SU1523570A1 - Способ получени карбоксипептидазы А из поджелудочной железы свиньи - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к способу получени  ферментного препарата карбоксипептидазы A (КПА) из поджелудочной железы свиньи, примен емого в белковой химии дл  структурных исследований. Цель изобретени  - повышение активности целевого продукта и упрощение процесса. КПА получают экстракцией сырь  0,005 М трис-HCL буфером при рН 7,5-7,6. Из полученного экстракта сульфатом аммони  при насыщении 0,64-0,66 и рН 7,5-7,6 выдел ют белковую фракцию, содержащую целевой продукт. Очистку КПА осуществл ют двукратной ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе, уравновешенной 0,005 М трис-HCL буфером при рН 7,5-7,6. Кристаллизуют из воды. Удельна  активность КПА 29,7-32,5 ед/мг белка. Выход по активности 31,5-32%.

Description

Изобретение относитс  к способам получени  ферментных препаратов, а именно карбоксипептидазы А.

Цель изобретени  - повышение активности целевого продукта и упрощение процесса.

Изобретение заключаетс  в том, что экстракцию сырь  (ацетоновый порошок поджелудочной железы свиньи) провод т 0,005 М трис-НС буфером при рН 7,5-7,6, из полученного экстракта сульфатом аммони  при насыщении 0,64-0,66 и рН 7,5-7,6 выдел ют белковую фракцию, содержащую целевой продукт, а очистку КПА осуществл ют двукратной ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе, уразновешен- ной 0,005 М трис-НС буфером при рН

7,5-7,6,и кристаллизуют фермент из воды.

Пример 1.0,7 кг свежезамороженных поджелудочных желез свиньи разрезают на кусочки 4-6 мм и оставл ют дл  автолиза при комнатной температуре на 24 ч. Полученную массу обрабатывают 4 раза ацетоном, затем смесью ацетона и эфира (в соотношении 1:1) и эфиром при интенсивном перемешивании в течение 1 мин, высушивают при комнатной температуре. Полумают l40 г ацетонового порошка.

Ацетоновый порошок перед экстракцией размельчают в лабораторной мельнице . l40 г ацетонового порошка размешивают с 1400 мл 0,005 М трис-НС буфера с рН 7,5 в течение 45 мин на

СП

to

оэ ел

магнитной мешалке при комнатной температуре . Осадок отдел ют центрифугированием при 6000 об/мин в течение 60 мин при C. Получают 1300 мл SKCTpaKta. рН экстракта довод т до рН 7,5 с помощью 1 М раствбра NaOH. К экстракту по порци м добавл ют сульфат аммони  до D,6V насыщени j п6ддер)кива  рН 7,5 Перемешивают 30 мин. -Выпайшуюбелкойую фракцию отдел ют центрифугированием при

6000 об/мин в течение tO мин и 3° С, суспендируют в ЗбО мл 0,05 И трис-ttCl буфера и подвергают диализу против 0,005 М трис-НС буфера с рН 7,5 до отсутстви  сульфата аммони . Осадрк, выпавший во врем  диализа, отдел ют центрифугированием в течение 30 мин при 6000 об /мин и | С и отбрасывают. Центрифугат используют дл  дальнейшей очистки.V .- ;

;.;/.,.. -, . .--

Хроматографи  проводитс  при С. На колонку размером .6x25 см, заполненную ДЭА;Э-целлюлозой, уравйовещеннрй 0,005 М трис-HGl буфером с рН 7,$ /: нанос т 40,0 мл раствора белка, полученного на стадии III со скоростью; течени  мл/ч. Через колонку пропускдюг 5л 0,005 М трис-HGl буфернрг .6 раствора с рН 7,5 дл  удалени  нёадсорбированных бел кс)в. КПА элюируют линейным градиентом концентрации : в одном сосуде 1 л О,005 М ТРИС-НС1 буфера с рН;,5, в другом 1 л 0,3 М натри  хлористого в 0,005 М трис-rHGl буфере с рН 7,5. Объедин ют фракции с удельной активностью КПЛ Ие менее 12 ед/мг белка. К об-ьединеннЫм фракци м с активностью КПА-добав- .Л ют сульфат аммоний; до О,б насыще- ни  и перемешивают 30 мин.; Осадок от- дел ют центрифугированием в течение 1 .4 при 6QOO обУмин И и раствор ют в мл 0,05 И трис-НС1 буфера С рН 7,5 Осадок, выпавший во врем  диализа, отдел ют центрифугированием и выбрасывают. Центрифугат в количестве 50 мл нанос т на колонку размером 2, 9x25 см, за пол неннук) ДЭАЭ - целлюлозой , уравновешенной 0,005 М трис- НС буфером с рН 7,5. Скорость течени  через колонку мл/ч. Через колонку пропускают 1 л 0,005 М трмс- НС1 буфера с рН 7,5 дл  удалени  побочных продуктов. Карбоксипептидазу А элюируют линейным градиентом концентрации: в одном сосуде 1л 0,005 М

трис-ИС1 буфера С рН 7,5, а в другом 1л 0,3 М натри  хлористого в 0,005 М трис-НС буфере с рН 7,5. Объедин ют фракции с удельной активностью- КПА не менее 16 ед/мг белка.

К элюату медленно по порци м добавл ют сульфат аммони  до 0,6 насыщени  и перемешивают 30 мин. Осадок

отдел ют центрифугированием при 6000 об /мин в течение 50 мин при С, раствор ют в 20 мл 0,05 М трисНС буфера с рН 7,5 и диализуют против 0,005 И трис-НС буфера с рН 7,5.

Осадок отдел ют Центрифугированием и выбрасывают.

ПОлу енный раствор КПА в 0,005 М тр ис-НС буфере с рН 7,5 диализу19т против воды дл  кристаллизации КПА. Выпавшие Кристаллы промывают Два раза водой, а:$атем раствор ют при рН 6,8 (рН доводитс  гидроокисью натри ) и отдел ют нёрастворившиес  примеси центрифугированием Лри 150000 об /мин В течение 3 мин. Полученный раствор КПА дйализуюТ: против воды пере кристаллизации КПА В образовавшуюс  суспензию кристаллов добавл ют толу0ла(0т объема суспензии).

:, Уде льна  активность 29,7 ,вд./мг белка; выход по активности 32.

П-р И М ер 2. Приготовление ацетонового порошка аналогично примеру 1.

T tO г. измельченного ацетонового порошка размешивают с 1400 мл 0,005 М

трис-НСГ/буфера с рН 7,5. Осадок отдел ют центрифугированием. Получают 1350 мл экстракта. рН экстракта довод т до 7,55 1 М раствором NaOH. К экстракту на холоду при 40°С

добавл )ют сульфат аммони  до 0,65 насыщени  при рН до 57,55. После центрифугировани  выпавшую белковую фракцию суспендируют в 0,05 Н трис-НС буфере с рН 7,55 и подвергают диализу против 0,005 М трис-ИС1 буфера с рН 7,55 flo Отсутстви  сульфата аммони . Диализат от стадии III нанос т на Колонку 6x20 см, заполненную ДЭАЭ-цел- люлозой, уравновешенной 0,005 М трисНС буфером 7,55 После отмывки колонки тем же буфером от неадсорбированных белк;ов КПА элюируют линейным градиентом концентрации: в одном сосуде 1 л 0,005 Н трис-HGl буфера с рН7,55,

а в другом 1 л 0,3 М натри  хлористого в 0,005 И трис-НС буфере с рН 7,55. Объедин ют фракцию с активностью КПА не менее 13 ед./мг белка. КПА из элю

эта осаждают сульфатом аммони  при 0,60 насыщении и рН 7,55, осадок отдел ют центрифугированием, суспендируют в 0,05 М трис-НС буфере с рН 7,55 и освобождают от солей диализом против 0,005 Н трис-НС1 буфера с рН 7,55. Получают мл диализата. Дл  дальнейшей очистки диализат нанос т на колонку 2,9x20 см, заполненную ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенной 0,005 М трис-НС буфером с рН 7,55. После промывки колонки этим же буфером КПД элюируют линейным градиентом концентрации: в одном сосуде 1 л 0,005 М трис-НС буфера с рН 7,55, а в другом 1л 0,3 М натри  хлорис- тог.о в 0,005 М трис-НС буфере с рН 7,55. Объедин ют фракции, имеющие

активность карбоксипептидазы А не ме- 20 нанос т на колонку 2,9x25 см с ДЭАЭ- нее 1б ед./мг белка. Из объединенной целлюлозой, уравновешенной 0,005 М

фракции сульфатом аммони  при насыщении 0,65 Н и рН 7,55 осаждают КПА. Осадок суспендируют в 20 мл 0,05 М трис-НС буфера с рН 7,55 и освобождают от сульфата аммони  диализом против 0,005 Н трис-НС буфера.

Полученный раствор КПА в 0,005 М трис-НС буфере с рН 7,55 диализуют против, воды дл  кристаллизации КПА. Выпавшие в процессе диаЛиза кристаллы промывают два раза водой, а затем раствор ют при рН 0,8 (рН доводитс  гидроокисью натри ) и отдел ют нера- створившиес  примеси центрифугирова- . нием. Полученный раствор КПА диализуют против воды дл  перекристаллизации КПА. В образовавшуюс  суспензию кристаллов добавл ют 4,5 % толуола.

Удельна  активность 32,5 ед./мг белка; выход по активности 31,5.

ПримерЗ. Ацетоновый порошок из поджелудочной железы свиньи приготавливают аналогично примеру 1.

г измельченного ацетонового порошка экстрагируют 1400 мл 0,005 i трис-НС буфера 7,6, После центрифугировани  получают 140) мл экстракта.

К экстракту при добавл ют сульфат аммони  до 0,05 насьцденного при рН 7,6. После центрифугировани  выпавшую белковую фракцию суспендируют а 0,05 М трис-НС буфере с рН 7,6 и подвергают диализу против 0,005 И трис-НС буфера с рН 7,6 до отсутстви  аммони .

Диализат от стадии III нанос т на колонку 6x25 см с ДЭАЭ-целлюлозой, уравновешенной 0,005 М трис-НС1 бу25

30

35

40

45

50

55

трис-НС1 буфером с рН 7,6. Колонку промывают тем же буфером, а элюирова- ние КПА провод т градиентом концентрацией 0,3 М натри  хлористого в 0,005 М трис-НС буфере с рН 7,6. Объедин ютс  фракции с удельной активностью КПА не менее 16 ед./мг белка . Из объединенной фракции сульфат аммони  при насыщении 0,66 и рН 7,6 осаждают КПА. Осадок суспендируют в 20 мл 0,05 М трис-НС буфера рН 7,6, диализуют против 0,005 М трис- НС буфера с рН 7,6 до отсутстви  сульфата аммони .

Полученный раствор КПА в 0,005 М трис-НС1 буфере с рН 7,6 диализуют против воды дл  кристаллизации КПА. Выпавшие кристаллы промывают два раза водой и затем раствор ют при рН 6,8 (рН доводитс  гидроокисью натри ) и отдел ют нерастворившиес  примеси центрифугированием. Полученный раствор КПА диализуют против воды дл  перекристаллизации КПА. Б полученную суспензию кристаллов добавл ют 5 толуола .

Удельна  активность КПА 30,2 ед./мг белка; выход по активности 31,8.

П р и М е р 4. Приготовление ацетонового порошка аналогично примеру 1

140 г измельченного ацетонового порошка экстрагируют l400 мл 0,005 М трис-НС буфера с рН 7,4. После центрифугировани  получают 1300 мл экстракта .

К экстракту при 4 С добавл ют; суль фат аммони  до 0,63 насьаиени  при рН 7,4, После центрифугировани  выпавшую

фером с рН 7,6. После отмывки колонки тем же буфером КПД элюируют линейным градиентом концентраций: в одном сосуде 1 л 0,005 И трис-НС буфера с

рН 7,6, а в другом 1 л 0,3 М ПаС1 в 0,005 М трис-НС буфере с рН 7,5, объедин ютс  фракции с удельной активностью КПД неменее 12 ед./мг. Из

Q полученной фракции КПА, освобожденную от основной массы побочных белков, осаждают сульфатом аммони  при 0,66 насьпцении и рН 7,6. Выпавший осадок КПД отдел ют центрифугированием, пендируют в 0,05 М трис-НС буфере с рН 7,6 и освобождают от солей диализом против 0,005 М трис-НС буфера с рН 7,6. Получают 50 мл диализата. Дл  дальнейшей очистки диализат

5

0

5

0

5

0

5

трис-НС1 буфером с рН 7,6. Колонку промывают тем же буфером, а элюирова- ние КПА провод т градиентом концентрацией 0,3 М натри  хлористого в 0,005 М трис-НС буфере с рН 7,6. Объедин ютс  фракции с удельной активностью КПА не менее 16 ед./мг белка . Из объединенной фракции сульфат аммони  при насыщении 0,66 и рН 7,6 осаждают КПА. Осадок суспендируют в 20 мл 0,05 М трис-НС буфера рН 7,6, диализуют против 0,005 М трис- НС буфера с рН 7,6 до отсутстви  сульфата аммони .

Полученный раствор КПА в 0,005 М трис-НС1 буфере с рН 7,6 диализуют против воды дл  кристаллизации КПА. Выпавшие кристаллы промывают два раза водой и затем раствор ют при рН 6,8 (рН доводитс  гидроокисью натри ) и отдел ют нерастворившиес  примеси центрифугированием. Полученный раствор КПА диализуют против воды дл  перекристаллизации КПА. Б полученную суспензию кристаллов добавл ют 5 то . луола.

Удельна  активность КПА 30,2 ед./мг белка; выход по активности 31,8.

П р и М е р 4. Приготовление ацетонового порошка аналогично примеру 1.

140 г измельченного ацетонового порошка экстрагируют l400 мл 0,005 М трис-НС буфера с рН 7,4. После центрифугировани  получают 1300 мл экстракта .

К экстракту при 4 С добавл ют; сульфат аммони  до 0,63 насьаиени  при рН 7,4, После центрифугировани  выпавшую

белковую фракцию суспендируют в 0,05 М трис-НС буфере с рН Т, и подвергают диализу против 0,005 М трис-НС1 буфера с рН 7, до отсутстви  сульфата аммони .

Диализат на стадии III нанос т на колонку 6x25 см, заполненную ДЭАЭ- целлюлозой, уравно1вешенной 0,005 М трис-НС1 буфером с рН 7,. После от- Q мывки колонки тем же буфером КПД элюируют линейным градиентом концентрации натри  хлористого 0,3 М в . 0,005 М трис-НС буфере с рН 7, 4. Объедин ют фракции с удельной актив- J5 ноетью КПД не менее 12 ед./мг белка. Из полученной объединенной фракции КПД осаждают сульфатом аммони  при 0,3 насыщении и рН 7,. Выпавший осадок КПД отдел ют центрифугированием, 20 после чего .суспендируют в 0,05 М трис-НС1 буфере с рН 7,6 и освобождают от солей диализом против 0,005 М трис НС буфера с рН 7,. Получают 5 мл диализата.25

Полученный диализат нанос т на колонку 2,9x25 см с ДЭДЭ-целлюлозой уравновешенной 0,005 И трис-НС1 буфером с рН 7,. Колонку промывают тем же буфером, а элюйрование КПД зО провод т градиентом концентрации 0,3 М.натри  хлористого в 0,005 М трис-НС1 буфере с рН 7Л Объедин ютс  фракции с удельной активностью КПД не менее 1б ед./мг белка.

Из объединенной фракции сульфатом аммони  при насыщении 0,63 и рН 7, осаждают КПД. Осадок суспендируют в 20 мл 0,05 М трис-НС буфера с рН 7,, диализуют против 0,005 М трис- дд НС буфера с рН 7, до отсутстви  сульфата аммони . ,

Полученный раствор КПД в 0,005 М трис-НС буфере с рН 7, диализуют против воды дл  кристаллизации КПД. д Выпавшие кристаллы промывают два раза водой и затем раствор ют при рН 6,8 и отдел ют нерастворйвшиес  примеси центрифугированием. Раствор КПД диализуют против воды дл  перекристалли- зации КПД. В полученную суспензию кристаллов добавл ют 3 толуола.

Удельна  активность КПД 20 ед./мг белка, выход 25.

П р и М е р 5. Приготовление ацетонового порошка аналогично примеру 1,

г измельченного ацетонов;ого порошка экстрагируют мл 0,005 М трис-НС буфера с рН 7,7. После цент-

35

0 5

О

д

5

рифугировани  получают 1350 мл экстракта .

К экстракту при °С добавл ют сульфат аммони  до О , 67 насыщени  при рН 7,7 После центрифугировани  выпавшую белковую фракцию суспендируют в 0,005 М трис-НС буфере с рН 7,7 и подвергают диализу против 0,005 М трис-НС буфера с рН 7,7 до отсутстви  сульфата аммони .

Диализат от стадии III нанос т на колонку 6x25 см с ДЭДЭ-целлюлозой, уравновешенной 0,005 М трис-НС буфером с рН 7,7. После отмывки колонки тем же буфером КПА элюируют линейным градиентом концентрацией 0,3 М натри  хлористого в 0,005 М трис-НС буфера рН 7,7. Объедин ютс  фракции с удельной активностью КПД не менее 12 ёд./мг белка.

Из полученной фракции КПД осаждают сульфатом аммони  при 0,67 насыщении и рН 7,7. Выпавший осадок КПД отдел ют центрифугированием, суспендируют в 0,05 М трис-НС буфере с рН 7,7 и освобождают от солей диализом против 0,005 Н трис-НС буфера с рН 7,7. Получают 52 мл диализата.

Дл  дальнейшей очистки диализат нанос т На колонку 2,9x25 см с ДЭАЭ- целлюлозой, уравновешенной 0,005 М трис-НС буфером с рН 7,7. Колонку промывают тем же буфером, а элюйрование КПД провод т линейным градиентом концентрацией 0,3 М натри  хлористого в 0,005 М трис-НС буфере с рН 7,7. Объедин ют фракции с удельной активностью КПД не менее 1б ед./мг белка.

Из объединенной фракции сульфатом аммони  при насыщении О,б7 и рН 7,7 осаждают КПД. Осадок суспендируют в 20 мл 0,005 Н трис-НС буфера с рН 7,7 и диализуют против 0,005 М трис- НС буфера с рН 7,7 до отсутстви  сульфата аммони .

Полученный раствор КПД в 0,005 М трис-буфере с рН 7,7 диализуют против ВОДЫ кристаллизацией КПД. Выпавшие кристаллы промывают два раза водой и затем раствор ют при рН 6,8 и отде - л ют нерастворившиес  примеси центрифугированием . Полученный раствор КПД диализуют против воды дл  перекристаллизации . 8 полученную суспензию кристаллов КПД добавл ют 6% толуола.

Удельна  активность КПД 22,6 ед./мг белка; выход 28,1%.

Таким образом, технико-экономический эффект предлагаемого способа заключаетс  в улучшении качества ферментного препарата карбоксипептидазы А, примен емой в белковой химии дл  структурных исследований, а также в упрощении технологического процесса за смет сокращени  числа стадий.

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   Способ получени  карбоксипептидазы А из поджелудочной железы свиньи, включашчий экстракцию ацетонового порошка трис-НС1 буфером, осаждение

   фермента сульфатом аммони , двукратную ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе в 0,005 М трис-НС1 буфере с градиентной элюцией хлористым натрием и последующей кристаллизацией из воды, о т л и ч а ю щ.и и - с   тем, что, с целью повышени  активности целевого продукта и упрощени  процесса, экстракцию, осаждение фермента и хроматографию ведут в 0,005 М трис-НС буфере рН 7,5-7,6, осаждение провод т при насыщении сульфата аммони  0,64-0,66, а элюцию с ДЭАЭ-целлюлозы ведут градиентом хлористого натри  0-0,30 М.