TH18080U - ไพรเมอร์ที่มีความจำเพาะต่อยีน mcp และกระบวนการผลิตและทำบริสุทธิ์โปรตีนเอ็มซีพีให้อยู่ในสภาพละลายน้ำด้วยไพรเมอร์ดังกล่าว - Google Patents

Abstract

การประดิษฐ์นี้เกี่ยวข้องกับการออกแบบและพัฒนาไพรเมอร์ที่มีความจำเพาะต่อยีน MCP รวมถึง กระบวนการผลิตและทำบริสุทธิ์โปรตีนเอ็มซีพี (Major capsid protein; MCP) ให้อยู่ในสภาพละลายน้ำด้วย ไพรเมอร์ดังกล่าว โดยไพรเมอร์ที่ได้ออกแบบตามการประดิษฐ์นี้จะมีความจำเพาะต่อยีน MCP เพื่อใช้ในการ ผลิตโปรตีนเอ็มซีพี (Major capsid protein; MCP) ทั้งนี้ ได้มีการพัฒนากระบวนการผลิตโปรตีนเอ็มซีพี (Major capsid protein; MCP) ที่ได้จากไพรเมอร์ดังกล่าวเพื่อให้โปรตีนเอ็มซีพี (Major capsid protein; MCP) ที่ได้มีสภาพละลายน้ำ และสามารถนำไปใช้ในการกระตุ้นระบบภูมิคุ้มกันและลดความยุ่งยากในการนำ พัฒนาวัคซีนได้ ซึ่งกระบวนการผลิตโปรตีนเอ็มซีพี (Major capsid protein; MCP) ตามการประดิษฐ์นี้จะ อาศัยยูเรีย (urea) ความเข้มข้นสูงร่วมกับการทำไดอะไลซิส (cialysis) เพื่อปรับสภาพโปรตีนจากสภาพ ตกตะกอนให้มาอยู่ในรูปที่ละลายน้ำได้หรืออยู่ในรูปธรรมชาติ (native form) เพื่อทำบริสุทธิ์โปรตีน โดยพบว่า โปรตีนเอ็มซีพี (Major capsid protein; MCP) ที่ได้จากกระบวนการตามการประดิษฐ์นี้มีคุณสมบัติในการ ละลายน้ำ และยังมีลักษณะโครงสร้างและคุณสมบัติโอลิโกเมอไรเซชัน (oligomerization) ที่คล้ายคลึงกับ โปรตีนเอ็มซีพี (Major capsid protein; MCP) ที่พบในไวรัสตามธรรมชาติอีกด้วย ดังนั้น จึงสามารถนำ โปรตีนเอ็มซีพี (Major capsid protein; MCP) ที่ได้ตามการประดิษฐ์นี้มาประยุกต์ใช้ในการพัฒนาวัคซีน ป้องกันการติดเชื้อไวรัสไอเอสเคเอ็นวี (Infectious spleen and kidney necrosis virus; ISKNV ในอนาคต ต่อไปได้

Claims (6)

1. ไพรเมอร์ที่มีความจำเพาะต่อยีน MCP Forward: 5' GGAATTCCATATGTCTGCAATCTCAGGTGCAAAC 3' Reverse: 5' CCGCTCGAGTCACAGGATAGGGAAGCCTGC 3'

2. ไพรเมอร์ที่มีความจำเพาะต่อยืน MCP ตามข้อถือสิทธิที่ 1 ที่ซึ่ง สภาวะที่เหมาะสมในเพิ่มปริมาณยีน MCP คือ ขั้นที่ 1 95 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 2 นาที ขั้นที่ 2 (25 รอบ) 95 องศาเซลเชียส เป็นเวลา 20 วินาที 63 องศาเซลเชียส เป็นเวลา 10 วินาที ขั้นที่ 3 70 องศาเซลเชียส เป็นเวลา 20 วินาที

3. กระบวนการผลิตและทำบริสุทธิ์โปรตีนเอ็มซีพีให้อยู่ในสภาพละลายน้ำด้วยไพรเมอร์ตามข้อถือสิทธิที่ 1 มี ขั้นตอนดังนี้ ก. การส่งถ่ายพลาสมิดลูกผสมที่มียีน MCP เข้าสู่แบคทีเรียเจ้าบ้าน โดยที่ยีน MCP ดังกล่าว ได้จาก ไพรเมอร์ที่มีความจำเพาะต่อยีน MCP ข. การผลิตโปรตีนเอ็มซีฟิโดยการเลี้ยงเชื้อแบคทีเรียลูกผสมที่ได้จากข้อ ก. ในอาหารเลี้ยงเชื้อที่มีสาร สกัดยีสต์ 1 เปอร์เซ็นต์โดยน้ำหนักต่อปริมาตร และแมกนีเซียมคลอไรด์ ความเข้มข้น 1 มิลลิโมลาร์ ที่มียา ปฏิชีวนะ ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส จนเชื้อมีค่าความหนาแน่นอยู่ระหว่าง 0.6 - 0.8 จากนั้นทำการ เปลี่ยนอุณหภูมิกะทันหันที่อุณหภูมิ 42 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 30 นาที และใส่สารไอพีทีจี ความเข้มข้น 1 มิลลิโมลาร์ ลงในอาหารเลี้ยงเชื้อ จากนั้นเลี้ยงเชื้อที่อุณหภูมิ 18 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 18 ชั่วโมง ทำ การละลายตะกอนเซลล์ที่ได้และแตกเซลล์ก่อนนำเข้าเครื่องปั่นเหวี่ยงโดยเก็บเฉพาะส่วนของโปรตีนที่ไม่ ละลายน้ำ ค. การทำบริสุทธิ์โปรตีนเอ็มซีพีที่ผลิตได้ โดยการนำโปรตีนที่ไม่ละลายน้ำจากข้อ ข. มาละลายด้วย สารละลายสำหรับแตกเซลล์มียูเรีย ความเข้มข้น 8 โมลาร์ เป็นองค์ประกอบ เป็นเวลา 18 ชั่วโมง นำเข้า เครื่องปั่นเหวี่ยงเก็บเฉพาะส่วนที่ละลายด้วยยูเรีย จากนั้นทำการไดอะไลชิสโปรตีนที่ละลายด้วยยูเรีย โดย ทำการลดความเข้มข้นยูเรียครั้งละ 2 โมลาร์ ต่อ 2 ชั่วโมง ให้สุดท้ายมีความเข้มข้นของยูเรีย 4 โมลาร์ จากนั้นนำโปรตีนที่ได้มาบ่มกับเม็ดบีทนิกเกิล เป็นเวลา 1 ชั่วโมง ทำการล้างคอลัมน์ด้วยบัฟเฟอร์สำหรับ ล้างโปรตีนที่มียูเรียผสมเป็นจำนวน 4 ครั้ง จากนั้นล้างคอลัมน์ด้วยบัฟเฟอร์สำหรับล้างโปรตีนที่มียูเรีย ผสม ความเข้มข้น 0 โมลาร์ อีก5 ครั้ง ทำการละลายโปรตีนออกจากคอลัมน์ด้วย สารละลายโปรตีนออก จากคอลัมน์ที่ผสมยูเรีย ความเข้มข้น 8 โมลาร์ ทำการไดอะไลซิสเปลี่ยนบัฟเฟอร์จากสารละลายโปรตีน ออกจากคอลัมน์ที่ผสมยูเรีย ความเข้มข้น 8 โมลาร์ เป็นสารละลายพีบีเอส โดยลดความเข้มข้นของยูเรีย ครั้งละ 1 โมลาร์ ต่อ 1 ชั่วโมง

4. กระบวนการผลิตและทำบริสุทธิ์โปรตีนเอ็มซีพืให้อยู่ในสภาพละลายน้ำ ข้อถือสิทธิที่ 3 ที่ซึ่ง การส่งถ่าย พลาสมิด ทำได้โดย การทรานส์ฟอร์ม

5. กระบวนการผลิตและทำบริสุทธิ์โปรตีนเอ็มซีพีให้อยู่ในสภาพละลายน้ำ ข้อถือสิทธิที่ 3 ที่ซึ่ง แบคที่เรียเจ้า บ้าน คือ E.coli สายพันธุ์ Ril

6. กระบวนการผลิตและทำบริสุทธิ์โปรตีนเอ็มซีพืให้อยู่ในสภาพละลายน้ำ ข้อถือสิทธิที่ 3 ที่ซึ่ง สารละลาย สำหรับแตกเซลล์ ประกอบด้วย ทริส ความเข้มข้น 20 มิลลิโมลาร์, อิมมิดาโซล ความเข้มข้น 15 มิลลิโมลาร์, โซเดียมคลอไรด์ ความเข้มข้น 300 มิลลิโมลาร์ และ 2-[4-(2,4,4-ไตรเมทิลเพนแทน-2-อิล) ฟีนอกชี]เอทานอล ความเข้มข้น 1 เปอร์เซ็นต์โดยปริมาตร โดยที่มีค่าความเป็นกรด - ด่าง คือ 8