SU1805097A1

SU1805097A1 - ШТАММ БАКТЕРИЙ КНОООСОССЦЗ ЕКУТНРОРОиЗ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ОЧИСТКИ ВОДЫ И ПОЧВЫ ОТ НЕФТИ и НЕФТЕПРОДУКТОВ

Info

Publication number: SU1805097A1
Application number: SU915015475A
Authority: SU
Inventors: Guzel G Yagafarova; Irina N Skvortsova; Aleksandr P Zinovev; Ildus R Yagafarov
Original assignee: Ufimsk Neftyanoj Inst
Priority date: 1991-12-06
Filing date: 1991-12-06
Publication date: 1993-03-30

Description

Изобретение относится к биотехнологии и касается нового штамма бактерий, используемого для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов.

Целью изобретения является получение * нового штамма бактерий Rhodococcus erythropolls, характеризующегося высокой скоростью утилизации нефти и степенью биотрансформации тяжелых фракций нефти.

Предлагаемый штамм депонирован в ВКМ и имеет регистрационный номер Rhodococcus erythropolls № 2 ВКМ АС-1399 после 18 ч культивирования палочковидные, короткие, редко, но встречаются с боковыми ветками. Через 33 ч происходит образование кокковидных элементов из палочек. Культура крамположительна, имеет IY тип . клеточной стенки, содержит галактозу, арабинозу, диаминопимелиновую кислоту. Споры не образует. Колонии на МПА и МПА + СА(1:1)окрашены в палево-розовые цвета. Форма колоний округлая, размер колоний (средний) 2-3 мм, поверхность гладкая, профиль выпуклый, край колоний ровный, структура однородная, консистенция маслянистая, способность к эмульгированию рав- 5 номерная. Рост в МП Б сопровождается Г помутнением среды, образованием обиль- ¢/) ного осадка. Штамп бактерий характериэу- |f* ется высокими скоростью.утилизации нефти и степенью биотрансформации ее тяжелых ~ фракций. 1 ил„ 4 табл.

д. Штамм Rhodococcus erythropolls получен путем селекции из природных образцов нефтесодержащих почв Крайнего Севера в районе г. Надыма. Для селекции 1 г почвы вносили в колбу объемом 250 мл, содержащей 99 мл стерильной воды, и после дальнейшего разведения до 10--10⁶ степени делали посевы на МПА, среду Чапека, СА. (3-4° и5-6°Б). После 7-15 суток культивирования наиболее типичные колонии испытывали на способность расти на твердой минеральной среде. Маккланга, г/л диет.·, воды: NaNO3 - 2.0: MnSCM ’ 7Н₂О - 0.5,

1805097 А1

1805097 4 ' \

Fe2(SO4h - 0,001, К2НРО4 - 1,0, ZnSO4 0,002, агар - 10-15, содержащей в качестве единственного источника углерода жидкий парафин. Для этого в чашку Петри разливали стерильную питательную минеральную среду. После того как среда застынет стерильным пробочным сверлом делали лунку. В лунку вносили стерильный парафин. Посев микроорганизмов производили штрихом. О посеве судили после 15 суток культивироКанияпотюявлениям колоний по штриху. Наиболее активный Штамм идентифицировали. Штамм хранят в лиофилизированном виде.

' Штамм имеет следующую, характеристику. Морфологические признаки: клетки после 18 часов культивирования палочковидные, короткие, редко, но всречаются с боковыми ветками. Через 33 часа происходит образование кокковидных элементов из палочек. Культура грамположительна, имеет IY тип клеточной стенки, содержит галактозу, арабинозу, диаминопимелиновую кислоту. Споры не образует. Колонии на МПА и МПА + СА (1:1) окрашены в палеворозовые цвета. Форма колоний округлая, размер колоний (средний( - 2-3 мм, поверхность гладкая, профиль выпуклый, край колоний ровный, структура однородная, консистенция маслянистая, способность к эмульгированию равномерная. Рост в МПБ сопровождается помутнением среды, образованием обильного осадка.

Физико-биологические признаки. Отношение к источникам углерода: используют галактозу, арабинозу, глицерин, инозит, лактозу, мальтозу, маннит, рамнозу, сорбит, сахарозу, глюкозу, лимоннокислый натрий. Не разлагает целлюлозу, крахмал.

Отношения к источникам азота: использует мочевину, аммонийный азот, нитратный азот.

Не разжижает желатину, не разлагает казеин,

Не обладает лецитиназной, тирозиназной и нитратредуктазной активностью. Не растет в присутствии 7% NaCI.

Не требует в среде присутствия, факторов роста.

Аэроб.

Растет в диапазоне температуры от 10 до 40°С, оптимальная область от 25 до 30°С.

Растет в диапазоне pH 4-9, оптимальная зона от 7 до 8. Штамм не патогенен для человека и животных.

Биотехническая характеристика штамма Rhodococcus erythropolls.

Изучена активность штамма при его выращивании на среде с добавлением в каче стве единственного источника углерода сырой нефти или ее фракций.

Для получения посевного материала используют среду Маккланга. Среду разлива5 ют по 50 мл в качалочные колбы объемом 250 мл и стерилизуют при 1 атм. в течение 30 минут. Засевают 3% бактериальной взвеси, нефть вносят стерильно в количестве 1% вес. Выращивание осуществляют на термостатированной качалке: 180 об/мин, 1°30°С.

Опыты ставятся в трех повторностях.

Контролями служат: минеральная среда с культурой без нефти: минеральная среда и нефть без бактерий.

По истечении двух суток в опытных колбах происходит исчезновение нефти, образуется муть, что не наблюдается в контрольных колбах.

О биотрансформации нефти судят электрофотометрически на приборе I4R-20 при 2923 см'¹, предварительно экстрагируя ‘ нефть четыреххлористым углеродом.

Кроме того ежесуточно определяют количество жизнеспособных клеток методом Коха, а также биомассу весовым методом на мембранных фильтрах. Для этого мембранные фильтры № 1 предварительно доводят до постоянного веса. Результаты приведены в табл. 1.

Как видно из табл. 1. длительность лаг. фазы составляет менее 1 суток: Экспоненциальная фаза продолжает около 2 суток, стационарная - 3 суток, затем происходит отмирание культуры. Прирост биомассы на 2 сутки составляет 0,075 г/л. Данные по биодеструкции нефти представлены в табл. 2,Как видно из табл. 2, наибольшая степень биоразложения нефти (80-87%) достигается на 2-3 сутки.

П р и м ё р. В серии опытов штамм выращивали в минеральной среде с добавлением в качестве единственного источника углерода: парафин, дизельное топливо, нефть, универсин В, содержащий тяжелые нефтяные остатки: гудрон и экстракты масляных фракций.

Минеральную среду Маккланга (состав ¹ приведен выше) разливают по 50 мл в качалочные колбы объемом 250 мл и стерилизуют при 1 атм. 30 мин. Засевают из расчета 3% по объему бактериальной взвеси. В качестве единственного источника углерода ¹ добавляют парафин, дизельное топливо, нефть, универсин В в количестве 1. 2, 3, 4, 5% вес.

Условия выращивания описаны выше.

О биораэложении нефти, универсина, дизельного топлива судят путем количест5 венного анализа методом экстракции этих соединений четыреххлористым углеродом с последующим измерением оптической плотности экстракта при 2923 см’¹ на спектрофотометре I4R-20, а парафина при 1460 см'¹.

На чертеже представлены результаты изучения зависимости, биодеструкции парафина, дизельного топлива, нефти и универсина В в воде через 40 часов (1 парафин, 2 - дизельное топливо, 3 - нефть, 4 - универсин В).

Из приведенных данных видно, что предлагаемый штамм Rhodococcus erythropolis № 2 ВКМ АС 1339Д способен использовать не только легкие фракции нефти, такие как парафин, но и дизельное топливо и более тяжелые фракции нефти, такие как парафин, но и дизельное топливо и более тяжелые фракции нефти, как универсин В, т.е. разлагать широкий спектр углеводородов. Причем штамм не теряет свою окислительную активность при содержании парафина, дизельного топлива, нефти и универсина при 5% вес. Максимальная биодеструкция наблюдается при содержании исследуемых нефтепродуктов в количестве 1% вес. и составляет для парафина 85%, дизельного топлива - 80%, нефти 78%, универсина - 45%.

Проводилитакже изучение активности штамма при разложении нефти в почве. Для • этого в пробирку объемом 50 мл вносят песок в количестве 25 г., стерилизуют в автоклаве при температуре 120°С в течение 30 мин. Вносят минеральное удобрение диаммофос из расчета 0,03% вес и нефть в количестве 0,41 г на 25 почвы. Посевной материал вносят из расчета 3% по объему бактериальной взвеси. Контролем служат пробирки без бактерий. Микроорганизмы культивируются при комнатной температу• ре. Время культивирования 40 суток. Количественный учет биоразложения нефти ведут спектрофотометрически на приборе 45 HR-20 при 2923 см'¹, предварительно экстрагируя нефть четыреххлористым углеродом. В табл. 3 приведены результаты исследований.

Посевной материал выращивают в жидкой минеральной среде Маккланга. В качестве единственного источника углерода добавляют жидкий парафин в количестве 3% вес. Для этого среду разливают по 50 мл в качал очные колбы объемом 250 мл и стерилизуют при 1 атм. втечениеЗО мин. Пара- ¹фин стерилизуют отдельно и вносят перед посевом. Микроорганизмы вносят путем смыва из косячков. Выращивание осуществляют на термостатированной качалке: 180 об/мин, t° -30°С. Посевной материал выращивают 8 течение 1 суток. 2 л сточной воды, содержащей 100 мг/л нефти, наливают в лабораторный аэротенк объемом 5 л. Вносят посевной материал в количестве 5% от объема. При помощи 5% раствора NaНСОз доводят pH до 7. В аэротенк при помощи компрессора продувается воздух в количестве 15-20 л в минуту. О биоочистке сточной воды от нефти судят спектрофотометрически на приборе HR-20 при 2923 -см¹, предварительно экстрагируя нефть четыреххлористым углеродом.

Из табл. 4 видно, что предлагаемая культура Rhodococcus erythropolis способна очи; щать и реальные стоки, при этом за 24 часа содержание нефти уменьшается с 100 мг/л до 10 мг/л.

Пример. Очистка почвы от нефти и нефтепродуктов.

Отбираются нефтезагрязненные пробы почвы у буровой скважины. Содержание нефти и нефтепродуктов в почве составляло 3% вес. Отобранная почва насыпается в эксикатор. Для сохранения влажности на дно эксикатора ставят стакан с водой. Для воздухообмена с крышки эксикатора отводится . стеклянная трубка, которая закрыта ватным 40. фильтром.

•Для очистки почвы го.товят водную смесь, включающую штамм Rhodococcus erythropolis с плотностью 10⁵-10⁶ клеток в 1 мл и диаммофос из расчета 0,03%. Микроорганизмы выращивают в жидкой минеральной среде Маккланга с парафином. Приготовленную водную смесь равномерно распределяют на нефтезагрязненную почву из расчета 1 л на 1 м. По истечении 40 и 60 суток оценивают количество оставшейся нефти методом спектрофотометрии.

* Таким образом предлагаемый штамм Rhodococcus erythropolis № 2 ВКМ АС^ЗЭД остается активным и в почве. Биоразложение нефти через 40 суток культивирования составляет 76%. В контро- 55 ле естественная убыль нефти оставляет 0,01 г.

Пример. Очистка стоков Уфимского нефтеперерабатывающего завода им. XXII съезда КПСС. ____ .

В результате исследований выявлено количество нефти и нефтепродуктов после 40 суток культивирования уменьшается с 3% до 1%, а после 60 суток до 0,21%.

Таким образом, предлагаемый штамм Rhodococcus erythropolis способен очищать реальную нефтезагрязненную почву.

Claims

Формулаизобретения

Штамм бактерий Rhodococcus erythropolls ВКМ Ас « 1339Д, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефте· продуктов.

Таблица!

Результаты роста микроорганизмов в среде с нефтью

Нефть, % Длительность культивирования, сутки 0 1 2 3 4 7 Бактерии в 1 мл 1 1 ΊΟ” 8*10° 8*10^в 9‘10^е 9 - 10^й 5·10^Β контроль без нефти 1-Ю⁶ 1-10⁶ 9-Ю⁵ 9 ·10⁵ 9-10⁵ 5·10⁵ Биомасса, г/л - 0,01 0,3 0,75 0,8 0,8 0,70 контроль без бакте- • рий 0,01 0,01 0,009 0,005 0,004

Таблица2

Влияние длительности культивирования на степень биоразложения нефти

Варианты начало Длительность культивирования 1 2 3 4 7 Био разложение, % /стерильная среда+бактерии+ 1 % нефти 0 10 80 < 87 88 88 Контроль /стерильная среда+1 % нефти/ 0 0 0 0 10 1,5

9 1805097 10

ТаблицаЗ

Результаты биоразложения нефти в почве

Вариант опыта Начальн. содер. нефти в 25 г почвы, г Содержание нефти через 40 суток Биодеструкция, % Стерильный песок + минеральные добавки + нефть + бактерии 0.41 0.10 76 Контроль: стерильный песок + минеральные добавки + нефть 0,41 0,40 0

Таблица4

Результаты очистки реальных стоков ,