SU1381160A1

SU1381160A1 - Способ оценки селекционного материала кукурузы на вы вление гена Опейк-2

Info

Publication number: SU1381160A1
Application number: SU864109274A
Authority: SU
Inventors: Александр Николаевич Винниченко; Надежда Петровна Коцюбинская; Лариса Валентиновна Комиссарова; Юрий Владимирович Донченко
Original assignee: Днепропетровский государственный университет им.300-летия воссоединения Украины с Россией
Priority date: 1986-06-10
Filing date: 1986-06-10
Publication date: 1988-03-15

Abstract

Изобретение относитс к селекционно-генетическим исследовани м и может быть использовано при массовой оценке селекционного материала кукурузы на наличие гена Опейк-2 на различных стади х созревани зерна. Целью изобретени вл етс упрощение процесса вы влени гена Опейк-2. Дл этого после обработки образца размолотого зерна экстрагентами, получени белковой фракции и очистки от механических примесей при последующем анализе ген Опейк-2 вы вл ют по повьшенной активности аскар- татаминтрансферазы при длине волны 500-560 нм. Обработку образца провод т при температуре 0-4 С в течение 30-60 мин. 6 табл. (Л

Description

со

ОС

Изобретение относитс к селекционно-генетическим исследовани м сельскохоз йственных культур и може быть применено при массовой оценке селекционного материала на качество белка.

Целью изобретени вл етс упрощение способа.

Упрощение способа обеспечиваетс тем, что после обработки образца размолотого зерна экстрагентами и получени белковой.фракции, очистки экстракта от механических примесей в последующем анализе ген Опейк-2 вы вл ют по повьпиенной активности аспартатаминотрансферазы при длине волны 500-560 нм, причем обработку образца провод т при в течение 30-60 мин, а в качестве экстра- г ента используют дистиллированную воду.

Пример I. Предложенным способом приводитс анализ активности АСТ-азы в зрелом зерне исходных +++А204; +++wf9; +++w64A; -t-n-wI55 и мутантных А204; , wf9;o O5O, w64A; wl55 линий кукурузы в соспоставлении с другими биохимическими критери ми , характеризующими качество зерна. У всех му+антов повышенное содержание лизина и незеиновых белков, полнопенных по аминокислотному составу, коррелирует с повышенной акттивностью аспартатаминотрансферазы . Поэтому в этом примере активность АСТ-азы может вл тьс критерием оценки биохимических изменений , происход щих в зерне кукуруз под действием гена Опейк-2, а следвательно , и способом вы влени наличи данного гена в генотипе.

Результаты представлены в табл.

П р и м е р 2. Проводитс вы вление гена Опейк-2 по повьппенной активности АСТ-азы в разные фазы созрвани зерна у исходных («+-bwf9, ++-ьА204) и гомозиготных мутантных o,o,O2wf9; ,jA204 линий кукурузы . Повьпиенна активность АСТ-азы отмечаетс в зерне мутантов по отношению к исходным генотипам во все строки онтогенетического развити , что позвол ет в отличие от известных способов вести более раннюю диагностику селекционного материала.

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

начина со стадии формировани зерна .

Результаты приведены в табл.2.

ПримерЗ. I г размолотого зерна кукурузы заливают 5 мл дистиллированной воды и провод т экстракцию альбуминов в первом варианте опыта в течение 15 мин, во втором 30 мин, в третьем 60 мин., в четвертом 80 мин при 4°С. Осадок во всех вариантах опыта определ ют центрифугированием . В супернатанте определ ют активность аспартатаминотрансферазы .

Оптимальные пределы времени получени экстракта 30-60 мин. Снижение времени экстракции приводит к резкому падению активности аспартатаминотрансферазы , а повышение удлин ет эксперимент без получени положительного эффекта.

Результаты опытов представлены в табл.3.

Пример4. 1 г размолотого зерна кукурузы заливают 5 мл дистиллированной воды и провод т экстракцию альбуминов в течение 30 мин в первом варианте опыта при 4°С, во . втором при 15°С, в третьем при 25°С. Осадок во всех вариантах опыта определ ют центрифугированием, в супернатанте определ ют активность АСТ- азы.

Наиболее высокий уровень энзи- матической активности наблюдалс в экстракте, полученном при 4 С.

Результаты опыта приведены в табл.4.

ПримерЗ. I г размолотого зерна кукурузы заливают 5 мл дистиллированной воды и провод т экстракцию белка в течение 60 мин, при 4°С. В пробирки внос т по 1 мл субстрата ACT и 0,2 мл кукурузного экс1 тракта. В первом варианте опыта пробы инкубируют 30 мин, во втором 60 мин, в третьем 90 мин при .

Оптимальное врем инкубации пробы с субстратом 60 мин, так как в первом варианте опыта активность АСТ-азы крайне низка , а в третьем возрастает врем опыта без достиже ни дополнительного положительного эффекта.

Зависимость активности АСТ-азы от времени инкубации представлены в табл.5.

Примерб. 1 г размолотого зерна кукурузы заливают 5 мл дистиллированной воды, провод т экстракцию белка в течение 1 ч при А с. В пробирки внос т по I мл субстрата ACT и 0,2 мл кукурузного экстракта. После 60-минутной инкубации в пробы добавл ют 1 мл I мМ 2,4-динитро- фенилгидразина и через 10 мин 10 мл 0,4 М NaOH. Через 10 мин записьшают спектр поглощени образовавшегос окрашенного комплекса в области 450-700 нм.

Обоснование граничных значений длины волны приведено в табл.6.

Приведенные в табл.6 данные свидетельствуют о том, что наиболее

значительные различи по активности аспартатаминотрансферазы между исходной и мутантной кукурузой наблю- даетс при измерени х величины оптической плотности в пределах 500- 560 нм. Эти пределы вл ютс граничными .

Claims

Формула изобретени

Способ оценки селекционного материала кукурузы на вы вление гена Опейк-2, предусматривающий обработку размолотого зерна экстрагентами с получением белковой фракции, очистку от механических примесей и последующий анализ, отличаю щи й- с тем, что, с целью упрощени

способа, ген Опейк-2 вы вл ют по по- выгаенной активности аспартатамин трансферазы при длине волны 500 - 560 нм. IТ а б л и ц а I

12,4524,95

10:1217,20

23,3028,29

10,3219,90

5,428,43

5,878,17

7,9310,87

9,8511,25

лость

Молочно-воскова спелость Воскова спелость

2,510,802,1610,543,476,12

2,970,951,988,603,564,37

4,181,591,906,842,244,31

9,253,941,502,357,505,80

Таблица2

41,83

17,67 16,09

51 ,00

30,19 30,37

Лини Активность АСТ-азы, ед.опт.плотности /мг белка Вариант опыта по примеру 3

...L IIL-- fL.. IllL Z

А 204 6,46 11,75 12,45 12,57 wf9 6,02 9,20 10,12 10,02

Таблица4 Лини Активность АСТ-азы, ед.опт. плотности/мг белка

Вариант опыта по примеру 4

А 20411,759,104,07

wf99,207,032,97

Таблица5

Врем инкубации,мин 30 60 90

Активность АСТ-азы, ед.опт.плотности/мг белка3,48 12,45 12,67

Таблицаб

Длина вол- Активность АСТ-азы, ед.опт.плотности / Разность ны, нм/мг белка

+++ wf9 wf9

Таблица 3