SU834512A1

SU834512A1 - Способ количественного определени нукле-Озид-5 -МОНОфОСфАТОВ

Info

Publication number: SU834512A1
Application number: SU792834315A
Authority: SU
Inventors: Виталийс Язепович Захаранс; Иварс Улдович Липсбергс
Original assignee: Предприятие П/Я Г-4740
Priority date: 1979-10-31
Filing date: 1979-10-31
Publication date: 1981-05-30

Description

(54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ НУКЛЕОЗИД-5 -МОНОФОСФАТОВ

Изобретение относитс к аналитической химии, а именно к способам количественного определени нуклеози -5 -монофосфатов, которые имеют боль шое значение в медицине, биохимии и молекул рной биологии. Известен способ количаственного определени нуклеозид-5 -монофосфатов , основанный на способности оснований нуклеиновых кислот поглощать ультрафиолетовые лучи в области 240290 нм l. Недостатком зтого способа вл етс низка .избирательность, поскольку невозможно определ ть нуклеоэнд-5 -монофосфаты в присутствии дезокс рибонуклеозид-5-монофосфатов и нукле озид-2(3)-монофосфатов. Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемо му результату вл етс способ количественного определени нуклеозид-5 -монофосфатов, заключающийс в последовательной обработке анализиру емой пробы раствором периодата иатри , раствором молибдата натри при рН среды 2,9-3,1, раствором иодида кали с последующим титрованием полученного раствора тиосульфатом натри в присутствии крахмала 21, Недостатком этого способа вл етс низка чувствительность определени , т.е. дл проведени анализа требуетс 35-40 мг анализируемого вещества. Цель изобретени - повышение чувствительности определени . Поставленна цель достигаетс тем, что в способе количественного определени нуклеозид-5 -монофосфатов, заключаквдимс в обработке анализируемой пробы раствором периодата натри , раствором молибдата натри при рН среды 2,9-3,1 и раствором иодида кали с последующим титрованием полученного раствора тиосульфатом натри в присутствии крахмала, полученный после обработки анализируемой пробы периодатом натри нуклеозид-5 -монофосфатдиальдегид обрабатывают метиламином или бутиламином при рН среды 6,5-7,5 и температуре 35-40 С при мольном соотношении нуклеозид-5 -монофосфатдигшьдегид ; периодат натри ; метиламин или бутиламин, равном 1:10-15:160-800 соответственно. В присутствии первичных алифати-ческих аминов положительный эффект достигаетс тем, что в результате расщеплени нуклеозид-5 -монофосфатдиальдегидов .образуютс три дополнительных моль иодата, которые действием избытка иодида кали перевод тс в эквивалентное количество иода. В конечном определении это приводит к измерению 24 эквивгшентов титранта на 1 моль определени вместо б эквивалентов в известном способе, что представл ет собой повышение чувствительности и экономии анализируемого вещества в 4 раза. Дл проведени анализа по предлагаемому способу необходимо 7-10 мг анализируе мого вещества .

Расщепление периодатом в присутствии первичных алифатических аминов протекает следующим образом.

Сперва нуклеозид-5 -монофосфатдиальдегиды реагируют с 1 моль первичного алифатического амина с образованием моноальдимина, который претерпевает внутримолекул рную конденсацию с образованием энамина. Последний образует четвертичное амониевое основание, которое быстро отщепл ет фосфат, а после этого гидратаци четвертичного аммониевого основани приводит к образованию другого энамина, который образует цикличес- кий эфир с периодатом. Гидролиз этого эфира приводит к образованию диола , который реагирует со вторым молем периодата с образованием карбоната гетероциклического основани , который при гидролизе образует промежуточный диол, реагирующий с третьим молем периодата.

Положительный эффект заключаетс в повышении чувствительности способа в 4 раза, по сравнению с известным, вследствие образовани 4 моль иодата в процессе окислени 1 моль нуклеозид-5 -монофосфата .

Температура среды 35-40°С обеспечивает быстрое и количественное протекание ., реакции расщеплени нуклеозид -Б-монофосфатдиешьдегидов.При более низких значени х температуры скорость реакции расщеплени замедл етс - реакци протекает количественно лишь за 4-5 ч. При более высоких температурах заметно возрастает в;еличина поправки расхода титранта в холостом опыте, что нежелательно при осуществлении аналитических определений.

Увеличение значени рН также ускор ет реакцию расщеплени нуклеозид; .-5 -монофосфатдиальдегидов периодатом . Оптимален интервал рН 6,5-7,5. Повышение кислотности среды замедл ет скорость этой реакции, а понижение кислотности среды выше рН 7,5 приводит к заметному возрастанию величины поправки расхода титранта в холостом. опыте..

Соотношени нуклеозид-5 -монофосфатдиальде .гид} периодат : первичный алифатический амин 1 : 10 - 15 : 160-800 обеспечивают быстрое

и количественное протекание реакции расщеплени нуклеозид-5 -монофосфатдиальдегидов . При более низких концентраци х периодата и первичного алифатического амина по существующей методике проведение эксперимента невозможно .

Таким образом, предлагаемый способ заключаетс в следующем.

Навеску определе емого нуклеозид-5 -монофосфата, величиной, приолизительно 25 мкмоль, раствор ют в дистиллированной воде и окисл ют 1015-кратным мол рным избытком периодата натри . Затем в реакционную смесь ввод т 160-800-кратное мол рное количество первичного алифатического амина, нейтрализованное до рН 6,57 ,5 и выдерживают в вод ной бане при 35-40°С в течение 1-2 ч. По окончании реакции расщеплени создают рН 3,0±0,2, замаскируют избыток периодата , а образовавшийс иодат избытком иодида кали превращают в эквивалентное количество иода, которое Наход т титрованием стандартным раствором тиосульфата натри . Параллельно провод т холостой опыт (без навески нуклеозид-5 -монофосфата) ;

Содержание основного вещества нуклеозид-5-монофосфатов вычисл ют по формуле

(У - Уд) . N. М

100% (1) 6 п . g

где V - объем стандартного раствора тиосульфата натри , израс ходованный на титрование в . анализе, мл;

V-, объем стандартного раствора тиосульфата натри , израсходова1|ный на титрование в холостом опыте, мл

N нормальность стандартного раствора тиосульфата натри (обычно 0,0250 н.), г-экв/л

М молекул рна масса определ .емого нуклеозид-5-монофосфата;

g навеска определ емого вещества , мг;

число моль периодата, реагип - рующих с 1 моль нуклеозид . -5 -монофосфата (п 1 в известном и п 4 в предлагаемом способах).

Пример 1.. Количественное определение аденозин-5 -монофосфорной кислоты (АМФ). М 347,23; рН 7,5; t . .

Claims

В коническую колбу емкостью 250 мл помещают навеску препарата, равную 8,68 мг и раствор ют в 10 мп дистиллированной воды. К полученному раствору прибавл ют 15 мп 0,025 М раствора периодата натри в воде, перемешивгиот содержимое колбы и оставл ют .на 10 мин в защищенном от пр мого солнечного света месте. Потом прибавл ют 2 мл 4 М раствора гидрохлорида бутиламина, нейтрализованного до рН 7г5 0,1 М раствором NaOH (контроль рН осуществл ют рН-метром) и реакционную смесь 1 ч выдерживают в вод ной бане при 40°С. Затем в кол бу внос т 25 мл буферного раствора на 1 М раствора монохлоруксусной кис лоты и NaOH с рН 3,0 и 8 мл 2 М раст вора молибдата натри и тщательно пе ремешивают ее содержимое. Наконец, прибавл ют 5 мл 20%-ного раствора ио дида кали , перемешивают содержимое колбы и через 2 мин выделившийс иод титруют 0,0250 н. рас.твором тиосульфата натри . К концу титровани прибавл ют 2 капли 0,5%-ного раствора крахмала и продолжают титровать до исчезновени сине-розовой окраски раствора. Расход титранта (V) составл ет 24,94 мл. Холостой опыт (без навески определ емого вещества) провод т аналогично . Расход титранта (V) составл ет 2,14 мл. По формуле (1) вычисл ют содержа ние АМФ. АМФ - (24,94-2,14)-347,23-0,250 8, 68- 4-6 X 100 95,0% Определено 25 мкмоль АМФ с точностью 0,8%. Пример
2. Количественное о ределение цитидин-5-монофосфорной кислоты (ЦМФ) . М 323,20 рН 7, t 35°С. . В коническую колбу емкостью 250 м помещают навеску препарата, равную 7,92 мг и раствор ют в 5 мл дистиллированной воды. К полученному раст вору прибавл ют 10 мл 0,025 М раствора периодата натри в воде, перемешивают содержимое колбы и оставл ют на 15 мин в защищенном от пр мо го солнечного света месте. Потом пр бавл ют 1 мл 4 М раствора гидрохлор да метиламина, нейтрализованного до рН 7,0 0,1 М раствором NaOH в воде (контроль рН осуществл ют рЦ-метром и реакционную смесь 1,5ч выдерживаю в вод ной бане при . Затем в кол бу внос т 20 мл буферного раствора из 1 М раствора монохлоруксусной ки лоты и ЫаОН срНЗ,Ои5мл2М раст вора молибдата натри и тщательно перемешивают ее содержимое. Наконец прибавл ют 5 мл 20%-ного раствора иодида кали , перемешивают содержимое колбы и через 1 мин выделившийс иод титруют 0,0250 н. раствором тиосульфата натри . К концу титрова ни прибавл ют 2 капли 0,5%-ного рас вора крахмала и продолжают титровать до исчезновени сине-розовой окраски раствора. Расход титранта (V ) составл ет 20,20 мл. Холостой опыт (без навески определ емого вещества) провод т аналогично . Расход титранта (V,j) составл ет 3,00,мл. По формуле (1) вычисл ют содержание ЦМФ. НМЛ (20,20-3, 00)-323, 20-0,0250 .. 7,92-4-6 У-ЮО 79,9% Определено 24,5 мкмоль ЦМФ с точностью 0,6%. Пример
3. Количественное определение уридин-5-монофосфорной кислоты динатриевой соли (УМФ.-НаОН). М 368,15-, рН 6,5; t 37°С. В коническую колбу емкостью 250 мл помещают навеску препарата, равную 9,20 мл и раствор ют в 5 мл дистиллированной воды. К полученному раствору прибавл ют 10 мл 0,025 М раствора периодата натри в воде, перемешивают содержимое колбы и оставл ют на 15 мин .в защищенном от пр мого солнечного света месте. Потом прибавл ют 5 мл 4 М раствора гидрохлорида метиламина, нейтрализованного до рН 6,5 0,1 М раствором NaOH (контроль рН осуществл ют рН-метром) и реакционную смесь 2 ч выдерживают в вод ной бане при . Затем в колбу внос т 20 мл буферного раствора из 1 М раствора монохлоруксусной кислоты и NaOH срНЗ,1и5мл2М раствора молибдата натри и тщательно перемешивают ее содержимое. Наконец, прибавл ют 5 мл 20%-ного раствора иодида кали , перемешивают содержимое колбы и через 3 мин выделившийс иод титруют 0,0250 н. раствором тиосульфата натри . К концу титровани прибавл ют 4 капли 0,5%-ного раствора крахмала и продолжаю- титровать до исчезновени сине-розовой окраски раствора. Расход титранта (V ) составл ет 20,78 мл. Холостой опыт (без навески определ емого вещества) провод т аналогично . Расход титранта (V,.) составл ет 1,44 мл. По формуле (1) вычисл ют содержание УМФ-Ма. (20,78-1,44)- 368,15-0,0250 t- У .. У УМФ-Na 9,20-4 )ЧОО 80,6% Определено 25 мкмоль УMФ-Na2 с точностью 0,5%. Формула изобретени Способ количественного определени нуклеозид-5 -монофосфатов путем обработки анализируемой пробы раствором периодата натри , раствором

834512 .8

Аюлибдата натри при рН среды 2,9-Источники информации,

3,1 и раствором иодида кали с по прин тые во внимание при экспертизе следующим титрованием полученного

раствора тиосульфатом натри в при- I, Ультрамикроанализ нуклеиновых

сутствии крахмала, отличай-кислот. Под ред. Д.П. Кнорре. М.,

« и и с тем, что с целью повышени Наука, 1973, с. 95-133. чувствительности определени , полу-,

ченный после обработки периодатом нат- 2. Вусев А.И., Захаранс В.Я.,

ри иуклеоэид-5-монофосфатдиальдегидМикстайс У.Я. Определение at-гликольдополнительно обрабашвают метилами-иой группировки в компонентах нукленом или бутиламином при рН среды 6,5- АЛиновых кислот. I I. Новый амплифика7 ,5 и температуре 35-40 0 при мольномционный метод титриметрического опсоотношении нуклеозид-5 -монофосфат-ределени рибонуклаозидов и нуклеозиддиальдегид : периодат натри : метил--5-фосфатов. Химико-фармацевтичесамин или бутиламин, равном 1:10 -кий журнал, 1977, 3, с. 128-132

15:160 - 800.(прототип).