SU505382A3

SU505382A3 - Способ определени триглицеридов в веществах

Info

Publication number: SU505382A3
Application number: SU1933651A
Authority: SU
Inventors: Вильхельм Валефельд Аугуст; Меллеринг Ханс; Грубер Волфганг; Бернт Эрик; Решлау Петер
Original assignee: Берингер Маннхайм Гмбх, (Фирма)
Priority date: 1973-06-19
Filing date: 1973-06-19
Publication date: 1976-02-28

Description

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТРИГЛИЦЕРИДОВ В ВЕЩЕСТВАХ

Изобретение относитс к способам определени триглицеридов в веществах и может быть использовано как при анализе пищевых продуктов, так и в медицинских цел х.

Известен способ определени триглицеридов в веществах, например пищевых продуктах , предусматривающий их ферментативное омыление путем добавлени к пробе липазы и последующее измерение количества образовавшегос глицерина.

Недостаток ферментативного расщеплени по известному способу состоит в том, что омыление протекает продолжительное врем и, кроме того, при осуществлении этого способа необходимо использовать значительные количества дорогого фермента. Дл того чтобы реакци протекала в приемлемый промежуток времени, необходимо в одну пробу добавл ть около 1 мг фермента. Врем реакции превышает 30 мин, поэтому способ мало пригоден дл проведени быстрых лабораторных исследований, в частности при частых определени х . Наконец, выделивша с в свободном состо нии кислота жирного р да образует с ионами кальци и .магни нерастворимые мыла, которые, если не проводить центрифугирование , привод т к помутнению и, следовательно , искажению результатов измерени .

С целью упрощени и уменьшени времени определени предложено нар ду с липазой к пробе добавл ть карбоксилэстеразу и алкилсульфат щелочного или щелочноземельного металла, содержащего в алкильном остатке от 10 до 15 атомов углерода. Алкилсульфат рекомендовано добавл ть в количестве от 0,001 до 0,1% (вес/объем), а омыление проводить при рН от 6 до 9. При этом желательно нар ду с карбоксилэстеразой и алкилсульфатом в пробу дополнительно вводить альбумин сыворотки в количестве от 0,1 до 2,0 мг/мл.

Количество липазы, необходимое дл одного определени , составл ет около 20 мкг. Определение провод т при комнатной температуре . В качестве липазы предпочтительно использовать липазу из Rhizopus arrhizus, а в качестве карбоксилэстеразы (БС 3.1.1.1) карбоксилэстергидролазу - препарат, получаемый из печени млекопитающих, в частности из печени свиньи.

Claims

Однако применение могут находить также и другие карбоксилэстеразы. Вполне достаточно использовать приблизительно 100 мкг эстеразы на одно определение. Среди алкилсульфатов желательно использовать соли щелочных металлов, так как они не образуют нерастворимого мыла с выдел ющимис жирными кислотами. При добавлении альбумина сыворотки в пробу можно использовать алкилсульфаты щелочноземельных металлов, например додецилсульфат в количестве до 0,001 % (вес/объем ). Количества более 0,1% привод т к образованию пены и некоторому замедлению реакции . По этой причине нецелесообразно примен ть алкилсульфат в таких количествах. Определение можно проводить при рН от 6до 9. Оптимальна область рН лежит между 7и 8,5, что позвол ет проводить омыление и измерение количества образовавшегос глицерина в одной реакционной смеси. Ионы кобальта и/или магни оказывают активирующее действие на липазу и эстеразу и поэтому могут быть добавлены к реакционной смеси дл еще большего ускорени реакции. В качестве буферов могут быть использованы все эффективные в указанной выше области значений рН буферы, кроме фосфатного . Пригодными буферами вл ютс триэтаноламиновый , амидазольпый, вероналовый, глициновый, трис-буфер, а также, что менее желательно, амидольный, бо атный и коллидиновый . Пример 1. Готов т состо щий из п ти компонентов реактив, который можно хранить в течение 1-2 дней. Компонент I0,1 М триэтаноламиновый буфер (рП 7,6), содержащий 3 ммол сернокислого магни , 1,5мг/мл альбумина сыворотки крупного рогатого скота и 0,1 мг/мл додецилсульфата натри . IIРаствор, содержащий 6 ммолей НАДН, 33 ммол АТФ и 11 ммолей фосфоэнолпирувата в дистиллированной воде. IIIСуспензи кристаллов, содержаща 2 мг/мл лактатдегидрогеназы и 1 мг/мл пируваткиназы. IVРаствор, содержащий 0,2 мг/мл липазы из Rhizopus arrhizns и 4,0 мг/мл карбоксилэстеразы. VСуспензи кристаллов, содержаща 2 мг/мл глицеринкиназы. Смешивают 2,9 мл компонента I, 0,1 мл компонента П и 0,02 мл компонента III, и смесь нагревают до 25°С. Затем добавл ют 0,1 мл сыворотки, котора содержит триглицериды , подлежащие определению, и полученную смесь выдерживают 5 мин при указанной температуре. После этого к реакционной смеси добавл ют 0,1 мл компонента IV, смесь выдерживают 15-20 мин при указанной температуре и Никотинамидадениндинуклеотид в гидрированной форме. Аденозинтрифосфат. сразу же после этого определ ют поглощение при 366 нм или 340 нм. Найденное значение обозначают EI. После этого к пробе добавл ют 0,02 мл компонента V и через 10 мин оп ть определ ют поглощение. Измеренное значение обозначают Eg. Через 10 мин снова определ ют поглощение и полученное значение обозначают ЕЗ. Расчет провод т по уравнению: АЕ (Е,-Е,}-(Е,-Е,}. Общее содержание глицерина в триглицеридах (в мг на 100 мл) равно ДЕ-89,1. Вышеописанное определение повтор ют 9 раз, причем каждый раз прибавл емое количество сыворотки уменьшают на 0,01 мл. При нанесении на график полученных значений ДЕ по отношению к добавленному количеству сыворотки получают пр мую линию (см. чертеж). Из найденных значений рассчитывают пропорциональность сг 0,9986. Сравнение сг (идеальн.) 1000 показывает высокую точность метода. Пример 2. Опыт, описанный в примере 1, повтор ют с использованием стандартного раствора триглицеридов. В опыте 1 в реакционную смесь не добавл ют карбоксилэстеразу и додецилсульфат, в опыте 2 - додецилсульфат, а в опыте 3 - карбоксилэстеразу. Результаты определени количества триглицеридов представлены в таблице как процентное отношение экспериментально полученных значений к тем концентраци м триглицеридов. которые добавлены в реакционную смесь. Приведенные данные показывают, что при соблюдении выбранных условий в отношении концентрации липазы лишь соответствующа предлагаемому способу комбинаци компонентов пригодна дл количественного определени . Формула изобретени 1. Способ определени триглицеридов в веществах , например пищевых продуктах, предсматривающий их ферментативное омыление утем добавлени к пробе липазы и последущее измерение количества образовавщегос лицерина, отличающийс тем, что, с цеью упрощени и уменьшени времени опреелени , нар ду с липазой к пробе добавл ют

карбоксилэстеразу и алкилсульфат щелочного или щелочноземельного металла, содержащего в алкильном остатке от 10 до 15 атомов углерода .
2. Способ по п. 1, отличающийс тем, что нар ду с карбоксилэстеразой и алкилсульфатом в пробу дополнительно ввод т альбумин сыворотки.

(Z6Bnm

.0

.300

1/10
3.Способ по по. 1 и 2, отличающийс тем, что омыление провод т при рН от 6 до 9.
4.Способ по по. 1-3, отл и ч а ю nui и с тем, что алкилсульфат добавл ют в количестве от 0,001 до 0,1% (вес/объем).
5.Способ по пп. 1-4, отличающийс тем, что альбумин сыворотки добавл ют в количестве от 0,1 до 2,0 мг/мл.

10/W

/10