SU907070A1 - Способ получени фибринолитического фермента - Google Patents

Description

I

Изобретение относитс  к производству ферментов, в частности к получению фибринолитических ферментов, которые могут быть использованы в

медицине.

Известен способ получени  фибринолитического фермента из базидиального гриба aria mellea, заключающийс  в обработке плодовых тел грибов водой при 2 С и извлечении водного экстракта вещества, содержащего фермент. После этого при рН 6,0 дважды этиловым спиртом или другим органическим растворителем, смешиваюоцшс  с водой, осаждают при минус 5°С АМ-протеазуо Очистку протеазм ведут ионообменной хроматографией и гельфильтрацией. Полученный фермент лиофилизуют. Способ позвол ет получить фермент, обладающий способностью к разрушению фибрина и вызываюгдий антикоагулирукщее действие L 1 J

Однако ограниченность ассортимента исходного сырь  и трудоемкость извлечени  из него фермента, а также отсутствие отечественных фибрино;штических препаратов из базидиальных грибов заставл ет предпринимать поиски новых путей получени  фибринолитического фермента из других родов съедобных грибов.

Наиболее близким по технической

10 сущности и достигаемому положительному эффекту к предлагаемому  вл етс  способ получени  фибринолитического фермента из плодовых тел бази;;иального гриба Tricholoma fla vovirens (Fr) Lundell et Nannp синоним Т. eguestre (зеленушка).

Способ получени  фибринолитического фермента заключаетс  0 том, что собранные грибы предварительно

20 высушивают, затем плодовые тела размельчают и суспензируют в физиологическом растворе при соотношении грибы: раствор, равном 1:10, 3 после чего провод т экстрагирование белков (инкубацию суспензии) при 37°С L тече1ше 2-3 ч, затем втечение ночи при комнатной температуре . Далее отдел ют экстракт фи трацией через марлю и повторно через фильтр Шамберлена, .после чего выдел ют фермент в верхний слой це трифугированием, предварительно ос ветлив раствор добавлением 20%-ног6 уксусного цинка при соотношении 1:10, дл  того, чтобы удалить балластные пигментные вещества. Вы деленный фермент диализуют против дистиллированной воды в течение не скольких дней и лиофилизуют 2. Однако известный способ не позв л ет получить достаточно высокую активность фибринолитического фермента из Tricholoma flavovirens, т как на стадии экстракции при происходит частична  потер  биологической активности фермента и не предусматриваетс  концентраци  бел Ков, содержащих фермент. Кроме того, известный способ дл телен за счет стадии высушивани  грибов и обработки больших объемов растворов (1:10), а также их двойной фильтрации через марлю и фильт Шамберлена, что к тому же  влйетс  трудоемкой операцией. Цель изобретени  - повьшение ак тивности фермента, обладающего фибринолитическим действием. Поставленна  цель достигаетс  тем, что согласно способу получени  фибринолитического фермента из плодовых тел баэидиального гриба рода Tricholoma путем суспендировани  плодовых тел, экстрагировани  белков из суспензии, отделени  экстрак та и вьщелени  из него фермента с последующим диализом и лиофилизацией целевого продукта, используют плодовые тела Tricholoma portentosum (Fr) Quel, экстрагирование осуществл ют при 3-5 С в течение 12-14 ч, а выделение фермента прово д т сернокислым аммонием до насыщени  0,75-0,80 в течение 1-2 ч. Проведение экстрагировани  на х лоду при Позвол ет сохранить фермент в нативном состо нии. В те чение 12-14 ч происходит полное экстрагирование фермента. Вьщелени фермента из экстракта сернокислым аммонием позвол ет сконцентрировать в осадке белки, содержащие фермент. При насыщении сернокислым аммонием от 0,75 до 0,80 осаждаютс  белки с фибринолитической активностью, тогда как при насыщении ниже 0,75 наблюдаетс  потер  фермента, а выше 0,8 в осадок выпадают неактивные балластные белки, что загр зн ет продукт и снижает его удельную активность . Щад щий режим осаждени  в течение 1-2 ч, за которые полностью формируетс  осадок, способствует сохранению исходной активкости нативного фермента, тогда как более длительна  экспозици  осадка приводит к частичной необратимой денатурации белка, который тер ет свою биологическую активность. Способ осуществл етс  следующим образом. Свежие плодовые тела Tricholoma portentosum суспензируют в физиологическом или забуференном физиологическом растворе (рН 7,0-7,2) при соотношении грибы: раствор, равном 1:3, после чего экстрагируют при 3-5 С в течение 12-14 ч, затем центрифугируют и супернатант осаждают сернокислым аммонием до насыщени  0,75-0,80, концентриру  фермент в осадке. Через 1-2 ч осадок отфильтровывают , .раствор ют в дистиллированной воде и диализуют в течение 2-3 дней сначала против водопроводной , воды, затем против дистил4 С и далее лиофильлированнон при но высушивают. Пример. К 1 кг очищенных плодовых тел грибов Т. portentosum, собранных в Минской области, добавл ли физиологический раствор ( рН 7,2) в соотношении 1:3 и грибы размельчали в гомогенизаторе (РТ-2) Полученный гомогенизат оставл ли на 14 ч, при 5 С дл  экстракции фермента, после чего экстракт центрифугирова:ли (3,5 тыс. об/мин),осадок отбрасывали , а из экстракта высаливали фермент сернокисль:м аммонием до насыщени  0,8 ч в течение одного часа при . Затем осадок отфильтровывали на бумажном фильтре и собирали. Полученный ферментативный белок раствор ли в 40 мл дистиллированной воды и ставили на диализ против проточной водопроводной воды в течение трех суток (отсутствие ионов SO провер ли качественной реакцией с BaCI) Затем раствор фермента диализовали против дистиллированной воды в .тече ние 14 при . Отдиапизованный раствор фермента лиофильно высушивали . Получили 1,5 г сухого фермента со специфической фибринолитической активноетыо.

Удельна  фибринолитическа  активность фермента (по Аструпу) составл ет 16850 ед., фибринолитическа  активность (по Эстоло) - 1:64, фибриногенолитическа  (по Эстоло) 1:1024.

9070706

Тромболитическа  активность составл ет 2,0 ч на 1 мг белка.

Дл  сравнени  активности фермента , полученного по предлагаемому способу, с активностью фермента, полученного по известному была произведена оценка фибринолитической (ФА) И фйбриногенолитической (ФГА) активности по методу, описанному Эстоло и другими.

Результаты сравнени  приведены в таблице..

Claims (1)

1. Формула изобретения

   Способ получения фибринолитического фермента из плодовых тел базидиального гриба рода Tricholoma путем суспендирования плодовых тел, экстрагирования белков из суспензии, отделения экстракта и выделения из него фермента с последующим диализом и лиофилизацией целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения активности фермента, используют плодовые тела Tricholoma portentosum (Fr) Quel, экстрагирование осуществляют при 3-5°С в течение 12-14 ч, а выделение фермента проводят сернокислым аммонием до насыщения 0,75-0,80 в течение 1-2 ч.