SU1472502A1 - Способ получени бактериальной холинэстеразы - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к микробиологической промышленности, а точнее к технологии получени  внеклеточной бактериальной холинэстеразы. С целью упрощени  способа и повышени  чувствительности к ингибитору-эфиру карбаминовой кислоты - прозерину в качестве продуцента холинэстеразы используют культуру PSEUDOMONAS AURANTIACA КМ-875, которую выращивают на жидкой аэрируемой среде, содержащей ацетилохолин в качестве индуктора, с последующим выделением конечного продукта и оценкой чувствительности фермента к ингибитору-прозерину в концентрации 10^-6 М. Преимущество предложенного способа заключаетс  в том, что полученна  бактериальна  внеклеточна  холинэстераза гидролизует ацетилтиохолин и ингибируетс  прозерином (в концентрации 10^-6М) за 30 мин, т.е. полученный целевой продукт имеет чувствительность к прозерину на 3-4 пор дка выше, чем у фермента, получаемого известным способом. 3 табл.

Description

1

Изобретение относитс  к микробиологической промьшшенности, а точнее к технологии получени  внеклеточной бактериальной холинэстеразы.

Цель изобретени  - упрощение способа и повышение чувствительности к ингибитору - эфиру карбаминовой кислоты прозерину.

Сущность изобретени  заключаетс  в том, что в качестве продуцента хо- линэстеразы используют культуру Pseudomonas aurantiaca-875 из Всесоюзной коллекции микроорганизмов (БКМ),.

в качестве антихолинэстеразного вещества используют прозерин (эфир карбаминовой кислоты) в концентрации 10 М. Антихолинэстеразную актив-г , ность соединений выражают величиной р1 50, котора  соответствует отрицательному логарифму мол рной концентрации вещества, вызывающей угнетение холинзстеразы на 50%.

Пример 1. Процесс получени  внеклеточной бактериальной холинэсте- разы, чувствительной к прозерину

4

1С

СП

о to

3147

(простигмину) провод т следующим образом .

Культивирование продуцента Pseudo- monas aurantiaca ВКМ-875 осуществл - ют в услови х аэрации на питательной среде следующего состава, (%): фруктоза 0,8; калий фосфорнокисльш двух-- замещенный 0,1; калий фосфорнокислый однозамещенный 0,1; магний сернокис- лый 0,03; кальций хлористый 0,01; .натрий хлористый 0,01; дрожжевой экстракт 0,05; аммоний фосфорнокислый двухзамещенный 0,2 (по азоту);.ацетил- холин 0,2 при значении рН среды рав- ном 7 - 7,2. Инокул т внос т в расчете 10% по объему. Выращивание провод т в 700 мл колбах с 50 мл среды на качалке при t 28 С в течение 72-86 ч. Выросшую биомассу отдел ют центрифУ гированием. В супернатанте определ ют

активность холинэсте азы по ацетилти- охолину в качестве субстрата и чувствительность к прозеринуо Выбор продуцента внеклеточной холинэстеразы провод т в три этапа. На первом этапе культуру бактерий выращивают на м сопептонном агаре (МПА) с добавлением 0,2% ацетилхолина в течение 24 ч. Выросшие клетки суспендируют в буфере и определ ют эстеразную активность по скорости гидролиза индофе- нил ацетата (ИФА). Активность фермента клеток выражают в условных единицах-минутах , необходимых дл  перехода неокрашенного субстрата ИФА в окрашенный продукт индофеноло

Эстеразна  активность клеток исследованных продуцентов приведена в табл.1.

Таблица 1

В качестве возможных продуцентов холинэстеразы отбирают культуру, клетки которых гидролизуют ИФА не более, чем за 2-3 мин. На 2-м этапе выбор продуцента провод т по эстеразной активности фермента нативного раствора после отделени  клеток центрифугированием . Выращивание отобранных на

1 этапе продуцентов провод т на м сопептонном бульоне (МПБ) с добавлением 0,2% ацетилхолина в колбах, на качалке при в течение 72 ч. Клетки отдел ют центрифугированием, активность фермента измер ют по скорости гидролиза ИФА и ацетилтиохоли- на.

Как следует из приведенного примера ., синтез внеклеточной холинэсте- разы начинаетс  в конце первых суток и продолжаетс  в течение четырех последующих , Макси альную активность наблюдают к 96 ч роста культуры.

Определ ют чувствительность синтезированной холинэстеразы к эфиру карбаминовой кислоты (йрозерину), Ве- пичина р lyj равна 6,0

50

Преимущество предлагаемого способа заключаетс  в том, что полз енна  бактериальна  внеклеточна  холинэсте- раза гидролизует ацетилтиохолин и ин- гибируетс  прозерином в концентрации 10 М за 30 мин, т.е. полученный це- gg левой продукт имеет чувствительность к эфиру карбаминовой кислоты (прозе- рину) на 3-4 пор дка вьше, чем у фермента , получаемого изве стньм способом .

7 , 14725028

Claims (1)

1. Формула и зобретени с последующей оценкой чувствительСпособ получени  бактериальнойности фермента к ингибитору прозерихолинэстеразы , предусматривающий куль-ну, отличающийс  тем,

   тивирование продуцента на жидкойчто, с целью упрощени  способа и поаэрируемой питательной среде, содер- вьшени  чувствительности к прозерижащей ацетилохолин в качестве индук-ну, в качестве продуцента используют

   тора, выделение конечного продуктаPseudomonas aurantiaca БКМ-875.