SU301142A1 - Способ получения конидий гриба beauveria bassiana (bals.) vuill.всесоюзнаяпатентно-т?хн^"е:кдньиблмотека - Google Patents

Description

Известно несколько способов получени  патогена дл  насекомых на основе гриба В. bassiana .

Использование в качестве патогена гонидий (бластоопор), образуемых этим грибом в глубинной культуре, несмотр  на простоту способа их получени , не нашло -практического применени , поскольку гонидий,  вл  сь вегетативной формой размножени  гриба, очень чувствительны к воздействию неблагопри тных внешних условий и менее патогенны, чем конидии.

Поэтому в качестве патогена дл  насекомых , как правило, используют конидии, которые получают поверхностным способом.

Известен также способ получени  конидий гриба В. bassiana на поверхности жидкого питательного субстрата в стационарной культуре .

Суть известного способа заключаетс  в следуюш ,ем.

Некоторое количество зерна, например кукурузы , в течение 1 час кип т т в утроенном количестве воды. К полученному отвару добавл ют 1% сахара, 0,2% азотнокислого натри  (кали ) или пептона и антибиотик (стрептомицин ). Готовую среду слоем 5-7 см разливают в чистую посуду, которую закрывают бумагой. Среду обильно засевают кониди ми гриба. Культивирование ведут при температуре 22-26° С. Через 14-20 дней на поверхности питательной среды получают конидиальные пленки гриба, которые используют дл  приготовлени  препарата.

Основными недостатками известного способа получени  конидий гриба В. bassiana  вл ютс  низка  продуктивность, длительность процесса получени  конидий, потребность в больших плош,ад х дл  массового культивировани  гриба, высока  стоимость питательной среды, веро тноегь частых загр знений последней посторонними микроорганизмами, обусловленна  медленным ростом гриба и оказываюш,а  отрицательное вли ние на продуктивность и вирулентность конидий, значительные затраты посевного .материала, большие затраты тепловой энергии на приготовление среды, возмолсность возникновени  аллергических  влений среди обслуживающего

персонала, св занна  с поверхностным ростом гриба.

Перечисленные недостатки делают известный способ трудоемким и мало рентабельным. Несовершенство известного способа получени  конидий гриба В. bassiana преп тствует организации промышленного производства препарата боверина.

Эта цель достигаетс  тем, что в отличие от известного способа конидии гриба получают непосредственно в жидкой питательной среде в глубинной культуре. Культивирование гриба до массового образовани  конидий ведут в стерильных услови х в течение 60-70 час при температуре 28-29° С и непрерывной аэрации , интенсивность которой в период массового конидиеобразовани  понижают, в органосинтетической -среде с нейтральным или слабощелочным исходным рН, содержащей 2% сахара, 0,2-0,5% азотнокислого натри , 0,2- 0,5% фосфорнокислого кали , 0,05-0,2% сернокислого магни  и не более 30 мг % аминного азота, источником которого могут служить, в частности, кукурузный экстракт или пивное сусло. Густота засева кониди ми питательной среды 0,5-1,5 млрд 1л, рН среды около 8.

Содержание аминного азота в питательной среде  вл етс  одним из факторов, вли ющих на репродуктивное размножение гриба В. bassiana (образование конидий) в глубинной культуре.

Отсутствие в синтетической питательной среде аминного азота приводит к слабому разрастанию мицели  и незначительному конидиеобразованию (количество конидий не превышает 30 млн/мл).

Чрезмерное содержание аминного азота в питательной среде (более 30 мг %) способствует вегетативному размножению гриба - образованию гонидий.- На среде, содержащей 55-60 амийного азота кукурузного экстракта (2%), отмечаетс  только образование гоЕидий. На среде с пивным суслом (35- 40 мг°/о аминного азота) параллельно происходит образование конидий и гонидий.

Оптимальным содержанием ъ среде аминного азота, способствующим хорошему конидиеобразованию лри слабом образовании гонидий ,  вл етс  10-15 мг% дл  пивного сусла и 4-10 мг% дл  кукурузного экстракта.

В качестве пеногасител  примен ют растительное масло. Масло в питательную среду ввод т част ми, по мере вспенивани  питательной среды и потреблени  масла грибом, при этом общий расход масла не должен превышать 0,2%, в противном- случае развитие гриба идет в сторону образовани  гонидий.

Питательную среду стерилизуют в ферментере при температуре 120° С в течение 30- 40 мин.

Дл  засева питательной среды готов т конидиальную суспензию, при этом в колбу с кониди ми наливают стерильную воду и шуттелируют на качалке в течение 1-2 час дл  получени  равномерной суспензии. Затем определ ют титр суспензии и производ т расчет посевного материала.

После охлаждени  питательной среды ее засевают конидиальной суспензией гриба из расчета 0,5-1,5 млрд/л.

нудительной аэрации, интенсивность которой в период разрастани  мицели  (О-20- 30 час) устанавливают равной 0,75-0,8 объема воздуха на 1 объем аэрируемой среды в 1 мин при механическом перемешивании среды . В период образовани  конидий интенсивность аэрации понижают до 0,3-0,4 объема воздуха на 1 объем аэрируемой среды в 1 мин без механического перемещивани  среды. Такой режим аэрации благопри тствует образованию конидий.

При культивировании гриба ведут обычный микроскопический контроль чистоты культуры и степени развити  гриба.

В начальный период культивировани  происходит прорастание конидий и разрастание мицели , количество которого через 20-30 час достигает 6-8 г на 1 л среды. Затем на мицелии образуютс  бутылевидные конидиеносцы,

расширенные у основани  и выт нутые к вершине в виде тонкого волокна. Коиидии вначале образуютс  на дисталь ом конце конидиеносца , а затем на небольших боковых стеригмах .

Форма конидий округла , размер 2,8Х Х4,0 мкм. Характер образовани  конидий в глубинной культуре не отличаетс  от образовани  их на поверхности питательного субстрата . Форма и размер конидий такие же,

каК и при образовании их на поверхности.

В отличие от конидий гонидий образуютс  путем отчленени  от мицели  боковых отростков или расчленени  мицели . Форма гонидий цилиндрическа , размеры (5--7)Х(7-

-14) мкм.

Культивирование заканчивают, когда количество конидий в культуральной жидкости достигнет максимума, т. е. когда дальнейшее продуцирование их прекращаетс . При этом

отмечаетс  частичный автолиз мицелиальных клеток, количество которых постепенно уменьшаетс .

Предлагаемый способ получени  конидий гриба В. bassiana апробирован в лабораторных услови х. приведены результаты этих испытаний.

Пример 1. Культивирование гриба вели в среде, содержащей 25% пивного сусла, 0,2% фосфорнокислого кали , 0,05% сернокислого

магни  и более 30 мг % аминного азота (последнее определ ли формольным титрованием ). Исходное рН среды было 6,0. Культивирование вели при температуре 28° С и посто нной аэрации. Через 90 час культивировани 

титр конидий составл л 46 млн/мл, гонидий- 128,75 млн/мл.

Б данном случае гриб одновременно продуцировал два типа клеток, что объ сн етс  большим содержанием аминного азота в среДе .

Полученные клетки (конидии и гонидий)отдел ли от культуральной жидкости и определ ли вирулентность их по смертности гусениц  блонной плодожорки V возраста. Смертность особь составл ла на 15-й день 13%, на 30-й день - 25%, в варианте с заражением гусениц поверхностными кониди ми - соответственно 65 и 88%. Приведенные данные но:казывают, что в ереде с большим содержанием пивного сусла происходит одновременно образование конидий и гонидий, вирулентность полученного на такой среде материала была ниже вирулентности поверхностных конидий. Пример 2. Культивирование гриба вели на среде, содержащей 0,5% азотнокислого натри , 0,5% фосфорнокислого кали , 0,2% сернокислого магни , 2% сахара, 0,4% кукурузного экстракта и 8 мг % аминного азота. Культивирование вели в течение 80 час при тех же услови х, что и в предыдущем примере . Образование конидий в этом случае было преобладающим, и к концу культивировани  количество их достигло 2040 млн/мл; гонидий при этом было 184 млн/мл. Пример 3. Культивирование вели на среде , содержащей 0,5% азотнокислого натри , 0,5% фосфорнокислого кали , 0,2% сернокислого магни , 2% сахара, 2% пивного сусла и 12,5 мг% аминного азота (последнее определ ли -формольным титрованием). Исходное рП среды 8,1, густота засева кониди ми 0,75 млрд/л, температура культивировани  28° С. В течение первых 30 час культивировани  интенсивность аэрации была 0,8 объема воздуха на 1 объем среды в 1 мин с механическим перемещиванием среды, затем ее понизили до 0,4 объема воздуха на 1 объем среды в 1 мин без механического иеремещивани  среды. Через 68 час культивировани  количество конидий достигло 456 млн/мл, количество гонидий было 0,5 млн/мл. При дальнейшем культивировании титр конидий не увеличивалс . Выход стандартного препарата с 50 л ферментера составил 15,2 кг. Полученные предлагаемым способом конидии хранили и испытывали на жизнеспособность и вирулентность в двух формах -жидкой и сухой. Жидка  форма представл ла собой конидии в культуральной жидкости, суха  форма - конидии, отделенные от культуральной жидкости путем сепарировани  и высушенные при температуре 30° С. Сопоставление в процессе хранени  жизнеспособности конидий, полученных предлагаемым и известным способами, показало, что через п ть мес цев хранени  в обоих случа х процент жизнеспособных -конидий был одинаков . Токсикологическа  оценка конидий, полученных в глубинной культуре, приведена в таблице. Из данных таблицы видно, что при дозированном заражении насекомых конидии, полученные предлагаемым способом, по вирулентности не уступали кониди м, полученным известным способом, в отношении гусениц  блонной плодожорки и имаго клопа - вредной черепашки; в отношении личинок колорадского жука глубинные конидии уступали по вирулентности поверхностным. Однако при обработке корма глубинными кониди ми, сохран вшимис  в жидкой форме в течение четырех мес цев, отмечена высока  смертность личинок колорадского жука П1-Iv возраста (93,3%). Изменение вирулентности конидий в процессе хранени  показано в таблице. Из таблицы видно, что конидии, полученные как поверхностным, так и глубинным способом , через п ть мес цев хранени  в равной степени патогенны дл  насекомых. Сухие гонидий, высушенные при температуре 30 С, нрактически не обладали патогенными свойствами-смертность имаго клона- вредной черепашки при дозировке 16,6 млн на одну особь на lS-й день опыта составила 187о и не отличалась от естественной смертности в контроле. Хранение гонидий в жидкой форме в лабораторных услови х (температура 15-22 С) не представл лось возможным, носкольку происходило образование грибной конидиальной пленки на поверхности культуральной жидкости , что исключало возможность инфицировани  -насекомых гониди ми. Проведенные опыты показали, что конидии, полученные предлагаемым способом, по показател м вирулентности и продолжительности хранени  не отличались от конидий, полученных известным способом; гонидий по этим показател м значительно уступали кониди м. Предлагаемый способ прост в осуществлении и не требует специального оборудовани . Он может быть осуществлен на люоом предпри тии , выпускающем микробные препараты . Сравнительные технико-экономические показатели известного и предлагаемого способов получени  конидий гриба В. bassiana приведены ниже. Основными достоинствами предлагаемого способа в сравнении с известным  вл ютс  получение конидий непосредственно в глубинной культуре, уменьшение веро тности загр знени  питательной среды посторонними микроорганизмами , улучшение санитарно-гигиенических условий труда, поскольку культивирование гриба провод т в закрытых ферментерах . Использование предлагаемого способа позвол ет сократить продолжительность получени  конидий в 5-8 раз, повысить продуктивность в 6-46 раз, новысить производительность способа в 26-300 раз, понизить стоимость питательной среды в 2-4 раза, понизить расход посевного материала в 18 раз, снизить затраты тепловой энергии в 5- 44 раза.

Сравнительные показатели вирулентности конидий гриба В. bassiana.