用該綴合物或組合物； （b） 開始對所述患者進行腫瘤切除手術； （c）用波長為約660至700 nm的光照射正接受切除手術的患者的切除位元點處的組織， 其中在步驟(a)後，在不超過約96小時或72小時的時間段內執行步驟(b)。
替代地，本文所述的綴合物或組合物的所有用途也可以被表示為方法，特別是用於診斷或治療患者的方法。例如，在檢測表達腫瘤標誌物的腫瘤的病灶或用於確定患者體內的表達腫瘤標誌物的腫瘤的位置中的用途也可以理解為檢測表達腫瘤標誌物的腫瘤的病灶或確定患者體內的表達腫瘤標誌物的腫瘤的位置的方法。
作為另一種替代方案，本文所述的綴合物或組合物的所有診斷用途和/或治療用途也可以表示為綴合物或組合物在製備用於(有助於)指定的診斷用途和/或治療用途的藥物或診斷劑中的用途。
在治療患有腫瘤的患者的方法的步驟(a)中，可以通過本領域已知的注射或灌注方法來施用該螢光綴合物或其組合物。特別地，可以通過靜脈內，腹膜內，皮下或肌內注射或灌注給藥方式來施用該綴合物或組合物。替代地，可以通過吸入或局部給藥方式來施用該螢光綴合物或其組合物。在這種情況下，局部施用包括直接施用到皮膚或施用到外部或內部粘膜。吸入可以有助於治療在其呼吸系統（例如在肺中）患有腫瘤的患者。當局部施用時，螢光綴合物或其組合物優選以噴霧的形式施用。
優選以0.1 至50 mg、或5 mg 至100 mg的劑量向患者施用該綴合物。在這種情況下，劑量是指在例如手術或診斷程式之前施用的綴合物和非綴合的抗體(若存在的話)的量。該劑量可以任選被劃分並間隔服用。在通過注射施用至患有結腸直腸癌、胃癌、膽道癌、胰腺癌、食道癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌或肺癌並正在接受切除手術的患者的情況下，劑量優選為約0.2至15 mg，例如0.5至10 mg、或5 至15 mg。優選地，所施用的劑量至少為5 mg。這些劑量範圍特別適用於具有如上所述的優選的取代度的綴合物和組合物。
優選地，在步驟(a)後，在不超過約96小時的時間段內執行步驟(b)。在其它實施方式中，在完成步驟(a)後，在不超過72小時、或不超過48小時、或不超過36小時、或不超過24小時、或不超過12小時的時間段內執行步驟(b)。
在該方法的步驟(c)中，以波長在近紅外區域內的光照射正接受切除手術的患者的切除位元點處的組織。在步驟(c)中使用的用於照射的光學設備優選靶向螢光綴合物的激發波長，該激發波長為優選介於660至700 nm之間的波長。在該方法的實施方式中，通過以680 nm的激發波長照射正接受切除手術的患者的切除位元點處的組織來執行步驟(c)。
在治療患有腫瘤的患者的方法的特別優選的實施方式中，該腫瘤是惡性胃腸道腫瘤，並且該螢光綴合物包含偶聯到為針對CEA的GOLD-2表位的嵌合單克隆抗體的靶向部分T的式(I)或優選式(Ⅱ)的螢光染料部分F，該靶向部分T包含G1m3同種異型的重鏈和km3同種異型的輕鏈，每條重鏈和每條輕鏈都包含至少一個小鼠IgG1可變結構域和至少一個人恒定結構域。
在本發明的又一方面，在上述實施方式的任何一個中所描繪的螢光綴合物也可以包含或摻入放射性同位素、放射性示蹤標記或放射性示蹤劑。可以例如通過直接對綴合物進行放射性標記或通過在綴合之前向靶向部分T應用放射性標記來得到經放射性標記的螢光綴合物。該經放射性標記的螢光綴合物及其組合物可以在治療應用和/或診斷應用中用作藥物。在一個實施方式中，向其施用該經放射性標記的綴合物或其組合物的受試者是已經患有癌症或處於患癌症風險的受試者。
實施例
實施例
1 -
抗
CEA
嵌合單克隆抗體的製備
基因設計與合成
分別編碼偽鼠（native murine）VH
和VL
可變結構域的以下核苷酸序列(A)和(B)是從鼠抗CEA抗體雜交瘤得到的，並且從頭合成並克隆到宿主pVVS串聯表達載體中。這些序列併入一些核苷酸修飾(不改變天然蛋白序列)以確保在CHO細胞中優化的克隆和優化的表達。KpnI和NheI限制位元點被分別插入編碼VH
結構域的序列的5’ 端和 3’ 端處。類似地，兩個限制位點序列SalI 和BSiWI被分別插入編碼VL
結構域的序列的5’ 端和 3’ 端處。 (A)重鏈(SEQ ID NO: 1)：GGTACCGCCGCCACC
ATGGACTCCAGACTGAACCTGGTGTTCCTGGTGCTGATCCTGAAGGGCGTGCAGTGCGACGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCTCCAGAAAGCTGTCTTGTGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCAACTTCGGCATGCACTGGATCCGGCAGGCCCCTGAGAAGGGCCTGGAATGGGTGGCCTATATCTCCGGCGGCTCCTCCACCATCTACTTCGCCGACACCCTGAAGGGACGGTTCACCATCTCCCGGGACAACCCCAAGAACACCCTGTTTCTGCAGATGACCTCCCTGCGGAGCGAGGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAGAGACTACTACATCAACAACTACTGGTACTTCGACGTGTGGGGCGCTGGCACCACCGTGACAGTGTCATCTGCTAGC
(B) 輕鏈(SEQ ID NO: 2)：GTCGACGCCGCCACC
ATGGAATTTCAGACCCAGGTGTTCGTGTTCGTGCTGCTGTGGCTGTCTGGCGTGGACGGCGACATCGTGATGACCCAGTCCCAGAAATTCATGTCCACCTCCGTGGGCGACCGGGTGTCCATCACATGCAAGGCCTCTCAGAACGTGCGGAGCGCCGTGGCCTGGTATCAGCAGACACCTGGCCAGAGCCCCAAGGCCCTGATCTACCTGGCCTCCAACAGATACACCGGCGTGCCCGATCGGTTCACCGGCTCTGGCTCTGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCAACGTGCAGTCCGAGGACCTGGCCGACTACTTCTGTCTGCAACACTGGAACTACCCCCTGACCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGGAACTGAAGCGTACG
載體合成
使用Sa1I/BsiWI和KpnI/NheI通過連續的雙酶切來製備被選擇用作VH
和VL
基因的宿主載體的pVVS串聯載體。這種表達載體編碼重鏈的人IgG1同種異型G1m3和人IgG1同種異型Km3的恒定結構域的序列。該載體還包括以下的功能元件：pCMV啟動子(用於重鏈和輕鏈兩者)、啟動子和用於翻譯的起始密碼子之間的嵌合內含子、pUC複製起點、BGH聚腺苷酸化位點、HS4 TK poly A絕緣子、SV40啟動子以及在載體擴增過程中和轉染後用於細胞選擇的卡那黴素/新黴素耐藥基因。酶切後，使用凝膠純化回收所得的載體骨架片段。
包含編碼如上所述的偽鼠VH
和VL
結構域的合成的VH
和VL
基因插入物的插入片段是分別使用KpnI/NheI和SalI/BsiWI從它們各自的PVVS串聯表達載體提取的並通過凝膠純化回收的。
將所有回收的片段彙集在一起並連接以產生用於轉染的最終載體。
轉染
/
選擇
由上述載體轉染的CHO細胞來自從歐洲細胞培養物保藏中心(ECACC)得到的CHO(無蛋白質)細胞系(編號＃00102307，批次02K/008)。這種細胞系，最初是由ECACC於1985年獲得，是從倉鼠卵巢組織得到的並且最初由Puck等人(1958)建立的親本CHO細胞系的亞克隆。
從ECACC小瓶得到的庫被命名為Bk1998。使細胞適應在沒有胎牛血清的情況下生長，然後通過有限稀釋法克隆。根據生長性質和轉染能力選擇亞克隆PF 3B9並將其儲備入庫(細胞庫Bk4164)。用於產生用於抗體的抗體生產的細胞基質的細胞庫Bk4164是由Bk21146的小瓶製備的。
最初使從亞克隆3B9得到的CHO細胞在添加有4 mM L-穀氨醯胺的EX-CELL ® ACF CHO培養基中解凍並在37℃在5％CO2
的濕潤氣氛中在回轉式震盪的條件下生長。在第五次傳代後2天進行轉染。通過用SWaI限制酶酶切使如上製備的表達載體線性化。用10 μg DNA通過Nucleofection™ (Amaxa)一式三份地進行轉染並在不震盪的情況下在37℃、5％CO2
下培育3天。在3天的回收期後，通過加入遺傳黴素(0.5 g/L)啟動選擇。不使用DNA經受Nucleofection™條件的細胞被用作抗生素選擇的對照。
在細胞活力達到至少80％後在遺傳黴素選擇壓力下進行有限稀釋克隆。針對3個轉染池中的每一個，以0.5個細胞/孔的目標細胞密度接種四十個96孔板。從這些池產生了來源於單細胞的475個克隆。在培養約18天后，通過ELISA評價抗體濃度以選擇150個最佳生產的克隆以便在24孔板中擴增。在細胞達到足夠的密度後，將這些轉移到6孔板中。根據10天分批動力學和如通過用於搖瓶擴增的快速酶聯免疫吸附試驗評估的mAb生產來進行進一步的選擇。基於補料分批動力學和如通過蛋白A HPLC評估的mAb生產(擴增到2L生物反應器)的進一步選擇導致選擇出用於抗體生產的lead克隆。
抗體生產
使lead克隆的細胞解凍並將其轉移到新生培養基(EX-CELL ® ACF CHO 培養基，4 mM L-穀氨醯胺)。在接種在75 cm2
燒瓶中後，測定活細胞密度並在離心後使細胞團塊以2 x 106
細胞/毫升的密度再懸浮在培養基中。細胞在37 ℃±1 ℃、8% ±2% CO2
中在回轉式震盪下生長。從第2天，培養物在增大容量的搖瓶中在EX-CELL ® ACF CHO培養基、4 mM L-穀氨醯胺中在37 ℃±1 ℃、8% ±2% CO2
中在回轉式震盪下擴增。在每次傳代評估細胞活力、密度和生長並經由顯微觀察法檢測出沒有污染物。在第17天，7次傳代後，使搖瓶的內容物彙集。對細胞進行計數並將其用於以0.5 x106
活細胞/毫升的密度以7 L的體積接種兩個15-L的生物反應器。細胞在補料分批培養物中在EX-CELL ® ACF CHO 培養基、5 mM L-穀氨醯胺、0.2%普朗尼克中在37℃下，在pH和氧調節下培養20天。根據需要加入BalanCD™ CHO Feed 3、葡萄糖和L-穀氨醯胺。每日評估細胞密度、活力、pH；也從第6天起每日取樣以確定葡萄糖濃度並從第10天起每日取樣以評估抗體濃度(蛋白A HPLC)。
在第20天通過使來自每個生物反應器的細胞懸浮液通過三個並聯深度篩檢程式並接著直接通過0.2 μm篩檢程式進行澄清。將經澄清的批量收穫物收集起來並通過蛋白A HPLC測試抗體含量，通過蛋白印跡分析鑒定重組蛋白，測試生物負荷、支原體和螺原體污染。將該批量收穫物分裝在2L PET瓶中並於-70℃至-90℃下儲存。
以如下方式對批量收穫物進行進一步處理：使經澄清的批量收穫物在15-25℃下解凍24小時，並將各個瓶子的內容物收集起來並通過磁力攪拌使其分佈均勻。將收集的批量收穫物首先在用50mM磷酸鈉、300mM NaCl、pH7.0的緩衝液平衡過的蛋白A親和層析柱上純化。在用平衡緩衝液並接著用25mM磷酸鈉、pH 7.0的緩衝液洗滌之後， 使用25mM乙酸鈉pH 3.5的緩衝液洗脫抗體。收集抗體峰(基於在280nm處的洗脫液吸光度)並在pH調節步驟之前將抗體洗脫液保持在15-25℃。
使用0.2M檸檬酸將抗體洗脫液的pH調節到3.8並在15-25℃同時攪拌下培養60-65分鐘。在用0.5 M Na2
HPO4
中和到pH 6.5之後，在0.2 μm篩檢程式上過濾該溶液，收集並於2-8℃下存儲。
使用磺酸酯配體樹脂通過陽離子交換層析進一步純化pH滅活抗體溶液。使用0.2 M檸檬酸將溶液的pH調整到5.0並將其載入到預先用25mM乙酸鈉、pH 5.0的緩衝液平衡的柱上。在用平衡緩衝液洗滌之後，使用25mM乙酸鈉、195.2 mM NaCl、pH 5.0的緩衝液洗脫抗體。基於在280nm處的吸光度收集。
使用在24 mM磷酸鈉、53.4 mM NaCl，pH7.0的緩衝液中平衡的季銨離子交換膜通過陰離子交換層析進一步純化所得的抗體溶液。使用0.5 M Na2
HPO4
將陽離子交換層析洗脫液的pH調整到pH 7.0並用25mM磷酸鈉、pH 7.0的緩衝液稀釋以達到11mS/cm的最終電導率。將溶液載入到所述膜上並基於在280nm處的吸光度在流過物中收集抗體。使收集的溶液通過0.2 μm篩檢程式過濾並進入無菌、一次性使用的PET容器中並於2-8℃下儲存。
然後使用30 kDA截止膜用10mM Tris-HCl、pH 7.2的緩衝液通過超濾和滲濾來濃縮抗體溶液。收集過濾的滲余物並於15-25℃下儲存。
然後用10 mM Tris-HCl pH 7.2的緩衝液將滲餘物稀釋至1 mg/mL並使其通過0.2 μm篩檢程式，接著通過預先用同樣的緩衝液平衡的納濾(Planova 15 N膜)。將濾液保存在15-25℃。在最後的步驟中，使所得的純化的批量抗體溶液過濾通過0.2 μm篩檢程式，使其分裝在無菌PET瓶中並於-70℃至90℃下存儲。
在每個純化步驟中取樣以便通過蛋白A HPLC進行抗體濃度測定。
通過諸如UPLC-UV-MS之類的本領域已知的方法表徵所得的抗體產物。如通過MALDI-TOF質譜所測定的，抗體的分子量是148.6 kDA。
實施例 2 - 式 ( Ⅳ ) 的螢光染料的製備
乙醯苯胺中間體(B) ：
使磺化假吲哚A與 1,4-丁烷磺內酯反應。使所得的中間體與β-丙烯醛縮苯胺反應以得到乙醯苯胺中間體B。 中間體化合物(D)：
中間體D經由威廉遜縮合製備以形成假吲哚前體C的羧基烷基氧基衍生物，接著用1,4-丁烷磺內酯季銨化。假吲哚C由胺化芳族前體的重氮化/還原，接著磺酸鹽形成、羥基化以及與酮發生費歇爾環化得到。 式 (IV) 的螢光染料
化合物B 與吲哚化合物D縮合。將所得的二碳花菁化合物用N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)活化以提供式(IV)的螢光染料。
實施例
3 -
螢光染料
綴合
到抗
CEA
嵌合
mAb
使實施例1的經純化的抗體在15-25℃下解凍約24小時。用30 kDa截止膜超濾/滲濾來執行緩衝液交換(0.1M磷酸鈉/碳酸鈉，pH9.3)。通過在15-25℃下過夜攪拌將螢光染料(實施例2的式(IV))以2.25 mg/mL的濃度溶解在DMF中。將DMF加入到抗體的溶液(使用0.1M磷酸鈉/碳酸鈉緩衝液稀釋到1 mg/mL的最終濃度，pH 9.3)中以得到10% v/v的最終濃度。然後將螢光染料的溶液以20 mL/min的流速以4.5摩爾過量加入到抗體溶液中。在環境溫度下在回轉式震盪下培養所得的反應混合物約45分鐘。
首先使用補充有10% (v/v) DMF的PBS-135mM L-精氨酸執行(30 kDa截止膜)第二超濾/滲濾步驟，接著配製緩衝液PBS-135mM- L-精氨酸以除去DMF。然後使用配製緩衝液將滲餘物稀釋至1.0-1.1 mg/mL的最終濃度(如通過分光光度分析所測定的)並過濾(0.2 μm)。
將所得的螢光綴合物填充到蓋有高密度聚乙烯帽的0.5L PET瓶子中，將其插入到琥珀色塑膠袋並於-20℃±5℃下儲存。
螢光染料/抗體的摩爾比是通過分光光度法測定的。觀察到1.5-1.6的平均綴合比率。
替代地，可以用DMSO作為綴合溶劑進行螢光染料到抗體的綴合。將螢光染料以4摩爾過量加入到具有10 % v/v的DMSO的最終反應濃度的所述抗體(具有1 mg/mL的溶液濃度)，在5至120分鐘之間的反應時間下得到如通過分光光度法所測定的平均綴合比率介於1.5-1.6之間的綴合物。相比於在DMF中在類似濃度和條件下製備的綴合物，在DMSO中製備的這些螢光綴合物就所得到的螢光發射強度、光致漂白和量子產率測量而言，沒有觀察到顯著差異。
實施例
4-
調配物
用於如根據實施例3製備的螢光綴合物的調配物的緩衝液也可以根據需要適合於本發明範圍內的用途和方法。例如，可以優選地在包含10 mM KH2
PO4
(VWR Prolabo)10 mM檸檬酸三鈉/檸檬酸(Fluka)、300 mM精氨酸HCl (Sigma)、0.02 % (w/v) 吐溫20 (Merck)的緩衝液中配製螢光綴合物，其中pH被調節到6.0。
實施例
5-
綴合物表徵
螢光研究
在680 nm的激發波長(用光學設備Fluobeam700所提供)處測定式(IV)的螢光染料和如根據實施例3製備的螢光綴合物的猝滅、光致漂白和螢光量子產率，該波長與臨床應用相關。
製備在0.05-500 μM的範圍內的各種濃度的於DMF中的式(IV)的螢光染料的樣品和於PBS 135 mM-精氨酸中的實施例3的螢光綴合物的樣品。
使用螢光計在猝滅(即，螢光染料本身在一定濃度下自抑制所發射的螢光)檢測之前測定螢光染料的最大螢光強度和最大濃度。
在減去緩衝液的背景螢光值之後得到螢光值。螢光綴合物在觀察到猝滅之前，最大螢光強度被測定為70 AU (任意單位)，最大濃度為5μM。螢光染料的最大螢光強度被測定為120 AU，且最大濃度為10 μM。
計算濃度為5 μM的樣品在680 nm的臨床波長處的作為衡量吸收光轉化為發射光的效率的量子產率。對於式(IV)的非綴合的螢光染料，量子產率被測得為0.26，而對於綴合螢光染料，觀察到0.15的量子產率，相當於只有43％的降低。
就臨床應用而言，特別是在腫瘤切除手術過程中，螢光綴合物的螢光染料應保持穩定和充足水準的螢光強度持續盡可能長的時間段。
也評估了螢光染料和綴合物，以及市售的碳花菁螢光染料（ Alexa Fluor®680）在680 nm的臨床激發波長處的光致漂白或螢光活性的損失，該市售的碳花菁螢光染料是具有與式(Ⅳ)的螢光染料的最大吸光度和發射波長相似的最大吸光度和發射波長(679 nm的最大吸光度和702 nm處的最大發射)的遠紅外發光染料。也評估了以類似於實施例3中描述的綴合方法製備的實施例1的抗CEA嵌合單克隆抗體和Alexa Fluor®
680的綴合物(得到約1.46的平均螢光染料與抗體比率)的光致漂白。於PBS 1x中製備這些綴合物的樣品。
製備濃度為5 μM的這些樣品並將其暴露於680 nm處的光。以0 h、30 min和1h、1.5h和2 h的光暴露時間間隔測量發射的螢光強度。 表1：隨著時間的推移的螢光發射(λex
= 680 nm)
在連續暴露於680 nm的臨床波長下30分鐘後，螢光綴合物的螢光為大約70%，而綴合到相同抗體的市售染料發射的螢光僅為約9%。1小時後，市售染料以及其綴合物的螢光強度幾乎為零，而螢光綴合物和未綴合的螢光染料的螢光仍然被保持。
組織交叉反應性
使用標準免疫組織化學技術在來源於三個不相關個體的42個人冷凍組織和血塗片的面板上進行使用生物素標記的綴合物的根據實施例3中製備的螢光綴合物的組織交叉反應性研究。發現抗體綴合物的特異性染色局限於消化道和幾種其它組織，上皮成分，主要在頂端細胞邊界或腔側，已在文獻中描述來表達證實僅靶向結合抗體的CEA。
抗原親和力
在BIACORE 3000設備上使用表面等離子體共振(SPR)也測定了如在實施例3中製備的螢光綴合物對靶癌胚抗原的親和力。癌胚抗原經由硫醇基偶聯到CM5晶片(Surface Thiol Coupling GE healthcare；Instruction 22-0618-10AB)。使用流中的6種不同濃度(從50 nM 到1.5 nM)的實施例1的嵌合單克隆抗體、單克隆抗體m511(實施例1的嵌合單克隆抗體的可變區所依據的原始鼠抗體)和螢光綴合物測量了結合和離解速率。使用Bia 軟體和 Bia 評估程式進行資料獲取和參數計算。實施例1的嵌合單克隆抗體對CEA的親和力(3.27x10-11
nM)保持非常接近於親本鼠511抗體對CEA的親和力(3.82x10-11
nM)，並且在其用近紅外螢光染料標記之後沒有改變(實施例3的螢光綴合物的KD被測量為3.21x10-11
nM)。
實施例 6- 體內研究
在表達人CEA的四種不同鼠模型體內評估了實施例3的螢光綴合物的功效。
在根據既定協定建立的LS-174T腹膜轉移癌小鼠模型中使用單光子發射電腦斷層攝影(SPECT)通過放射性測量評估螢光綴合物的組織分佈。使免疫抑制NMRI裸鼠經由腹腔注射過度表達CEA的LS-174T細胞而經受LS-174T細胞移植。10天后給小鼠靜脈注射30和50μg的125
I放射標記的螢光綴合物(其是通過使螢光綴合物與放射性標記碘化試劑一起培養來製備的)。在用50 μg的綴合物處理48小時後小鼠的視覺化(使用Nano-SPECT-CT (Bioscan®)相機進行)顯示放射性基本上局限于存在於小鼠的腹腔內的腫瘤結節。這一結果與在動物處死後得到的不同器官中放射性的生物分佈測量相對應。
也通過腹腔注射過度表達CEA的 LS-174T人腫瘤細胞之後向患有晚期腹膜轉移癌的免疫抑制NMRI裸鼠注射非放射標記的螢光綴合物進行體內螢光視覺化研究。在癌病發展12天以後，使動物靜脈接受20或30μg的螢光綴合物。在48小時後，處死動物並使用最優探針分別在680 nm 的激發波長和700 nm的發射波長處顯現螢光。在兩種劑量下，螢光分佈明顯地局限於腹膜腫瘤，使得能夠得到腹膜腔包括胰腺的區域(圖1，A列，在700nm處顯現的原位腫瘤) 中微結節的明顯視覺化。小於1 mm且重量小於1 mg (0.2-1.7 mg)的結節是可識別併發螢光的(圖1，展示與在A列描述的相同動物的個別切除腫瘤的B列，在700nm處顯現)。向健康動物注射所述螢光綴合物和作為對照的非相關的螢光綴合物(綴合有PX抗體，即，從鼠骨髓瘤MOPC21純化的IgG1單克隆抗體(參考Köhler 等人, Eur J Immunol 1976 (6) 292))，並沒有引起任何特異性染色。
值得注意的是，螢光綴合物不管腫瘤結節的位置如何都能夠使過度表達CEA的腫瘤結節視覺化，從而模擬臨床狀況。
使用基於表達人CEA的人結直腸癌的原位小鼠模型的模型(Tseng 等人, Vis. Exp. 2007 (10) 484)。在六周齡CD1-FOxn1nu
免疫抑制雌性小鼠的背部4個位點皮下注射過度表達CEA的HT29細胞以誘導皮下人結腸腫瘤發展。然後移除小腫瘤片段(直徑約3 mm)並移植到動物的盲腸壁以誘導原位腫瘤的發展。稍微破壞盲腸壁以誘導免疫反應並有利於腫瘤細胞浸潤。在這些腫瘤發展後，向動物靜脈注射30 μg的根據本發明的螢光綴合物(或具有非相關的PX抗體的螢光綴合物，作為對照)。在注射0、4、24和48小時後使用PEARL成像系統(Li-Cor Biosciences)測量皮下腫瘤或使用FLARE術中成像系統(Curadel)測量原位腫瘤在近紅外(700 nm)的螢光信號。
結果，在皮下和原位兩個位置處的腫瘤在700 nm處的術中免疫光檢測都被清楚觀察到(分別為圖2A和圖2B)。皮下腫瘤的螢光是如此高水準以致於在注射抗體48小時後通過動物的皮膚可見螢光(圖2A，A排)。
使用本發明的螢光綴合物也觀察到過度表達CEA的肝轉移人腫瘤。將LS-174T細胞或LoVo人結腸腺癌細胞注射到如在公開協定(參見 Tibbetts 等人, Cancer 1993, (71), 315-21)中所述的免疫抑制Balb/c裸鼠的脾臟中。這兩種細胞類型均過度表達CEA並誘導肝轉移癌的發展，但是遵循不同的模式。LoVo細胞誘導許多小轉移灶穿過肝臟的表面播散，而LS-174T細胞誘導僅少量較大轉移灶的形成。在700 nm處螢光視覺化48小時之前使小鼠受試者接受30 μg的螢光綴合物。作為對照，對小鼠注射基於PX抗體的非相關的綴合物。發現裸眼不可覺察(即裸眼不可見的)的非常小尺寸的腫瘤結節，例如，肝臟的表面上的微轉移灶，可在注射有所述螢光綴合物的小鼠中的限定這些腫瘤的輪廓的螢光下檢測到。 此外，證實了不論何種腫瘤結節的細胞系，均能使肝轉移灶視覺化。對照組沒有觀察到腫瘤的檢測。
用胰腺腫瘤的模型進行了類似的研究。在該研究中使用六周齡的無胸腺CD1-Foxn1nu
免疫抑制雌性小鼠，並且在腫瘤接種和成像程式過程中用異氟烷麻醉。如在Kim 等人, Nat. Protoc., 2009, 4, 1670-80中所描述的獲得原位胰腺腫瘤。動物的脾臟和胰腺均通過橫向切除而橫向外部化以暴露胰腺的整個長度。細針平行于脈管系統插入胰腺，通過該細針注射500 000 BXPC-3-luc2細胞(螢光素酶轉染的細胞系)。通過生物發光成像(BLI)每週監測原位腫瘤的生長，其是通過在使用IVIS光譜成像系統(Perkin Elmer Life Sciences)成像之前10 min腹膜內注射150 mg/kg的總體積為50 μL的於PBS中的D-螢光素溶液(SynChem, Inc)來執行。一旦經由BLI檢測到原位腫瘤，則通過動物的尾靜脈靜脈注射30 μg的螢光綴合物。在注射48小時後將動物處死，並在700 nm處的近紅外下檢查。觀察到原位胰腺腫瘤的清楚視覺化。在注射非特異性綴合物或單獨的螢光染料的對照小鼠中沒有觀察到視覺化。
信號與背景比是使用採用Pearl Impulse小動物螢光成像系統(LI-COR)測量的NIR螢光信號計算的。將圖像進行歸一化並選擇感興趣區域以便分析。將平均腫瘤特異性信號除以來自周圍組織的平均信號以提供平均信噪比。使用採用邦費羅尼校正的兩因素重複測量方差分析評估不同組在所有時間點的顯著信號與背景比。與信號與背景比值接近1的游離螢光染料或非相關的對照綴合物相反，螢光綴合物的信號與背景比大於3。
用蘇木精-伊紅染色的BXPC-3皮下腫瘤的切除的免疫組織化學分析證實螢光綴合物被結合到腫瘤，與僅表現為圍繞腫瘤細胞的非特異性染色的對照組相反。
總之，發現例如根據實施例3製備的螢光綴合物不論腫瘤的位置以及腫瘤的起源(即，結腸直腸對比胰腺)如何都能實現過度表達CEA的腫瘤結節的體內識別，證實了螢光綴合物的靶向能力。觀察到高水準的信噪比，能夠實現裸眼不可見的非常小的結節的檢測。
評估靜脈施用螢光綴合物的安全性和毒性的藥理學研究也證明對Wistar大鼠的中樞和外周神經系統沒有顯著不利影響，對Beagle犬的心血管和呼吸功能也沒有顯著不利影響，並證明大鼠很好地耐受高達40 mg/kg每天(85倍的預期臨床劑量) 的經測試的最大劑量水準的綴合物以及犬很好地耐受5 mg/kg(10倍的預期臨床劑量)的經測試的最大劑量水準的綴合物。
實施例
7-
臨床研究
(a)腹膜轉移癌-評估實施例3的綴合物在患有消化道起源的腹膜轉移癌(轉移性腫瘤)的15個人患者中的安全與性能的臨床研究。
通過靜脈注射施用5到15 mg範圍內劑量的實施例3的螢光綴合物。初步結果表明在任何這些劑量中均沒有觀察到不良反應。
(b) 結腸直腸癌和胰腺癌
-評估實施例3的螢光抗體綴合物在患有直腸癌或胰腺癌的30個人患者中的安全與性能的臨床研究。
進行手術48小時之前使用靜脈注射5 mg劑量的螢光綴合物的研究。在迄今研究的患者中，沒有報導在給藥過程中或給藥後不久的不良反應。總之，沒有觀察到生命體征與基線值相比在臨床上的顯著變化。
初步結果顯示在疑似腫瘤位元點處有非常明顯的螢光定位。使用配置以適用於螢光綴合物的設置的Artemis開放成像系統(Quest Medical Imaging)進行術中視覺化。
在一個胰腺癌患者中，使用螢光綴合物導致位於通常基於單獨的視覺檢查和觸診會被認為是圍繞局限於胰腺體中的原發腫瘤的無腫瘤切除邊緣(即導致保留腫瘤組織)的區域中的腫瘤細胞的識別(圖3-如通過單獨的視覺檢查和觸診確定而建議的切除邊緣由虛線表示，該邊緣會太靠近腫瘤組織，腫瘤組織的主要部分由點線表示。如通過螢光確定而建議的切除邊緣由實線表示)。由於許多腹膜轉移瘤的存在，僅進行探查和分期，即僅切除轉移瘤以在手術室的後臺上進行活檢和進一步分析。螢光綴合物提供病灶的明確的分界以及無論在體內還是在切除後體外的切除腫瘤中的轉移灶的清晰邊緣(圖3，A排：在白光下和在螢光(疊加圖像)下體內轉移灶的圖像；圖3，B排：在白光下和在螢光(疊加圖像)下體外切除的轉移灶的圖像)。
在以下施用螢光綴合物的另一個胰腺癌患者中觀察到類似的結果。觀察到明確界定疑似腫瘤的螢光，該腫瘤位於胰頭附近。
在確診為大腸癌的患者中，在切除前48小時施用5 mg劑量的螢光綴合物。該劑量耐受性良好，沒有觀察到不良反應。在懷疑轉移灶的髂旁左側淋巴結處檢測到界定轉移灶的明確的螢光信號。成功進行切除。
也對患有局部晚期直腸癌的患者施用5mg劑量的螢光綴合物。該劑量耐受性良好，沒有觀察到不良反應。進行腹腔鏡低位前切除術。切除的直腸組織在手術室後臺進行視覺化。觀察到切除的組織中清晰界定的腫瘤組織。
雖然本發明已以實施例揭露如上然其並非用以限定本發明，任何所屬技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作些許之更動與潤飾，故本發明之保護範圍當視後附之專利申請範圍所界定者為準。
無
圖1示出了在施用20 µg的實施例3的螢光綴合物後在700 nm處可見的LS-174T腹膜轉移癌小鼠模型內的原位腫瘤樣微結節的螢光(A列)和切除後的腫瘤樣微結節的螢光(B列)。 圖2A示出了過度表達CEA的人類結直腸癌(HT-29)的皮下腫瘤小鼠模型內腫瘤的圖像，該圖像是在施用30 µg的螢光綴合物48小時之後拍攝的(A-實施例3的螢光綴合物；B-對照綴合物)。從左到右的列示出了在白光、螢光(在700 nm處可視) 下拍攝的圖像以及在疊加下獲取的圖像。 圖2B示出了過度表達CEA的人類結直腸癌(HT-29)的原位腫瘤小鼠模型內腫瘤的圖像，該圖像是在施用30 µg的實施例3的螢光綴合物48小時之後拍攝的(A-切開前，B-切開後，C-腫瘤暴露後)。從左到右的列示出了在白光、螢光(在700 nm處可視) 下拍攝的圖像以及在疊加下獲取的圖像。 圖3示出了在患者的原發性胰腺腫瘤的手術過程中拍攝的圖像，該拍攝是在施用5 mg的實施例3的螢光綴合物48小時後進行的(A是在白光下，以及B是與螢光疊加的圖像)。虛線表示僅基於目測和觸診所建議的切除邊緣，而實線給出了基於螢光可視所建議的切除邊緣。點線表示如由螢光所示的腫瘤的大致輪廓。 圖4示出了在施用5 mg的實施例3的螢光綴合物48小時之後胰腺癌患者的腹膜轉移的圖像。在A排的圖像是手術中在體內獲得的，而在B排的圖像是切除後離體的(左列在白光條件下，而右列是與螢光作為疊加圖像)。
Claims (23)
- 一種螢光綴合物，其包括偶聯到靶向部分T的螢光染料部分F，其中部分F具有式(I)：其中 Y在每次出現時獨立地選自SO3 H、SO3 - 和SO3 M， 其中M是一價陽離子； x、z、和y獨立地選自1至8的整數；以及 其中部分T對腫瘤標誌物具有親和力。
- 如請求項1所述的綴合物，其中Y選自SO3 - 和SO3 Na。
- 如請求項1或2所述的綴合物，其中部分F具有式(II)：。
- 如請求項1至3中任一項所述的綴合物，其中所述腫瘤標誌物是腫瘤抗原。
- 如請求項4所述的綴合物，其中所述腫瘤抗原是癌胚抗原(CEA)。
- 如任意前述請求項所述的綴合物，其中部分T選自抗體、抗體片段和包含至少一個抗體的可變區的融合蛋白；並且其中所述抗體任選是嵌合單克隆抗體(mAb)。
- 如任意前述請求項所述的綴合物，其中所述部分T是結合到CEA抗原的一個或多個表位的嵌合單克隆抗體。
- 如請求項7所述的綴合物，其中部分F具有式(II)，並且其中所述嵌合單克隆抗體針對CEA的GOLD-2表位，其包含G1m3同種異型的重鏈和km3同種異型的輕鏈，每條重鏈和每條輕鏈都包含至少一個小鼠IgG1可變結構域和至少一個人恒定結構域。
- 如請求項8所述的綴合物，其中所述嵌合單克隆抗體包含SEQ ID NO: 4的可變輕鏈區和SEQ ID NO:3的可變重鏈。
- 如請求項1至5中任一項所述的綴合物，其中所述部分T是非肽配體。
- 如任意前述請求項所述的綴合物，其中n個部分F被偶聯到一個部分T，並且其中n是選自1至4的整數。
- 一種包含任意前述請求項所述的綴合物的組合物，其中所述組合物任選地： (a)是無菌的並包含緩衝水溶液和L-精氨酸，和/或 (b)包含包括沒有偶聯到部分F的部分T的化合物。
- 如請求項12所述的組合物，其中所述組合物中的所述綴合物的平均綴合度為約0.5至3。
- 一種用於製備螢光綴合物的方法，其包括以下步驟： (a)提供具有式(III)的螢光染料：其中Y在每次出現時獨立地選自SO3 H、SO3 - 和SO3 M，其中M是一價陽離子； x、z、和y獨立地選自1至8的整數；以及 Z選自抗衡離子、氫、琥珀醯亞胺基、磺基琥珀醯亞胺基、以及硝基苯基； (b)提供對腫瘤標誌物具有親和力的靶向劑；以及 (c)偶聯所述螢光染料與所述靶向劑。
- 如請求項14所述的方法，其中Y選自SO3 - 和SO3 Na。
- 如請求項14或15所述方法，其中所述靶向劑是對CEA具有親和力的嵌合單克隆抗體，和/或其中所述螢光染料是式(IV)的化合物：。
- 如請求項1至11所述的綴合物或者根據請求項12至13所述的組合物的體外用途，其用於檢測樣本中的腫瘤細胞或用於診斷和/或檢測腫瘤。
- 如請求項1至11所述的綴合物或者根據請求項12至13所述的組合物，其用作藥物或診斷劑。
- 如請求項1至11所述的綴合物或者根據請求項12至13所述的組合物，其用於： (a) 檢測表達所述腫瘤標誌物的腫瘤的病灶或用於確定患者體內的表達所述腫瘤標誌物的腫瘤的位置，和/或 (b) 檢測正接受或已經接受表達所述腫瘤標誌物的腫瘤的切除手術的患者體內切除邊緣處的腫瘤細胞或腫瘤組織。
- 用於請求項18或19的用途的綴合物或組合物，其中所述用途包括以下步驟： (a) 向患有腫瘤的患者施用所述綴合物或組合物； (b) 開始對所述患者進行腫瘤切除手術； (c) 用波長為約660至700 nm的光照射正接受所述切除手術的所述患者的切除位元點處的組織，其中在步驟(a)後，在不超過約96小時的時間段內執行步驟(b)。
- 用於請求項18至20中任一項的用途的綴合物或組合物，其中所述腫瘤是結腸直腸癌、胃癌、膽道癌、胰腺癌、食道癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌或肺癌。
- 用於請求項21的用途的綴合物或組合物，其中所述腫瘤是惡性胃腸道腫瘤，並且其中所述綴合物是根據請求項8或9所述的綴合物。
- 用於請求項18至22中任一項的用途的綴合物或組合物，其中所述綴合物或組合物是通過局部，吸入，或靜脈內，腹膜內，皮下，或肌內注射或灌注施用的。
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