SU370229A1

SU370229A1 - METHOD FOR GETTING HYDROCORTISON AND ACETOTA

Info

Publication number: SU370229A1
Application number: SU1621324A
Authority: SU
Priority date: 1971-01-19
Filing date: 1971-01-19
Publication date: 1973-02-15

Description

1one

Изобретение относитс к микробиологическим методам .получени гормональных препаратов и касаетс спо-соба получени гидрокортизона и ацетата кортизона.This invention relates to microbiological methods for obtaining hormonal preparations and concerns a method for producing hydrocortisone and cortisone acetate.

Известен Способ получени гидрокортизона и эпигидрокортизона, вл ющегос ис.ходным веществом дл получени ацетата кортизона химическими методами, путем микробиологического превращени 21-ацетата вещества «S Рейхштейна при помощи микроорганизмов, выращенных ъ питательной среде, содержащей источники углерода, азота .и минеральные соли.A known method of producing hydrocortisone and epihydrocortisone, which is the original substance for producing cortisone acetate by chemical methods, by microbiologically transforming the 21-acetate substance "S Reichstein" using microorganisms grown in a nutrient medium containing carbon sources, nitrogen, and mineral salts.

Однако этот способ весьма продолжителен и св зан со значительными затруднени ми при выделении чистых препаратов.However, this method is very long and is associated with considerable difficulties in the isolation of pure preparations.

Цель изобретени - ускорение .и упрощение процесса.The purpose of the invention is to accelerate and simplify the process.

Это достигаетс тем, что трансформацию осуществл ют при помощи мицели гриба Tieghemella orchidie, выращенного на среде, содержащей в качестве источника углерода дисахарид, например, сахарозу; исходный стероид внос т однократно в растворителе, например , этаноле; по завершении процесса трансформации гидрокортизон выдел ют известными приемами; образовавщийс маслообразный осадок обрабатывают хлороформом и содержащиес в нем стероиды превращают известными методами в ацетат кортизона.This is achieved in that the transformation is carried out with the help of the mycelium of the Tieghemella orchidie fungus grown on a medium containing a disaccharide such as sucrose as a carbon source; the original steroid is applied once in a solvent, for example, ethanol; at the end of the transformation process, hydrocortisone is isolated by known techniques; the oily precipitate formed is treated with chloroform and the steroids contained therein are converted into cortisone acetate by known methods.

Мицелий берут в количестве 5-6 г/л среды в пересчете на воздушно-сухой вес и в возрасте , соответствующем последней трети фазы экспоненциального роста и началу фазы затухающего роста. Этанол берут в количестве 3,8-3,9% к объему среды при концентрации исходного стероида 0,5 г/л.Mycelium is taken in the amount of 5-6 g / l of medium in terms of air-dry weight and at an age corresponding to the last third of the exponential growth phase and the beginning of the decaying growth phase. Ethanol is taken in the amount of 3.8-3.9% by volume of the medium at a concentration of the initial steroid of 0.5 g / l.

Пример. Культуру гриба Tieghemella orchidis щт. 233 поддерживают при комнатнойExample. The culture of the mushroom Tieghemella orchidis scht. 233 support at room

температуре на скошенном сусле-агаре во флаконах. При пересеве гриб выращивают 12-14 дней при 26-28° С, а затем 6-8 дней при комнатной температуре. Споры гр.иба смывают с .поверхности агара 100 мл стерильной воды и споровой суспензией (в 1 мл 2,4-10 спор) из двух флаконов, засевают среду в фер ментере емкостью 32 л с 12-15 л среды ЛЬс, содержащей, г/л: 20 (сухой вес) кукурузного экстракта, 30,0 сахарозы, 1,0temperature on oblique wort agar in bottles. When reseeding, the fungus is grown 12-14 days at 26-28 ° C, and then 6-8 days at room temperature. The spores of the gr.iba are rinsed from the surface of the agar with 100 ml of sterile water and a spore suspension (in 1 ml of 2.4-10 spores) from two vials, seeded with 32 L fermenter with 12-15 liters of LBL medium containing g / l: 20 (dry weight) corn extract, 30.0 sucrose, 1.0

NHlNOs; 3,0 (NH4)2HPO4; 0,2 MgSO.,; 0,04 FeS04-7H2O и 10 л водопроводной воды.NHlNOs; 3.0 (NH4) 2HPO4; 0.2 MgSO.,; 0.04 FeS04-7H2O and 10 liters of tap water.

Среду стерилизуют при 0,8 атм 30 мин; рН после стерилизации 5,2-5,5. Культуру выращивают в течение 20-22 час, при 28° С и подаче воздуха 1,4 л на 1 л среды в 1 мин. Число оборотов .мешалки 150 обмин. Полученный инокул т в количестве 10-12 л внос т в ферментер емкостью 300 л со 120-130 л среды Мае и провод т вторую инокул цию при томThe medium is sterilized at 0.8 atm 30 min; The pH after sterilization is 5.2-5.5. The culture is grown for 20-22 hours, at 28 ° C and an air supply of 1.4 liters per 1 liter of medium per minute. The number of revolutions. Mixers 150 Obmin. The resulting inoculum in the amount of 10–12 l is introduced into a 300 l fermenter with 120–130 l of Mae medium, and the second inoculation is carried out with

же режиме ферментации. Через 18-20 час мицелий отфильтровывают и отмытый от литательной среды водой (рН 7,0-7,2) используют дл процесса трансформации ацетата вещества «S. Рейхштейна, которую .провод т в том же фер|Менте. В качестве среды используют 110 л водопроводной воды, .в которую внос т 2,5-3,5 мг синтомицина, 5-6 г/л мицели гриба и 55 г 21-ацетата вещества «S Рейхштейна в виде 0,05%-кого раствора в этаноле. Общее количество этанола в среде составл ет 3,8-3,9%. Трансфюрмацию провод т при тех же услови х , что и выращ.ивание культуры гриба. Продолжительность процесса составл ет 10-14 час и контролируетс хроматографией на бумаге до исчезновени исходного вещества . Культуральную жидкость фильтруют, экстрагируют хлористым метилено, растворитель удал ют в вакууме, и раствор ют остаток в 98 М.Л дихлорэтана. К раствору добавл ют 98 мл 10% раствора хлористого кальци в абсолютном спирте и 196 мл воды, через 48 час (5° С) отфильтровывают юсадок. Такую очистку повтор ют еще 2 раза и получают 32 г сольвата гидрокортизона (52,2% от теоретического количества). Дл получени очищенного препарата полученный сольват раствор ют в 3,2 л гор чего этилацетата, обрабатывают углем, фильтруют, упаривают в вакууме до 100 мл и отфильтровывают. Выход очищенного препарата 26 г. После выделени сольвата гидрокортизона в объединенных маточных растворах отдел ют дихлорэтановый слой, водный слой трижды обрабатывают этилацетатом, и из объединенного органического экстра1 та удал ют в вакууме растворитель . Остаток кип т т 10 мин с 50 мл хлорофор;ма и -через 24 час отфильтровывают 13,3 г вещества , содержащего, %: 47,7 эпигидрокортизона, 2,85 гидрокортизона .и 6-7 кортизюна. Осадок при 60° С раствор ют в 65 мл лед ной уксусной кислоты, добавл ют при 20° С 3,7 г ацетата бари и 29 мл уксусного ангидрида, выдерживают 5 час при 25-26° С, обрабатывают углем и при 0° С по капл м прибавл ют 2 л воды. Смесь моноацетатов эпигидрокортизона отфильтровывают, «з фильтрата экстракцией хлористым метиленом выдел ют дополнительное их количество и объединенный продукт (11,78 г) раствор ют в 84 мл ацетона. Раствор фильтруют, добавл ют при 25° С 15,8 мл раствора Килиони, через 30 лгын охлаждают до 20° С, выливают ори 0° в 850 мл воды, через 30 мин отфильтровывают .и сушат. Технический -продукт перекристаллизовывают из 170 М.Л спирта, получа 7,75 г ацетата кортизона (13,6% от теоретического количества ). Пред м е т изобретени 1. Способ получени гидрокортизона и ацетата кортизона путем микробиологического превращени 21-ацетата вещества «S Рейхштейна при .помощи микроорганизма, выращенного в питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, отличающийс тем, что, с целью ускорени и упрощени процесса, трансформацию осуществл ют при помощи .мицели гриба Tieghemella orchidis, выращенного на среде, содержащей в качестве источника углерода дисахарид , например, сахарозу, исходный стероид внос т однократно в растворителе, например , этаноле, это завершении процесса трансформации гидрокортизон выдел ют известными приемами, о:браЗ0.вавшиЙ1С маслообразный осадок обрабатывают хлороформом, и содержащиес в нем стероиды -превращают известными методами в ацетат кортизона. .2. Способ по п. 1, отличающийс тем, что мицелий берут в количестве 5-6 г/л среды в пересчете на воздушно-сухой вес. 3.Способ по п. 1, отличающийс тем, что мицелий берут в возрасте, 1соответст вующем последней трети фазы экспоненциального роста и началу фазы затухающего роста. 4.Способ -по п. 1, отличающийс тем, что этанол -берут в количестве 3,8-3,9% к объему среды при концентрации исходного стероида 0,5 г1л.the same fermentation mode. After 18–20 hours, the mycelium is filtered off and the water washed from the test medium with water (pH 7.0–7.2) is used to transform the substance “S. Reichstein, which is carried out in the same fer | Ment. As a medium, 110 l of tap water is used, in which 2.5-3.5 mg of syntomycin, 5-6 g / l of fungal mycelium and 55 g of 21-acetate of the substance “S Reichstein in the form of 0.05% solution in ethanol. The total amount of ethanol in the medium is 3.8-3.9%. The transformation was carried out under the same conditions as the cultivation of the fungus. The duration of the process is 10-14 hours and is monitored by paper chromatography until the starting material disappears. The culture fluid is filtered, extracted with methylene chloride, the solvent is removed in vacuo, and the residue is dissolved in 98 M. L dichloroethane. 98 ml of a 10% solution of calcium chloride in absolute alcohol and 196 ml of water are added to the solution, after 48 hours (5 ° C) the residue is filtered. This purification is repeated 2 more times, and 32 g of the hydrocortisone solvate is obtained (52.2% of the theoretical amount). To obtain a purified preparation, the resulting solvate is dissolved in 3.2 l of hot ethyl acetate, treated with charcoal, filtered, evaporated in vacuo to 100 ml and filtered. The yield of the purified preparation is 26 g. After isolating the hydrocortisone solvate in the combined mother liquors, the dichloroethane layer is separated, the aqueous layer is treated three times with ethyl acetate, and the solvent is removed from the combined organic extract in vacuo. The residue is boiled for 10 minutes with 50 ml of chlorofor; 13.3 g of the substance is filtered off after 24 hours; the substance containing,%: 47.7 epihydrocortisone, 2.85 hydrocortisone and 6-7 cortisone. The precipitate is dissolved at 60 ° C in 65 ml of glacial acetic acid, 3.7 g of barium acetate and 29 ml of acetic anhydride are added at 20 ° C, kept at 25-26 ° C for 5 hours, treated with coal and at 0 ° C 2 liters of water are added dropwise. The mixture of epihydrocortisone monoacetate is filtered off, an additional amount of them is extracted from the filtrate by extraction with methylene chloride and the combined product (11.78 g) is dissolved in 84 ml of acetone. The solution is filtered, 15.8 ml of Kilioni solution is added at 25 ° C, after 30 hours the mixture is cooled to 20 ° C, ori 0 ° is poured into 850 ml of water, and after 30 minutes it is filtered and dried. Technical product recrystallized from 170 M.L of alcohol to obtain 7.75 g of cortisone acetate (13.6% of the theoretical amount). BACKGROUND OF THE INVENTION 1. A method for producing hydrocortisone and cortisone acetate by microbially converting the 21-acetate of the substance "S Reichstein" with the aid of a microorganism grown in a nutrient medium containing sources of carbon, nitrogen and mineral salts, in order to accelerate and to simplify the process, the transformation is carried out using a Tieghemella orchidis mycelium grown on a medium containing a disaccharide as a carbon source, for example, sucrose, the original steroid is introduced once in a solvent e, for example, ethanol, this is the completion of the transformation process, hydrocortisone is isolated by known methods, o: braz0. your 1C oily residue is treated with chloroform, and the steroids contained in it are converted into cortisone acetate by known methods. .2. A method according to claim 1, characterized in that the mycelium is taken in an amount of 5-6 g / l of medium in terms of air-dry weight. 3. The method according to claim 1, characterized in that the mycelium is taken at an age corresponding to the last third of the exponential growth phase and the onset of the decaying growth phase. 4. A method according to claim 1, characterized in that ethanol is taken in an amount of 3.8-3.9% by volume of the medium at a concentration of the starting steroid of 0.5 g1l.