SU1140788A1 - Способ получени эритроцитарного диагностикума - Google Patents

Abstract

1. СПОСОБ ПОЛУг1ЕНИЯ ЭРИТРОЦИТАРНОГО даЛГНОСТИКУМА путем стабилизации эритроцитов, обработки их дубильной кислотой с последующей сенсибилизацией, от л и ч а ю щ и йс   тем, что, с целью повьшени  выхода целевого продукта, стабилизированные эритроциты и нестандартные диагностикумы сенсибилизируют гомологичным сенситином, предварительно обработанным сульфосалициловой кислотой , вз той в концентрации О,15-. , 0,8 мг на 1 мл сенситина.

Description

СХ) X) Изобретение относитс  к биологии и медицине, преимущественно к иммунодиагностике и иммунохимии, и может быть использовано в производстве эритроцитарных диагностикумов различной специфичности и в научных исследовани х . Известен способ получени  зритроцитарного диагностикума путем стабил зации эритроцитов, обработки их дубильной кислотой с последующей сенсибилизацией СП. Однако известный способ не позвол ет получать однородные по качеству серии цнагностикумов. Целью изобретени   вл етс  повышение выхода целевого продукта. Указанна  цель достигаетс  тем, что согласно способу получени  эрит . роцитарного диагностикума путем стабилизации эритроцитовj .обработки их дубильной кислотой с последующей сенсибилизацией, стабилизированные эритроциты и нестандартные диагности кумы,сенсибилизируют гомологичным сен ситином, предварительно обработаиньм сульфосалициловой кислотой, вз той в концентрации 0,15-0,80мг на 1 мл сен ситина . Способ выполн етс  следующим обра зом. Дл  приготовлени  эритроцитарных диагностнкумов (дифтерийного, столбн чного , трепонемного) могут быть ис пользованы стабилизированные эритроциты млекопитающих, птиц, не подвергавшихс  ранее сенсибилизации белковыми или другими сенситинами, а также представл ющие собой производственнЬтй брак (серии, слабые сразу после изготовлени  или утратившие активность, в результате хранени ). :| .,.. . Ста:билизированные эритроциты подвергают последовательно процедуре отмывани  (солевые растворы с детер , гентом, например твин-80, в концентрации от 1 : 10000 до 1:100000), затем обрабатьгеают веществами-присоедини те  ми, например, дубильн.ой кислотой ( от 1:10000 до 1:80000, преимущественно 1:20000), при 20-37°С в течение 20 Нин - 12. ч с последовательным отмыванием . 0,85%-ным раствором хло.рида натри , рН 5,9-6,4, Подготовленные эритроциты суспенд руют в забуференном 1:100 (1/15 М фосфатного буфера) 0,85%-ном раство ре хлорида натри  при рН 5,9-6,4 до концентрации 2,5-5%. Эту взвесь соедин ют с эффективной дозой сенситина, установленной в предварительном опыте, и смесь инкубируют при 37-45°С в течение 3-5 ч. По .истечении этого срока к каждой смеси добавл ют формальдегид (до 1%-ной концентрации в объеме). Последующее отмывание сенсибилизированных эритроцитов и хранение готового препарата производ т в присутствии 1%-ного формальдегида. .Готовые препараты испытьшают в РИГА со стандартной диагностической сывороткой дл  определени  специфической активности. Сопоставление условий сесибилизации показало, что в пределах рН 5,9-6,4 обеспечиваетс  наиболее эффективное присоединение сенситинов, например, дифтерийного, столбн чного ли сониката патогенных бледных трепонем, что про вл етс  наивысшими титрами соответствующих стандартных сывороток в РИГА. При этом эффективна  концентраци  сенситина обеспечивает достижение .максимальной активности полученного диагностикума как из 2,5%-ной так, из взвеси подготовленных эритроцитов, а получение трепонемного эритроцитарного диагностикума возможно при использовании полученного известным способом в экспериментальных услови х ультразвукового антигена в дозе 0,2 мг белка на 1 мл взвеси эритроцитов . Повышение дозы сенситина от 0,2 До 2 мг белка на 1 мл взвеси эритроцитов способствует повьшенйю активности днагнос икума на 2-3 разведени  (1:2п), дальнейшее; же повк щение дозы белка снижает активность, полученной серии диагностикума. Кроме того, обработка веществами-присоединител ми (например, дубильной КИСЛОТОЙ) может производитьс  с равным успехом в течение 30 мин 16 (18) ч при 20-37°С, причем сенситин перед присоединением к подготовленным эритроцитам обрабатывают сульфосалициловой кислотой в дозе, обеспечивак дей стойкую опалесцендию конкретного белкового коллоида. li р им е р 1. Дл  приготоапени  дифтерийного или столбн чного зритроцитарных диагностикумов формалинизированные эритроциты бара1на не подвергавшиес  ранее сенсибилизации, п следовательно отмывают 0,85%-ным ра вором хлорида натри , затем - раств ром детергента (например, твина-80) и снова 0,85%-ным раствором хлорида натри . Полученный осадок ресуспенд руют и соедин ют с раствором глютар вого альдегида. После контакта осад ресуспендируют, осаждают дентрифуги рова:нием, осадок снова ресуспендиру ют, отмывают 0,85%-ным раствором хл рида натри , вновь ресуспендируют в изотоническом растворе хлорида натри , в котором содержитс  дубиль на  кислота. После взаимодействи  эритроциты осаждают, осадок промывают 0,85%-ным раствором хлорида натри  с детергентом (твином-80), затем - без детергента. Сенситин прогревают при 65°С в течение 1 ч и быстро охлаждают при О С (вода со льдом) . Затем к нему по капл м постепе но добавл ют l/J-ный раствор сульфосалициловой кислоты до по влени  стойкой опалесценции. Ресуспендированные эритроциты, подготовленные, как описано ранее, соедин ют с обработанным гомологичным сенситином и помещают на 5 ч в вод ную баню при 45°С. По истечении этого срока к каждой смеси добавл ют формальдегид до 1%-ной концентрации в объеме. Последующее отмывание сенсибилизированных эритроцитов и хранение готового препарата производитс  в присутствии 1%-ного формальдегида. Пример 2. Дл  приготовлени  дифтерийного или столбн чного эрйтроцитарных диагностикумов формалинизированные эритроциты барана, paHeie подвергавшиес  сенсибилизации . дифтерийным или столбн чным анатокси нами, последовательно обрабатывают аналогично примеру 1 с использованием одноименного сенситина - дифтерийного или столбн чного. Прим ер 3. Дл  приготовлени  трепонемного эритроцитарного диагностикума формалинизированные эритроциты барана, ранее не подвергавшиес  сенсибилизации, последовательно обрабатывают аналогично примерам 1 и 2 до этапа сенсибилизации. Полученный известным способом в зкспериментальных услови х -соникат патогенных бледных: трепонем стандарт j зируют по содержанию белка (метод 7884 Лоури) и примен ют в качестве сенситина в концентрации, соответствующей 0,2 мг/мл на 1 мл 2,5%-ной взвеси подготовленных эритроцитов, взаимодействие с которым происходит в присутствии забуференного 1:100 (1/15 М фосфатного буфера) 0,85%ного раствора хлорида натри  (рН , 5,9) в течение 40 мин при 38°С. Пример 4. Дл  приготовлени  трепонемного эритроцитарного диагностикума формалинизированные эритроциты барана, ранее не подвергавшиес  сенсибилизации, последовательно об- рабатывают, как в примерах 1 и 3, но дл  сенсибилизации используют сенситин с концентрацией белка 2 мг/мл на 1 мл 2,5%-нсй взвеси подготовленных эритроцитов (рН 6,4) в течение 45 мин при 38°С. Пример 5. Дл  приготовлени  трепонемного эритроцитарного диагностикума формалинизированные эритроциты барана, ранее не подвергавшиес  сенсибилизации, последовательно обрабатывают как в примере 1 и 3, но дл  сенсибилизации Используют сенситин с концентрацией белка 0,2 мг/мл на 1 мл 5%-ной взвеси подготовленных эритроцитов (рН 6,4) в течение 40 мин при 37°С. Пример 6. Дл  приготовлени  трепонемного эритроцитарного диагностикума формалинизированные эритроциты барана, ранее не подвергавшиес  сенсибилизации, последовательно обрабатывают, как в примере 1и 3, но дл  сенсибилизации используют сенситин с концентрацией белка 2мг/мл на 1 мл 5%-ной взвеси подготовленных эритроцитов (рН 5,9) в течение 30 мин при 38°С. По предлагаемому способу были подвергнуты повторной обработке 4 л 720 мл взвесей эритроцитов активностью 0,006-0,0015 АЕ/мл, 9Т% которых сохранили этот показатель в течение 12-18 мес цев. При сравнении 15 серий столбн чного анатоксина ранее можно было расчитывать на пригодность из них 2-3, а по новой технологии было получено 10 серий препарата с активностью 0,006 (2); 0,003 (3);0,0013 2); 0,008 (3) АЕ/мл. При сравнении 6 серий дифтерийных анатоксинов азного производства 25 оказались ригодными дл  получени  высоко чувствительных цнагностикумов активностью 0,006-0,0002 АЕ/мл. Кроме того , 6 л 170 мл (650 серий) дифтерийного диагностикума и 5 л 950 мл (720 серий) столбн чного диагностикума бьшо получено с помощью воздей ,стви  сульфосалициловой кислотой, причем активность препарата значительно превысила обычные показатели: 0.0008-0.0002 АЕ/мл (дифтерийный), 0,003-0,0008 АЕ/мл(столбн чный) Сроки сохранени  активности дл  89% ; серий превысили 12 мес цев. Эти коли чества препарата в услови х постановки РПГА микрометодом обеспечивают обследование более 300 тыс.человек. Применение сульфосалициловой кислоты позволило присоединить к стабилизированным эритроцитам через танин или глютаровый альдегид и танин ранее не присоедин вшийс  антиген - соникат патогенных бледных трепонем и приготовить 19 серий нового диагностического препарата. Титры антител в РПГА с. трепонемным эритроцитарным диагностикумом колеблютс  от 1:64 до 1:1024 при ранних формах сифилиса и от 1:2000 до 1:32000 при поздних формах этого заболевани . Диагностикум сохран л свою активност в течение 3 мес (срок наблюдени ).

Пример 7. Дл  приготовлени  дифтерийного или столбн чного эритроцитарного диагностикума формалинизированные эритроциты барана или нестандартные серии эритроцитарных диагноСтикумов последовательно обрабатывают, как в примере 1, с использованием одноименного .сенситина, предварительно обработанного сульфосалициловой кислотой, вз той в концентрации 0,15 мг на 1 мл сенситина.

И р и м е р 8. Дл  приготовлени  дифтерийного шш столбн чного эритроцитарного диагностикума формалинизированные эритроциты барана или нестандартные серии эритроцитарных диагностикумов последовательно обрабатывают ,, как в примере 1, с использованием Одноименного :сенситина,. предварительно обработанного сульфосалициловой кислотой, вз той в концентрации 0,2 мг на 1 мл сенситина.

П р им е р 9. Дл  приготовлени  дифтерийного или стоблн чного -эритроцитарного диагностикума формалинизированные эритроциты барана или нестандартные серии эритроцитарных диагностикумов последовательно обрабатывают, как в примере 1, с использованием одноименного сенситина , предварительно обработанного сульфосалициловой кислотой, вз той в концентрации 08 мг 1 мл сенситина .

Пример 10. Дл  приготовлени  дифтерийного или столбн чного эритроцитарного диагностикума формалинизированные эритроциты барана или нестандартные серии эритроцитарных диагностикумов последовательно обрабатывают, как в примере 1, с использованием одноименного сенситина , предварительно обработанного сульфосалициловой кислотой, вз той в концентрации 0,85 мг на 1 мл сенситина .

По предлагаемому способу были сенсибилизированы формалинизированные эритроциты и нестандартные диагностикумы дифтерийным или столбн чным анатоксином, предварительно обработаннь1м сульфосалициловой кислотой , вз той в концентрации 0,15 ,85 мг на 1 мл анатоксина. Сопоставление полученных результатов дано в таблице.

Таким образом, предлагаемый способ производства или экспериментального приготовлени  эритроцитарных диагностикумов повьшает возможности использовани  формалинизированных эритроцитов из числа отбракованных серий за счет повторной обработки, а также позвол ет использовать в качестве сенситинов дополнительные серии коммерче.ских полуфабрикатов вакцин, сывороток дл  изготовлени  эритроцитарных диагностикумов высо кой специфичности и чувствительности ..

Предлагаемый способ приготовлени  эритроцитарных диагностикумов обеспечивает по сравнению с известным способом возможность повторного использовани  формалинизированных эритроцитов (утилизации производственного брака и серий, вьтедших из срока годности) путем повторной их обработки веществрм-присоединителем и одноименным сенситином, использовани  в 6-8 раз большего чиса производственных образцов полуфабгрикатов сенситинов (например, анатоксинов ) дл  получени  эритроцитарных диагностикумов высокой специфичности и чувствительности за счет обработки белковых коллоидов сульфосалициловой кислотой, а также возможность присоединени  к эритроцитам р да веществ белковой природы , в том числе полученных в экспериментальных услови х, не сенсибилизирующих эритроциты известным способом, например сониката патогенных бледных трепонем, при изготовлении эритроцитарного диагностикума этой специфичности.

формалинизированный 1080

эритроцитарный 225

нестандарт720 ный 340

68,5 70,3 65,6 43,1

50.260,1 67,6 58,9

59,0 72,3 75,6 68,4 53,4

64.374,0 83,5 79,0 61,1

Claims (1)

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭРИТРОЦИТАРНОГО ДИАГНОСТИКУМА путем стабилизации эритроцитов, обработки их дубильной кислотой с последующей сенсибилизацией, от л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, стабилизированные эритроциты и нестандартные диагностикумы сенсибилизируют гомологичным сенситином, предварительно обработанным сульфосалициловой кислотой, взятой в концентрации 0,15-· , 0,8 мг на 1 мл сенситина.

»1140788