SU111195A1 - Способ получени антибиотика полимиксина - Google Patents

Description

Изобретением  вл етс  способ получени  антибиотика полимиксина из культуральной жидкости В. Роlymyxa .

Применение предлагаемого способа позвол ет получать препарат высокой эффективности при лечении долго незаживающих ран, вызванных синегнойной палочкой.

Отличительна  особенность способа заключаетс  в том, что культуральную жидкость обрабатывают щавелевой кислотой, бактериальные к«1етки и выпавшие соли отфильтровывают , а прозрачный фильтрат подщелачивают едким натром, после чего антибиотик адсорбируют из раствора на катиопите КБ-4-П2 и элюируют 0,35 и раствором сол ной кислоты в метаноле, из которого неорганические примеси удал ют адсорбцией на катионите СБС-1, а содержащий антибиотик раствор или нейтрализуют на анионите ЭДЭ-10, упаривают и сушат дл  выделени  твердой сол нокислой соли полимиксина, или нейтрализуют триэтиламином, добавл ют к полученному раствору сульфат триэтила .мика з метано.ю, выпавший сульфат полпмлкслпа отфильтровывают , промьнзают метанолом и сущат в вакууме.

Пример 1. 90 л культуральной жидкости с активностью 2100 ед/мл определ ют чашечным л1етодом с тест-организмом Escherichia СоИ, обрабатывают npii перемешивании насыщенным раствором щавелевой кислоты (2,6 ./) до достижени  полноты осаждени  кальци  и рН раствора 3,0.

Выпавщий осадок оксалата кальци  со взвесью бактериальных клеток отдел ют фильтрованием, а прозрачный раствор нейтрализуют 10%-ным раствором едкого натра (1,75 л) до рП 6,5-7,0.

Прозрачный нативный раствор (96 л с активностью 1750 ед/ли) пропускают через колонку с диаметром 2,5 с.и и высотою 40 см. наполненную 7 г катионита КБ4-П2 в натриевой фор.ме, со скоростью л час1г. Иоиит с адсорбированным на нем полимиксином (92,3-10 ед) промывают 2 л дистиллированной воды до Достижени  прозрачной

промывной воды, а затем /и мл метанола , после чего провод т вытеснение антибиотпка 0,35 к раствором сол ной кислоты в метаноле со скоростью 10 лл/час/г ионита.

Полученные 300 мл раствора сол нокислого полимиксина в метаноле нейтрализуют анионитом ЭДЭ-10 в ОН-форме и получают 340 мл раствора активностью 16,3-10 ед/мг.

Всего получают 55,4 10 ед, что составл ет 60% по отношению к полимиксину , сорбированному на ионите . С учетом элюатов более низкой концентрации выход достигает 65%.

300 мл указанного выше раствора сол нокислого полимиксина в метаноле профильтровывают через колонку с диаметром 3 см и высотою 60 см, наполненную 270 г катионита СБС-1 в Н-форме со скоростью 2 мл/час/г катионита. Затем кислый раствор нейтрализуют с помощью анионита ЭДЭ-10 до рН раствора 6,5.

Получают 373 мл раствора с активностью 118-102 ед/мл и 50 мл с активностью 27-10 ед/мл. Пр мой выход антибиотика на стади х обработки ионитами СБС-1 и ЭДЭ-10 90%. Общий выход на этих стади х 94,8%.

Сухой препарат полимиксина из метанольного раствора сол нокислого полимиксина выдел ют так.

1. 170 мл раствора антибиотика после очистки ионитами СБС-1 и ЭДЭ-10 с активностью 118-10 ед/мл упаривают в вакууме при 35-40° до V4 первоначального объема; выпавщий при упаривании неактивный осадок отдел ют фильтрованием, после чего прозрачный концентрат упаривают в вакууме досуха.

Получают 2,34 г сол нокислого полимиксина с активностью 7100 ед/мг. Всего 16,6-106 ед. Выход на стадии упаривани  и получени  су.кого препарата 83%. Выход сол нокислого полимиксина от антибиотика , сорбированного катионитом из культуральной жидкости, около 45%.

2. К 200 л{л раствора антибиотика с активностью 118- 10 ед/мл добавл ют 2 н раствор триэтиламинсульфата в метаноле (13,5 мл) до полноты осаждени  сульфата гголимиксина .

Выпавшую сернокислую соль антибиотика отдел ют фильтрованием, промывают метанолом до отсутстви  в промывном метаноле следов хлоргидрата и сульфата триэтиламина и высушивают в вакууме при комнатной температуре. Получают 1,56 г препарата с активностью 10-103 ед/мг. Всего 15,6- 10 ед.

Препарат раствор ют в 30 мл дистиллированной воды, отдел ют фильтрованием небольщой неактивный осадок и из прозрачного раствора добавлением 100 мл метанола осаждают сульфат полимиксина. Последний отдел ют фильтрованием и высушивают в вакзуме при температуре не выше 45°.

Получают сульфата полимиксина 1,52 г с активпостью 10-10 ед/мг. Всего 15,2- 10 ед. Выход на стадии выделени  сульфата полимиксина 64,4%. Общий выход иолимиксина от антибиотика, сорбированного катионитом из кзльтуральной жидкости , 36,0%.

Прим,ер 2. 75 л культуральной жидкости с активностью 2300 ед/мл определ ют чащечным методом с тест-организмом Escherichia Coli, обрабатывают при перемешивании насыщенным раствором щавелевой кислоты (2,5 л) до достижени  полноты осаждени  кальци  и рП раствора 3,0. Выпавщий осадок аксалата кальци  со взвесью бактериальных клеток отдел ют фильтрованием , а прозрачный нативный раствор нейтрализуют 10%-ным раствором едкого натра (1,75 л) до рН 6,5-7,0.

75 л прозрачного нативного раствора с активностью 1900 ед/мл пропускают через колонку с диаметром 2,5 см и высотою 40 см, наполненную 5 г катионита КБ4-П2 в натриевой форме со скоростью 1 . В фильтрате - 65-10 ед; сорбировано ионитом 77-10 ед.

Ионит с адсорбированным на нем полимиксином промывают 1,8 л дистиллированной воды до достижени  прозрачной промывной воды и затем 50 г метанола, после чего провод т вытеснение антибиотика 0,35 н раствором сол ной кислоты в метаноле со скоростью 50 мл/час/г ионита.

Полученные 320 мл раствора сол нокислого полимиксина в метаноле нейтрализуют анионитом ЭДЭ-10, после чего получают 350 мл раствора с активностью 15,2-10 ед/мл и общим содержанием антибиотика 53,2-106 ед, что составл ет 67,2% по отношению к полимиксину, сорбированному на ионите.

С учетом элюатов более низкой концентрации выход достигает 71%. Емкость катионита по отношению к полимиксину 15,4-10 ед/г.

320 мл (обща  активность 48,6-10 ед) указанного выше раствора сол нокислого полимиксина в метаноле профильтровывают через колонку высотою 60 см и диаметром 3 см, наполненную 260 г катионита СБС-1 в Н-форме со скоростью 2 мл/час/г катионита.

Получают 365 мл раствора; активность 12,7-10 ед/мл; обща  активность 46,3-10 ед. Пр мой выход на стадии обработки СБС-1 95%. Обший выход с учетом слабых промывок 98,0%.

Выделение сухого препарата полимиксина из метанольного раствора сол нокислого полимиксина производитс  следующим образом.

1. 200 мл кислого раствора антибиотика (обща  активность 25,4-10® ед), очищенного с подгощью ионита СБС-1, нейтрализуют до рН 6,6 фильтрацией через анионит ЭДЭ-10. Объем раствора 225 мл. Активность 11-Ю ед1мл. Обща  активность 24,7 - 10 ед.

220 мл нейтрализованного раствора сол нокислого полимиксина концентрируют до /4 первоначального объема в вакууме при температуре 35-40°.

Выпавший при упаривании осадок отдел ют фильтрованием, после чего концентрат высущивают в вакууме досуха.

Получают 3,06 г сол нокислого полимиксина. Активность препарата 6800 ед1 г. Всего 20,8-10 ед. Выход на стадии получени  сухого препарата 86%. Выход сол нокислого полимиксина от антибиотика, сорбированного катионитом изкультуральной жидкости, 51,0%.

2. 150 мл кислого раствора антибиотика , полученного после очистки катионитом СБС-1 с активностью 12,7-10 ед1мл нейтрализуют 8 мл триэтиламина до рН 6,5. К нейтрализованному раствору добавл ют 12,5 мл 2 н раствора триэтиламинсульфата в метаноле до полноты осаждени  сульфата полимиксина.

Выпавшую сернокислую соль антибиотика отдел ют фильтрованием , промывают метанолом до отсутстви  в промывном метаноле следов хлоргидрата и сульфата триэтиламина и высушивают в вакууме при комнатной температуре.

Получают 1,35 г препарата с активностью 9- 10 ед1мг. Всего 12.1-106 ед.

Препарат раствор ют в 25 мл дистиллированной воды, отдел ют фильтрованием небольшой неактивный осадок и из прозрачного раствора добавлением 100 мл метанола выдел ют сульфат полимиксина. Последний отдел ют фильтровани: ем, высушивают в вакууме при температуре не выше 45°.

Получают сульфата 1.3 г активностью 9-10 ед.мг. Всего 11,(3. Выход на стадии выделени  сульфата полимиксина 61.4%. Общий выход сульфата полимиксина от антибиотика, сорбированного катионитом из культуральной жидкости , 38%.

Предмет изобретени 

Способ получени  антибиотика полимиксина из культуральной нсидкости В. Polymyxa. отличающийс  тем, что, с целью получени  препарата высокой эффективности , культуральную жидкость обрабатыв ают щавелевой кислотой, бактериальные клетки и выпавшие соли отфильтровывают, а прозрачный фильтрат подщелачивают ед№ 111195 КИМ натром, после чего антибиотик адсорбируют из раствора на катионите КБ-4-П2 и элюируют 0,35 н раствором сол ной кислоты в метаноле , из которого неорганические примеси удал ют адсорбцией на катиониге СБС-1, а содержащий антибиотик раствор или нейтрализуют на апионите ЭДЭ-10, упаривают и сушат дл  выделени  твердои сол нокислой соли полимикси . нейтрализуют триэтилами ° добавл ют к полученному раствору сульфат триэтиламина. в метаноле, выпавший сульфат полимиксина отфильтровывают, промывают метанолом и сзшат в ваку)ме.