SU1724689A1 - Method for preparation of restriction endonuclease, recognizing and splitting the nucleotide sequence 5ъtgatca3ъ - Google Patents
Method for preparation of restriction endonuclease, recognizing and splitting the nucleotide sequence 5ъtgatca3ъ Download PDFInfo
- Publication number
- SU1724689A1 SU1724689A1 SU904804871A SU4804871A SU1724689A1 SU 1724689 A1 SU1724689 A1 SU 1724689A1 SU 904804871 A SU904804871 A SU 904804871A SU 4804871 A SU4804871 A SU 4804871A SU 1724689 A1 SU1724689 A1 SU 1724689A1
- Authority
- SU
- USSR - Soviet Union
- Prior art keywords
- enzyme
- activity
- strain
- yield
- increase
- Prior art date
Links
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относитс к биотехнологии и генной инженерии. Целью изобретени вл етс увеличение выхода и повышение активности целевого продукта. Способ предусматривает использование в качестве штамма - продуцента Bacillus stearothermophilus(BKnM B-5209), имеющего легко разрушаемые ультразвуком бактериальные стенки и содержащего только одну рестриктазу, что позвол ет увеличить выход целевого фермента в 1,5 раза, облегчить выделение и очистку фермента. Выход фермента 65000 ед./r биомассы, активность 15 ед./мкл. Рестриктаза Bst 77, полученна по предлагаемому .способу, вл етс изоши- зомером Bel I и может полностью заменить ее во всех генно-инженерных работах. (Л СThis invention relates to biotechnology and genetic engineering. The aim of the invention is to increase the yield and increase the activity of the target product. The method involves the use of Bacillus stearothermophilus (BKnM B-5209) as a producer strain, which has bacterial walls that are easily sonicated and contains only one restriction enzyme, which makes it possible to increase the yield of the target enzyme by 1.5 times, to facilitate the isolation and purification of the enzyme. The output of the enzyme is 65000 units / r of biomass, the activity is 15 units / μl. The restriction enzyme Bst 77, obtained by the proposed method, is a Bel I isospuomer and can completely replace it in all genetic engineering works. (Ls
Description
Изобретение относитс к биотехнологии и генной инженерии и касаетс получени сайт-специфической эндонуклеазы, способной узнавать и расщепл ть последовательность нуклеотидов б -ТСАТСА-З.The invention relates to biotechnology and genetic engineering and concerns the production of a site-specific endonuclease capable of recognizing and cleaving the sequence of nucleotides b-TCATSA-3.
Рестриктаза такой специфичности может быть использована дл исследовани первичной структуры ДНК, физического картировани различных геномов, расшир ет возможность конструировани гибридных молекул по сайту, имеющему в своей основе широко распространенный тетра- нуклеотид 5 -САТС-3 .Restriction of such specificity can be used to study the primary structure of DNA, physical mapping of various genomes, expands the possibility of constructing hybrid molecules on a site, which is basically based on the widely used tetra-nucleotide 5 -CATS-3.
Известен способ получени рестриктаз Bst GI (сайт узнавани б -ТСАТСА-З) и Bst Gil (сайт узнавани 5 -ССА/Т6С-3)из штамма Bacillus stearothermophllus G3.A known method for producing Bst GI restriction enzymes (recognition site b -TCATSA-3) and Bst Gil (recognition site 5 -CCA / T6C-3) from Bacillus stearothermophllus G3 strain.
Недостатком данного способа вл етс наличие двух активностей, что затрудн ет получение чистого фермента, узнающего и расщепл ющего последовательность нуклеотидов 5 -TG АТС А-3The disadvantage of this method is the presence of two activities, which makes it difficult to obtain a pure enzyme that recognizes and cleaves the sequence of nucleotides 5 -TG PBX A-3
Известен способ получени рестрикта- зы Bsp XII (сайт узнавани s -TGATCA-З ) и Bsp XI (сайт узнавани 5 -ATCGAT-J), включающий в себ культивирование штаммаA known method for producing restrictase Bsp XII (recognition site s -TGATCA-3) and Bsp XI (recognition site 5 -ATCGAT-J), including the cultivation of the strain
4 N3 N О 00 Ч)4 N3 N O 00 H)
Bacillus sphaerlcus, хроматографические стадии очистки.Bacillus sphaerlcus, chromatographic purification steps.
Недостатком данного способа вл етс невысокий выход фермента Bsp XII, который составл ет приблизительно40000 ед./г сырой биомассы. Кроме того, наличие двух ферментов усложн ет процедуру очистки и получени целевой рестриктазы без интерферирующего загр знени .The disadvantage of this method is the low yield of the Bsp XII enzyme, which amounts to approximately 400 U / g of raw biomass. In addition, the presence of two enzymes complicates the purification procedure and the production of a targeted restriction enzyme without interfering contamination.
Наиболее близким к предлагаемому вл етс способ получени рестриктазы Bel I, узнающей и расщепл ющей сайт 5- TGATCA-3 , включающий в себ использова- ние штамма - продуцента Bacillus caldolyticus, культивирование его дл получени биомассы, многократную дезинтеграцию биомассы, выделение и очистку рестриктазы хроматографическим способом .The closest to the present invention is the Bel I restriction enzyme production method that recognizes and cleaves the 5-TGATCA-3 site, including the use of the Bacillus caldolyticus producer strain, its cultivation for biomass production, multiple biomass disintegration, isolation and purification of the restriction enzyme by chromatographic in a way.
Недостатками известного способа вл ютс низкий выход целевого фермента (40000 ед./r сырой биомассы) и низка активность фермента {1 ед./мкл), а также прочность клеточной стенки штамма затрудн ет разрушение биомассы и требует многократной дезинтеграции.The disadvantages of this method are the low yield of the target enzyme (40000 units / r of raw biomass) and the low activity of the enzyme {1 unit / μl), as well as the strength of the cell wall of the strain makes it difficult to destroy the biomass and requires repeated disintegration.
Целью изобретени вл етс увеличение выхода и активности целевого продукта.The aim of the invention is to increase the yield and activity of the target product.
Поставленна цель достигаетс тем, что согласно способу получени рестриктазы в качестве продуцента используют штамм Bacillus stearothermophilus (ВКПМ В-5209).This goal is achieved in that according to the method for producing restrictase, Bacillus stearothermophilus strain (VKPM B-5209) is used as a producer.
Штамм выделен из термальных источников в результате поиска продуцентов биологически активных веществ.The strain was isolated from thermal sources as a result of a search for producers of biologically active substances.
Полученный штамм Bacillus stearothermophilus депонирован в ВКПМ ВНИИгенетики под регистрационным номером В-5209, а продуцируема им рестрик- таза названа Bst 77 I согласно общеприн той номенклатуре.The resulting Bacillus stearothermophilus strain was deposited in the VKPM VNIIgenetiki under registration number B-5209, and the restriction strain produced by it is called Bst 77 I according to the generally accepted nomenclature.
Штамм Bacillus stearothermophilus характеризуетс следующими признаками.The strain Bacillus stearothermophilus is characterized by the following features.
Морфологические признаки.Morphological signs.
Клетки палочковидные, пр мые или слегка изогнутые (0,5-0,75) х (2-14) мкм, подвижные . Образуют эндоспоры овальной формы, терминального расположени , вздутые относительно размеров вегетативной клетки. Окраска по Граму вариабельна .Cells are rod-shaped, straight or slightly curved (0.5-0.75) x (2-14) μm, motile. They form endospores of oval shape, terminal location, swollen relative to the size of the vegetative cell. Gram coloration is variable.
Культуральные признаки.Cultural features.
Штамм нетребователен к факторам роста , хорошо растет на обычных питательных средах (СПА, МПА, МПБ). На агаризованных средах образует мелкие круглые, непигментированные колонии, прозрачные, блест щие , с ровным краем. Оптимальна температура роста 65°С, рН 7,0-7,2.Strain undemanding to growth factors, grows well on conventional nutrient media (SPA, MPA, BCH). On agar media, it forms small, round, non-pigmented colonies, transparent, shiny, with a smooth edge. The optimum growth temperature is 65 ° C, pH 7.0-7.2.
Культуру поддерживают пересевом на плотных средах, хран т в растворе глицерина при -70°С или в лиофильно-высушенном состо нии.The culture is maintained by re-sowing in dense media, stored in a glycerol solution at -70 ° C or in a lyophilized state.
Физиологические признаки.Physiological signs.
Не восстанавливает нитраты, отрицателен по лецитиназе, в реакции с метиловым красным и Фогес-Проскауера; не гидроли- зует крахмал, казеин, желатин, эскулин; не использует малонат, цитрат, не растет приDoes not restore nitrates, negative for lecithinase, in reaction with methyl red and Voges-Proskauer; does not hydrolyze starch, casein, gelatin, esculin; does not use malonate, citrate, does not grow when
концентрации NaCI 5% и 0,001 % лизоцима; энергично образует кислоту из глюкозы, очень слабо - из арабинозы, ксилозы и ман- нита: не дезаминирует фенилаланин, не выдел ет индол и сероводород.NaCl concentrations of 5% and 0.001% lysozyme; vigorously forms acid from glucose, very weakly from arabinose, xylose and mannitol: it does not deminerate phenylalanine, does not release indole and hydrogen sulfide.
Штамм высокочувствителен к антибиотикам: пенициллину, карбенициллину, ампициллину , гентамицину, метициллину, сульфатиазолу, линкомицину; менее чувствителен к тетрациклину, мономицину, неомицину , олеандомицину, левомицетину, канамицину, ристомицину, рифампицину; слабо чувствителен к полимиксину; устойчив к стрептомицину.The strain is highly sensitive to antibiotics: penicillin, carbenicillin, ampicillin, gentamicin, methicillin, sulfathiazole, lincomycin; less sensitive to tetracycline, monomitsin, neomycin, oleandomycin, levomycetin, kanamycin, ristomycin, rifampicin; slightly sensitive to polymyxin; resistant to streptomycin.
Дл культивировани BacillusFor the cultivation of Bacillus
stearothermophilus В-5209 примен ют среду следующего состава, г/л: пептон 10; дрожжевой экстракт (Difco) 5; глюкоза 5; дистиллированна вода остальное. Культивирование провод т при 65°С и интенсивной аэрации до достижени стационарной фазы роста.stearothermophilus B-5209 use medium of the following composition, g / l: peptone 10; yeast extract (Difco) 5; glucose 5; distilled water else. The cultivation is carried out at 65 ° C and intensive aeration until the stationary growth phase is reached.
Выход целевого фермента 65000 ед./гThe yield of the target enzyme 65000 units / g
сырой биомассы с активностью 15 ед./мкл.raw biomass with an activity of 15 units / μl.
Отличием предлагаемого способа от известного вл етс использование нового более продуктивного штамма Bacillus stearothermophilus, превышающего по выходу известный более, чем в 1,5 раза, с более высокой активностью выдел емогоThe difference of the proposed method from the known one is the use of a new, more productive strain of Bacillus stearothermophilus, exceeding in yield the known one more than 1.5 times, with a higher activity of the released
целевого фермента, способностью легко ли- зироватьс при ультразвуковой дезинтеграции ,target enzyme, the ability to easily lyse upon ultrasonic disintegration,
Пример. Штамм выращивают в питательной среде следующего состава, г/л:Example. The strain is grown in a nutrient medium of the following composition, g / l:
пептон 10; дрожжевой экстракт 5 (Difco); глюкоза 5; дистиллированна вода остальное . Культивирование провод т при 65°С с аэрацией 2 об./мин, а при перемешивании 150 об/мин до стационарной фазы роста.peptone 10; yeast extract 5 (Difco); glucose 5; distilled water else. Cultivation was carried out at 65 ° C with aeration of 2 rpm, and under stirring, 150 rpm before the stationary growth phase.
Клетки собирают центрифугированием при 5000 g и температуре 4 С.Cells collected by centrifugation at 5000 g and a temperature of 4 C.
Биомассу весом 5 г загружают в стекл нный химический стакан, добавл ют 10 мл 10 мМ калийфосфатного буфера (рН 7,0),Biomass weighing 5 g is loaded into a glass beaker, 10 ml of 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) is added,
содержащего 1 мМ ЭДТА, 7 мМ 2-меркапто- этанол (буфер А) с добавлением 0,4 М хлористого натри , перемешивают при помощи магнитной мешалки до получени гомогенной суспензии, добавл ют 6 мг лиэоцима и перемешивают в течение 30 мин.containing 1 mM EDTA, 7 mM 2-mercapto-ethanol (buffer A) with addition of 0.4 M sodium chloride, stirred using a magnetic stirrer to obtain a homogeneous suspension, add 6 mg of Lieozim and mix for 30 minutes.
Суспензию разрушают на ультразвуковом дезинтеграторе на резонансной частоте 22 кГц.The suspension is destroyed by an ultrasonic disintegrator at a resonant frequency of 22 kHz.
Озвученную суспензию перенос т в стакан, содержащий50 мл ПЭГ-6000(11,2%) и декстран Г-500 (3,5%), помещают на магнитную мешалку и при посто нном перемешивании добавл ют 4М раствор Nad до конечной концентрации 0,5 М. Смесь перемешивают в течение 5 мин.The voiced suspension is transferred to a beaker containing 50 ml of PEG-6000 (11.2%) and dextran G-500 (3.5%), placed on a magnetic stirrer, and with constant stirring, 4M Nad solution is added to a final concentration of 0.5 M. The mixture is stirred for 5 minutes.
Дл разделени фаз суспензию центрифугируют на центрифуге G-21 при 20000 об/мин в течение 10 мин. Полученный гру- бый экстракт (25 мл) разбавл ют в два раза буфером Аи нанос т на колонку с гидрокси- лапатитом объемом 25 мл. Примесные белки удал ют промыванием буфером А, содержащим 0,2 М NaCI. Элюцию фермента прово- д т линейным градиентом NaCI 0,01-0,25 М концентрации буфером А. Фракции, содержащие целевой продукт, собирают, фермент разбавл ют в 1,5 раза 20 мМ трис-HCt (рН 7,5), содержащим 0,1 мМ ЭДТА, 7 мМ 2-меркаптоэтанол, 10%-ный глицерин (буфер В) и нанос т на колонку с гепарин-сефа- розой 4В объемом 30 мл. Примесные белки удал ют промыванием буфером В, содержащим 0,2 М NaCI. Фермент элюируют линей- .ным градиентом 0,2-1.0 М NaCI в буфере В. Фракции, содержащие целевой продукт, объедин ют и диализируют против 50 мМ трис-HCI (рН 7,9), содержащего 1 мМ ЭДТА, 7 мМ 2-меркаптоэтанол, 0,02%-ный тритон Х-100, 60%-ный глицерин.To separate the phases, the suspension is centrifuged in a G-21 centrifuge at 20,000 rpm for 10 minutes. The resulting coarse extract (25 ml) is diluted twice with Au buffer applied to a 25 ml hydroxylapatite column. Impurity proteins are removed by washing with buffer A containing 0.2 M NaCl. The elution of the enzyme is carried out with a linear NaCI gradient of 0.01–0.25 M concentration with buffer A. The fractions containing the desired product are collected, the enzyme is diluted 1.5 times with 20 mM Tris-HCt (pH 7.5) containing 0.1 mM EDTA, 7 mM 2-mercaptoethanol, 10% glycerol (buffer B) and applied to a 30 ml heparin-rosehaph column. Impurity proteins are removed by washing with buffer B containing 0.2 M NaCl. The enzyme is eluted with a linear gradient of 0.2-1.0 M NaCI in buffer B. The fractions containing the desired product are combined and dialyzed against 50 mM Tris-HCl (pH 7.9) containing 1 mM EDTA, 7 mM 2- mercaptoethanol, 0.02% Triton X-100, 60% glycerol.
Выход фермента 65000 ед.акт./г сырой биомассы, активность 15 ед./мкл. Препарат не содержит примесей эндонуклеаз. За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое дл полного расщеплени 1 мкг ДНК фага А в течение 1 ч при 37°С.The output of the enzyme is 65000 units of act. / G of raw biomass, the activity of 15 units / μl. The drug does not contain impurities endonucleases. Per unit of activity, the minimum amount of enzyme necessary for complete cleavage of 1 µg of phage A DNA for 1 hour at 37 ° C is taken.
Предлагаемый способ по сравнению с известным обеспечивает повышенный выход целевого фермента (более, чем в 1,5 раза), облегчает выделение и очистку фермента от интерферирующей рестриктазной активности, поскольку используемый штамм продуцирует только одну рестрикта- зу, позвол ет повысить активность рестрик- тазы более, чем в 10 раз, а также облегчает разрушение клеточных стенок бактерий при ультразвуковой дезинтеграции.The proposed method, in comparison with the known, provides an increased yield of the target enzyme (more than 1.5 times), facilitates the isolation and purification of the enzyme from interfering restriction activity, since the strain used produces only one restriction enzyme, allows more restriction activity to be increased. than 10 times, and also facilitates the destruction of bacterial cells during ultrasonic disintegration.
Поскольку рестриктаза Bs-t 77 I имеет сайт узнавани 5 -TGATCA-3 , идентичный сайту узнавани рестрйктазы Bel I, она может заменить последнюю во всех генно-инженерных работах.Since restriction enzyme Bs-t 77 I has a recognition site 5 -TGATCA-3, identical to the Bel I restriction recognition site, it can replace the latter in all genetic engineering works.
Claims (1)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU904804871A SU1724689A1 (en) | 1990-03-23 | 1990-03-23 | Method for preparation of restriction endonuclease, recognizing and splitting the nucleotide sequence 5ъtgatca3ъ |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU904804871A SU1724689A1 (en) | 1990-03-23 | 1990-03-23 | Method for preparation of restriction endonuclease, recognizing and splitting the nucleotide sequence 5ъtgatca3ъ |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
SU1724689A1 true SU1724689A1 (en) | 1992-04-07 |
Family
ID=21503229
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SU904804871A SU1724689A1 (en) | 1990-03-23 | 1990-03-23 | Method for preparation of restriction endonuclease, recognizing and splitting the nucleotide sequence 5ъtgatca3ъ |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
SU (1) | SU1724689A1 (en) |
-
1990
- 1990-03-23 SU SU904804871A patent/SU1724689A1/en active
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Blolabs. - Catalog, 1986-1987. Lieger M., Patillon M., Roizes G., Lerouge Т., Dupret D., Jeltsch 1.М. Two restriction endonucteases from Bacillus sphaericus Bsp XI and Bsp XII - Nucl. Acids Res., 1987. v. 15, N.9,p. 3919. Bingham A.H.A., Atkinson Т., Sciaky D., Roberts R.I. A specific endonuclease from BaciHus caldolyticus.- Nucl. Acids Res., 1978, v. 5, N.10, p. 3457-3467. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
SU1423002A3 (en) | Method of producing protein reducing content of cholesterol in blood of mammals | |
US5702939A (en) | Glucosamine-6-phosphate deaminase and process for producing the same | |
SU1724689A1 (en) | Method for preparation of restriction endonuclease, recognizing and splitting the nucleotide sequence 5ъtgatca3ъ | |
JPH05276973A (en) | Production of activated sialic acid | |
JPS6362195B2 (en) | ||
JPS6243671B2 (en) | ||
SU1659480A1 (en) | Strain of bacterium klebsiella pneumoniae - a producer of restrictase kpn 378 1 | |
JP2898022B2 (en) | Method for producing collagen degrading enzyme | |
SU1645300A1 (en) | Streptomyces fradiae strain: producer of restrictase sfr 1 | |
RU2077577C1 (en) | Strain of bacterium deleya marina - a producer of alkaline phosphatase and a method of alkaline phosphatase preparing | |
KR100260837B1 (en) | Optical activating carbon acid and method for preparing isomer ester | |
JP2876645B2 (en) | Alkaline phosphatase and method for producing the same | |
SU1689400A1 (en) | Strain of bacteria flavobacterium balustinum - a producer of restrictase fbei | |
RU2115728C1 (en) | Strain of bacterium bacillus stearothermophilus - a producer of restriction endonuclease recognizing and splitting nucleotide sequence 5'-ggtnacc-3' | |
JP3873512B2 (en) | Method for producing D-3- (2-naphthyl) alanine | |
SU1645293A1 (en) | Strain bacteria streptococcus faecalis - is a producer of restrictase sfa n | |
RU2001952C1 (en) | Strain of bacterium rhizobium leguminosarum - a producer of restriction endonuclease rle 691 | |
RU2021373C1 (en) | Strain of bacterium bacillus pumilis producing restriction endonuclease recognizing and cleaving nucleotide sequence 5′- cctnagc- 3′ | |
RU2270859C1 (en) | STRAIN OF BACTERIUM BACILLUS SUBTILIS AS PRODUCER OF RESTRICTION ENDONUCLEASE Bisi | |
SU1752769A1 (en) | Method of restriction endonuclease preparation, which is able to recognize and to cleave nucleotide sequence g-t-c-g-a-c | |
SU1449582A1 (en) | Method of producing restrictase alu1 | |
JPH0458884A (en) | New restrictive enzyme | |
RU2046142C1 (en) | Strain of bacterium bacillus pumilus - a producer of restriction endonuclease bpu 19-1 | |
RU2110573C1 (en) | Strain of bacterium photobacterium phosphoreum - a producer of restriction endonuclease recognizing and splitting nucleotide sequence 5'-gg(t/c)(ag)cc-3' | |
RU2143489C1 (en) | Method of lysostafin producing |