SU1472499A1

SU1472499A1 - Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS, используемый дл получени моноклональных антител к интерлейкину-2 человека

Info

Publication number: SU1472499A1
Application number: SU874297479A
Authority: SU
Inventors: Юрий Анатольевич Овчинников; Виталий Евгеньевич Лунев; Владимир Андреевич Несмеянов; Наталья Владимировна Казенных; Сергей Васильевич Беляев; Александр Юрьевич Циманис; Людмила Викторовна Оноприенко; Инесса Ивановна Михалева
Original assignee: Институт биоорганической химии им.М.М.Шемякина
Priority date: 1987-08-14
Filing date: 1987-08-14
Publication date: 1989-04-15

Abstract

Изобретение относитс к области иммунологии и биотехнологии. Цель изобретени - создание нового более доступного штамма гибридных клеток - продуцента моноклональных антител (МА) к интерлейкину-2 человека, обеспечивающего более высокий уровень биосинтеза МА с высокой константой св зывани . Штамм гибридных клеток ЛНКБ-2 получен от сли ни миеломных клеток X63 AG 8 653 со спленоцитами мыши, иммунизированной препаратом рекомбинантного интерлейкина-2. Сли ние провод т полиэтиленгликолем 4000, содержащим 10 об.% диметилсульфоксида. Штамм депонирован под номером ВСКК(П) N 128Д. Концентраци МА в культуральной жидкости 75 мкг/мл, в асците 8 мг/мл. Константа св зывани антител с 1L2 составл ет 3^.10⁸ М^-1. МА, продуцируемые штаммом, св зываютс как с гликозилированным, так и рекомбинатным интерлейкином-2, а также пептидом, соответствующим последовательности аминокислот интерлейкина-2 человека 59-72. Получаемые МА вл ютс иммуноглобулинами класса G2B. МА используют дл определени интерлейкина-2 в биологических жидкост х и бактериальных лизатах.

Description

31472499

напором среду. Клеточную суспенны в а в о в 10

зию перенос т в пробирку и позвол ют неразбившимс комочкам клеток рсесть в течение 2-3 мин. Клеточную суспензию декантируют в другую пробирку и центрифугируют (200 xg, 10 мин) при комнатной температуре. Затем 30X10 селезеносных клеток мыши и 6 «10 миеломных клеток )бЗ Ag 8 653

смешивают в пробирке и промывают средой RPMI-1640t Надосадочную жидкость осторожно удал ют и при помешивании к клеточному осадку медленно, по капл м, в течение 30 с добавд ют 1 мл |5 50%-ного раствора полиэтиленгликол 4000 с 10% по объему диметилсульфок- сида в среде RPMI-1640, Через одну минуту дл разбавлени полиэтилен- гликол по капл м приливают 10 мл 20 KPMI 1640, Клетки оставл ют на 10 мин при комнатной температуре, затем цен-; трифугируют (200 xg, 10 мин). Надосадочную жидкость декантируют, к осадку добавл ют 40 мл RPMI 1640, со- 25 держащей 10% эмбриональной тел чьей сыворотки (ЭТС), суспендируют клетки пипетированием и клеточную суспензию распредел ют в четыре 96-луночные плашки, в которые за день до сли ни 30 высаживают мышиные перитонеальные клетки (5/10 клеток на лунку). На следу-I ющий день в лунки плашки внос т по 100 мкл среды, содержащей М

Концентраци специфических иммуно глобулинов в культуральной жидкости более 75 мкг/мл, в асцитной жидкое-, ти - 5 - 10 мг/мл.

Характеристика полученного продук та. Штамм продуцирует Ig G субкласса 2Ь, В твердофазном иммуноферментном анализе антитела взаимодействуют с препаратами IL 2 из линии .Jurkat, рекомбинантного IL 2 и синтетическим пептидом,соответствующим последова- ..тельности аминокислот 59-72 интерлей кина 2 человека.

Стабильность продуцировани антител сохран етс на прот жении 25 пас сажей в культуре,

Криоконсервирование,

Среда дл замораживани - 90% ЭТС 10% ДМСО, Плотность клеток к10 кл/мл. Ампулы с клетками в пенопластовой коробке вьщерживают при минус - 70°С в течение суток и перенос т в дюары с жидким азотом. Режим

о

гипоксантина, 8х10 М 3,2к10 М тимидина. Клоны гибридных клеток станов тс заметными через 7- 10 дней. Тестирование клонов провод т, когда клетки заполн ют лунку на 20%, Положительные культуры клонируют методом лимитирующих разведений при плотности 0,1-1 Клетка на лунку.

Полученный штамм обозначен ЛНКБ-2„ Он депонирован под номером ВСКК(П) № 128Д и характеризуетс следунщими признаками,

Культуральные признаки,

Стандартные услови культивировани : среда RPMI-1640, 300 мг/мл L- глютамина, 10% ЭТС, М меркап- тоэтанола. Температура ,

При суспензионном культивировании клетки слабо прикреплены к субстрату или располагаютс свободно. При посевной плотности 1 кл/мл через 3-5 дней плотность достигает З кл/мл. Кратность рассева 5-.. Ш раз.

отогрева - вод на бан при 37 С,

аминоптерина и эс Жизнеспособность клеток после крио- . консервировани 40% по окрашиванию с трипановым синим.

40

45

50

55

Контаминаци , Контаминации отсутствуют .

Использование штамма иллюстрируетс следующими примерами.

Пример 1, Йммуноферментный . анализ моноклональных антител ЛНКБ-2

Образцы, содержащие антитела (су- пернатанты клеточных культур или ас- цитна жидкость), тестируют методом .твердофазного иммуноферментного анализа по св зыванию с препаратами IL 2 из клеточной линии Jurkat (удельна активность 8, ед,/мг белка), рекомбинантного IL 2, пептидом , соответствукщим последовательности аминокислот 59-72 IL 2 человека , В л унки 96-луночной планки внос т препарат IL 2 (50 нг на лунку) или пептид (500 нг/лунку) в 0,05 М -бикарбонатном буфере рН 9,6 и остав- -п ют на 18 ч при 4 С, Плашку отмыва5 0 5 0

Культивирование в организме животных . Гибридные клетки прививают и выращивают в виде асцита в пбритоне- альной полости мышей линии BALB/c, За 7 дней до введени клеток мышам ввод т по 0,5 мл пристана. Асцит образуетс через 10-14 дней после введени 2-5 млн, клеток, 0 Продуктивность штамма.

Концентраци специфических иммуноглобулинов в культуральной жидкости более 75 мкг/мл, в асцитной жидкое-, ти - 5 - 10 мг/мл.

Характеристика полученного продукта . Штамм продуцирует Ig G субкласса 2Ь, В твердофазном иммуноферментном анализе антитела взаимодействуют с препаратами IL 2 из линии .Jurkat, рекомбинантного IL 2 и синтетическим пептидом,соответствующим последова- ..тельности аминокислот 59-72 интерлей- кина 2 человека.

Стабильность продуцировани антител сохран етс на прот жении 25 пассажей в культуре,

Криоконсервирование,

Среда дл замораживани - 90% ЭТС, 10% ДМСО, Плотность клеток к10 кл/мл. Ампулы с клетками в пенопластовой коробке вьщерживают при минус - 70°С в течение суток и перенос т в дюары с жидким азотом. Режим

о

отогрева - вод на бан при 37 С,

0

5

0

5

Контаминаци , Контаминации отсутствуют .

Пример 1, Йммуноферментный . анализ моноклональных антител ЛНКБ-2.

Образцы, содержащие антитела (су- пернатанты клеточных культур или ас- цитна жидкость), тестируют методом .твердофазного иммуноферментного анализа по св зыванию с препаратами IL 2 из клеточной линии Jurkat (удельна активность 8, ед,/мг белка), рекомбинантного IL 2, пептидом , соответствукщим последовательности аминокислот 59-72 IL 2 человека , В л унки 96-луночной планки внос т препарат IL 2 (50 нг на лунку) или пептид (500 нг/лунку) в 0,05 М -бикарбонатном буфере рН 9,6 и остав- -п ют на 18 ч при 4 С, Плашку отмыва1472499

ют 0,1%-ным раствором твина-20 в 0,01 М натрийфосфатном буфере, содержащем 0,15 М NaCl (ФСБТ), рН 7,2, и инкубируют с 200 мкл 1%-ного раствора бычьего сывороточного альбумина (БСА.) в течение 1 ч при З7 с. Плашку снова отмывают ФСБТ и внос т в лунку по 100 мкл препарата, содержащего антитела. После инкубации в течение ig одного часа при 37°С плашки отмывают ФСБТ и обрабатывают раствором антител к иммуноглобулинам мыши, конъюги- рованных с пероксидазой хрена

ствии додецилсульфата натри . Выход 70 мг на 1 л культуральной жидкости. При получении иммуноглобулинов из асцитной жидкости гибридные клетки прививают и выращивают в перитоне- альной полости мьшей линии BALB/c. За 7 дней до инъекции клеток мышам ввод т внутрибрюшинно по 0,5 мл пристана. Асцитную жидкость забирают через 14 дней после введени 4 к клеток на мышь.С одной мыши получают 6 мл асцитной жидкости. После отделени клеток центрифугированием

(100 на лунку, разведение 1:1000, 15 (400 xg) асцитную жидкость разбавл - 1 ч ). Плашку еще раз отмывают ют до концентрации белка 10 мг/мл и

и внос т 100 мкл раствора орто -фени-провод т высаливание 40%-ным сульфатом аммони (2,4 г сульфата аммони на 10 мл разбавленного асцита). Осалендиамина (1 мг/мл) в 1%-ном цитрат- ном буфере (рН 4,5), содержащем

0,05% Н20. Реакцию останавливают через 15 мин добавлением 100 мкл на лунку раствора 2М серной кислоты. Отрицательным контролем служат лунки плашки, не содержащие IL 2, а также

20 ДОК отдел ют центрифугированием (10000 xg, 30 мин)5 раствор ют в ФСБ, рН 8,2 и диализуют против этого же буфера. Дальнейшую очистку провод т

. - - -. - ---на протеин А-сефарозе по описанной

лунки,.в которые вместо антител кIL 2 25 схеме. Выход гомогенного цо данный внос т нормальный иммуноглобулин мыши. электрофореза в полиакриламидном геПример 2. Получение и очистка ле иммуноглобулина составл ет 5 мг моноклональных антител.из 1 мл асцитной жидкости.

Получение и очистка ЛНКБ-2 анти-Определение концентрации ЛНКБ-2

тел из культуральной и асцитной жид- зо антител в культуральной и асцитной

жидкост х.

в лунки 96-луночной плашки внос т по 250 нг кроличьих антител к Ig G мыщи в 0,05 М бикарбонатном буфере, 2g рН 9,6 и инкубируют 18 ч при 4°С. Лунки плашки, отмывают ФСБТ и инкубируют с 200 мкл 1%-ного раствора бычьего сывороточного альбумина (I ч, 37 С). .После отмывки лунок ФСБТ 40 по плашке раститровывают образцы

(100 мкл), содержащие моноклональные антитела, и инкубируют в течение 1 ч при 37 С, затем лунки плашки отмыва- ,- -- -----..- К)т ФСБТ и внос т 100 мкл кроличьих

4В:-культуральную жидкость (200 мл), 5 антител к Ig G мыши, меченных пер- РН которой довод т до 8,2, нанос т оксидазой хрена. Далее ИФА провод т на колонку объемом 5 мл. Колонку про- как описано в примере 1. в качестве

кости.

Гибридные клетки наращивают в пластиковых матрасах в среде, RPMI 1640, содержащей 10% ЗТС, 300 мг/л L-глутамина и 51(10- М меркаптоэтано- ла.При посевной плотности 5х 10 кл/мл через п ть дней плотность достигает l.xio кл/мл. Культуральную жидкость с максимальной продукцией иммуноглобулинов (75 мкг/мл) получают от клеток в стационарной фазе роста (седьмой день). Очистку иммуноглобу- линов провод т на протеин А-сефарозе

мывают 0,01 М натрийфосфатным буфе-с ром, содержащем 0,15 М хлористого натри (ФСБ), рН 8,2, и элюируют специфически адсорбировавшийс иммуноглобулин 0,1 М цитратом натри с 0,15 М NaCl, рН 3,5. Элюат сразу нейтразируют 1М раствором трис-НС1, рН 8,1. Раствор иммуноглобулинов концентрируют до 3 мг/мл и диализуют против ФСБ, рН 7,2. Иммуноглобулин гомогенен по данным электрофореза в 10% полиакриламидном геле в присутстандарта используют нормальные мышиные иммуноглобулины. Концентраци моноклональных антител в культуральной жидкости составл ет 75 мкг/мл. Концентраци иммуноглобулина в асцитной жидкости составл ет 8 мг/мл.

Определение константы св зывани МЛ ЛНКБ-2 с IL 2 и с пептидом, соответствующим последовательности аминокислот 59-72 IL 2 человека.

Константу св зывани определ ют с помощью ИФА по уравнению К

1472499

(400 xg) асцитную жидкость разбавл - ют до концентрации белка 10 мг/мл и

стандарта используют нормальные мышиные иммуноглобулины. Концентраци моноклональных антител в культуральной жидкости составл ет 75 мкг/мл. Концентраци иммуноглобулина в асцитной жидкости составл ет 8 мг/мл.

1/(4 МАВ -2М,А.В), где МАВ - концентраци антител, соответствующа 50% св зыванию от максимального, МАВ - концентраци антител, соответствук ца 5.0% св зыванию от максимального в случае нанесени на плашку вдвое меньшего количества антигена На лунку плашкн нанос т cooTBeTctseHHO 100 и 50 нг IL 2 или 500 и 250 нг пептида 59-72, ИФА провод т как в примере 1. Константа св зывани антител с IL 2 составл ет , а с петидом М ,

Пример 3, Взаимодействие моноклональных антител ЛИКБ-2 с пептидом, соответствующим последова тельности аминокислот 59-72 2 человека ,

Пептид Leu-Glu-Glu-Glu-Leu-Lys- -Pro-Leu-Glu-Glu-Val-Leu-Asn-Leu, соответствующий последовательности 59 -72 интерлейкина 2 человека, получен классическими методами пептидного синтеза в растворе. Гомогенность конечного продукта доказана аминокислотным анализом, тонкослойной хроматографией , н-ЯМР спектрами,

Взаимодействие ЛНКБ-2 антител с пептидом 59-72 провер етс в твердо-, фазном конкурентном иммуноферментном анализе. На плашЛу нанос т IL 2 (100 г/лунку).в 0,05 М бикарбонатном буфере с рН 9,6 в течение 18 ч при 4°С. После промывки и пассивировани плакки (пример 1) в лунки внос т 100 мкл раствора антител (5 мкг/мл) в ФСБ с 1%-ным БСА и пептидом в две- ичных разведе.ни х, т.е. провод т конкуренцию антигена, иммобилизован- ного на плашке, с пептидом в растворе за св зывание с антителами ЛНКБ- 2). ИФА далее провод т, как в примере 1. П тидес типроцентное ингибиро- вание св зывани антител с IL 2 наблюдаетс при концентрации пептида 0,5-мкг/мл.

Таким образом, ЛНКБ-2 антитела специфически узнают последовательность аминокислот 59-72 IL 2 человет ка.

Пример 4, Использование мо-ч. ноклональных антител ЛНКБ-2 дл опре,п делени IL 2.

Культуральный супернатант (1,5 л), полученный в результате-ст имул ции

10

15

20

25

30

35

40

5

0

5

клеток линии Jurkat (2vlO кл/мл) конканавалином А (20 мкг/мл) и 4/з- -форбол-12р-миристат- 3W-ацетатом (10 нг/мл), концентрируют ультрафильтрацией до объема 150 мл и высаливают сульфатом аммони (84 г). Осадок раствор ют в 5 мл 0,01 М фосфатного буфера, содержащего 0,15 М хло- ристого натри и 0,1% полиэтиленгли- кол 6000, рН 7-,2 (ФСБП), и нанос т на колонку (2, см) с ультрагелем АсА 54. Активные фракции объедин ют, нанос т на колонку с голубой сефаро-- ЗОЙ CL - 6В (10 мл) и колонку промывают ФСБ. Сорбировавшиес белки ,элюируют градиентом хлористого натри ;от 0,15 до 1 М.

После проведени гельфильтрации и делени на голубой сефарозе каждую фракцию тестируют в биологическом тесте (в разведении 1:10) и в твердофазном иммуноферментном анализе (100 мкл из каждой фракции внос т в плащку, далее пример 1). Биологическую активность IL 2 определ ют с помощью IL 2 - зависимой линии цито- токсических Т-лимфоцитов ыши. Уровень пролиферации оценивают путем окрашивани клеток 3-(4,5-диметил- тиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий- бромидом. Количественную оценку ocyw -. ществл ют сравнением тестируемых образцов IL 2 с международным стан- дартом (BRMP Reference reagent, 13, ЫО ед../мг),

Иммуноферментное и биологическое тестировани дают одинаковые профили элюировани IL 2,

Таким образом, использование штамма гидридных клеток ЛНКБ-2 позвол ет получить моноклональные антитела к IL 2 человека; штамм-продуцент вл -. етс более продуктивным (на 33%), чем известные; продуцируемые этим штаммом МА отличаютс от известных более высокой константой св зывани и дп них установлен участок св зывани на молекуле-IL 2.

Claims

Формула изобретени

Штамм гибридных культивируе « 1х клеток животных Mus musculus BCKK(II) № 128Д, используемый дл получени моноклональных антител к интерлей- кину-2 человека.