SU1474550A1 - Способ определени активности фосфолипазы А. - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к медицине и предназначено дл  определени  активности фосфолипазы А. Цель - повышение чувствительности и ускорение способа. Измер ют скорость изменени  поверхностного потенциала на бислойной мембране при ферментативном гидролизе методом автоматической компенсации внутримембранного электрического пол , которую регистрируюут по отсутствию второй гармоники емкостного тока. 3 ил.

Description

1

Изобретение относитс  к способам определени  активности фосфолипазы А и может быть использовано в медицине и биологии, например, дл  определени  активности панкреатической фосфолипазы при диагностике заболеваний поджелудочной железы.

Цель изобретени  - повышение чувствительности , ускорение способа и возможность измерений активности в присутствии примесей в исследуемом образце путем измерени  разности поверхностных потенциалов бислойной липидной мембраны дл  определени  скорости ферментативного гидролиза.

На фиг. 1 - 3 приведены графические зависимости.

Пример 1. Построение калибровочной кривой дп  коммерческого препарата фосфолипазы А фирмы Калбио- хем (ФРГ).

Ячейку заполн ют раствором 100 мМ КС1, 20 мМ имидазола, рН 8,9. Бислойные липидные мембраны формируют из раствора  ичного фосфзтидил- холина в декане, В  чейку добавл ют ЭДТА (до концентрации 0,2 мМ, Р оба отсека  чейки), через 2 мин - раствор фосфолипазы, через 2 мин - хлористый кальций (до концентрации 5 мМ, в оба отсека  чейки).

Результаты показаны на фиг. 1-3.

За единицу активности фермента принимают такую активность, при которой за 1 мин образуетс  1 кМ жирных кислот. По калибровочным кривым, построенным дл  препарата известной активности, можно определ ть активность неизвестного препарата.

Величина фосфолипазнои активности может быть определена по формуле, основанной на электрохимической модели,

W AVVC ,

где V - скорость изменени  поверхностного потенциала (В/с) на начальном участке (фиг. 1); ,4 К) ; С - концентраци  Фонового этектролиС

tnaA

1

01

сд

та j W - активность фосфолипазы (количество моль жирных кислот, образующихс  за 1 с на 1 м1 мембраны).

Пример 2, Определение фос- фолипазной активности панкреатического сока.

Измерени  провод т так же, как и при построении калибровочной кривой (пример 1), но мембрану формируют из азолектина, а вместо фосфолипазы добавл ют 10 мкл панкреатического сока человека, полученного при зондировании протока поджелодучной железы. Кинетика изменени  поверхностного потенциала показана на фиг. 1. Величина активности, рассчитана по наклону начального участка кривой, 4 мВ/мин Тдл  данных условий)

W 3.I

.

Такое же значение получаетс  при проведении анализа в присутствии желчи (на 10 мкл панкреатического сока добавл ют 10 мкл желчи).

Использование бислойной липидной мембраны в качестве субстрата и применение метода автоматической компенсации внутримембранного пол  дл 

0

5

0

5

0

измерени  поверхностного потенциала этой мембраны позвол ет создать метод определени  активности фосфолипазы А в растворе. Предлагаемый способ имеет более высокую точность и чувствительность, чем известный не требует тщательной очистки препарата и реагентов, может быть использован дл  измерений в присутствии примесей, позвол ет проводить анализ быстро и с малым количеством образца.

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   Способ определени  активности фосфолипазы А в растворе путем измерени  скорости изменени  поверхностного потенциала на бислойной липидной мембране при ферментативном гидролизе отличающийс  тем, что, с целью повышени  чувствительности, ускорени  способа и возможности измерени  активности в присутствии приме- сей, измерение поверхностного потенциала осуществл ют методом автоматической компенсации внутримембранного электрического пол , регистрируемой по отсутствию 2-й гармоники емкостного тока.

   W

   72J

   Концентраци  фосфолипазы, усл. ед.

   Фив. 2

   MS/HUH

   0.5

   0.254

   0.30.8

   Концентраци , ml мл

   0.9