SU1090713A1 - Питательна среда дл культивировани продуцентов целлюлолитических ферментов и ксиланазы - Google Patents

Abstract

ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ПРОДУЦЕНТОВ ЦЕЛЛЮЛОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ И КСИЛАНАЗЫ, содержаща  источники углерода, азота, витаминов, аминокислот, источник минерального азота - азотнокислый ... / рий, а также минеральные соли - однозамещенный фосфорнокислый калий, сернокислый магний и воду, отличающа с  тем, что, с целью повышени  активности продуцентов и 1 удешевлени  среды, она дополнительно содержит в качестве источника углерода, азота, витаминов и аминокислот солодовые ростки при следую.щем соотношении компонентов, мас.%: Азотнокислый натрий0,3 Однозамещенный фосфорнокислый каший0,2 Сернокислый i магний0,05 Солодовые ростки1,5-4 (Л Вода, млДо 100

Description

со о

:

i

Изобретение относитс  к микробио логической промышленности и касаетс питательных сред дл  выращивани  продуцентов цел кшолитических ферме тов и ксиланазы культуры-Tric ioderm lignorum 60-24, содержаща  пшеничны отруби, свекловичный жом, солодовые ростки f 1J . Недостатками этой среды  влйютс  . сложный составj содержащий большой набор минеральных солей и vмкpoэлeМентов , что значительно ее удорожает , а также низка  активность ксила . назы. Наиболее близкой к изобретению   л етс  питательна  среда дл  выраади вани  продуцента целлюлолитических ферментов и ксиланазы Aspergillus terreus llf 2, где в качестве ист ника углерода используют измельченную пшеничную солому 2%,. в качестве источника углерода, азота, витамино аминокислот - кукурузный экстракт 1,5%, как источник минерального азо та NaNOj 0,3%, а также КН2РО4 0,2% ;MgSO4 7Н,О 0,05%, водопроводна  во |да рН 4, 5. I На этой среде ферментативна  ак гивность гриба Asp. terreus. 17р характеризуетс  следующими величинами единица активности (миллилитр культураль1|ой жидкости) j эндоглюканаза 25 экзоцеллобиогидролаза 1,0; целлобиаза 0,5; ксиланаза 73. Недостатками этой среды  вл ютс  ее многокомпонентность, высока  стоимость и недостаточно высока  ферментативна  активность выращивае мых на ней продуцентов. Целью изобретени   вл етс  повышение активности продуцентов и удешевление среды. Поставленна  цель достигаетс  те что питательна  среда дл  культивировани  продуцентов целлюлолитических ферментов и ксиланазы, содержаща  источники углерода, азота, вита минов, аминокислот., источник мине рального азота - азотнокислый натри а также минеральные соли - однозаме щенный фосфорнокислый калий, сернокислый магний и воду, содержит в ка честве источника углерода, азота, витаминов и аминокислот солодовые |ростки при следующем соотношении ко понентов, мас.%: Азотнокислый натрий0,3.1 Однозамещенный фосфорнокислый калий0,2 Сернокислый магний0,05 Солодовые ростки 1,5-4,0 Вода, млДо 100 Ферментативна  активность продуцентов , выращенных на.предлагаемой среде, отличаетс  высокими показатал ми и составл ет дл  Aspergillus terreus I7p и Myceliophthora thermophila no эндоглюканазе 40-42 ед/мл, экзоцеллобиогидролазе 1,0-3,8 ед/мп, целлобиазе 1,2-2,7 ед/мл, ксиланаз 95-420 ед/мп. Преимущество предлагаемой среды заключаетс  в том, что в качестве единственного и одновременного источника углерода, витаминов, аминокислот , а также азота среда содержит солодовые ростки в количестве 1,54 ,0 мас.%. Солодовые ростки  вл ютс  дешевым отходом пивоваренного производства и могут быть непосредственно без дбполнительной обработки введены в состав питательной среды. Содержание солодовых ростков менее 1,5 мас.% приводит к снижению активности ферментов, а более 4 мас.% приводит к удорожанию среды без достаточного повышени  активности всех ферментов . Пример 1, Берут питательную среду следующего состава, мас.%; солодовые ростки 1,5; NaNOg 0,3; КН2РО4 0,2; МдЗО47НгО 0,5; вода водопроводна  рН 4,5, и на ней провод т выращивание продуцента Myceliophtora thermophila ИНМИ PA 1-8, который депонирован под BKM-F-2148 Д. Спорами, полученными при вьаращи ,вании культуры на перловой крупе в течение 6 сут, засевают/ колбы емкост ю 250 мл, содержащие 50 мл пред лагаемой среды. Вь защивание про- вод т на круговой качалке (180 об/мин) в течение 72 ч при 45. Мицелий с твердыни остатками среды отдел ют центрифугированием. Центрифугат используют дл  определени  активности ферментов. Активность целлюлолитических ферментов определ ют по известной методике Мэндельс и Вебера в модификации, измер   количество образовавшимис  редуцирующих веществ (в перерасчете на глюкозу) при действии целлюлаз на соотвествующие субстраты (Na карбоксиметилцеллюлозу , фильтровальную бумагу, целлобиозу). Редуцирующие вещества определ ют колориметрическим методом ШЬмоди-Нельсона при длине волны 660 нм в кювете с толщиной сло  раствора 5 мм« За единицу активности целлюлаз прин то такое количество ферментов, под действием которого при услови х опыта образуетс  1 мг редуцирующих веществ в перерасчете на глюкозу. Активность ксиланазы определ ют по действию фермента на 1%-ный раствор ксилана. Реакционна  смесь состоит из 0/72 мл ксилана, 0,25 мл культуральной жидкости соответствующего разведени . Инкубацию провод т в течение 1 ч. Редуцирующие вещества определ ют методом Шомоди-Нельсона . Калибровочную кривую (Стро т по ксилозе. За единицу активности ксиланазы принимают, такое количество фермента, под действием которого образуетс  1 мг ксилозы в услови х опыта .

Ферментативна  активность продуцента имеет следующие показатели, ед/мп: эндоглюканаза 38; экзоцеллобиогидролаза 3,8 целлобиаза 2,3; ксиланаза 370.Пример 2. Берут питательную среду следующего состава, мас.%: солодовые ростки 4; NaNOg 0,3; 0,2; 7Н4О 0,05; водопроводна  вода рН 4,5, и на ней провод т выращивание штамма Myceliophthora thermophila ИНМИ РА-1-8.

Посев, услови  выращивани  и определение активности ферментов осуществл ют по примеру 1.

Ферментативна  активность продуцента за 72 ч роста достигает следующих показателей, ед/мл: эндоглюканаза 42; экзоцеллобиогидролаза 3,9; целлобиаза 2,7; ксиланаза 420.

Пример 3. Берут питательную среду следующего состава, мас.%: солодовые ростки 2,5; NaNOj 0,3; , 0,2; 0,05; водопроводна  вода рН 4,5, и на ней провод т выращивание штамма Aspergillus terreus 17 р, депонированного под -F-1862.

Суспензией спор, полученной с№звом с поверхности плотной питательной среды, содержащей (%: NaNO. 0,3;

NHjPq, 0,2; MgS04- 0,05, с полос .кой фильтровальной бумаги в качестве источника углерода, засевают 100 мл предлагаемой среды.Продуцент культивируют в колбах на 250 мл на круговой качалке (220 об/мин) при 40 в течение 96 ч. Активность ферментов определ ют в культуральной жидкости после отделени  центрифугированием мицели  и твердых остатков согласно примеру 1,.

При культивировании гриба Asp. terreus 17р на предлагаемой среде получены следующие результаты, ед/м ; Эндоглюканаза 40; экзоцеллобиогидролаза 1,0; целлобиаза 1,2; ксиланаза

,96,...

I I Как видно из приведенных результатов , предлагаема  среда обеспечивает

.более активный биосинтез целлюлолитических ферментов и ксиланазы.

Солодовые ростки в качестве источника азота, углерода, витаминов и аминокислот замен ют одновременно два компонента - дорогосто щий кукуруз ный экстракт, получает ый из пищевого сырь , и солому, на размол и усиленный режим стерилизации которой требуетс  значительный расход энергии

; Солодовые ростки очень богаты углеводами , аминокислотами, азотисты ,ми и минеральными веществами, витакйнами , содержат до 12% целлюлозы и

|Ксилан. Целлюлоза и ксилан  вл ютс  индукторами биосинтеза указанных ферментов . Солодовые ростки  вл ютс  отходом .пивоваренного производства,

,их стоимость в 2,4 раза ниже куку;рузного экстракта.

Myceliophthora thermophila синтезирует ксиланазу с активностью 370;420 ед/мп, котора  значительно превышает активность известной. Нар ду с ксиланазой образуетс  комплекс . целлюлоз с особенно активной эндоглюканазой , накапливаетс  значительна  биомасса гриба.

В насто щее врем  известна питательна  среда дл  культивировани  Asp.niger 15 в опытно-промышленном масштабе. Получены партии ферментного препарата. Недостатком этой среды  вл етс  ее сложный состав и довольно низка  активность ксиланазы (20 ед/мп) при длительном культивировании продуцента (7 сут).

В заводских услови х получена высокоактивна  культуральна  жидкость гриба Asp.terreus 17р, котора  испытываетс  в сельском хоз йстве при облагораживании грубых кормов дл  животных . В опытно-промышленных услови х также получены партии ферментного препарата, которые будут переданы дл  .-дальнейшей очистки во ВНИТИАФ медицинского назначени  (г.Ленинград) с целью создани  полиферментной лекарственной формы.

Claims (1)

1. ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ПРОДУЦЕНТОВ ЦЕЛЛЮЛОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ И КСИЛАНАЭЫ, содержащая источники углерода, азота, витаминов, аминокислот, источник минерального азота - азотнокислый нат- рий, а также минеральные соли - однозамещенный фосфорнокислый калий, сернокислый магний и воду, отличающаяся тем, что, с целью повышения активности продуцентов и 1 удешевления среды, она дополнительно содержит в качестве источника углерода, азота, витаминов и аминокислот солодовые ростки при следую щем соотношении компонентов, мас.%: Азотнокислый

   натрий 0,3 Однозамещенный фосфорнокислый калий 0,2 Сернокислый • магний 0,05 Q 5g Солодовые ростки 1,5-4 Вода, мл До 100 ω

   значительно ее удорожанизкая активность ксилаблизкой к изобретению яв-