SU1075740A1 - Штамм @ @ ВКМ в-1454 д-продуцент литического фермента - Google Patents

Abstract

ШТАММ PSEUDOMONAS LYTICA. ВКМ В-1454 Д (Всесоюзна  коллекци  культур микроорганизмов при Институте .биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР, коллекционный номер ВКМ В-1454Д) -продуцент литического фермента. (Л с:

Description

vj

ел

-pib Изобретение относитс  к микробиологической промышленности, производ щей ферментные препараты, и может быть использовано в фармацев тической и медицинской промьпЕпеннести . Фермент может найти широкое при нение при борьбе с инфекционными заболевани ми, вызванными грамнпол жительной микрофлорой. Наиболее распространенными продуцентами фермента литического действи  . вл ютс  различные виды бактерий, например, Achromobacter lunatur СО, Flavobacterium L2j, Bacillus cereus Гз и др. Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту из известных штаммов  вл етс  Pseudomonas aeruginosa L, процес культивировани  которого ведут в течении 72 ч при 30°С, рН7,4 в ср де, содержащей 2-5% нормальных пар финов (С 0,6% мочевины, 0,05% , 0,05% NaHjPO,0 ,05 MgSO, 0,1% дрожжевого экстра та, 10 мкг/мл FeSO, 10 мкг/мл CaC Дл  осаждени  литического фермента используют сульфат аммони  (80% насыщени ) или этанол в- соотношении 3:1. Полученньй таким обра зом литический препарат лизирует следующие микроорганизмы; псевдомо нады, микрококки, стафилококки, батдиллы. Бактериолитическа  активность фермента составл ет 20-80% лизиса тест-культура в 1 ч. OcHOBHbiNr общим недостатком кзвсстньсх штаммов  вл етс  их низка  активность. Кроме того, велико врем  культи вировани  штаммов продуцентов, а п л чаемый препарат не лизирует штам мы следуюш х родов микроорганизмов Streptococcus, Chromobacterium, Flavobacterium, Kurthia, Sarcina, .Neisseria. Целью изобретени   вл етс  штам Pseudomonas lytica ВКМ В-1454Д, об ладаю ций высокой литической активностью . Поставленна  цель достигаетс  использованием в качестве продуцен та литического препарата неописаннего ранее штамма Pseudoroonas lyti ВКМ В-1454 Д, выделенного из воды реки Оки в ареале максиальнс го распространени  микроорганизмов, лизирующих стафилококки. Штамм Pseudomonas lytica ВКМ В-1454 Д характеризуетс  следуюш 1ми свойствами: Морфологические и культуральные признаки; Грам.отрицательные палочки, не образующие спор. О, 5-0,83-5 мкм, слегка искривленные монотрихи, клетки подвижные. Колонии на МПА бесцветные, с ровным краем, при старении слегка морш 1нистые в центре. При росте в МПБ образуют осадок, муть, пленку. Флуоресцирующий пигмент не продуцирует . Физиолого-биохимические свойства, Строгий аэроб, растет при температуре от 4 до 37°С, не растет, при , оптимальна  температура . Метаболизм глюкозы дыхательный. В качестве источника углерода ис-пользует арабинозу, глюкозу, галактозу , сахарозу, мальтозу и ацетат натри . Не использует ксилозу, фруктозу, рамнозу, лактозу, рафинозу , соли щавелевой, молочной,  блочной , лимонной и глутаминовой кислот, глицерин, дульцит, маннит, сорбит, инозит, инулин. Не ну-ждаетс  в факторах роста. Способна расти на минеральной среде без факторов роста. Оксидазна  и каталазна  активности - положительные. Не образует хитиназу, целлю азу, уреазу, сероводород, индол. .Гидролизует крахмал. Не разжижает желатину. Пептонизирует молоко. Редуцирует нитраты. Не обладает липолитической ак- . тивностью (40, 60, 80- твины) . Аргининдигидродаза отсутствует. Процентное содержание Г+Ц 59,5%. Хранитс  на МПА, из-за энергичного автолиза требует пересевов через 7-10 суток. Штамм Pseudomonas lytica хранитс , не тер   жизнеспособности и активности, под слоем вазелиноБого масла или в лиофильно сухом состо нии . . При росте на твердой среде, содержащей стафилококк, образует крупные зоны лизиса вокруг своих колоний . 310757 Новый штамм выделен из воды реки Оки в ареале максимального распростр .анени  микроорганизмов, лизирующих стафилококки. На основе морфологических, куль- j туральных и физирлого-биохимических свойств новый штамм согласно определителю Берги 8-го издани , относитс  к роду Pseudomonas. Излучение свойств нового штамма 10 не позвол ет отнести его ни к одному из 26 видов рода Pseudomonas, представленных в определителе. По р ду свойств: способности расти на минеральной среде без факторов роста, составу Г+Ц, способности к денитрификации и росту при , наиболее близок к виду Pseudomonas cichorii. Однако от этого вида ее отличает способность гидролизовать крахмал 20 и неспособность образовывать флуорес- . цирующий пигмент. На основании этого культуре дано видовое название Pseudomonas lytica. Продуцент литического препарата 25 Pseudomonas lytica .ВМК В-1454Д вы- . ращивают всреде, содержащей 0,0080 ,012% дрожжевого экстракта, 0,060 ,08% казаминовых кислот, 0,51 ,5 мг/мл автоклавированных, лиофиль- зо но высушенных клеток стафилококка при рН среды 8,0-8,3, культивирование провод т в течение 18-20 ч при 22-25С. Выдел ют целевой продукт после отделени  клеток от культуральной жидкости известными методами,

За единицу литической активности (Е/мл) прин то такое количество фе;рмента, которое вызывает падение оптической плотности суспензии живых или автоклавированных клеток тест - организма (Staphylococcus aureus) в 0,01 М фосфатном буфере, рН 8,5, на 0,01 оптическую единицу в 1 мин. Удельную литическую активность (Е/мг) рассчитывают как отношение активности фермента к количеству белка в том же объеме. I

Литическое действие препарата провер ли на живых и прогретых (80°С в течение 20 мин) клетках 38 видов грамположительных бактерий, 3 видов нокардий, 4 видов микробактерий , 27 видов грамотрицательных микроорганизмов и 19 видов дрожжей из коллекции культур ИБФМ АН СССР, а также на клетках 133-Х штаммов 15

Staphylococcus

aureus- -B-83

Менее интенсивньш лизис наблюдалс  под действием фермента на некоторые виды флавобактерий, а также на Kurthia zpphf11 В-183 и на хромобактерии. С высокой скоростью препарат лизировал прогретые клетки многих грамположительных, так и многих грамотрицательных организмов . 1

Препарат показал высокую активность в отношении всех опробованных штаммов стафилококков и микрококков вьщеленных от больных. Менее эффективно препарат действовал на стрептококки групп В и Д, а также на некоторые стрептококки группы А.

Грамотрицательные патогенные микроорганизмы , за исключением Neisser оказались устойчивыми к действию фермента. . .

Приме р. Штамм Pseudomonas lytica В-1454 Д выращивают в жидкой среде, содержащей 0,01% дрожжевого экстракта (Difсо), 0,06% казаминовы 0 атогенных микроорганизмов из колекции Государственного, научносследовательского института станартизации и контрол  медицинских иологических препаратов МЗ СССР м. Л.А. Тарасевича. Результаты проведенных исследоаний представлены в табл. 1 и 2. Из таблицы видно, что литический препарат из культуральной жидкости нового штамма Pseudomonas lytica активен в отношении клеток грамположительных микроорганизмов: Arthrobacter globiformis А. citreus А. cristallopoietes А. tumescens Bacillus firmus Mucrococcus luteus Sarcina aurantiaca

кислот (Difсо), 1,0 мг/мл автоклавированных лиофильно высушенных клеток Staphylococeus aureus при рН 8,3 20-24 ч при 24°С на качалке в 100 МП среды в медицинских колбах объемом 750 мл. Клетки отдал ют центрифугированием на холоду при 6200 g в течение 40 мин.

К полученному прозрачному супернатанту добавл ют разбавленную уксусную кислоту до установлени  рН 6,7 и раствор MgCl до конечной концентра.ции .

. Обработанный вышеописанным способом супернатант нанос т на колонку 2, см с гидроксилаппатитом (Мазин А.Л., Сулимова Г.Е., Биохими , 1975, т. 40, вып. 1). После нанесени  колонку промывают 0,01 М натрий-фосфатным буфером рН 6,8, содержащим 10 MgCl. Десорбцию ведут натрий-фосфатным буфером рН 6,8, образующим градиент мол рности от 0,01 до 0,15 М, Максимальна  литическа  активность элюируетс при концентраики буфера 0,08-0,1 М

Полученньш таким образом препарат имеет удельную активность 10001500 Е/мг,

Физико-химические характеристики литического препарата.

Температурный оптимут 1 препарата 45-50°С.

Оптимум рН - 8,5

Оптимум мол рности фосфатного буфера 0,01 М.

Действие литического препарата из культуральной жидкости Pseudomonas lytica на различные микроорганизмы (коллекци  культур ИБФМ АН СССР)

Препарат стабилен при температуре ниже 40С и инактивируетс  при 15-минутном прогреве при .

Таким образом, преимущество предлагаемого штамма по сравнению с известным заключаетс  в том, что активность получаемого препарата значительно выше, чем известного. Так, например, лизис тест-культуры Staphylococeus aureus получаемым препаратом из Pseudomonas lytica протекает на 100% в течение 5 мин, в

то врем  как из Pseudomonas aerugiпоза лизис Staphylococeus aureus протекает на 86,4% за 1 или 4 часа.

Фермент обладает иным спектром литического действи . В известном

20 техническом решении препарат лизирует представителей родов Staphylococeus , Micrococcus, Bacillus, Corynebacteriuin, Lactobacillus, Pseudomonas, Proteus, Erwinia,

25 Arthrobacter, Achromobacter, Aeromonas , Kanthomonas.

Получаемый препарат лизирует интактные клетки представителей

30 родов Staphylococeus, Micrococcus, Arthobacter, Chromobacterium, Bacillus , Streptococcus, Flavobacterium, Kurthia, Sarcina, Neisserid.

Кроме того, почти все исследован- 5 ные тест-организмы лизируютс  препарат-ом после их прогревани  при 80°С (см. табл. 1).

Та б л и

ц а 1

В-126

ИБФМ В-151

В-52

92

- - 90 88

96

94 92

94

97

94 97

100

97

и

12

1075740

.Продолжение табл, 1 Rhodotorula aurantiaca . R. glutinus. Zygosaccharomyces thermotolerans Y-511 Candida utilis Y-105 Cryptococcuslawrentia Cryptococcus albus var BKM 1540 terreug Torulopsis magnoliae Y-429 Nadsonia Y-289 fulvescens Pichia membranae faciens Y-292 Rhodotorula glutinus Y-319 Saccharomyces cerevisiae Y-357 Saccharomyces carlsbergensis Y-335 ShizosaccharoY-393 rayces pombe 25 30 22 25 2126 00 00 00 7,0 8,0 0 12,2 16,5 22 25 12,5 17,8 00 00

Продолжение табл . 2

444 8172

S 546 Некоторые штаммы обозначаютс  фамилией выделены.

О О

120 120

420 больного, от которого они были

Claims (2)

1. ШТАММ ΡδΕϋϋΟΜΟΝΑδ ЬУТЮА ВКМ В-1454 Д (Всесоюзная коллекция культур микроорганизмов при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР, коллекционный номер ВКМ В-1454Д) — продуцент литического фермента.

   , 6Ц „ 1075740

   1

   1075740
2. 2