SU1571064A1 - Способ микроклонального размножени лиственницы - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к биотехнологии, а именно к микроклональному размножению ценных пород деревьев, и может примен тьс  в лесном хоз йстве. Целью изобретени   вл етс  повышение выхода размножаемых растений и ускорение процесса размножени . Способ состоит в том, что в культуру ввод т зимние апикальные почки диаметром не менее 3 мм и последующее культивирование осуществл ют в три этапа, при этом используют среды Литвей и Соммера со специфическими фитогормонными добавками. 6 табл.

Description

Изобретение относитс  к области биотехнологии , а именно к проблеме клональ- ного микроразмножени  лесных древесных растений дл  воспроизводства ценных хвойных пород в лесном хоз йстве.

Целью изобретени   вл етс  увеличение выхода размножаемых растений и ускорение процесса размножени .

Способ состоит в том, что в качестве исходных эксплантатов используют поко щиес  (зимние) апикальные почки не менее 3 мм в диаметре, которые ввод т в среду Литвей с добавлением 0,5-1,5 мг/л 6-БАП и 0,5-2,0 мг/л кинетина (среда 1) дл  инициации пазушных почек, после чего диски с пазушными почками перенос т на лишенную фитогормонов среду Соммера (среда 2) дл  формировани  конгломерата пазушных побегов с последующим разделением и субкультивированием на той же среде с уменьшенной вдвое концентрацией минеральных солей, содержащей 20-50 мг/л мочевины

(среда 3), дл  стимул ции удлинени  побегов .

Способ осуществл етс  следующим образом .

С одревесневших годичных побегов срезают черенки длиной 10-15 см, несущие апикальную почку диаметром не менее 3 мм. Сбор материала провод т в период с окт бр  по апрель Возможность хранени  одревесневших черенков в течение длительного времени под снегом, а также в холодильных камерах обеспечивает круглогодичное проведение работ Верхушечные части черенков отрезают, обмывают в слабом мыльном растворе и прополаскивают в проточной воде. Подготовленный таким образом материал стерилизуют сначала в течение 2 мин в 70%-ном водном растворе этилового спирта, затем 15 мин в 5%-ном водном растворе гипохлорита кальци  и трижды промывают стерильной дистиллированной водой В стерильных услови х (шкафу с ламинарным течением возсл С

сл

XI

о

С Јь

духа)удал ют покровные чешуи с верхушечной почки и выдел ют зачаточный побег, несущий меристему и листовые примордии. Изолированные эксплантаты помещают на агаровую питательную среду 1 в биологические пробирки или колбы. Среда 1 содержит минеральные соли, витамины, мезоинозит, а также 2% сахарозы, 0,6% агара и гормональные вещества: 6-бензиламинопурин (БАП) в концентрации 0,5-1,5 мг/л и кинетин 0,5-2 мг/л (табл.1). В течение 4-7 недель на этой среде (у 53-81% эксплантатов) происходит инициаци  пазушных почек, что выражаетс  в набухании исходной почки, разрастании ее в ширину и образовании светло-зеленого диска диаметром до 10 мм. Полученные таким образом диски перенос т на питательную среду 2, представл ющую собой модифицированную по минеральному составу среду Соммера, лишенную регул торов роста (табл.1). На этой среде в течение 4-5 недель происходит рост инициированных пазушных почек с образованием конгломерата коротких побегов длиной 1-3 мм (в среднем 16,7 побегов на 1 эксплантат). Сформированный конгломерат раздел ют под микроскопом и каждый побег помещают на среду 3,  вл ющуюс  ди- люированной вдвое по минеральному составу средой 2, к которой добавлена мочевина в концентрации 20-50 мг/л (табл.1). На этой среде происходит удлинение побегов , которые в течение 4-7 недель достигают длины 6-10 мм. Полученные таким образом побеги морфологически пригодны дл  стимул ции ризогенеза на укоренительных средах. Процесс клонировани  составл ет 85-130 дней от момента введени  эксплантатов в культуру до получени  удлиненных побегов.

В табл,1 представлены среды, используемые дл  клональной мультипликации ли- ственницы в культуре изолированных вегетативных почек in vitro.

П р и м е р 1. Растительный материал черенки длиной 15 см заготавливают в 3 срока: но бре, феврале, апреле с 20-23-летних деревьев лиственницы Сукачева различного географического происхождени  (30 клонов). Часть черенков, собранных в но бре и феврале, находитс  под снегом (5 мес) и в холодильнике при 3°С (2 мес), после чего их используют дл  вз ти  эксплантатов . Наиболее крупные апикальные почки (5-6 мм) после стерилизации и удалени  покровных чешуи культивируют последовательно на питательных средах 1, 2 и 3 со следующими оптимальными концентраци ми добавок: БАП 1,0 мг/л, кинетин 1,0 мг/л, мочевина 30 мг/л. Культуры выращивают на

светоплощадке при 16-часовом фотопериоде (освещение люминесцентными лампами 2000-500 лк) при 26°С днем и 22°С ночью. Продолжительность культивировани  на

каждой из сред варьируют в зависимости от клонов от 4 до 6 недель. Различи  в характере мультипликации в зависимости от сроков вз ти  и продолжительности хранени  черенков не  вл ютс  существенными

0 (табл.2). Средн   эффективность образовани  дисков с пазушными почками (инициаци  пазушных меристем) 75%, среднее число побегов на 1 эксплантат 18,7, а максимальное 25, средн   длина побегов после

5 удлинени  8,4 мм. Продолжительность процесса мультипликации 12-17 недель.

П р и м е р 2. Растительный материал черенки длиной 15 см заготавливают в но бре и апреле с 20-23-летних деревьев (20

0 клонов). Апикальные почки распредел ют наЗ группы по их размерам: мелкие(1-2 мм), средние (3-4 мм) и наиболее крупные (5-6 мм), затем культивируют отдельно при тех же услови х, что в примере 1. Результаты

5 приведены в табл.3.

Таким образом, дл  культивировани  целесообразно использовать почки размером не менее 3 мм.

П р и м е р 3. Растительный материал

0 черенки длиной 15 см заготавливают в но бре , феврале с 20-летних деревьев (20 клонов ). Культуры почек выращивают на среде 1 с различными концентраци ми гормональных веществ. В ходе экспериментовус5 тановлены предельные значени  и оптимальные концентрации.БАП и кинети- на. Результаты представлены в табл.4 и 5 соответственно.

П р и м е р 4. Растительный материал, как в примере 1. После культивировани  на средах 1 и 2 полученные множественные микропобеги отдел ют и субкультивируют индивидуально на среде 3 с различными концентраци ми мочевины с целью удлине5 ни . Экспериментально определены предельные значени  и оптимальные концентрации мочевины. Результаты представлены ниже.

Концентраци  мо-Средн   длина

0чевины, мг/лпобегов,мм

206,1

308,4

505.7

П р и м е р 5. Черенки длиной 10 см

5 заготавливают путем отстрела в 100-летних естественных насаждени х лиственницы Сукачева, принадлежащих к двум попул ци м (20 клонов). Через 5 дней после сбора апикальные почки диаметром 3-4 мм ввод т в культуру (после удалени  покровных чешуй ) и выращивают последовательно на питательных средах 1-3 с оптимальными концентраци ми добавок: БАП 1,0 мг/л, кинетин 1,0 мг/л, мочевина 30,0 мг/л. Культуры помещают в термосветоклиматокаме- ру при тех же услови х, что в примере 1, но освещенность поддерживают на уровне 25000 лк. Эффективность образовани  дисков варьирует между клонами и составл ет в среднем 55%, число формирующихс  по- бегов измен етс  от 13 до 14, а в среднем 8,3, средн   длина побегов к концу удлинени  6,2 мм. Продолжительность процесса мультипликации 16-18 недель.

Преимуществами изобретени   вл ют- с : возможность микроклонировани  взрослых элитных деревьев лиственницы (до 100 лет включительно), относ щейс  к числу наиболее ценных трудноразмножаемых хвойных пород; идентичность растений-ре- генерантов и донорского дерева по генотипу вследствие мультипликации, через пазушное побегообразование; высока  степень мультипликации (до 25 побегов на эксплантат ), ранее достигаема  только на лиственных древесных породах; эффективное удлинение побегов (до 6-10 мм); простота подготовки и хранени  растительного материала перед введением в культуру (отсутствие гормональной и прочей обработ- ки); быстрота процесса, занимающего от

момента введени  эксплантатов в культуру до получени  удлиненных побегов 85-130 дней; возможность круглогодичного проведени  работ.

Claims (1)

1. Формула изобретени  Способ микроклонального размножени  лиственницы, включающий посадку эксплантатов на питательную среду, культивирование, получение регенерантов и адаптацию их к услови м открытого грунта , отличающийс  тем, что, с целью увеличени  выхода размножаемых растений и ускорени  процесса размножени , в качестве эксплантатов используют поко щиес  апикальные почки диаметром 3 мм и более, а культивирование осуществл ют в три этапа, при этом на первом этапе - инициации морфогенеза пазушных п очек - культивирование ведут на среде Литвей, в которую ввод т дополнительно 6-бензила- минопурин в количестве 0,5-1,5 мг/л, и кинетин , в количестве 0,5/2,0 мг/л; на втором этапе - формирование пазушных побегов - культивирование ведут на среде Соммера без фитогормонов, на третьем этапе - удлинение побегов - культивирование ведут на среде Соммера с уменьшенным вдвое количеством минеральных солей, в которую дополнительно внос т мочевину в количестве 20-50 мг/л,

   Таблица 1

   Продолжение табл.1

   рН 5.6-5,8

   Эффективность образовани  дисков - отношение числа дисков к числу введенных в культуру эксплантатов, выраженное в %.

   Примечание: Концентраци  кинетина во всех вариантах 1 мг/.л.

   Таблица 2

   Продолжение табл.2

   Таблица 3

   Таблица 4

   1571064

   Примечание,

   (онцентраци  БАП во всех вариантах 1 мг/л.

   Таблица 5