SU1423551A1 - Способ получени фруктозодифосфатальдолазы - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к энзимологии , точнее к вьзделению ферментов, и предназначено дл  научной и лабораторной практики при изучении роли фруктозодифосфатальдолазы в иммунитете при холере и дл  использовани  фруктозодифосфатальдолазы как возможного компонента противохолерной вакцины . Цель изобретени  - повьш1ение степени очистки. Дл  этого холерные вибрионы инактивируют 6-кратным замораживанием-оттаиванием , центрифугируют . Провод т механическую дезинтеграцию клеток со стекл нным песком, экстрагируют гомогенат 0,005 М трис- НС1-буфером рН 7,6, снова центрифугируют . Затем провод т дробное фракционирование , осадок раствор ют и диали- зуют против 0,005 М трис-НС1-буфера рН 7,6, провод т ионообменную хроматографию - очистку на ДЭАЭ-целлкшозе при элюции линейным градиентом 0,5 М NaCl рН 7,6, Полученные порции элюата спектрофотометрируют при А 280 нм и стро т хроматографический профиль. Полученные 5 пиков излучают на ферментативную актцрность. Фруктозоди- фосфатальдолазной активностью обла- . дают 4-й и 5-й пики, которые объедин ют и изучают на антигенные и имму- ногенные свойства. (/)

Description

Изобретение относитс  к энзимоло- гии, а именно к выделению ферментов, и может быть использовано в научной к лабораторной практике дл  изучени  роли фруктозодифосфатальдолазы в иммунитете при холереJ а также использование как возможного ко.тонента :противохолерной вакциныо i Цель изобретени  - повышение сте- |пени очистки,

I Пример. Культуру холерных |вибрионов классического биовара, сер iBapa Инаба, штамм 569В выращивают в течение 8-10 ч в 250-литровом ре- акторе-ферментере в услови х аэрации при 34-36 С глубиннь м методом на бульоне из ферментативного гидроли- зата кд:зеина рН 8,0, содержащего 200 мг% аминного азота 2% пептона, 0,5% NaCl, 0, 2-замещенного фосфата натри  Культивирование вибрионов пр.одолжают до концентрации 155-65 млрд, микробных клеток в, 1 мл |(в соответствии с регламентом произ- |водства холерной вакцины Холероген- натоксин + О - антиген), перенос т всидкую реакторную культуру в объеме |2з5 л в стекл нную бутыль, емкостью Зли помещают в низкотемпературный колодильник дл  замораживани . Заме- заживание провод т при -25°С в тече ние 48 ч (в низкотемпературном холо- ,щльнике Грюнланд ГДР, модель 1-12,5/0,1), оттаивание при комнат- |ной температзфе в течение 30 ч. Пос- |ie окончани  шестикратного цикла за- Ьюраживани -оттайвани  и постановки гестов на жизнеспособность вибрионов Ьультуральную ЖРЩКОСТЬ центрифугиру- tor с целью вьщелени  вибрионов из Ьреды при 6000g в течение 30 мин на Центрифуге ЦЛР-1 Надосадок отбрас№ бают, осадок клеток в объеме 120 мл йеренос т в фарфоровую ступку, соедин ют с равным объемом стекл нного йеска и растирают в течение 20 мин, Йо окончании процедлэы в ступку внос т рабочий буфер (0,005М.трис-НС1« :рН 7,6) в объеме 240 мл перемешиваю дают стекл нному песку осесть и над осадочную жидкость (360 мл) перенос  :Ь центрифужные стака1ли Клеточный экстракт центрнф5пгируют при 6000g в течение 30 мин дл  удалени  фрагментов разрушенных клеток. После центри фугировани  надосадок в объеме 350 мл йеренос т в колбу, осадок, состо щий тз разрушенных клеток вибрионов, от

..

0

0

5

брасывают. Бесклеточный экстракт насыщают сернокислым аммонием вначале до 30% путем внесени  в колбу с экстрактом сухой сот.и из расчета 180 г/л, раствор ют перемешиванием и центрифугируют дл  отделени  образовавшегос  осадка при 6000g в течение 20 мин. После этого надосадочную жидкость (350 мл) перенос т в колбу (осадок 40 мл,, содержащий балластные вещества , отбрасывают) и вновь насыщают сульфатом аммони  до 100% (от 30 до 100%) из расчета 510 г/л, раствор ют C внесенную соль (178,5 г) перемещива- нием и центрифугируют с целью отделени  осадка при 6000g в течение 20 мин. Надосадочную жидкость отбрасывают , осадок в объеме 30 мл, содержащий фермент, помещают в диализатор и диализуют против рабочего, буфера в течение 24 ч. При обессоливании происходит увеличение объема содержимого диализатора за счет гидрофильных свойств белка до 130 мл. По окончании диализа препарат фильтруют через бумажный фильтр (дл  удалени  крупных частиц) и нанос т на колонку размером 2,5-50 см с ДЭАЭ-целлгало- зой, уравновешенной рабочим буфером Сорбцию ферментсодержащего белка на целлюлозу провод т со скоростью 40 мл/л, Элюцию осуществл ют в объеме 1 л 0,5М NaCl в рабочем буфере со , скоростью 20 мл/ч. Фракции собирают на автоматическом коллекторе фракций ХКОВ-1 по 5 мл в пробирку. Полученные порции элюата спектрофотометрируют при 280 нм на СФ-26, по полученным данным стро т хроматографический про0

5

0

филь. Полученные 5 пиков изучают

на ферментативную активность. Фруктоз одифосфатальдолазной активностью обладают четвертый и, п тый пики. Наиболее активные порции (четвертьй и п тый пики) объедин ют и изучают на антигенные и иммуногенные свойства .

Таким образом, способ позвол ет повысить степень очистки более, чем в 3 раза.

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   Способ получени  фруктозодифосфатальдолазы путем экстракции сырь , фракционировани  сульфатом аммони , ионообменной хроматографией, о т л и,31423551

   чающийс  тем, что, с цельюбуфером рН 7,6, центрифугируют, фрак- повышени  степени очистки, холерныеционируют дробно сернокислым аммони- вибрионы инактивируют шестикратнымем, осадок раствор ют, и диализуют замораживанием - оттаиванием, центри-против 0,005 М трис-НС1-буфера рН 7,6 фугируют, клетки механически дезин-и очищают на ДЭАЭ-целлюпозе при элю- тегрируют со стекл нным песком, экст-ации линейным градиентом 0,5 М хло- рагируют гомогенат 0,005 М трис-НС1-ристого натри  рН 7,6,