SU1650698A1 - Фаговый вектор @ К9 дл конструировани геномных библиотек - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к биотехнологии , в частности к генетической инженерии. Целью изобретени   вл етс  упрощение способа конструировани  геномных библиотек при использовании вектора ASK9. Вектор ASK9 получен на основе фага AEMBL3 и фазмиды. Он позвол ет получать репрезентативные геномные библиотеки с использованием рестриктаз BamHI, SauSAI. MBOI и других, имеющих такие же липкие концы. ASK9 дает возможность перевода вставки в плазмидную и одноцепочечную форму, а также использу  коммерческие препараты праймеров, специфически метить 5 и Звонцы вставки, что удобно дл  целей прогулки по хромосоме.

Description

Изобретение относитс  к биотехнологии , в частности к генетической инженерии.

Целью изобретени   вл етс  упрощение способа конструировани  геномных библиотек при использовании вектораАЗКЭ.

Вектор ASK9 получен на основе AEMBL3 и фазмиды SK2 ASR. Он характеризуетс  следующими признаками: размер 48 т.п.н., емкость встраиваемой ДНК 4,5 - 19,0 т.п.н. Состоит из AEMBL3, соединенного с фазми- дой SK2 ASR. Фазмида SK2 ASR представл ет собой фазмиду SK2A, в которой удалены Salf и EcoRI участки. Спектр хоз ев дл  ASK9: LE392 F hsd R 514 (п. mk), sup Е 44. sup F 58, lac Y 1/OZ (lac I 2Y)6, gal K2, gal Т 22, met B1, trp R 55; J M 109 rec A1, Alacpro.end A1,gyrA96, thi-1, hsd R 17, sup E 44, rel A1. F1; tra D36,pro AS, lac lqZ ДМ15. Q359 hsd Rki hsd Mk , sup ф 80, p 2.

Полученный вектор позвол ет получать репрезентативные геномные библиотеки с

использованием рестриктаэ Bam, Sau 3AI, MbOl и других, имеющих такие же липкие концы. ASK9 дает возможность перевода вставки в плазмидную и одноцепочечную формы, при этом используетс  способ, принципиально отличный от запатентованного фирмой Stratagene.

Применение этого метода позвол ет быстро, эффективно и стабильно осуществить перевод вставки в плазмидную форму. Дл  библиотек вА5К9 гарантированы невозможность суперинфекции фагом М13 и неконтролируемый перевод вставки ДНК в фаге А е одноцепочечную форму. ASK9 дает возможность, использу  коммерческие препараты праймеров, специфически метить 5- и 3-концы вставки, что удобно дл  целей прогулки по хромосоме.

Таким образом, применение ASK9 дл  конструировани  геномных библиотек дает значительный выигрыш во времени.

О

ел о о ю

00

Пример 1. Способ заключаетс  во введении в фаг AEMBL3 фазмиды SK2 ASR.

Стади  1. ДНКфазмиды SK2A, гидроли- зуют рестриктазой Sal и останавливают реакцию прогреванием 15 мин при 65°С. С помощью фрагмента Кленова ДНК-полиме- разы 1 из E.coli в присутствии всех четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов затупл ют липкие концы. Затем раствор ДНК развод т в три раза и провод т самолиги- рование. Лигированную ДНК ввод т в клетки E.coli штамм I.M.109, Рассев бактерий производ т на чашки Петри с 2%-ным L-ara- ром, содержащим 25 мкг/мл ампициллина, 0,1% IPTG и 0,1% X-gal. Из дес ти белых колоний по стандартным методикам выдел ют ДНК и анализируют рестриктазами EcoRI, Baml, Sail. Фазмиду, содержащую EcoRI, Baml, но не содержащую SaM-участ- ков узнавани  рестриктазами и названную SK2 AS, используют на следующей стадии.

Стади  2. Удаление участка узнавани  рестриктазы EcoRI в фазмиде SK2 AS. ДНК фазмиды SK2 AS гидролизуют рестриктазой EcoRI и останавливают реакцию прогреванием 15 мин при 65°С. С помощью фрагмента Кленова в присутствии всех четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов затупл ют липкие концы. Затем ДНК развод т в три раза и провод т самолигирование. Лигированную ДНК расщепл ют рестриктазой EcoRI и ввод т в клетки E.coli штамм J.M.109. Рассев бактерий производ т на L- агар с 25 мкг/мл ампициллином. Из дес ти колоний по стандартным методикам выдел ют ДНК и анализируют рестриктазами EcoRI, Baml и Sail. Фазмиду, содержащую Baml, но не содержащую EcoRI и Sail участков (названа SK2 ASR), используют на следующей стадии.

Стади  3. Конструирование рекомби- нантной фазмиды gSR. ДНК фага Agt II гидролизуют рестриктазой Baml и фермент инактивируют прогреванием. Затем провод т отжиг липких концов фага А инкубацией раствора ДНК при 42°С в течение 1 ч, и центральный Baml - фрагмент размером около 6,5 тыс. пар нукл. очищают гель-электрофорезом в 0.7%-ной легкоплавкой агаро- зе (препарат А), ДНК фазмиды SK2 ASR гридролизуют рестриктазой Baml и после инактивации фермента прогреванием лиги- руют с препаратом А. Лигированную ДНК ввод т в клетки E.coli штамм J.M. 109 и рассевают на L-arap с ампициллином (25 мкг/мл). С выросших колоний снимают отпечатки на нитроцеллюлозные фильтры и провод т гибридизацию с препаратом А, ДНК которого мет т Р с помощью никтрансл ции . Клетки из п ти колоний, гибри- дизующихс  с препаратом А, наращивают в 10 мл L-среды с ампициллином (100 мкг/мл) и выдел ют плазмидную ДНК стандартным

методом. Анализ полученной ДНК рестриктазами EcoRI, Baml, Sail подтверждает клонирование в фазмиде SK2 ASR участка Agtll. Эту фазмиду, названную gSR, используют в следующей стадии.

Стади  4. Конструирование фага-вектора AgEs7. ДНК фазмиды gSR гидролизуют рестриктазой BgllJ и фермент инактивируют прогреванием. ДНК фага AEMBL3 гидролизуют рестриктазой Baml и фермент

инактивируют. Оба препарата ДНК в экви- мол рных соотношени х смешивают и лиги- руют. Лигированную ДНК упаковывают в белки фага A in vitro и полученные фаговые частицы рассевают на газон клеток E.coli

штамм LE392, содержащий 0,1% Х-ga,. Из дес ти голубых бл шек наращивают фаг, выдел ют ДНК и анализируют с помощью рестриктаз EcoRI, Baml, Sail. Один из фагов, названный A gES7, имеет ожидаемую структуру . Его используют на следующей стадии. Стади  5. Конструирование фага-вектора ASK9. ДНК фага EMBL3 гидролизуют рестриктазой Baml и вставочный фрагмент размером около 13,7 тыс.пар нуклеотидов

очищают гель-электрофорезом в 0,7%-ной легкоплавкой агарозе (препарат А). ДНК фага AgES7 гидролизуют рестриктазой Baml и плечи очищают гель-электрофорезом в легкоплавкой агарозе (препарат Б). Препараты А и Б в эквимол рных соотношени х смешивают и лигируют. Лигированную ДН К упаковывают в белки фага A In vitro и полученные фаговые частицы рассевают на газон клеток E.coli, штамм LE392. Из шести

бл шек наращивают фаг, выдел ют ДНК и анализируют с помощью рестриктаз EcoRI, Baml и Sail. Один из фагов, названный ASK9, имеет ожидаемую структуру и используетс  дл  конструировани  репрезентативных геномных библиотек.

Применение ASK9. Фаг ASK9 удобен дл  получени  репрезентативных геномных библиотек по классической методике. ДНК фага ASK9 гидролизуют 10-кратными избытками рестриктаз EcoRI и Baml. Затем ДНК осаждают изопропанолом, причем значительна  часть олигонуклеотидных фрагментов EcoRI - Baml остаетс  в супер- натанте и после растворени  осадка ДНК

получают концевые фрагменты (плечи ASK9 с липкими концами Baml и внутренний фрагмент с липкими концами EcoRI.

Геномную ДНК не полностью гидроли- эуют рестриктазой sau 3A1 (или МВО I) и

выдел ют фрагменты размером 15-20 т.п.н. (с помощью гель-электрофореза или центрифугировани ). Эти фрагменты лигируют с фаговой ДНК, обработанной, как описано выше, лигированную ДНК упаковывают в белки фага Я in vitro и образовавшимис  фаговыми частицами заражают клетки E.colt. При этом обычно около 70% выросших фагов - рекомбинанты.

Следует отметить, что в ASK9 сохранена селекци  в пользу рекомбинантных фагов и исходные, не рекомбинантные ASK9 не способны размножатьс  на клетках E.coli, лизо- генных по фагу Р2 (spl-фенотип) - штаммы Q 359, NM 539.

Вставка ДНК в ASK9 может быть легко переведена в плазмидную форму. При этом используют другой принцип, чем в AZAP. ДНК рекомбинанта ASK9 гидролизуют ре- стриктазой Sail (можно примен ть также Ctat) и инактивируют фермент 3-кратным замораживанием/оттаиванием. Обе ре- стриктазы достаточно редко расщепл ют эукариотическую ДНК (5а1Тимеет в среднем один участок узнавани  на примерно 50 тыс, пар нуклеотидов, a Clal - около 20 тыс, пар нуклеотидов). Затем ДНК разбавл ют и са- молигируют. Лигированную ДНК ввод т в компетентные клетки E.coli, которые высевают на L-arap с ампициллином. Выросшие колонии содержат вставку ДНК в плазмид- ной форме, причем плазмида либо вовсе не содержит нуклеотидных последовательностей фага Я (в случае Sail), либо небольшую их часть (в случае Clal). Процесс перевода в плазмидную форму быстр (3-4 ч) и эффективен (0.1 мкг/мл ДНК рекомбинанта дает много сотен колоний). Также какдл  ASK12, дл  Я5К9 и его рекомбинантов существует и другой путь перевода в плазмидную форму - путь пр мой инфекции фагом клеток E.coli, резистентных к литическому размножению фага Я, однако этот путь менее удобен и может быть полезен только дл  специальных опытов.

При суперинфекции клеток E.coli, содержащих плазмиду, фагом М13 ДНК плаз- миды упаковываютс  в белки фага в одноцепочечной форме, удобной дл  секве- нировани  ДНК вставки по известному методу Сэнгера,

Емкость Я5К9 до 19 тыс. пар нуклеотидов , что вполне достаточно дл  получени  репрезентативных геномных библиотек, поскольку при расчетах репрезентативности, библиотеки обычно исход т из средней вставки в 15 тыс. нуклеотидов.

Таким образом, фагА5К9 можно использовать дл  конструировани  репрезентативных геномных библиотек по классическому методу. Основные преимущества предлагаемого вектора по сравнению с известным заключаетс  в возможности

5 получени  библиотеки генов без предварительной очистки плечей фага А, отбора против нерекомбинантных фагов, быстрого, эффективного и контролируемого перевода в плазмидную форму, свободную от пле0 чей фага Я, а также возможности перевода в одноцепочечную форму дл  определени  первичной структуры ДНК по методу Сэнгера , в гарантированное™ от возможности суперинфекции библиотеки в ASK9 фагом М13,

5 возможности специфического мечена  5л 3- и других участков вставки с использованием стандартных, доступных препаратов затравок .

0 П р и м е р 2. Клонирование в Я5К9 фрагментов геномной ДНК человека.

3 мкг ДНК человека расщепл ют ре- стриктазой Baml в стандартных услови х и

5 инактивируют фермент прогреванием 15 мин при 65°С. 3 мкг ДНК ASK9 гидролизуют рестриктазами Baml и Eco RI и инактивируют ферменты прогреванием. Оба препарата смешивают (весовое соотношение ДНК век0 тора и геномной ДНК 1:1) и провод т лигирование при суммарной концентрации ДНК

250мкг/мп 1 10 мкг лигированной ДНК

упаковывают в белки фага Я In vitro л 1/500

полученных Фаговых частиц рассевают на

5 газон E.co iv штамм Q 359. Из шести случайно отобранных бл шек в 10 мл L-среды с LE492 выращивают фаги и выдел ют из них ДНК. Электрофоретический анализ ДНК показывает , что все они рекомбинанты и со0 держат вставку ДНК 10 - 15 тыс. пар нуклеотидов, 0,5 мкг ДН К одного из них (№1) гидролизуют в течение 30 мин 1 ед. рестрик- тазы ЗаИ. Фермент инактивируют 3-кратным замораживанием/оттаиванием. ДНК

5 развод т и лигируют при комнатной температуре в течение 1 ч 0,1 мхг лигированной ДНК добавл ют к компентентным клеткам E.coli штамм J.M. 109, инкубируют 10 мин при 0°С, а затем 5 мин при 38°С и после

0 добавлени  1 мл L-среды еще 45 мин при 37°С. Затем 0,2 мл клеток рассевают на L-arap с ампициллином (25 мкг/мл). Из трех колоний в 10 мл L-среды с ампициллином (25 мкг/мл). Из трех колоний в 10мл L-среды

5 с ампициллином (50 мкг/мл) наращивают клетки и выдел ют ДНК щелочным лизисом. Электрофоретический анализ ДНК показывает , что плазмиды содержат ту же вставку ДНК, что и исходный фаг № 1.

Claims (1)

1. Формула изобретени  Фаговый вектор ASK9 дл  конструировани  геномных библиотек размером 47,7 т.п.н., содержащий Cos - Salf - фрагмент ДНК фагаЛЕМВ1-3 - левое плечо размером 20,3 т.п.н.; Sal - BgllJ - фрагмент ДНК фаз- миды SK2A размером 3,8 т.п.н., в котором методом достройки уничтожен EpoRI-уча- сток; Baml - Baml фрагмент ДНК фага AEMBL3 размером 13,7 т.п.н.; Baml - Bamll - фрагмент ДНК фазмиды SK2A размером 0,7 т.п.н., в котором методом до

   стройки уничтожен Sail-участок; Sal| - Cos - фрагмент ДНК фаraAEMBL.3- правое плечо, размером 9,2 т.п.н.; места возможной вставки чужеродной ДНК по участкам узнавани  рестриктаз Baml и EcoRI; емкость вектора 4,4 - 19,0 т.п.н.; спектр хоз йств: штаммы Escherlchla coll: LE 392 F hsd R 514 (n/, miO, sup 44, sup F 58, lac Y 10Z (lac IZY)6. galK 2, gal T22, met B1. trp R 55; JM109 rec A1, Лас pro, end A1,gyrA96, thl-1, hsd R 17, sup E44, rel A1, F1; Q359 hsdRk, hsdMk+, supF, ф 80, P2.