SU1110171A1 - Штамм бактерий @ @ @ -20-продуцент глицеролдегидрогеназы,окисл ющий глицерин в диоксиацетон - Google Patents

Abstract

Шта№{ бактерий Gluconobacter oxydans D-20 (коллекци  Цеитрального музе  промьшшениьос микроорганизмов Всесоюзного научио-исследоватепьского института генетики и селекции микроорганизмов, коллекционный номер ЩШМ В-2520) - продуцент глице- ролдегидрогеназы окисл ющий глицерин ;в диоксиацетон.

Description

Изобретение относитс  к микробиологической промьгашености и представл ет собой штамм культуры бактерий Gluconobacteroxydans D-20 дл  промьшшенного получени  диоксиацетата , примен емого в пищевой промышленности и медицине. Известна культура бактерий Acetobacter aceti-npoдуцент глицеролдегидрогеназы, окисл ющий глицерин в диоксиацетон lj ,

Наиболее близка к предлагаемой культурабактерий Acetobacter Suboxydans - продуцент внеклеточного фермента глицеролдегидрогеназы катализируюпрй окисление глицерина строго избирательно по вторичной гид роксильной группе в диоксиацетон. Бактерии G.oxydans хорошо развариваютс  на средах с глицерином, который как источник углерола обеспечивает осуществление их энергетических и синтетических процессов. Эта культура хранитс  в коллекции микроорганизмов биологического факультета Ленинградского государственного университета и  вл етс  прототипом изобретени  2j .

Бактериальные клетки этой культуры имеют палочковидную форму, средние размеры клеток 0,5 - 1,2 мкм, размножаютс  делением, споры не образуют , склонны к образованию длинг ных цепочек. Бактерии-каталазоположительные облигатные аэробы. Ассимилируют глюкозу, лактозу, мальтозу, галактозу, глицерин, этанол, метанол пропанол и другие спирты. Характертернй особенность ассимилировать уксусную кислоту. Этот штамм используетс  дл  ползчени  уксусной кислоты на спирте, глюконовой или котоглюконовой кислоты из глюкозы, сорбозы из сорбита. 1Чтамм способен окисл ть глицерин в концентрации не более 2% до диоксиацетона при температуре в течение 48 ч. Выход диоксиацетона - 98%, определенный по результатам анализа. Однако данный штамм не может найти промышленного применени  дл  получени  диоксиацетона в св зи с его неспособностью окисл ть высокие концентрации глицерина (2%). В св зи с этим процесс производства диоксиацетона с применением этого татамма  вл етс  низкопроизводительным .

Целью изобретени   вл етс  получение активного штамма G.oxydans.

способного окисл ть глицерин при концентрации последнего в среде 10-20%.

Данный штамм бьш вьщелен -селекционным путем воздействи  высоких концентраций глицерина на исходную культуру бактерий G.oxydans, полученную из Ленинградского государственного университета.

Ниже приведена схема селекции штамма G.oxydans

Gluconobacter oxydans ЛГУ

Отбор на способность окисл ть

6% глицерина

Отбор на способность окисл ть

10% глицерина

Отбор на способность окисл ть

15% глицерина

Отбор на способность окисл ть

20% глицерина, штамм G.oxydans

.

Предлагаемый штамм отличаетс  от исходного штамма не только значительно большей способностью окисл ть глицерин, но р дом морфологических и физиологических признаков .

Данный штамм хранитс  в коллекции Центрального музе  промьшшенных микроорганизмов Всесоюзного научноисследовательского института генетики и селекции под коллекционным номером В-2520,

Морфологические признаки.

Бактериальные клетки имеют палочковидную форму, средний размер клетки 0,6 X 1,2 X 1,6 мкм. Размножаютс  делением, спор не образуют, формирование цепочек наблюдаетс  редко. Инволютные формы про вл ютс  в виде сильно увеличенных клеток

На агаризованной. среде с глицерином образуют мелкие вьтуклые круглые гладкие блест щие колонии без пигментов. На поверхности жидкой среды через 24 ч образуют тонкую прозрачную полисахаридную пленку.

Физиолого- биохимические, свойства

Бактерии каталазоположительные, облигатные аэробы. Молодые клетки грамотрицательны.

Оптимальна  температура дл  окислени  глицерина до диоксиацетата - 28-30°С, рН 5,5. ;

Отношение к углеводам. Бактерии G.oxydans хорошо ассимилируют глюкозу, мальтозу, галактозу, раффинозу .

Отношение к спиртам. Ассимилируют глицерин, этанол, метанол, пропанол, изопропанол, бутанол, изобутанол , пентанол, сорбит, маннит.

Отношение к уксусной кислоте. Не ассимилирует.

П р и м е р 1, Окисление глицерина в диоксиацетон провод т следующим образом. Дл  подготовки посевного материала суспензию клеток G.oxydans из одной пробирки (возраст культуры - одни сутки) в асептических услови х внос т в колбу Эрленмейера с четырьм  отбойниками объемом 750 мл, содержащую 50 мл посевной среды следующего состава, мас.%:

15,0

1,25 0,3 0,029 5,5-5,7

Выращивание посевного материала провод т в течение 16-20 ч при 30 С до содержани  диоКсиацетона в среде 6,0-8,0%.

Посевным материалом в количестве 2% засевают среду дл  ферментации следующего состава, мас.%: .

Глицерин15,0

Кукурузный

3KCTpaKt

(50% сухих

веществ)0,63

KHjPO 0,5

рН среды 5,5-5,7

Ферментационную среду разливают по 100 мл в колбы Эрленмейера четьфьм  отбойниками объемом 750 мп. Ферментацию осуществл ют на качалке (180 - 200 об/мин) в течение 48 ч. Содержание диоксиацетона в среде 14,4 - 14,7%, что составл ет выход 98-100% от теоретического.

П р и м е р 2. Дл  проведени  ферментации в укрупненных лабораторных услови х посевной материал готовили следующим образом. Суспензию клеток односуточной культуры G.oxydans из одной пробирки вносили в колбу Эрленмейера емкостью 750 мл снабженную четырьм  отбойниками, содержащую 100 мл питательной среды следующего состава, мас.%:

20,0

Глицерин Кукурузньп экстракт (50% сухих веществ)

1,5 0,3

КН2Р04, 0,025 . MRSO

5,5-5,7

рН среды

Выращивание посевного материала осуществл ют на качалке (180200 об/мин) при ЗО-с в течение 24 ч до накоплени  в среде 7,0-8,0% диоксиацетона.

Окисление глицерина в диоксиацетон провод т в ферментере емкостью 30 л (рабочий объем 20 л), имеющем сульфитное число, равное 10 г 02Л/ч .

Питательна  среда дл  ферментации имела следующий состав, мас.%: Глицерин20,0

Кукурузный экстракт (50% сухих

веществ)0,75

KHjPO 0,5

рН среды5,5-5,7

После стерилизации и охлаждени  среды до 30 С ее засевают посевным материалом в количестве 1%. Ферментацию осуществл ют в течение 72 ч при . За это врем  окисление глицерина до диоксиацетона проходит на 96%, что составл ет 3,75 кг диоксиацетона. Удельна  производительность ферментера составл ет 62,7 кг 100%-ного диоксиацетона с 1 м оборудовани  в сутки.

Удельна  производительность ферментера рассчитываетс  по формуле

Wr-k П

Irt

где а - удельна  производительность ферментера}

ff - количество глицерина,

вз того на окисление, кг} 1C - коэффициент перевода рабочего объема ферментера на 1 мJ

- выход диоксиацетона при

окислении глицерина, t - срок ферментации, сутки, 1,02 - коэффициент пересчета глицерина на диоксиацетон.

ПримерЗ.В производственных услови х посевной материал готов т в инокул торе емкостью 10 л.

заполненном 6 л питательной среды, именнцей состав, как указано в примере 1.

Дл  засева инокул тора используют культуру G.oxydans , выращенную в колбе, как описано в примере 2.

Ферментер емкрстью 1 м (рабочий объем 600 л), снабженный  корной ме (цалкай, делающей 180 об/мин и обес«печивакицей аэрацию 1 объем воздуха на один объем среды в минуту. Производственна  питательна  среда дл  ферментагщи имеет состав, как указано в примере 1.

После стерилизации и последзпщего охлаждени  среды до 30 С ее засеваю т посевным материалом из инокул тора. Ферментацию осуществл ют в течение 72 ч. За это врем  окисление глицерина проходит на 94,5%. Удельна  производительность ферментера(Составл ет 47,5кг/ в сутки.

В таблице приведены сравнительные показатели предлага юго штамма с прототипом.

Таким образом, преимущество предлагаемого штa ttlaдл  промышленного получени  диоксиацетойа эакшочаетс  в ув личеиии концентрациидиоксиацетона;,

Предлагаемый штамм позвол ет получать культуральную жидкость, содержащую высокие концентрации диоксиацетона , что упрощает процесс выделени  конечного продукта, снижает трудоемкость процесса.

.

15-20 95-98

98 . 48-63

10