SU1756354A1

SU1756354A1 - Способ выделени хитиназ из культуральной жидкости АстINомYсеS KURSSaNoVII 93

Info

Publication number: SU1756354A1
Application number: SU894794718A
Authority: SU
Inventors: Ирина Алексеевна Стояченко; Валерий Петрович Варламов; Вадим Александрович Даванков; Нина Яковлевна Кобзева; Наталья Андреевна Тиунова; Алексей Михайлович Безбородов
Original assignee: Институт элементоорганических соединений им.А.Н.Несмеянова; Институт биохимии им.А.Н.Баха
Priority date: 1989-09-26
Filing date: 1989-09-26
Publication date: 1992-08-23

Abstract

Изобретение относитс к получению ферментов, в частности хитиназ, продуцируемых актиномицетами. Целью изобретени вл етс повышение степени очистки хитиназ. Изобретение заключаетс в том, что хитиназы (XI, XII, XIII) выдел ют непосредственно из культуральной жидкости Actinomyces kurssanovil 93 в две стадии: ли- гандообменной хроматографией на имино- диуксусной агарозе, зар женной ионами двухвалентной меди, путем ступенчатого понижени рН сначала от 6,0-7,5 до 4,8-5,6, затем до 3,8-4,5 (перва и втора фракции соответственно). После этого фракции подвергают дополнительной очистке с помощью гидрофобной хроматографии на бутил-Тойоперле в градиенте концентрации сульфата натри от 1,5-1,0 М до 0, хитиназы вымывают фосфатным буфером, содержащим сульфат натри в концентрации 0,1-0,2 М и не содержащим сульфат натри . Степень очисгки до 25. 2 табл. fe

Description

Изобретение относитс к способам выделени и очистки ферментов хроматографией , конкретно к способам выделени хитинзз из Kurssanovii 93.

Известен способ выделени хитиназ из культуральной жидкости путем сорбции ферментов на хитине с последующим его гидролизом хитиназами. Этот метод приводит к потере более 60% исходной хитиназ- ной активности и не позвол ет разделить ферменты, близкие по сродству к хитину.

Наиболее близким к предолженному по технической сущности и достигнутыми результатам вл етс способ выделени хитиназ из культуральной жидкости Act. Kurssanovii 93 осаждением фермента этиловым спиртом или сульфатом аммони .

Однако, данный способ не позвол ет получать ферменты высокой степени очистки . Активность препарата составл ет только 18-22 ед/мл.

Целью изобретени вл етс повышение степени очистки хитиназ.

Способ выделени хитиназ из культуральной жидкости Actinomyces Kurssanovii заключаетс в том, что ее нанос т на имино- диуксуснокислую агарозу, зар женную ионами двухвалентной меди и уравновешенную буфером, создающим рН 6,0-7,5, вымывают балластные белки при рН 6,0-7.5. затем последовательно элюируют две фракции белков путем ступенчатого понижени рН сначала до 4,8-5,6, затем до 3,8-4,5, после чего каждую из двух фракций белков

VI

01

о со

СП

Јь

после доведени в них рН до 6,8-/,2, нанос т на бутил-Тойоперл 650 М, уравновешенный буфером, создающим рН 6,8-7,2 и содержащим сульфат натри с концентрацией 1,0-1,5 М, затем примеси первой фракции вымывают раствором сульфата натри с концентрацией, понижающейс с 1,0-1,5 до-0,1 М, а хитиназу вымывают фосфатным буфером с концентрацией 0,01-0,02 М, примеси второй фракции вымывают раствором сульфата натри с концентрацией, понижающейс с 1,0-1,5 до 0,3-0, 4 М, хитиназу с мол.м. 26 кДа вымывают раствором сульфата натри с концентрацией 0,1-0,2 М, хитиназу с мол.м, 42 кДа вымывают фосфатным буфером с концентрацией 0,01-0,02 М.

Способ осуществл етс следующим образом .

На колонку с иминодиуксуснокислой агарозой, зар женной ионами двухвалентной меди и уравновешенной буфером с рН 6,0-7,5, содержащим 0,5-1,0 М хлористого натри , нанос т кулътуральную жидкость Actlnomyces Kurssanovli 93 в объеме, равном объему колонки. Элюцию провод т со скоростью 0,8-1,0 мл/мин при ступенчатой смене буферов следующего состава:

А - 0,1 М натрий-ацетатный буфер. рН 6,0-7,5, содержащий 0,5-1,0 М хлористого натри ;

Б - 0,1 М натрий-ацетатный буфер, рН 4,8-5,6, содержащий 0,5-1,0 М хлористого натри ;

3 - 0,1 М натрий-ацетатный буфер, рН 3,8-4,5, содержащий 0,5-1,0 М хлористого натри .

При этом на колонке не сорбируютс ft -N-ацетилглюкоззминидаза, протеазы (80% протеазной активности культуральной жидкости) и другие примеси. Белки, обладающие хитиназной активностью по коллоидному хитину, которую оценивают по количеству восстанавливающих Сахаров с помощью 3,5- динитросалициловой кислоты, элюируют путем ступенчатого понижени рН сначала буфером Б, а затем буфером В (перва и втора фракции соответственно).

В каждой из двух фракций белков довод т рН до 6,8-7.2. после чего их нанос т на колонку с бутил-Тойоперлом 650 М, уравновешенным 0,1 М натрий-фосфатным буфером рН 6,8-7,2, содержащим 1,0-1,5 М сульфата натри . Элюцию провод т убывающим градиентом концентрации сульфата натри , задаваемым автоматическим смесителем в течение 2 ч, со скоростью 0,8-1,0 мл/мин. Начальный буфер: 0,1 М фосфатный буфер, рН 6,8-7,2, содержащий 1,0-1,5 М сульфата натри , конечный буфер: 0,01- 0,02 М фосфатный буфер, рН 6,8-7,2.

Примеси первой фракции элюируют в градиенте концентрации сульфата натри , хитиназу (XI) вымывают 0,01-0,02 М фосфатным буфером рН 6,8-7,2, примеси второй

5 фракции вымывают раствором сульфата натри с концентрацией, понижающейс от 1,0-1,5 до 0,3-0,4 М, хитиназу с мол.м. 26 кДа (XI) вымывают раствором сульфата натри с концентрацией 0,1-0,2 М, а хитиназу

0 с мол.м, 42 кДа (XIII) вымывают 0,01-0,02 М фосфатным буфером рН 6,8-7,2, не содержащим сульфата натри .

Рели иминодиуксуснокислую агарозу, зар женную ионами двухвалентной меди,

5 уравновесить буфером, имеющим рН меньше 6,0, и проводить сорбцию белков культуральной жидкости Actlnomyces Kurssanlvii 93 при этом рН, то хитмназа первой фракции не будет задерживатьс на колонке, а будет

0 элюировзтьс вместе с балластными ми, что исключает ее выделение в индивидуальном виде.

Если рН уравновешивающего буфера и буфера А больше 7,5, происходит частична

5 инактиваци ферментов.

Если первую фракцию белков вымывать с иминодиуксуснокислой агарозы при рИ меньше 4,8, не удаетс ее полностью отделить от второй фракции, при рН больше 5,6,

0 хитиназа не элюируетс с сорбента.

Если вторую фракцию белков вымывать с сорбента при рН меньше 3,8, происходит частична инактиваци ферментов, при рЫ больше 4,5, фракци не элюируотс с ими5 нодиуксуснокислой агарозы.

Интервал рН 6,8-7,2 соответствует минимуму потерь хитинззной активности, поэтому данный интервал рН использован дл хроматографической очистки первой и вто0 рой фракций белков на бутил-Тойоперле. Уравновешивающий буфер содержит сульфат натри в концентрации 1,0-1,5 М. При меньшей концентрации наблюдаетс неполна сорбци хиткчаз, при более высокой

5 концентрации - высаливание белков.

Хитиназа, содержаща с в первой фракции, элгаируетс с бутил-Тойоперла в 0,01-0,02 М фосфатном буфере. Если проводить элюцию буфером с концентрацией

0 больше 0,02 М или меньше 0,01 М, не произойдет полного элюировани фермента, По аналогичным соображени м выбран интервал концентрации сульфата натри 0,1- 0,2 М дл элюированил хитинази второй

5 фракции.

Осуществление способа в объеме изложенных признаков позвол ет получать препараты высокоочищенных ферментов, гомогенных по данным электрофореза в полиакриламмдном геле в денатурирующих услови х , имеющих активность; 0,9 ± 0,02 мкМ/мг мин, (XI), 1,59 ± 0,02 мкМ/м мин (XII), 5,13 ± 0,02 мкМ/мг мин (XIII), что превышает активность продукта, получаемого по известному способу в 5, 10 и 32 раза соответственно дл ферментов XI, XII и XIII.

Иминодиуксуснокисла агароза, зар женна ионами двухвалентной меди, ранее использовалась дл разделени ферментов класса нуклеаз, однако она не использовалась дл разделени карбогид- раз, к которым относ тс хитинззы; указанна функци носител не вытекает с очевидностью из его изчстных свойств.

Пример 1. Колонку с иминодиуксус- нокислой агарозой зар жают ионами меди промыванием колонки п тью объемами 0,5 М раствора сульфата меди, уравновешивают 0,1 М натри - ацетатным буфером рН 6,5, содержащим 0,5 М хлористого натри . На колонку (2,0 4,5 см) нанос т 15 мл куль- туральной жидкости. Элюцию провод т со скоростью 0,8 мл/мин при ступенчатой смене буфером следующего состава:

А - 0,1 М натрий-ацетатный буфер, рН 6,5. содержащий 0,5 М хлористого натри ;

Б - 0,1 М натрий-ацетатный буфер, рН 5,0, содержащий 0,5 М хлористого натри ,

В - 0,1 М натрий-ацетатный буфер, рН 4,0, содержащий 0,5 М хлористого натри , объем фракций 4 мл.

Хитиназна активность была обнаружена во фракци х белков, элюирующихс буферами Б и В. Каждую из этих фракций после доведени рН до 7,0 нанос т на колонку с бутил-Тойоперлом 650 М, уравновешенную 0,1 М натрий-фосфатным буфером рН 7,0, содержащим 1,0 М сульфата натри . Размер колонки (2,5 х 7,5 см), нанос т 16 оптических единиц (280 нм). Элюцию провод т линейным градиентом сульфата натри от 1,0 до О М, задаваемым автоматическим смесителем Ультраград, со скоростью 0,8 МЛ/РШН в течение 2 ч. Начальный буфер: 0,1 М натрий-фосфатный, рН 7,0, содержащий 1,0 М сульфата натри ; конечный буфер: 0,02 М натрий-фосфатный, рН 7,0. После

этого колонку промывают конечным буфером .

Пример 2-9. Способ осуществл етс аналогично примеру 1.

Режимы его проведени представлены

в табл.1, активность полученного продукта проведена в табл. 2.

Таким образом, предлагаемый способ

позвол ет повысить степень очистки хитиназ XI, XII, XIII из культуральной жидкости

Actlnomyces Kurssanovll 93 в 5, 10 и 32 раз

соответственно,

ф ормула изобретени

Способ выделени хитиназ из культуральной жидкости Actlnomyces Kurssanovll 93, отличающийс тем, что, с целью повышени степени очистки хитиназ. куль- туральную жидкость нанос т на иминодиуксуснокислую агарозу, зар женную ионами двухвалентной меди и уравновешенную 0,1 М натрий-ацетатным буфером рН 6,0-7,5, содержащим хлористый натрий, отмывают балластные белки, затем последовательно

элюируют две фракции белков путем ступенчатого понижени рН сначаладо4,8-5,6, затем до 3,8-4,5, в каждой из двух фракций довод т рН до 6,8-7,2, после чего нанос т их на бутил-тойоперл 650 М, уравновешенный 0,1 М натрий-фосфатным буфером рН 6,8-7,2, содержащим 1,0-1,5 моль сульфата натри , вымывают примеси первой фракции тем же буфером с сульфатом натри в убывающем градиенте концентрации от 1,0-1,5

до 0,1 моль, а элюцию хитиназы осуществл ют убывающим от 1,0-1,5 доО мол. градиентом концентрации сульфата натри в 0,01-0,02 М натрий-фосфатном буфере, при этом примеси второй фракции вымывают

буферным раствором, содержащим сульфат натри в убывающем градиенте концентрации от 1,0-1.5 до 0,3-0,4 моль, хитиназу с мол.м. 26 кДа вымывают раствором, содержащим сульфат натри в концентрации 0,20 ,1 моль, а хитиназу с мол.м. 42 кДа вымывают 0,01-0,02 М натрий-фосфатным буфером.

Таблица 1

Claims

Формула изобретения

Способ выделения хитиназ из культуральной жидкости Actinomyces Kurssanovli 93, отличающийся тем, что, с целью повышения степени очистки хитиназ, культуральную жидкость наносят на иминодиуксуснокислую агарозу, заряженную ионами двухвалентной меди й уравновешенную 0,1 М натрий-ацетатным буфером pH 6,0-7,5, содержащим хлористый натрий, отмывают балластные белки., затем последовательно элюируют две фракции белков путем ступенчатого понижения pH сначала до 4,8-5,6, затем до 3,8-4,5, в каждой из двух фракций доводят pH до 6,8-7,2, после чего наносят их на бутил-тойоперл 650 М, уравновешенный 0,1 М натрий-фосфатным буфером pH 6,8-7,2, содержащим 1,0-1,5 моль сульфата натрия, вымывают примеси первой фракции тем же буфером с сульфатом натрия в убывающем градиенте концентрации от 1,0-1,5 до 0,1 моль, а элюцию хитиназы осуществляют убывающим от 1,0-1,5 доО мол. градиентом концентрации сульфата натрия в 0,01-0,02 М натрий-фосфатном буфере, при этом примеси второй фракции вымывают буферным раствором, содержащим сульфат натрия в убывающем градиенте концентрации от 1,0-1,5 до 0,3-0,4 моль, хитиназу с мол.м. 26 кДа вымывают раствором, содержащим сульфат натрия в концентрации 0,20,1 моль, а хитиназу с мол.м. 42 кДа вымывают 0,01-0,02 М натрий-фосфатным буфером.

Таблица!

Показатели для способа по примеру

Условия разделения

-L.J 5 ΕΞΙ J.J ----- pH буфера, уравновешивалщего ИДК-агарозу 6,0 7,5 7,5 5,0 7.0 / 7,0 7,0 7,0 pH элюирования балластных белков 6,0 7,0 7,5 5,0 7,0 7,0 7,0 7,0 оН элюций первой фракции белков, содержа|в(их *хити- . назу ‘ _ . · ’ ♦ 5,0 А.8 М 6,0 5,0 5,0 pH элюции второй фракции белков, содержащих хитиназу 1»,0 3,8 3,9 М 4,0 М 3,0 pH буфера,уравновешивающего бутип-Тойоперл 7,0 6,8 6,9 6,9 7,0 7,0 7,2 7,0 Концентрация,м: сульфата натрия в уравновешивающем буфере 1,0 1,5 1,3 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 то’же в элюирующем растворе 0,2 0,1 0,2 0,2 0.2 0,2 0,2 0,2 фосфатного буфера 0,02 0,01 0,015 0,02 0,02 0,02 0,02 0,0

Таблица2

Способ по примеру

Активность,

MkMG/cNAc___ (мин-мгЛс^

Примечание

Предлагаемый

1 X 1 -92, X II - 160, X III -515 2 V Λ I - 09, X II - 159, X III-510 3 X 1-90, w Λ II - 160, X III- 512 4 X I - 80, X 11-158, X III-513

'5

Ί

Известный 18-22

Первая фракция не отделяется от балластных белков

Первая й вторая фракции не разделяются

Первая и вторая фракции белков не разделяются

Частичная инактивация фермен-. тов

Плохое разделение первой и второй фракции белков

Концентрация белка 1 мг/мл