TH18727U - ชุดไพรเมอร์และดีเอ็นเอวงกลมตรวจจับสำหรับวิเคราะห์ปริมาณไมโครอาร์เอ็นเอ21 และกรรมวิธีสำหรับวิเคราะห์ไมโครอาร์เอ็นเอด้วยชุดไพรเมอร์ดังกล่าว - Google Patents

Abstract

หน้า 1 ของจำนวน 1 หน้า บทสรุปการประดิษฐ์ การประดิษฐ์นี้เป็นการพัฒนาชุดไพรเมอร์และกรรมวิธีการวิเคราะห์ปริมาณไมโครอาร์เอ็นเอเป้าหมาย โดยใช้เทคนิคไลเกชัน และบรานโรลลิ่งเซอร์เคิลแอมพลิพีเคชันโดยใช้อุณหภูมิเดียว ทำให้ลดการรบกวน สัญญาณรบกวนจากพื้นหลังโดยอาศัยคุณสมบัติเฉพาะตัวของกราพีนออกไซด์ สามารถตรวจวัดปริมาณไมโคร อาร์เอ็นเอเป้าหมายได้ถึงระบบเฟมโตโมล ในระยะเวลาประมาณ 3 ชั่วโมง 30 นาที อีกทั้งยังสามารถวิเคราะห์ ไมโครอาร์เอ็นเอเป้าหมายชนิดปกติออกจากชนิดกลายพันธ์ได้อย่างแม่นยำ การประดิษฐ์ครั้งนี้ได้ใช้ ดีเอ็นเอวงกลมตรวจจับ โดยที่บริเวณปลาย 5’ และ 3’ มิลำดับเบสที่สามารถจับอย่างจำเพาะต่อไมโครอาร์เอ็น เอเป้าหมาย จากนั้นอาศัยคุณสมบัติของเอนไซม์ทีโฟ-อาร์เอ็นเอไลเกสทู เชื่อมต่อปลายทั้งช้างเพื่อเปลี่ยน โครงสร้างของดีเอ็นเอวงกลมตรวจจับ จากโครงสร้างแบบวงกลมปลายเปิดเป็นปลายปิด เพื่อเข้าสู่ปฏิกิริยาบ รานโรลลิงเซอธ์เคิลแอมพลิพีเคชัน โดยทำการเพิ่มไพรเมอร์พีเอและอาศัยการทำงานของเอนไซม์ไพน์29 ดีเอ็น เอโพลิเมอร์เรส โดยเอนไซม์นี้ทำการสังเคราะห์ดีเอ็นเอสายใหม่โดยใช้ไมโครอาร์เอ็นเอเป้าหมายและไพรเมอร์ พีเอที่เพิ่มเข้าไป ให้ทำหน้าที่เป็นไพรเมอร์เริ่มต้น จากนั้นทำการวิเคราะห์เซิงปริมาณผลิตผลที่เกิดขึ้นโดยอาศัย คุณสมบัติการยับยั้งการส่งสัญญาณฟลูออเรสเซนด์ของกราพีนออกไซด์

Claims (10)

หน้า 1 ของจำนวน 2 หน้า ข้อถือสิทธิ

1. ชุดไพรเมอร์และดีเอ็นเอวงกลมตรวจจับสำหรับวิเคราะห์ปริมาณไมโครอาร์เอ็นเอ21 ประกอบด้วย ก. ไพรเมอร์พีเอ ที่มีลำดับนิวคลิโอไทด์ ดังนี้ 5’-CAA CCA AAA CCA ACA CCA-3’ และ ข. ดีเอ็นเอวงกลมตรวจจับ21 ซึ่งมีลำดับนิวคลีโอไทด์ ดังนี้ 57Phos/-ct gat aag eta CAA CCA AAA CCA ACA CCA ATT CCA CAC CTC CCT ACA CAA CCA AAA CCA ACA CCA tc aac ate agt -3’ ที่ซึ่งไพรเมอร์พีเอจับกับดีเอ็นเอวงกลมตรวจจับ21

2. ชุดไพรเมอร์และดีเอ็นเอวงกลมตรวจจับ ตามข้อถือสิทธิที่ 1 ประกอบเพิ่มเติมด้วย ดีเอ็นเอวงกลมตรวจจับ 16 ซึ่งมีลำดับนิวคลิโอไทด์ดังนี้ 5 ’/Phos/-g ctg eta CAA CCA AAA CCA ACA CCA TCC TCT ACC TCT ACC TCT CAA CCA AAA CCA ACA CCA eg cca ata ttt aeg t -3’ โดยที่ไพรเมอร์พีเอจับกับดีเอ็นเอวงกลมตรวจจับ 16

3. กรรมวิธีลำหรับวิเคราะห์ไมโครอาร์เอ็นเอโดยใช้เทคนิคไลเกชันและปฏิกิริยาบรานโรลลิงเซอเคิล แอมพลิพีเคชันที่อุณหภูมิเดียว ด้วยขุดไพรเมอริและดีเอ็นเอวงกลมตรวจจับ ตาม ข้อถือสิทธิที่ 1 มีขั้นตอน ดังนี้ ก. เตรียมดีเอ็นเอวงกลมตรวจจับแบบปลายปิดที่จำเพาะกับไมโครอาริเอ็นเอเป้าหมาย ด้วย เทคนิคไลเกชัน โดยการนำไมโครอาริเอ็นเอเป้าหมาย มาทำการไอบริไดเซชัน ร่วมกับดีเอ็นเอ วงกลมตรวจจับที่จำเพาะกับไมโครอาริเอ็นเอเป้าหมาย เพื่อให้ดีเอ็นเอวงกลมตรวจจับที่จำเพาะ เข้าจับกับไมโครอาริเอ็นเอเป้าหมาย จากนั้นน่าเอนไซม์ทีโฟ-อาริเอ็นเอ ไลเกสทู ไปเชื่อมต่อดี เอ็นเอวงกลมตรวจจับที่จำเพาะที่ปลาย 5’เข้ากับปลาย 3’ เกิดเป็นดีเอ็นเอวงกลมตรวจจับแบบ ปลายปิดที่จำเพาะกับไมโครอาริเอ็นเอเป้าหมาย ข. น่าดีเอ็นเอวงกลมตรวจจับแบบปลายปิดที่จำเพาะกับไมโครอาริเอ็นเอเป้าหมายที่ได้ไปสังเคราะห์ ดีเอ็นเอสายใหม่โดยใช้ไมโครอาริเอ็นเอเป้าหมายและไพรเมอริพีเอ เป็นไพรเมอริเริ่มต้น เพื่อเข้า สู่ปฏิกิริยาบรานโรลลิงเซอร์เคิลแอมพลิพีเคชั่น โดยอาศัยการทำงานของเอ็นไซม์ไพน์29 ดีเอ็นเอ โพลิเมอร์เรส เพื่อให้ได้ผลิตภัณฑ์ไมโครอาร์เอ็นเป้าหมายที่มีลักษณะเป็นดีเอ็นเอสายเดี่ยวสาย ยาว และ หน้า 2 ของจำนวน 2 หน้า ค. วิเคราะห์ผลิตภัณฑ์ไมโครอารีเอ็นเป้าหมายที่ถูกเพิ่มจำนวน ด้วยดีเอ็นเอ-กราฟีนคอมเพล็กซ์ ที่ ประกอบด้วยดีเอ็นเอสายเดี่ยวตรวจจับที่ติดด้วยสารฟลูออเรสเซนต์ที่จำเพาะกับไมโครอาร์เอ็น เอเป้าหมาย จากนั้นทำการตรวจวัดสัญญาณฟลูออเรสเซนต์ที่เกิดขึ้น

4. กรรมวิธี ตามข้อถือสิทธิที่ 3 ประกอบเพิ่มเติมด้วย การเปรียบเทียบสัญญาณฟลูออเรสเซนต์ที่เกิดขึ้นจาก ไมโครอาร์เอ็นเอเป้าหมายที่เป็นไมโครอารีเอ็นเออ้างอิง

5. กรรมวิธี ตามข้อถือสิทธิที่ 3 ที่ซึ่ง ไมโครอารีเอ็นเป้าหมายเลือกได้อย่างน้อยหนึ่งชนิดจาก ไมโครอารีเอ็น เอ21 และไมโครอารีเอ็นเอ16

6. กรรมวิธี ตามข้อถือสิทธิที่ 3 หรือ 4 ที่ซึ่ง ไมโครอารีเอ็นเอเป้าหมายที่เป็นไมโครอารีเอ็นเออ้างอิง คือ ไมโครอารีเอ็นเอ16

7. กรรมวิธี ตามข้อถือสิทธิ 5 ที่ซึ่ง ดีเอ็นเอวงกลมตรวจจับที่จำเพาะกับไมโครอารีเอ็นเอ21 มีลำดับ นิวคลิโอไทด์ ดังนี้ 5 ’/PhosAct gat aag eta CM CCA AM CCA ACA CCA ATT CCA CAC CTC CCT ACA CM CCA AM CCA ACA CCA tc aac ate agt -3’

8. กรรมวิธี ตามข้อถือสิทธิที่ 5 ที่ซึ่ง ดีเอ็นเอวงกลมตรวจจับที่จำเพาะกับไมโครอารีเอ็นเอ16 มีลำดับ นิวคลิโอไทด์ ดังนี้ 5 ’ / PhosAg ctg eta CM CCA AM CCA ACA CCA TCC TCT ACC TCT ACC TCT CM CCA AAA CCA ACA CCA eg cca ata ttt aeg t -3’

9. กรรมวิธี ตามข้อถือสิทธิที่ 3 หรือ 5 ที่ซึ่ง ดีเอ็นเอสายเดี่ยวตรวจจับที่ติดด้วยสารฟลูออเรสเซนต์ชนิด ไซไฟว์ (Cy5) ที่จำเพาะสำหรับตรวจจับไมโครอารีเอ็นเอ21 มีลำดับนิวคลิโอไทด์ ดังนี้ 5’-/Cy5AATT CCA CAC CTC CCT ACA-3’

10. กรรมวิธี ตามข้อถือสิทธิที่ 3, 5, 6 ข้อใดข้อหนึ่ง ที่ซึ่ง ดีเอ็นเอวงกลมตรวจจับชนิดควบคุม ที่จำเพาะกับ ไมโครอารีเอ็นเอ16 มีลำดับนิวคลิโอไทด์ ดังนี้ 5’/PhosAg ctg eta CM CCA AM CCA ACA CCA TCC TCT ACC TCT ACC TCT CM CCA AAA CCA ACA CCA eg cca ata ttt aeg t -3’