SU404186A1 - Б П Т Б Алчп '>&-,'Ю^У'^:''ЛЧ1 - Google Patents

Description

1

Изобретение относитс  к кормовым добавкам , стимулирующим рост животных, в частности домашней птицы.

Известны стимулирующие кормовые добавки , содержащие витамины, антибиотики, аминокислоты , гормонные препараты.

Предлагаетс  кормова  добавка, котора  с целью ускорени  роста животных, в частности домащней птицы, содерл ит антибиотик Х-5108 или его физиологически активные соли .

Антибиотик Х-5108 вырабатываетс  Streptomyces sp. Х-5108, АТСС 21386.

Strepiomyces sp. Х-5108 выделен из образца почвы, отобранного на Бермудских островах. Культура этого организма получила лабораторный индекс Streptomyces sp. Х-5180, подкультура 3191-2 была выставлена в Американской коллекции типов культур, в Токвилле , штамм Мэримнь, где эта культура была внесена в коллекцию АТСС под регистрационным номером 21386. Виды Streptomyces, идентифицированные как Streptomyces sp. Х-5108, включают все штаммы Streptomyces, вырабатывающие антибиотик Х-5108 и не могущие быть дифференцированными от штамма АСС 21386 и его подкультур.

Штамм Streptomyces Х-5108 АТСС 21386 имеет следующие особенности.

Оценка степени роста. Культура дает хорошо развитый и разветвленный мицелий на субстрате и характерный воздушный мицелий на многих средах. В услови х погрулсени  бактерии развиваютс  в виде твердых и крупных особей и в зависимости от примен емой питательной среды они могут быть бесцветными, желтыми, желтовато-коричневыми или оливково-коричневыми. Они представл ют собой коричневато-черные н тна по кра м зоны роста па агар-агаре из экстрактов дрожлсевого солода.

Воздушный мицелий характеризуетс  умеренным развитием, имеет бархатистую текстуру и пигментирован в серовато-белый, светлый , умеренно-серый и л елтовато-серый цвет с тонкими белыми кра ми на ранней стадии роста.

Наблюдаютс  концентрические кольца и образование секторов из колоний серого цвета. Сравнение некоторых свойств Streptomyces sp. Х-5108 со свойствами других культур приведено в табл. 1.

Таблица 1

) Рост хороший в течение 8 дней при 24, 28, 32 и 37 С, но не при .

Рост хороший при применении бульона с триптоном (темный пигмент, отрицательна  реакци  на индол по прошествии 3 дней); питательного бульона ГДА, бульона Чапека с сахарозой, бульона Краинского с глюкозой и бульона с глицерином и цитратом кальци .

Таблица 2

Таблица 3 Морфологи . Цепи спор, образующиес  на воздушном мицелии, разветвл ютс  моноподиально и симподиально с образованием пр мых цепей, петель, крючков, раст нутых и имеющих неправильную форму спиралей (3-4 витка), также имеющих метлообразное расположение. Цепочки бывают как короткими , так и длинными, но преимущественно они содержат более 10 спор. На больщинстве сред наблюдаетс  образование склеропий. Споры  вл ютс  удлиненными и имеют овальную форму и цилиндрическую. Поверхность спор гладка . Физиологи . Растворимый пигмент . На агар-агаре с экстрактом дрожжей и экстрактом солода образуютс  следы коричневого пигмента. Культура  вл етс  хромогенной (образует меланин) на агар-агаре с пептоном-железом и тирозином, а также на бульоне с триптономэкстрактом дрожжей. Характеристики культур Streptomyces sp. Х-5108 (инкубаци  14 дней. Температура 28°С) приведены в табл. 2. Физиологические реакции Streptomyces sp. Х-5108 приведены в табл. 3. Кроме того, дл  Streptomyces sp. наблюдаетс  хорошее использование L-арабинозы, dфруктозы , d-маннита, L-рамнозы, d-раффинозы и сахарозы; плохое использование d-ксилозы , L-инозита и полное отсутствие использовани  целлюлозы. Характер использовани  органического азота дл  Streptomyces sp. (период инкубации 14 дней. Температура 28°С) приведен в табл. 4. Культура хорошо развиваетс  при 24-57°С, но не развиваетс  при 42 или 50°С. Культивирование продуцента Streptomyces sp. Х-5108 с целью получени  желаемого антибиотика Х-5108 осуществл ют с применением самых различных способов ферментации. При ферментации в колбах порцию спор, вз тую со среза культуры на агар-агаре, инокулируют в 100 мл питательной среды в конической колбе Эрленмейера объемом 500 мл и инкубируют при температуре около 28°С на вращающейс  качалке в течение 7 дней. Пробы бульона отбирают на третий, п тый и седьмой день. Аналогично при приготовлении больщих порций бульона продукт инокулировани  готов т в конических колбах Эрленмейера емкостью 6 л или в пирексовых бутылках объемом 22,2 л, снабженных устройствами дл  аэрации, отбора проб и т. д. Аэрацию в бутылках и резервуарах создают за счет продувани  стерильного воздуха через сбраживаемую среду. При выполнении процесса в резервуарах дополнительное перемешивание осуществл ют за счет механических лопастных мешалок. Дл  контролировани  процесса пенообразовани  употребл ют такие антипенообразователи , как свиной л рд, соевое масло и т. д. Streptomyces sp. Х-5108 может культивироватьс  в самых различных культуральных жидких средах. Особенно ценными дл  получени  нового антибиотика  вл ютс  среды, содержащие источник ассимилируемого углерода , например, крахмал, глюкозу, мелассу и источник ассимилируемого азота, такой как белки, гидролизаты белков, полипептиды, аминокислоты , жидкость, получаемую при обработке початков к курузы, аммониевые соли, и неорганических катионов и анионов, таких как калий, натрий, кальций, магний, сульфат, фосфат, хлорид и т. д. Микроэлементы, такие как кобальт, медь, железо, молибден, бор поступают в среду в качестве примесей к другим компонентам среды. Активность антибиотика Х-5108 оценивают при испытани х его in vitro по зоне ингибировани  грамположительной бактерии Bacillus Е обычным методом диффузии в среде агар-агара с чашкой и пластинкой. В другом случае пользуютс  дл  испытаний грамположительной бактерией Bacillus simplex. Обе бактерии дают зону ингибировани  мм при использовании раствора с концентрацией ед/мл. При этом методе испытаний культуру испытуемого микроорганизма выращивают в питательном бульоне, например, в бульоне с триптиказой с соей, в течение 24-42 час при 28°С на вращающейс  качалке (100 мл среды в конической колбе Эрленмейера объемом 500 мл). Концентраци  продукта дл  инокулировани , использовавшегос  дл  инокулировани  сло  дл  посева в 4 мл, составл ет 0,25-0,5%; этот слой наливают на 20 мл уже застывшего питательного сло  агар-агара в чашке Петри. Чашки помещают в холодильник по меньщей мере на 2 час до отбора и заполнени  их испытуемым раствором, содержащим антибиотик . Затем чашки инкубируют при 35°С в течение 18 час, и диаметры зон ингибировани  измер ют с точностью до 0,5 мм. Вычисление числа (ед/мл) производ т на основании стандартных кривых. Дл  производства антибиотика целесообразно пользоватьс  сложными азотсодержащими веществами из различных источников, такими, как например, растительные материалы (соевые бобы или хлопкова  мука, овс на  мука, твердое вещество томатной пасты, растворимые вещества, образующиес  при ферментации зерна), материалами животного происхождени  (рыбна  мука, продукт, получаемый при проваривании м сной муки, продукты гидролиза аминокислот) и клетками микробов (дрожжи «торула). Источниками углерода служат, например, глюкоза, глицерин, декстрин, и кукурузный крахмал. Кроме неорганических солей, обычно присутствующих в природных средах, можно вводить дополнительные соли, такие как фосфат кали , карбонат кальци , сульфат магни  и микроэлементы, которые иногда улучшают рост и выход антибиотика (в зависимости от компонентов уже присутствующих в основной среде). Одной из рекомендуемых сред дл  производства антибиотика Х-5108 в

Таблица 5

Продолжение

) Среда не содержит декстрина ) Среда не содержит СаСОз ) Среда не содержит CaCOg или КаНРО

Таблица 6 больших аппаратах дл  ферментации,  вл етс  среда, содержаща  1 % обезжиренной муки из сем н хлопка, 0,5% концентрата лсидкости , получаемой при выщелачивании кукурузы , 1% кукурузного крахмала, 0,1% KsHPO,, 0,1% карбоната кальци . В табл. 5 приведена характеристика питательных веществ дл  антибиотика Streptomyces sp. Х-5108 во встр хиваемых колбах , а в табл. 6 - вли ние изменени  питаStreptomyces sp. Х-5108 хорошо растет также и образует антибиотик на некоторых химических синтетических средах, содержащих аммониевые соли, нитрат или аминокислоты (глутамат, аргинин, глицин), служащие источниками азота вместе с глюкозой, декстрином, крахмалом, цитратом, ацетатом, служащими источниками углерода, с добавкой таких солей , как фосфат кали , карбонат кальци  и сульфат магни  и с микроэлементами, включающими ионы двухвалентного железа, двухвалентной меди, двухвалентного марганца, двухвалентного кобальта, двухвалентного цинка. Результаты форментацин Streptomyces sp. Х-5108 на различных синтетических средах приведены в табл. 8.

Продукци  антибиотика Х-5108 возрастает при хорошей аэрации среды дл  ферментации . Кроме того, получение антибиотика Х-5108 может быть осуществлено при любой температуре, обуславливающей удовлетворительный рост микроорганизма. Так например, Streptomyces sp. Х-5108 выращивалс  в колбах , инкубировавщихс  при температуре 24, 28, 30 и . Испытани  антибиотика через

три, четыре, п ть и шесть дней показали, что примерно один и тот же максимальный выход может быть достигнут при любой температуре в пределах 24-32°С. Наибольший выход достигаетс  через три-четыре дн  при 30 и 32°С, в то врем , как дл  его достижени  при температуре 28°С требуетс  четыре дн , а при температуре 24°С - п тьшесть дней. Величина рН среды во врем  процесса ферментации остаетс  почти нейтральной или становитс  слабо кислой. Конечна  величина рН зависит от присутствующих буферных веществ от первоначальной величины рЫ среды, котора  должна быть почти нейтральной до стерилизации.

В процессе выделени  и очистки антибиотика Х-5108 можно использовать самые различные способы, иапример, способ экстракции растворителем, способ периодической экстракции или непрерывной противоточной экстракции «из жидкости в жидкость, осуществл емый в экстракционных колоннах и метод хроматографии, основанный на проникновении в гель сырого антибиотика, выделенного из культуральной среды, тельных веществ на выход этого антибиотика во встр хиваемых колбах и резервуарах. Все среды, кроме специально оговоренных случаев, содержат 1% декстрина, 0,1% К2НР04ИО,1% СаСОз. В каждые 100 мл среды дл  инокулировани  внос т I мл суспензии спор Streptomyces sp. Х-5108. Результаты ферментации в резервуарах с различными средами приведены в табл. 7 Таблица 7

13

Таблица 8

1,0% глутамата натри , 1% декстрина, 0,1% К2НРО4, 0,05% MgSO,, 1,0% смеси аминокислот, 1% декстрина

0,1% К2НРО4, 0,1% солей VSP № 1

BBI бульон Чапека-Докса

1,0% аргинина, 1,0% декстрина , 0,1% КгНРО, 0,1% СаСОз, 0,05% MgSOi

1,0% ДЬ-аспаргиновой кислоты , 1,0; декстрина, 0.1% КаНРО. 0,1/0 СаСОз. 0,05% MgSOi

Антибиотик Х-5108 из культуральной среды выдел ют путем отделени  мицели  при помощи фильтровапи  или центрифугировани . Затем его экстрагируют из профильтрованного или процентрифугированной среды как периодический или противоточный метод распределительной экстракции. Экстракции растворителем осуществл ют в интервале величин рН 3-7,5 с использованием не смешивающихс  с водой сложных эфиров в качестве растворител , этилацетат, амилацетат, бутилацетат и тому подобные алифатические эфиры. Рекомендуетс  пользоватьс  бутилацетатом. Лучша  система растворителей дл  использовани  при противоточном распределительном методе состоит из смеси этилацетата, изопропанола и 0,1 и. водного раствора вторичного фосфата натри .

Конечную очистку антибиотика Х-5108 осуществл ют методом хроматографии, основанным на проникновении в гель. Очистка основана на адсорбции предварительно очищенного препарата антибиотика, например, препарата , полученного при экстракции растворителем , на геле декстрана с поперечными св з ми или на полимеризованном геле декстрана . Предварительно очищенный препарат антибиотика подвергают хроматографированию на сефадексе ВН-20 с элюированием спиртом.

После фильтровани  или центрифугировани  среды дл  ферментации дл  анализа антибиотика Х-5108 пользуютс  методом хроматографии на тонком слое или методом хроматографии па бумаге. В св зи со свойствами антибиотика, визуальную оценку п тен осуП1ествл ют с использованием флуоресцентного метода; кроме того, можно пользоватьс  методом биоавтографии. Хроматографироваиие лучще проводить на стекл нных пластинках с силикагелем. Примен ема  при хроматогр; фии на тонком слое система растворителей состоит из хлороформа, метанола и водного гидрата окиси аммони ,

14

Продол жение

Антибиотик Х-5108 после очистки представл ет собой аморфное желтое вещество. Дл  получени  солей этого антибиотика с катионами пользуютс  антибиотиком Х-5108 и фармацевтически приемлемым неорганическим нли органическим основанием. К числу солей антибиотика Х-5108 относ тс  соли с щелочными металлами, такие, как натриева  и калиева  соли, соли со щелочноземельными металлами , такие как кальциева  соль.

Эти соли получают при использовании водных растворов гидратов окиси щелочных и щелочноземельных металлов. Так, растворы антибиотика Х-5108 в водном растворе гидрата окиси натри , водном растворе гидрата окиси кали  или гидрата окиси кальци  образуют натриевую, калиевую или кальциевую соль. Эти соли употребл ют дл  тех же биологических целей, что и антибиотик. В св зи с тем, что растворы солей антибиотика Х-5108, в особенности натриевой соли, обладают значительно больщей стабильностью, чем растворы антибиотика в несолевой форме, пользуютс  слабо щелочными буферными растворами дл  очистки путем противоточного распределени  и смес ми растворителей с аммиаком при хроматографии на тонком слое, что приводит к снижению концентрации антибиотика в растворе.

Антибиотик содержит следующие элементы (см. табл. 9):

Таблица 9

15 Антибиотик Х-5108 растворим в спиртах, например, в метаноле, этаноле, 1- и 2-пропаноле , и в г/7ег-бутиловом спирте; в несмешивающихс  с водой сложных эфирах, например , в этилацетате, амилацетате, бутилацетате , алифатических сложных эфирах; растворим в хлороформе. Антибиотик нерастворим в воде. Натриева  соль антибиотика Х-5108 растворима в воде, низших спиртах, таких как метанол, этанол, изопропанол и бутанол, и в Ы,М-диметилформамиде; слабо растворима в амиловом спирте, тетрагидрофуране и диоксане; очень слабо растворима в ацетоне, амилацетате, бутилацетате и этилацетате и нерастворима в бензоле, хлороформе и диэтиловом эфире. Ниже приведены различные физические свойства антибиотика Х-5108: а f -82,8° (,52 этанол) ИК-спектр антибиотика Х-5108 (таблетки с бромистым калием), см-: 3400 (широка ); 1660 (сильна ); 1580 (широка ); 1580, 1380, 1250, 1100, 1040 и 995. ИК-спектр натриевой соли антибиотика Х-5108 (таблетки с бромистым калием), сми 3400 (широка ); 1645, 1570, 1500, 1388, 1105 и 1000. Дл  УФ-спектра Ямакс ммк 334 (, 0,1 н. НС1); 233 (Е 1см 610, 0,1 н. НС1); 206 (Elсм 500, 0,1 н, НС1); 327 (, буферный раствор изопропанол/К2НРО4 с рН 7; 231 (Ei с°м 660, буферный раствор изопропанол/К2НРО4 с рН 7; 327 (Е ГСМ 416; 0,1 н. КОН; 231 (, 0,1 н. КОН). ЯМР-спектр антибиотика Х-5108 (СНС1з, и тетраметилсилана - внутренний стандарт), б: 0,92; 1,66 и 2,03, 3,16 и 3,43 и в области сигналов характерной дл  олефинов. Антибиотик Х-5108 обладает широким спектром микробицидной активности. Спектр определен методом с чашкой и пластиной, с диффузией в среде агар-агара. Антибиотик Х-5108 имеет низкую оральную и парентеральную токсичность, значительную активность против стрептококков при систематическом (оральном) и местном (субкутанном) введении, активность против пневмококков и кишечного кокцидиоза. Антибиотик Х-5108 употребл етс  в качестве активного ингредиента в новых и ценных препаратах, которые при оральной даче домашней птице привод т к усиленному росту и повышенной эффективности питани  животных . Введение этих препаратов осуществл ют путем примешивани  их к сбалансированным в отношении питательности кормам дл  домашней птицы. Активный ингредиент-антибиотик Х-5108 ввод т в концентрированную, предварительно полученную смесь, котора  в дальнейшем может быть добавлена к корму

16 дл  домашней птицы. При приготовлении твердой предварительно изготовленной смеси, содержащей антибиотик Х-5108, любой подход щий носитель или инертный наполнитель может вести себ  как инертный ингредиент при условии, что он  вл етс  инертным по отношению к активному антибиотику, используемому в качестве добавки, и нетоксичен дл  домашней птицы, получающей этот препарат. Такому требованию удовлетвор ют многочисленные твердые материалы, источники минеральных продуктов, такие как измельченна  устрична  скорлупа, съедобные злаковые растени , материалы растительного, морского или животного происхождени , например, которые содержатс  в кормах животного происхождени ; кукурузна  мука, мука, получаема  из цитрусовых растений, соева  мука, рыбь  мука, отходы м са, высушенные остатки после сбраживани  и т. п. Количество антибиотика Х-5108, требующеес  дл  достижени  желательного стимулировани  скорости роста и повышени  эффективности кормлени , варьируют на 100 вёс. ч. корма примерно 0,0001-0,01 вес. ч. антибиотика . Пример 1. Определение стимулирующего рост эффекта антибиотика Х-5108. Основной рацион готов т из следующих ингредиентов , вес.%: Измельченное желтое зерно кукурузы56,075 М со и костна  мука (50% белков)4,000 Рыбь  мука (60% белков)4,000 Соева  мука (50% белков) 28,000 Дегидратированна  мука из моцерны1,000 Животный мир4,000 Метионнн0,200 Минеральный фосфат0,250 Карбонат кальци 1,200 Йодированна  соль0,250 Добавка витаминов1,000 Добавка следовых минеральных компонентов0,025 К этому рациону прибавл ют антибиотик Х-5108 в количестве 50 мг антибиотика на 1 кг рациона. Стимулирующие рост эффекты антибиотика Х-5108 Определ ют путем непринудительного кормлени  домашней птицы рационом с добавкой антибиотика Х-5108. Дл  испытаний берут 1-дневных цыпл т породы «скрещенных бройлеров. При опытах пользуютс  группами, состо щими из 5 цыпл т мужского пола и 5 цыпл т женского пола. Этим группам дают свободный доступ к корму. Случайное распределение дублеров иозвол ет выравн ть вли ние таких факторов, как обогрев, свет и положение . Птиц наблюдают в течение двухнедельного периода времени, и вес цыпл т измер ют через 14 дней. Регистрируют также колиЧестно потребл вшегос  корма и вычисл ют эффективность кормлени  по сравнению с контрольными экземпл рами. Одновременно провод т контрольные опыты, при которых пользовались описанным выше Привес, 96

в табл. 10 приведены результаты этих опытов.

) Среднее значение дл  40 цыпл т.

Из приведенной таблицы видно, что цыпл та , питавшиес  с добавкой 50 мг антибиотика Х-5108 на 1 кг корма дают усиленный рост по сравнению с группой контрольных цыпл т. В то же врем , как показывает 10%-ное улучшение эффективности питани , те же птицы извлекают больше пользы из получаемого корма.

Пример 2. Опыт, описанный в примере 1, включа  контрольный опыт, повтор ют несколько раз с использованием того же основного рациона. При этих опытах уровень антибиотика X-51G8 варьируют. Испытательным

хюо

Таблица 10

цыпл там дают корм с добавкой, содержавшей активный ингредиент в количестве 5, 10, 25, 50 и 100 мг на 1 кг рациона. Эти опыты повтор ют дл  лучшего подтверждени  результатов . При контрольных опытах четыре группы по 10 цыпл т питаютс  основным рационом , лишенным добавки антибиотика. При всех опытах скорость роста за двухнедельный период времени сравнивают с ростом контрольной группы. Регистрируют также потребление корма и улучшение эффективности питани  по савнению с контрольной группой. В табл. II приведены результаты опытов.

Таблица 11 Средний конечный вес-средний начальный вес испытательной группы Средний конечный вес-средний начальный вес контрольной группы способом, за исключением того, что контрольным цыпл там дают свободный доступ к корму , содержавшему те же питательные ингредиенты , но не содержавшему добавки антибиотика Х-5108.