(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРОМБОРЕЗИСТЕНТНЫХ ПОЛИМЕРНЫХ МАТЕРИАЛОВ рение шва между искусственным и естественным органом под действием этого фермента. Цель изобретени - повышение тромборезистентной и ({ибринолитической активности и стабильности полимерного материала. Это достигаетс Sa счет химической им- мобилизапии на поверхности предварител ьн озонированного полимерного материала, ац лированного ангидридом или хлорангилридом акриловой или метакриловой кислоты фибринолитического фермента микробного происхождени , выделенного из Actinomvces r/)i(eroides,mT. i ИммоОализациго провод т в присутствии ненасыщенного гидрофильного мономера под действием инициатора радикальной полимеризации. Реакцию озонировани полимерного м териала провод т обычным образом при О-1ОО С пропусканием над поверхностью обезжиренного материала озона со скоростью 3-7 л/ч. Реакцию .иммоби зации фермента на поверхность озониров ного полимера провод т растворением адили.рованного фермента обычно в буфер ном растворе (рН 7,0-9,0) до концентрации 0,5-10 мг/м с пЬспедующим растворением в том же растворе гидрофильного мономера до концентрации 1-500 мг/мл, погружением в полученны раствор озонированного полимера и воздействием на реакционную смесь инициа тором радикальной полимеризации. Реакцию иммобилизации провод т предпочтительно при С. в вакууме или в атмосфере инертного газа, например аргона или азота. Весовое соотношение ацилированный фермент : гидрофильный мономер 1:50-800. В качестве исходного полимерного материала используют полиэтилен, полипропилен, полистирол, пол метилметакрилат, сложные полиэфиры и т.п в качестве гидрофильного мономера - ак риламид, метакриламид, оксиэтилметакри лат и т.д., а в качестве инициатора полимеризации вещественные инициаторы, например динитрил бисазоизомасл ной кислоты и рибофлавин, а также УФ-излу- чение, Адйлированный фермент получают, добавл к раствору фермента с ко1щенрат цйей 0,5-1О мг/мл ангидрид или хлорангифид акриловой или метакрнловой кислоты обычно при рН 7,0 - 9,0, тем .пературе О-60 С и мольном соот юшеш1 ферментгангндрид или хлорангитэид I-IO500 . Основной отличительный признак изо&« ретени - используемый фибринолитическйй фермент., Услови проведени проиесса иммоа1лизации фермента (рН, температура и соотношени реагентов) полностью ;)бусловленьг /физико-химический и биологической природой самого фермента и полимерного носител , и могут измен тьс в довольно широких пределах. Пример 1. Ацйлирование фермента провод т при О С добавлением к раствору 50 мг фермента в 50 мл би- . карбонатного буфера (рН 8,0) 0,05 г клорангидрида акриловой кислоты. Затем перемешивают в теченке 15 мин и к раствору добавл ют 4 г зкркламида. Озонирование полипропиленовой пленки толщиной 0,05 мм и площадью 10 см провод т при 2О С, пропуска над поверхностью обезжиренной диэтиловым эфиром пленки озона со скоростью 7 л/ч в течение 4 4,1 Озонированную пленку помещают в раствор ацилированного фермента и акриламида. Раствор вакуумируют до 10 мм рт,ст. и облучают УФ светом в течение 2 ч.. Облученную пленку промывают бикарбонатным буфером. Активность полученной пленки при использовании в качестве субстрата 1%-ного раствора казеина 9,3tO,2 мкг тирозина/мин. При внесении пленки на поверхность сформировавшегос сгустка фибрина зона растворимости образуетс в течение 8 мин. При добавлении тромбина к раствору фибриногена , нанесенному на поверхность полученной пленки, фибрин не образуетс . Пленка с иммобилизованным ферментом хранитс в течение 1 мес. при 20 С, полностью сохран свою активность, а при хранении в течение 1,5 мес тер ет около ЗО % исходной активности. Пример 2. Стадию ацилировани , озонировани и иммобилизации провод т по примеру 1, облуча озонированную пленку в растворе ацилированного фермента и акриламида в течение 3 ч. Активность пленки по отношению к казеину ll,3tO,2 мкг тирозина/мин. Зона растворимости при внесении пленки на поверхность фибрина образуетс в тече1те 7 мин. Преврашение фибриногена в фибрин под действием тромбина на поверхности пленки не происходит. Пример 3. Стадию аци;шровани , o3onMpoBatmH и иммобилизации провод т по примеру 1, облуча озонирован56 ную пленку в растворе ацклированного фермента и акриламида, к которому пред варителъно добавл ют инициатор полимеризадии - рибофлавин в количестве 1О мг/л, в течение 3 ч. Активность пленки по отношению к казеину 26,3±О, мкг тирозина/мин. Зона растворимости при внесении пленки на поверхность фиб рина образуетс в течение 5 мин. Превращение фибриногена в фибрин под действием тромбина на поверхности пленки не происходит. Пример 4. Ацнлирование ферме та провод т при 5 С добавлением к. рас твору 2О мг фермента в 1О мл бикарбонатного буфера (рН 7,5) 0,05 г хлор ангидрида метакриловой кислоты, В качестве полимера используют полиэтиленовую пленку толщиной О,О8 мм и площадью 10 , см, а в качестве гидрофильного мономера 2 г оксиэтилметакрила- та. Стадию озонировани и иммобилизации провод т по примеру 1, Активность пленки по отношению к казеину i to,2 мкг тирозина/мин, Фибринолитичес- ка активность пленки аналогична актив ности пленки, полученной в примере 1. П р и м ер 5, Получение тромборё зистентного полимера провод т по примеру 2, использу в качестве ацилирую щегб агента ангидрид акриловой кислоты Свойства материала аналогичны свойств материала, полученного в примере 2, Пример 6. Получение тромборезистентного полимера провод т по примеру 3, использу в качестве полимера плотную ткань из полиэтилентерефталата , а в качестве гидрофильного мономера 1 г метакриламнда. Активнос полученного материала по отноше}шю К казеину 2О,0±0,3 мкг тирозина/мин 5 см 1Фибринолитическа активность ткани аналогична активности пленки, по лученной в примере 3, . . Пример 7, Ацилирование фермента провод т при 2О С добавлением к раствору 10О мг фермента в 10 мл фосфатного буфера (рН 7,0) 0,002 г хлорангидрида акриловой кислоты. После добавлени хлорангидрида раствор перемешивают в течение 10 мин и к ра твору добавл ют 5 г акриламида. Озонирование пластины из полиметилмета- к.рилата толщиной 3 мм и дааметром 50 мм провод т при 100 С, пропуска над обезжиренной поверхностью пластины озон со,скоростью 3 л/ч в течение 30 миъи Озонированную пластину помещают в раствор ацилированного фермента и акриламида. Раствор вакуумируют до 5-10 мм рт.ст, и облучают УФ-све- том 30 мин при 6О С, Активность полученной пластины при использовании в качествесубстрата казеина 18,,3 мкг тирозина/мин. Зона растворимости при внесении пластины на поверхность фибрина образуетс в течение 13 мин. Превращение фибриногена в фибрин под действием . тромбина на поверхности пластины не происходит, П р и м е р 8, Анилированне фермента провод т при 6 О С, добавл к раствору 10 мг фермента в 20 мл боратного буфера (рН 9,0) 0,012 г хлорангидрида акриловой кислоты. Сразу после добавлени хлорангидрида к раствору добавл ют . Ю,02, г акриламида, Озонирова- ние полипропиленовой пленки провод т при О С, пропуска озон со скоростью 5 л/ч в течение 20 ч. Озонированную пле1жу толщиной 0,1 мм и площадью 10 см и инициатор) полимеризации - рибофлавин в концентрации 15 мг/л помещают в раствор ацилированного фермента и акриламида и раствор вакуумиру- ют до 10 мм рт,ст. Раствор облучают видимым светом (лампа накалива т мощностью 250 Вт) 6 ч при О С. Активность полученной пленки 13,7iO,3 мкг тирозина/мин. Зона растворимости при внесегти плешщ на гговерхность фибрина образуетс за 7 мин. Превращение фибриногена в фибрин под действием тромбина на поверхности пленки не происходит. Из рассмотренных примеров видно, что по предлагаемому способу получают стабильные тромборезистентные полимеры , которые не только предотвращают образование тромба, но и катализируют растворение уже сформировзавщегос сгустка фибрина без привлечени внутрен- них ресурсов орагнизма. То есть в данном случае эффект тромборезистентности обусловлен не активацией-профибринолизина , а непосредственным воздействием иммобилизованного j фермента на процессы тромбообразовани ифибрш-юлиза. Дополнительный вклад в повышение гемо- совместимости вносит гидрофнлизаци поверхности полимерного материала за счет привитой сополимеризации гидрофильного мономера в процессе иммобилизации фермента. Формула изо Г рутени 1, Способ получеш тромборезистентных полимерных матери.а-юв нммобклиза-
цией на их поверхности ферментов, отличающийс : тем, что, с пелью повышени тромборезистентной и фибринолитической активности и стабильности полимерного материала, полимерный материал предварительно озонируют и иммобилизацию провод т в присутствии гидрофильного ненасыщенного мономера под действием инициатора ра дикальной полимеризации, а в качестве : фермента используют ацилированный ангидридом или хлорангидридом акриловой или метакриловой кислоты фибринолити ческий фермент, выделенный из Aciinoтуоев Asroides шт. 1,
2,Способ по п,1, отличающийс тем, что в качестве исходного полимерного материала используют полиэтилен, полипропилен, полистирол, пога метилметакрилнт, сложные полиэфиры ,
3,Способ, по п,1, отличаю - fix и и с тем, что в качестве гидро льного ненасыщенного мономера ис-
пользуют акриламид, метакрнламид, оксиэтилметакрилат ,
4, Способ по п,1, отличающийс тем, что в качестве инициатора полимеризации используют веще- ртвенные инициаторы, например динитрил бисазоизомасл ной кислоты или рибофлавин , или УФ-излучение.
S. Способ по n.iu 1-4, отличающийс тем, что процесс иммобилизации осуществл ют при 0-6 О С,
Источники информации, прин тые во внимание при экспертизе
1.0о-Ь Тромборезистентные материа- льцТгап5. Ашег. SOC. Artif 1сча anternqt . Organs, 10,213,19644