CN117886938A - 一种egfr荧光抗体、制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
为克服现有技术中荧光染料存在非靶向性摄取、假阳性率高、半衰期短及不稳定的问题，本发明提供了一种EGFR荧光抗体，包括荧光染料、连接子、EGFR抗体及马来酰亚胺，所述EGFR抗体共价结合带有所述连接子的马来酰亚胺修饰的荧光染料分子。同时，本发明还公开了包括上述EGFR荧光抗体的制备方法及应用。本发明提供的EGFR荧光抗体可直接靶向肿瘤细胞EGFR，假阳性率低，且EGFR荧光抗体能通过胞吞作用被肿瘤组织高效特异性摄取并长时间滞留在肿瘤组织，提供稳定的荧光成像与导航特性。
Description
技术领域
本发明属于生物抗体-荧光染料技术领域，具体涉及一种EGFR荧光抗体、制备方法及应用。
背景技术
根治性手术切除是实体瘤治疗的基础，但在过去的几十年中，手术技术并未发生根本改变。在传统外科肿瘤手术中，主要依靠医生主观评估组织结构、颜色和触感等区分肿瘤与周围正常组织，并尽可能完整地切除肿瘤，但这种方式难免存在肿瘤残留或对正常组织过度切除的可能。而现有的医学影像手段无法检测到毫米级及以下的微小肿瘤病灶，这些微小病灶如果不能被彻底清除，可能会引起肿瘤的复发及转移，危及患者生命。因此要实现对肿瘤的根治性切除，还需要更精确的导航定位及微小病灶的术中显影技术。荧光导航手术尤其是免疫荧光导航手术，是将荧光基团标记在抗体上，通过抗体靶向肿瘤组织表面抗原，借助近红外激发光源、高灵敏近红外荧光摄像机及计算机图像处理系统实现手术中实时荧光成像，进而能够在术中实时显示肿瘤组织，可以帮助外科医生更精确地判断肿瘤边界及转移灶，从而确定手术切除范围。荧光导航手术系统最早应用于神经外科领域，近年来其临床应用范围已逐步扩展到脊柱外科、耳鼻喉科、肝胆外科和胃肠外科等，并随着精准外科理念的提出得到推广。
传统的基于吲哚菁绿荧光显像的肿瘤手术实时导航技术，其基本步骤包括：术前或术中经静脉或组织局部注射吲哚菁绿，术中获取和保存吲哚菁绿荧光图像，术者切除显示荧光的肿瘤和可疑淋巴结送病理学检查。传统的基于荧光标记抗体的肿瘤手术实时导航技术，首先需要制备荧光标记抗体，其基本步骤是采用抗体标记试剂盒，使携带活性酯的荧光染料与抗体上赖氨酸的游离氨基发生NHS酯反应，经过提纯得到所需的荧光标记抗体。例如Ito等(DOI:10.1007/s10120-013-0316-0)开展了一项基于吲哚菁绿标记的EGFR单抗的小鼠荧光显像研究，研究团队采用吲哚菁绿抗体标记试剂盒(Dojindo,Kumamoto,Japan)制备吲哚菁绿标记的西妥昔单抗，使携带活性酯的吲哚菁绿与西妥昔单抗上赖氨酸的游离氨基发生NHS酯反应。研究团队还构建了荧光素酶稳定表达的胃癌细胞系，建立了小鼠腹腔转移瘤CDX模型，通过静脉注射吲哚菁绿标记的西妥昔单抗，进行腹膜转移灶的三维(3D)双生物发光和荧光成像。此类传统技术尽管能够实现肿瘤的荧光显影，但技术的局限性使其难以普遍应用。
基于吲哚菁绿荧光显像的肿瘤手术实时导航技术中，吲哚菁绿在荧光导航手术应用中因其非靶向性的特点，具有一定的假阳性率，这可能导致正常组织被过度切除；吲哚菁绿经静脉注射后立即与血浆白蛋白和α、β脂蛋白结合，经血液循环迅速被肝细胞高效摄取，并被肝细胞以游离形式分泌到胆汁中，且无肠肝循环，因此吲哚菁绿被肝细胞以一级动力学清除，在体内停留时间较短(15min后滞留率＜10％)；基于荧光标记抗体的肿瘤手术实时导航技术中，采用的是第一代抗体标记技术，荧光标记抗体产物不均一(抗体中荧光基团的数量不一致)，荧光信号不恒定，临床适应症不明确，且尚未实现商业化，还处于在临床试验阶段；已报道的基于吲哚菁绿标记的西妥昔单抗的小鼠荧光显像，制备荧光抗体采用的是第一代抗体标记技术，合成原理是携带活性酯的荧光染料与抗体上赖氨酸的游离氨基发生随机NHS酯反应，稳定性和生物安全性都无法预测，且缺少标记抗体在小鼠体内的药代动力学的相关数据。
发明内容
针对现有技术中免疫荧光导航手术的荧光染料存在非靶向性摄取、假阳性高、半衰期短及不稳定的问题，提供一种EGFR荧光抗体、制备方法及应用。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案如下：
一方面，本发明提供一种EGFR荧光抗体，所述EGFR抗体共价结合带有所述连接子的马来酰亚胺修饰的荧光染料分子。
可选的，所述荧光染料包括吲哚菁绿、花青素和罗丹明中的一种或多种。
可选的，所述连接子结构式如下所述：
其中a的取值为1～5，b的取值为0～5。
可选的，所述荧光染料与所述马来酰亚胺连接结构式如下所示：
另一方面，本发明提供一种EGFR荧光抗体的制备方法，包括以下步骤：
合成制备马来酰亚胺修饰的荧光染料，马来酰亚胺与荧光染料分子间采用连接子连接；
取EGFR抗体与蛋白还原剂混合反应后，得到还原后抗体；
将还原后抗体与修饰的荧光染料混合反应后，提纯，得到EGFR荧光抗体。
可选的，所述蛋白还原剂包括三(2-羧乙基)膦、DTT和GSH中的一种或多种。
可选的，所述蛋白还原剂的浓度为5～10mM。
可选的，所述提纯还包括高速离心，所述离心时间为3～5min，离心速度为15000～20000g。
另一方面，本发明提供的所述EGFR荧光抗体在肿瘤诊断成像剂中应用。
可选的，所述肿瘤诊断包括结肠癌手术。
本发明技术方案中，利用所述连接子连接荧光染料与所述马来酰亚胺，得到修饰的荧光染料，被修饰的荧光染料再与所述被还原后的EGFR抗体标记结合，本发明提供的技术方案与传统的荧光染料标记抗体技术及吲哚菁绿标记西妥昔单抗技术均不同；本发明提供的所述EGFR抗体可直接靶向肿瘤细胞EGFR，假阳性率低，且EGFR荧光抗体能被EGFR高表达的肿瘤组织高效摄取，可长时间滞留在肿瘤组织，体内半衰期长；另外，本方案提供的EGFR荧光抗体的制备方法，具有产物稳定性高，易于生产的优点。
附图说明
图1是本发明提供的EGFR荧光抗体合成流程示意图；
图2是本发明提供的小鼠荧光活体成像图；(a、ICG在小鼠结肠癌皮下瘤模型的连续荧光活体成像；b、EGFR荧光抗体在小鼠结肠癌皮下瘤模型的连续荧光活体成像；c、EGFR荧光抗体在小鼠体内的代谢曲线)；
图3是本发明提供的荧光腹腔镜下EGFR荧光抗体对比ICG在小鼠结肠癌皮下瘤模型的荧光强度检测图(a、对照组ICG在小鼠结肠癌皮下瘤模型的成像；b、实验组EGFR荧光抗体在小鼠结肠癌皮下瘤模型的成像)。
图4是本发明提供的荧光腹腔镜下EGFR荧光抗体在小鼠原位结肠肿瘤模型的荧光强度检测图。
具体实施方式
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供一种EGFR荧光抗体，所述EGFR抗体共价结合带有所述连接子的马来酰亚胺修饰的荧光染料分子。
所述本发明技术方案中，利用所述连接子连接荧光染料与所述马来酰亚胺，得到修饰的荧光染料，被修饰的荧光染料再与所述EGFR抗体标记结合，可直接靶向肿瘤细胞EGFR，假阳性率低，且EGFR抗体能被EGFR高表达的肿瘤组织高效摄取，可长时间滞留在肿瘤组织，体内半衰期长。
在一些实施例中，所述荧光染料包括吲哚菁绿、花青素和罗丹明中的一种或多种。
需要说明的是，所述吲哚菁绿作为三碳菁型染料，具有近红外吸收特性(峰值吸收约800nm)，最大发射波长为807nm，但在可见光范围内几乎没有吸收，这是近红外波长(700～900nm)下自发荧光、组织吸收和散射较低的原因；马来酰亚胺活性基团，在中性pH以及各种底物(抗体、肽、蛋白质、寡核苷酸、小分子药物等)上可以将吲哚菁绿染料选择性地连接到巯基上(游离巯基、R-SH)，而无需任何激活；由于马来酰亚胺与胺、醇和酚(包括酪氨酸和组氨酸)的反应性非常低，不与组氨酸和蛋氨酸反应，因此具有非常高的标记选择性。此外，吲哚菁绿的人体安全性好，毒性反应低，是临床应用多年的荧光显影剂。
具体的，在本申请优选实施例中，所述荧光染料包括吲哚菁绿及磺酸基取代的吲哚菁绿。
所述连接子(linker)也叫化学连接子，一般为分子量较小的基团或片段，其主要作用连接原本很难发生反应的两个化学结构或分子，使化学结构或分子间反应得以顺利进行；
本申请中的所述连接子用于连接所述马来酰亚胺与所述荧光染料；具体的，本申请实施例中所述连接子结构如下：
在一些实施例中，所述荧光染料与所述马来酰亚胺连接结构式如下所示：
在优选实施例中，所述荧光染料与所述马来酰亚胺连接结构式如下所示：
需要说明的是，所述马来酰亚胺是顺丁烯二酸酐与胺衍生物反应的结构元素，容易通过亲核Michael加成反应形成稳定的目的产物；
所述二磺酸-ICG-马来酰亚胺，是ICG-马来酰亚胺的磺酸化衍生物。磺酸化增强了其水溶性，使其能够在水性缓冲液、细胞培养液和其他水性溶液中稳定溶解；另外，二磺酸-ICG-马来酰亚胺，保持了原始荧光染料ICG的荧光特性，具有在近红外波长范围内的荧光发射，使其在标记反应中能够形成稳定的共价结合，提供持久的荧光信号；
具体的，所述合成方法参考现有文献报道中的合成方法(TargetingFluorescenceImaging of RGD-Modified Indocyanine Green Micelles on GastricCancer.FrontBioeng Biotechnol.doi:10.3389/fbioe.2020.575365)。
本发明一实施例提供一种EGFR荧光抗体的制备方法，包括以下步骤：
合成具有马来酰亚胺修饰的荧光染料，荧光染料与马来酰亚胺通过连接子连接；
取EGFR抗体与蛋白还原剂混合反应后，得到还原后抗体；
将还原后抗体与修饰的荧光染料混合反应后，提纯，得到EGFR荧光抗体。
在一些实施例中，所述蛋白还原剂包括三(2-羧乙基)膦、DTT和GSH中的一种或多种。
在一些实施例中，所述蛋白还原剂的浓度为5～10mM。
在优选实施例中所述蛋白还原剂的浓度为10mM。
在一些实施例中，所述蛋白还原剂的添加量为0.5～2当量。
在一些实施例中，所述EGFR抗体的添加量为0.5～2当量。
在一些实施例中，所述提纯还包括高速离心，所述离心时间为3～5min，离心速度为15000～20000g。
具体的，EGFR荧光抗体的制备方法中，所述EGFR抗体溶液与所述蛋白还原剂混合反应后离心，去除残留蛋白还原剂；具体的，所述离心时间为5min，离心速度为20000g。
本发明另一实施例提供的所述EGFR荧光抗体在肿瘤诊断成像剂中应用。
具体的，本技术采用的所述荧光材料靶向肿瘤细胞的靶点蛋白(EGFR)，靶向性高假阳性率低，所述的荧光染料能被EGFR高表达的肿瘤组织高效摄取，在体内的半衰期较长，能长时间滞留在肿瘤组织，提高了病灶成像的分辨率和成像效率，术中能实时精准定位靶点蛋白高表达的肿瘤组织。
在一些实施例中，所述肿瘤诊断包括结肠癌手术。
具体的，所述EGFR荧光抗体通过靶向肿瘤细胞的靶点蛋白，在体内与靶点蛋白结合，使相应病灶荧光成像。结肠癌中EGFR高表达，因此本申请所述的EGFR荧光抗体应用在结肠癌手术中，有利于高效、便捷的示踪结肠癌病灶。以下通过实施例对本发明进行进一步的说明。
实施例1
本实施例用于说明本发明公开的EGFR荧光抗体及其制备方法，图1为其示意图，包括以下操作步骤：
采用连接子分别连接马来酰亚胺和荧光染料，得到修饰的荧光染料；
取EGFR抗体与2.0当量的三-(2-羧乙基)膦还原剂37℃混合反应2h，得到还原后抗体；
将还原后抗体与修饰的荧光染料4.0当量混合25℃反应4h后，20000g，高速离心5min，取上清并脱盐处理，加入PBS作为平衡液，使其pH＝7.4，得到EGFR荧光抗体。
动物实验
检测实施例1制备得到的EGFR荧光抗体在小鼠体内的药时曲线，包括以下操作步骤：
建立稳定荧光素酶表达的结肠癌细胞系：
小鼠品系：NCG，肿瘤细胞系：人结肠癌细胞系HT29(luciferase稳转细胞株)；
荧光材料静脉注射给药；
荧光材料的用量：
TBSA＝kW2/3/10000
TBSA＝total body surface area(m3)
W＝weight(g)
Kmouse＝9.1
TBSAmouse＝7.57E-3m3
Initial dose:250mg/m2
Wmouse＝24g
每只小鼠的标准治疗剂量:250mg/m2，结合既往文献报道，以治疗剂量的1/10(25mg/m2)作为诊断用剂量；
由于EGFR荧光抗体的(药物-抗体比)DAR＝8，即每一个EGFR抗体分子共价结合8个吲哚菁绿分子，作为对照组，计算得到每只小鼠的吲哚菁绿的诊断用剂量为5.74μg；
经小鼠尾静脉注射EGFR荧光抗体(每只小鼠25mg/m2)，使用IVIS Spectrum活体成像，激发光780nm，发射光830nm条件下，观察2周(第1周每日成像1次，第2周隔日成像1次)。
检测实施例1制备得到的EGFR荧光抗体在小鼠体内荧光强度，包括以下步骤：
建立小鼠人结肠癌细胞系异体移植模型，包括皮下瘤模型和结肠原位模型；
经小鼠尾静脉注射EGFR荧光抗体作为实验组，注射吲哚菁绿作为对照组，3天后，利用荧光内窥镜摄像系统成像(808nm激光)观察实验组和对照组荧光强度。
图2中，a图表示ICG经静脉给药后，小鼠皮下瘤未见特异性荧光显影，而小鼠非肿瘤部位(尤其是肝脏)出现非特异性荧光显影(如D0所示)，24小时后荧光信号消失(圆圈内为肿瘤实际大小)；b图表示EGFR荧光抗体经静脉给药后1～4天可见皮下瘤特异性显影(圆圈内为肿瘤实际大小)，给药后5～7天荧光信号逐渐衰减；c.小鼠血清中EGFR荧光抗体代谢曲线，半衰期大约4.5天。
图3为小鼠皮下瘤模型，其中a图表示经静脉注射ICG的对照组中荧光信号在小鼠全身呈弥散分布；b图表示经静脉注射EGFR荧光抗体的实验组中荧光信号富集在皮下瘤，说明EGFR荧光抗体特异性靶向肿瘤组织。
图4为小鼠结肠原位肿瘤模型，EGFR荧光抗体经静脉给药后3天，使用荧光内窥镜摄像系统成像：术前(大体观)在普通光源下不可见的结肠肿瘤，在近红外(808nm激光)和荧光模式下均可显像(箭头指示位置)；术中(剖腹后)在普通光源下可见结肠肿瘤，近红外(808nm激光)和荧光模式下均可见结肠肿瘤特异性荧光显像(箭头指示位置)，而非肿瘤组织则无荧光信号。
即本申请提供的EGFR荧光抗体能被EGFR高表达的肿瘤组织高效摄取，可长时间滞留在肿瘤组织，延长所述EGFR荧光抗体在其体内半衰期，进而为相关肿瘤的免疫荧光标记手术提供了良好的导航示踪效果，提高肿瘤切除术的精准度。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种EGFR荧光抗体，其特征在于，包括荧光染料、连接子、EGFR抗体及马来酰亚胺，所述EGFR抗体共价结合带有所述连接子的马来酰亚胺修饰的荧光染料分子。
2.根据权利要求1所述的一种EGFR荧光抗体，其特征在于，所述荧光染料包括吲哚菁绿、花青素和罗丹明中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的一种EGFR荧光抗体，其特征在于，所述连接子结构式如下所示：
其中a的取值为1～5，b的取值为0～5。
4.根据权利要求1所述的一种EGFR荧光抗体，其特征在于，所述荧光染料与所述马来酰亚胺连接结构式如下所示：
。
5.根据权利要求1～4任意一项所述的EGFR荧光抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
合成制备马来酰亚胺修饰的荧光染料，马来酰亚胺与荧光染料分子间采用连接子连接；
取EGFR抗体与蛋白还原剂混合反应后，得到还原后抗体；
将还原后抗体与修饰的荧光染料混合反应后，提纯，得到EGFR荧光抗体。
6.根据权利要求5所述的一种EGFR荧光抗体制备方法，其特征在于，所述蛋白还原剂包括三(2-羧乙基)膦、DTT和GSH中的一种或多种。
7.根据权利要求5所述的一种EGFR荧光抗体制备方法，其特征在于，所述蛋白还原剂的浓度为5～10mM。
8.根据权利要求5所述的一种EGFR荧光抗体制备方法，其特征在于，所述提纯还包括高速离心，所述离心时间为3～5min，离心速度为15000～20000g。
9.如权利要求1～4任意一项所述的EGFR荧光抗体在肿瘤诊断成像剂中应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肿瘤诊断包括结肠癌手术。
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