Изобретение ОГНОСИЕСЯ к ыикробиологическим способам получени гормональных веществ и может быть испопьзовано в медицинской промышленности дл получени лекарственных нрепар тов гидрокортизона и ацетата кортизона .The invention is OGNOSING for microbiological methods for producing hormonal substances and can be used in the medical industry to produce drugs for hydrocortisone and cortisone acetate.
Известен способ получени гидрокортизона и ацетата кортизона путем микробиологической трансформации вещества «J ieMxniTeuHa или его 21-ацетата в растворе органического растворител , например этанола, zvмети сульфоксида , при помощи отмыто-го мицепи гриба .oc ойзЛХо(л. , выращенного в питательной среде, содержащей источники углерода, азота, соли фосфора, серы, магни , с последующим выделением гидрокортизона из реакционной смеси и химическим превращением осальных продуктов трансформации в ацетат кортизона.A known method of producing hydrocortisone and cortisone acetate by microbiological transformation of the substance "J ieMxniTeuHa or its 21-acetate in an organic solvent solution, such as ethanol, zmetre sulfoxide, using washed mycelium of the fungus .oc OisLho (L., grown in a nutrient medium containing sources of carbon, nitrogen, salts of phosphorus, sulfur, magnesium, followed by release of hydrocortisone from the reaction mixture and chemical transformation of the main products of transformation into cortisone acetate.
Известный способ малопроизводителен , так как позвол ет проводить храисформацию исходного стероида при концентрации его не выше 0,5 г/в.The known method is not very productive, since it allows for storing the original steroid at a concentration not higher than 0.5 g / c.
Повышение концентрации исходного стероида приводит либо к ингибированию процесса трансформации из-аа токсичности растворител , либо к стимулированию процессов деструкции стероидов.Increasing the concentration of the original steroid leads either to inhibition of the transformation process due to toxicity of the solvent, or to stimulation of steroid degradation processes.
С целью интенсификации процесса предложено в питательнуо среду дополнительно вводить соли кали , кальци и меди, а вещество t Рейхштейна или его 21-ацетат вносить дробно В таком количесгве, чтобы его концент раци в реакционной сыёси не превышала О,44),8 г/л. 21-аце1аг вещества i Рейхштейна це е сообрази о вносить в pacsозоре этанопа в концентрации 251лг/и порци ми по 0,15-0,20 г/л через каждне 2 часа до конечной концентрации 1,5-2,0 г/л, а в растворе диыетидсульфокоида в концентрации 25 ыг/мн порци ми по 0,2-0,3 г/л через каждые 2 часа до конечной концентрации 2,5-3,t) г/л. Вещество р Рейхштейна удобно вносить в iQfcr-aoti метанольном растворе СаС в концентрации 30-35 ыг/мд порци ми по 0,15 г/л через каждые 2 часа до конечной концентрации 2,0-2,5 г/л. Из солей кали , кальци и меди рекомендовано использовать в количестве 2 г/л, GaCOg - 0,5 г/л и Cuk,e, X - 0,015 г/а. Пример I. Культуру гриба с, c/renlо (л.ь штаыы 233 поддерживают на скошенном сусле-агаре во флаконах или пробирках. Цри пересеве гриб выращивают 12-14 дней при 28°С, а затем 6-8 дне при комнатной температуре. Дн трансформации используют куль туру, выращенную при пересеве с кос ков не более, чем мес чной давности. Споры гриба смывают с поверхности агара стерильной водой либо с редой и I мл споровой суспензии (3-10 спор/мл засевают среду в конические колбы объемом 750 ил со 100 мл среды Cj следр)щего состава (в г/л) : кукурузный экстракт 20,0; сахар-рафинад 30 ,0;Kj,HPOi, 2,0;К2.50 0,5; . W,0 ..0,.. qois CaCOg 0,5; вода водопроводна 1л. Среду стерилизую при 0,8 атм 30 мин, рН после стерилизации 5,5. Культуру выращиваю в течение 20-22 час при 28°С на круговой качалке (220 об/ыин). Полученным инокул том в количестве 1 5-7 мл засевают такие же колбы со 100 мл ср1вды Cg и провод т вторую инокул цию в указанных услови х. Мицелий гриба, отфильтрованный и отмытый от питательной среды водой (рН;7,0), испольауюх дл проведени процесса трансформации. Трансформацию провод т также в медицинских колбах объемом 750 мл со 100 мл водопроводной воды (рН 7,0). В воду внос т мицелий гриба из расчета 8,0-9,0 г/л (по весу, воздушносухого мицели ) и внос т раствор исходного стероида в этаноле (25 мг/мл; растворител ) из расчета 0,15-0,20г/п и затем такое же количеств о стероида каждые 2 часа. Режим аэрации, температуру и перемешивание среды под держивают такими, как при выращивании культуры. В указанных услови х общее количество превращаемого стероида в течв-i ние всего процесса составл ет 1,5-2,0 г/л. Продолжительность процесса контролируют методами хроматографии на бумаге или тонкослойной хроматографии на силикагеле (силуфоле). После исчезновени из реакционной смеси вещества и 4 W Рейхштейна и его 21-ацетата процесс останавливают подкислениеы среды Hi 50 до рН 2,0. Продолжительность трансформации в указанных услови х составл ет 26-28 час. Выход стероидов составл ет в среднем (в %): эпигидрокортизон20,0 гидрокортизон60,0 кортизон2,0 веществе Г Рейхштейна и его 21-ацета1 следы. Выделение гидрокортизона и превращение эпигидрокортизона и кортизона в ацетат кортизона провод т известными методами.In order to intensify the process, it was proposed to additionally introduce salts of potassium, calcium and copper into the nutrient medium, and the substance t of Reichstein or its 21-acetate should be introduced fractionally. Such a quantity so that its concentration in the reaction does not exceed O, 44), 8 g / l . The 21-acetylene of the i Reichstein I think that it is necessary to introduce ethanop in a pacsozor in a concentration of 251lg / and in portions of 0.15-0.20 g / l every 2 hours to a final concentration of 1.5-2.0 g / l, and in a solution of diethidisulfoid at a concentration of 25 g / m in portions of 0.2-0.3 g / l every 2 hours to a final concentration of 2.5-3, t) g / l. The Reichstein substance p is conveniently introduced into the iQfcr-aoti methanol solution of CaC in a concentration of 30-35 Yg / MD in 0.15 g / l portions every 2 hours to a final concentration of 2.0-2.5 g / L. Of potassium, calcium and copper salts, it is recommended to use in the amount of 2 g / l, GaCOg - 0.5 g / l and Cuk, e, X - 0.015 g / a. Example I. The culture of the fungus with, c / renl (l.shtayy 233 support on beveled wort-agar in bottles or test tubes. When reseeding the fungus is grown for 12-14 days at 28 ° C and then for 6-8 days at room temperature. The transformation day used was a culture grown during the subculture with no more than a month ago. The spores of the fungus were washed off the surface of the agar with sterile water or with red and I ml of spore suspension (3-10 spores / ml were seeded into 750 conical flasks sludge from 100 ml of medium Cj of the following composition (in g / l): corn extract 20.0; refined sugar 30, 0; Kj, HPOi, 2.0; K2.50 0.5;. W, 0 ..0, .. qois CaCOg 0.5; water is tap 1. L is sterilized medium at 0.8 atm 30 min, pH after sterilization is 5.5. I grow culture for 20-22 hours at 28 ° C on a circular rocking chair (220 v / yin). The resulting inoculum in an amount of 1 5-7 ml inoculated the same flasks with 100 ml cf. Cg and the second inoculation was carried out under the indicated conditions. Mycelium of the fungus, filtered and washed from the nutrient medium with water (pH; 7.0), used to carry out the transformation process. The transformation is also carried out in 750 ml medical flasks with 100 ml of tap water (pH 7.0). Mycelium of the fungus is introduced into water at the rate of 8.0–9.0 g / l (by weight, air-dry mycelium) and a solution of the initial steroid in ethanol (25 mg / ml; solvent) at a rate of 0.15–0.20 g / n and then the same amount of steroid every 2 hours. The aeration mode, temperature and mixing of the medium are maintained such as when growing a culture. Under these conditions, the total amount of steroid to be converted during the whole process is 1.5-2.0 g / l. The duration of the process is controlled by paper chromatography or silica gel thin layer chromatography (Silufol). After the substance and 4 W of Reichstein and its 21-acetate disappear from the reaction mixture, the process stops acidification of the Hi 50 medium to pH 2.0. The duration of the transformation under these conditions is 26-28 hours. The steroid yield averages (in%): epihydrocortisone, 20.0 hydrocortisone, 60.0 cortisone, 2.0 substance G Reichstein, and his 21-acetic acid 1 traces. The isolation of hydrocortisone and the conversion of epihydrocortisone and cortisone to cortisone acetate are carried out by known methods.