SU1627557A1 - Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L. - продуцент моноклональных антител против белка р24 вируса лейкоза крупного рогатого скота - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к гибри- домнон технологии и может быть использовано в биологии и ветеринарии дл  иммуноиндикации вируса лейкоза КРС. Цель изобретени  - получение штамма гибридомных культивируемыхкпе- ток, продуцирующего моноклональные антитела (монАТ) против бечка р24 пируса дейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС), относ щиес  к субклассу Ip,G-2b. Ытамм потучают гибридизацией клеток селезенки мышей линии Balb/c, иммунизированных ВПКРС, с клетками миеломы мышей Balb/c РЗХбЗЛ З.653. Птлчм депонирован под номером ВСКК/П/ № 225П. Шгамм культивируют в среде /1МЕМ с добавлением 10% сыворотки эмбриона коровы, 20 мМ Ht-PES, 2,5 мМ L-глутамина, 200 мкг/мл гентамицина при 37 С и 7,5% СО в воздухе. Мтамм приминаетс  в брюшную полость сингенных мзлгаей в виде ас- цитных опухолей. Гнбридома продуцирует монАТ класса TgG2b, специфичные к белку р24 ВЛКРС. Специфичность монАТ установлена иммунофермеитным анализом на очищенном белке р24, а также методом Вестерн-блотинга. Продуктивность штамма - около 7 мг монАТ из 1 мл асцнтной жидкости. 45 (Л

Description

Изобретение относитс  к гибридом- ной технологии и может быть использовано в биологии и ветеринарии дл  иммуноиндикации вируса лейкоза крупного рогатого скота (КРС).

Целью изобретени   вл етс  получение штамма гибридомных клеток, продуцируюгдег,) моноклональные антитела (монАТ) против белка р24 вируса лейкоза крупного рогатого скота, относ щиес  к субклассу IgG2b.

Штамм BLV-p24-V1, ВСКК/П/ №225Д- получают следукчиим образом.

В-лимАоциты из селезенки иммун- . ных мышей линии Balb/c гибридизируют с помощью 50%-ного раствора полиэти- леигликол  1550 по общеприн той методике с клетками мышиной миеломы P3x63Ag8.653 Преднарительно мышей иммунизируют трижды лизированным вирусом лейкоза КРС по 80 мкг внутрн

СП СП

3

адъювлитом Френнд

ОрюшИПНО С 11ОГ1НЫМ

еженедельно.

Бус торное введение в хвостопую вену 50 мкг белка провод т через мес ц после третьей иммуниза дни .

R-клетки селе }енки мыши выдел ю методом аффинной хроматограЛин на онове F(ab -фрагментов, иммобилизованных на сефлдекс G - 200.

В результате тестировани  методо иммунофермеьт ого анализа (ИФА) полученных гибридных культур по признку продукции антител против бепка р24 вируса псикоза КРС и последующего их клонировани  отобран штамм, продуцирующий монЛТ протип белка вируса гтейкоча ICPC.

ИФЛ провод т по следующей схеме.

Вирус лейкоза КРС в карбонатном- биклрбонатном буфере при рН 9,6 с концентрацией 1 мкг/мл в объеме 100 мкл внос т в лупки полистироловых планшетов. Адсорбцию провод т в течение 18 ч при 4°С. Лунки отмывают АоссЪатным буфером, рН 7,4, с 0, 1 Nad (ФБ) и с 0,05% Твин-20 (ТФБ). Затем в лунки добавл ют по 100 мкл мствора ФБ, содержащего 1% альбумина бычьей сыворотки (БСА), инку- 5. руют 1 ч при чомнатной температур и отмывают несколько раз. Затем в лунки добавлмот по 100 мкл асцит- ной жидьости в разведении 1:10 - 1:8192 с ТсгЧ - БСА инкубируют 1 ч ри 37 С, ошпвают ТФБ. Внос т в лунки по 100 мкг конъюгата (кроличьи антитела против иммуноглобулинов мы:ии,меченные пероксидазой, НИИЭМ им. М.Л.Гамалеи АМН СССР) в разведении 1: 1000 и инкубируют 1 ч при 37 С. После 4-5-разовой промывк ТФБ внос т по 100 мкл субстрата ABTS. Через 30 мин реакцию останавливают добавлением 100 мкд 2%-ного раствора лимонной кислоты, определ  оптическую плотность при 416 нм. Анализ данных показал, что монАТ реагируют с вирусом лейкоза КРС, титр антител составл ет 2048 дл  асцитных жидкостей.

В качеств положительного контрол  используют иммунную сыворотку мышей KRLV, а в качеств отрицательнго контрол  - сыворотку интактных мышей и супернатант миепомы, не продуцирующей иммуноглобулины.

Штамм характеризуемс  следующими свойствами.

5

0

5

0

5

0

5

0

5

КЦРП-И культивируют на ростовой сроцс Игла в модификации Дальбекко ) с добавлением 10% сыворотки эмбриона коровы, л . 2,5 мМ глу- тамина, 20 мМ ОугЪера HKPPS, 200 мкг/мл Iентамицина.

Культивирование провод т при 3/V п чнкубагоре с содержанием 7,5% СОл. По - .пна  концентраци  105 кч/мл, Мутность рассева 1:6. Клонирован ie клеток провод т в 96- чеечных млатах с использованием в качестве гоп ающе- го ло  макрофаго ribiiiien. С.пециЛи- ческа  эффективность 3-го клонировани  составл ет 9Я%.

} мчоконоерр ци - тгрово;, т -ьшо- ротко жбрионов кор в с .зни- ei О7 диметилсуо1ь«Ьг ксидч, 50% сы- ор п эмбрион.,ч крупно о рогатого скога при Концрнтршли 1x10 кле- т к мп. Жизнеспособнс сть кле,ок паима после размораживани  состав- зпет 80.

Прививка по 10б клеток штамма .Y-p24-Vl сингенным предобработанным мьпчам вызывает у них образован ie асцитпой опухопи, сопровож/1ающрес  ьыделением асцнтноп жидкости г ко личесгве 1-5 мл. В асцитнон жидкости содержатс  специфические монАТ к Оелку р24 вируса пейкоза КРС. Способность продуцировать монА 1 клетками ьчтамма BLV-p24-Vl сохран лась на прот жении 4 нес непрерывного ю тьтивировани  клеток in vitro. После размораживани  клетки сохран ют способнссть продуцировать ионАТс Прививка кк нам клеток на р ,- HIix пассажах культивировани  стабильно вызывает образование у них асцитных опухолей.

Дл  выделени  из асцитнои жидкости иммуноглпбутины осаждаю cvjibftaTOM аммони  до 50/ насыщени . Осадок отдел ют ценiрифугироьанием, диал 1зуют, после чего про во 1, т фра;с- ционирование через сефадекс 0-150.

Из 1 мл асцитной жидкости после осажденг  белков сульфатом аммони  получают 7 мг монАТ. Титр антител в асцитной жидкости, установленный с л&мощью иммуноферментного метода, составл ет 2048.

Субкласс монАТ определ ют с помощью коммерческих антисубклагсовых Л сывороток методом иммунодиффузии в агаровом геле. МонАТ KT -p24-V1 принадлежат к субклассу 1р,С,2Ъ

5ir,

Дл  подтверждени  специфичности монЛТ к р24 BT.V используют также МР.ТОДЫ иммунсанализа в п тнах (dot) на нитроцеллюдозной мембране и Вес- терн-блотинга. Одновременно это  вл етс  примерами использовани  монАТ BLV-p24-V1 дл  иммуноиндикации бел- Ki p 2 4.

Пример 1. Игтуноанализ в п тнах на нитроцеллюлозной мембране.

На вырезанные полоски нитроцел- люлознон мембраны с диаметром пор 0,45 мкм, величиной 5x5 мм нанос т 1 мкл белка р24 вируса лейкоза КРС в концентрации 0,1 мг/мл, высушивают и помещают в пупки полистироловой пластины дл  ИФА. Затем в лунки внос т 100 мкл блокирующего буфера, состо щего из ФБ, содержащего 3% альбумина сыворотки крови быка, инкубируют 30 мин при комнатной температуре, промывают ФБ и инкубируют с 50 мкл асцитной жидкости в разведении от 1:4 до 1:4096 в течение 2 ч при комнатной температуре во влажной камере. Затем промггоают ФБ и вторично инкубируют с блокирующим буфером на прот жении 30 мин при комнатной температуре . Затем в лунки внос т по 100 мкл конъюглта в разведении 1:1000 в блокирующем буфере, инкубируют 2 ч при комнатной температуре, отмывают и внос т по 100 мкл приготовленного субстрата о-дианизидина (0,5 мг/мл о-дианизидина, 0,5 М Трис-НС1, рН 7,5, 2 мкл/мл 30% НгПг). Реакцию останавливают дистиллированной водой.

Окрашивание оценивают визуально.

Результаты свидетельствуют о взаимодействии монАТ BLV-p24-V1 с очищенным белком р24 вируса лейкоза КРС. i

П р и м е р 2. Применение монАТ BLV-p24-V1 в методе Вестерн-блотнн- га.

Дл  проведени  иммунного блотинга 100 мг вирусного материала или 8 мкг белка р24 фракционируют в ДСКа- ПААГ в стандартной трис-глициновой системе. Электроперенос белков на нитроцеллюлозную мембрану (НМ) .с диаметром пор 0,45 мкм провод т при

10

75576

JO R л течение 1Н ч. После -жои- чани  ллектрофорезл гель вммлчтмют в течение 30 мин в биллетн.члиропанной поде. Дл  иммуноиндикацни ков на НМ используют иммуппфермент- ный метод. Дл  этого ММ просушивают и инкубируют в течение 2 ч при 37 С в блокирующем буфере (0,01 М трис- НС1, рН 7,5, 0,9% NaCl, 3% БСА). Затем НМ помещают в раствор с асцит- ной жидкостью в разведении от 1:4 до 1:4096 или в раствор очищенных монАТ. П качеств контрол  используjr ют., сыворотку здоровых мышей. НМ инкубируют при комнатной температуре в течение ночи. Затем отмывают в течение 1,5 ч при 37°С с отмывающим буфером (0,05% трис-HCl, рН 7,5 с

20 0,05 Твин-20, 3 мМ Na2 ЭДТА нО,25М NaCl ). Затем НМ помещают в конъюгат, разведенный блокирующим буфером 1:1000, и инкубируют в течение 1,5 ч при 37°С, после чего НМ отмывают

25 отмывающим буфером в течение 1,5 ч при 37°С, помепают в раствор субстрата о-дианнзнчина, как описано выше , инкубируют в темноте при комнатной температуре до по влени  окJQ раски.

С целью установлени  неспецифического перекрестного св зывани  монАТ в методе Вестерн-блотннга использованы следующие контрольные антигены: альбумин сыворотки криви КРС, гемоглобин сыворотки крови КРС, лизированные лимфоциты крови здоровых коров, антигены вируса герпеса КРС типа I, коммерческие препараты  щурного антигена.

Результаты свидетельствуют о том, что монАТ BLV-p24-V1 не св зывают с перечисленными антигенами. МонАТ высокоспецифично реагирует с белком

., р24 вируса лейкоза КРС.

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   Штамм гибридных культивируемых 5Q клеток животных Mus musculus ВСКК(П) 225 Д-продуцент моноклональных антител против белка р24 вируса лейкоза крупного рогатого скота.

   40