SU1070164A1

SU1070164A1 - Способ получени иммобилизованной монофенол-монооксигеназы

Info

Publication number: SU1070164A1
Application number: SU823464475A
Authority: SU
Inventors: Анна Борисовна Емец; Валерия Петровна Гаврилова; Наталья Александровна Гончарова; Юрий Евгеньевич Казакевич; Наталья Ивановна Свердлова; Надежда Константиновна Григорьева; Людмила Николаевна Федорова; Леонард Абрамович Вольф
Original assignee: Ленинградский ордена Трудового Красного Знамени институт текстильной и легкой промышленности им.С.М.Кирова; Ботанический институт им.В.Л.Комарова
Priority date: 1982-07-07
Filing date: 1982-07-07
Publication date: 1984-01-30

Abstract

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ МОНОФЕНОЛ-МОНООКСИГЕНАЗЫ путем обработки органического носител раствором, содержащим монофенол-монооксигенаэу , отличающийс тем, что, с целью сохранени активности фермента при иммобилизации и упрощени процесса, в качестве носител используют аминосодержащее полиакрилонитрильное волокно с обменной емкостью 2-3 ммоль/г, а в качестве раствора, содержащего фермент, используют культуральный фильтрат базидиапьного гриба Coriolus hirsutus. (Л

Description

Изобретение относитс к получению ико4ОбилизованнЕ2Х ферментов, в частности полифенолмолофенап--моно.оксигеназы (попифенолоксидазы), котора может быть использована как катализато со специфической и контролируемой активностью в химической промышленности и в производстве дубильных веществ, а также в прикладной биохимии и кшкробиологии.

Известен способ иммобилизации про кишленной грибной монофенол-монооксиГЁназы вЖИДКИХ мембранах til

Недостатками способа вл ютс слолость получени жидких мембран, их нестабильность, а также невозможност многократного использовани иммобилизованного эакапсулированного фермент в технологическом цикле из-за малой механической устойчивости эмульсий иммобилизованных ферментов.

Наиболее близким по технической сущности и, достригаемому результату к предлагаемому вл етс способ получени иммобилизованной мойофенолмонойксигенаэы путем обработки органи ческрго носител (энзакрил АА) раствором , содержащим монофенол-монооксигенаэу . Способ заключаетс в ковалентНой иммобилизации фермента на органическом носителе (энзакриле АА) с помощью реакции азосочетани С21.

- .

Недостатками изнестнрго способа Явл ютс ннзка удельна активность целевого продукта (25% от активности растворимого) и длительность иммобилизацйи (65 ч)о

цельИзобретени - сохранение активности фермента при иммобилизации и упрощени процесса.

Поставленна цель достигаетс тем, что согласно способу получени иммобилизованной монофенол-монооксигеназы путем обработки органического носител раствором, содержащим монофенол-монооксигеназу , в качестве носител используют аминосодержащее полиакрилонитрильное волокно с обменной емкостью 2-3 ммоль/г, а в качестве раствора, содержащего фермент, используют культуральный фильтрат базидиального гриба Coriolus hirsutus.

Предлагаемый способ позвол ет использовать полифенолоксидазы, продуцируемые базидиальным грибом Cori- olxis hirsutus, т.е. вести иммобилиза цию из неочищенных культуральных фильтратов, что обеспечивает возможность исключить стсщии осаждени , фильтрации и очистки фермента и таким образом использовать дл иммобилизации более дешевый и доступный продукт.

Иммобилизованна на волокнистом носителе полифенолоксилаэа вл етс биологически активным гетерогенным катализатором, что, во-первых, позвол ет использовать иммобилизованную полифенолоксидазу, многократно, так как легко осуществить отделение волокна от растворимых продуктов реакции и субстрата, а во-вторых, обеспечивает возможность перевода периодических технологических процессов на непрерывный режим.

Кроме того, -способ иммобилизации отличаетс простотой и высоким качестве получаемого продукта (выход по активности достигает 85-9в%).

Способ осуществл ют следующим образом.

Фермент полифенолоксидазу получают выращиванием базидиального гриба Coriolis hirsutus поверхностным способом на питательной среде, содержащей , г: глюкоза 10, пептон 3, KHjPOi, 0,6, KallPOi. 0,4, MgS04-7HtO 0,5 и СиЗОц 50 мг, ГеЗОг, 7НгО 5 мг И 2 -л водопроводной водыс Продолжительность выращивани гриба составл ет 10 сут при 24-26 с. Данный штамм синтезирует внеклеточную полифеноло ксидазу , активность которой состав лет 1,48-5,23 ед/мг белкаJ Активность определ ют по окислению пиро1 атехина и парафенилендиамина.

Дл иммобилизации навеску аминосодержащего полйакрилонитрильного волокна обрабатывают в течение 30-60 мин культуральным фильтратом, полученным в результате выращивани гриба Coriolis birsutus , По оконча:нии обработки продукт промывают дистиллированной водой.

Пример 1. Аминосодержащее полнакрнлонитрильное волокно. (0,5 г) обменной емкостью 2 ммоль/г обрабатывают в течение 30 мин при 18 С 50 МП культурального фильтрата базидиального гриба Coriolis hirsutus с активно9тью 1,48 ед/мг белка Продукт отмывают дистиллированной водой Получают препарат с активностью 4,17 ед/г волокна (90% от исходной).

Пример 2. Аминосодержащее полиакрилонитрильное волокно 0,5 г емкостью 2,5 ммоль/г обрабатывают в течение 45 мин при 20С 50 мл культурального фильтрата базидиального гриба Coriolus hirsutus с активность 4,13 ед/мг белка. Продукт отмывают дистиллированной водой Получают препарат с активностью 25,9 ед/г волокна (85% от исходной).

Пример 3i Аминосодержащее полиакрилонитрильное волокно 0,5 г с емкостью 3 ммоль/г обрабатывают в течение 60 мин при 50 мл культурального фильтрата базидиального гриба Coriolus hirsutus с активность 5,23 ед/мг белка. Продукт отмывают дистиллированной водой. Получают препарат с активностью 40 ед/г волокна (80% от исходной). При иммобилизации фермента происходит образование стабильного комплекса фермент-волокно, что подтверждаетс устойчивостью св зи между носителем и ферментом, котора не разрываетс в ацетатном и фосфатном буфере с различной ионной силой и рН. Наиболее веро тно, что св зь белка с носителем осуществл етс в данном случае по механизму координационно-ионной иммобилизации с образо ванием комплекса металлосодержащий фермент - аминосодержаща хелатообра зующа группировка волокнистого носи тел . Стабильность комплекса фермент волокно оцениваетс в конкретных технологических процессах, в частнос ти при окислении о-дефенолов. . , Полученные образцы иммобилизованного фермента на аминосодержащем волокне имеют высокую стабильность, позвол кидую использовать их многократно , За 7 циклов использовани активность снижаетс только на 30%. Иммо билизованный фермент обладает более высокой термостабильностью, чем рас воримый. Определение активности провод т ,по методу, основанному на измерении активности фермента по скорости обра зовани сине-фиолетовой окраски окис ленного диметил-п-фенилендиамина в присутствии пирокатехина. Активность А вычисл ют по найденной скорости реакции по формуле 4 - Е(а-а. Ъ) . 7Т где Е - зкстинкци (0,200) J а - отношение количества жидкос ти, вз тоЯ дл приготовлени выт жки; 5 - степень дополнительного раз ведени выт жки; S - степень посто нного разведени выт жки в реакционной смеси; с - толщина сло (2 см); t - врем (в секундах). При иммобилизации монофспил-монооксигёназы в услови х, параметры которых наход тс ниже указанных пределов , не достигаетс удовлетворительных результатов по активности иммобилизованной на волокне полифенол оксидазы„ Превьииеиие этих условий не обеспечивает роста активности фермента на волокне и вл етс неэкономичным . Использование в качестве носител аминосодержащего полиакрилонитрильного волокна емкостью менее 2 ммоль/г не обеспечивает полного извлечени фермента из культурапьного фильтрата, а применение волокна емкостью выше 3 ммоль/г -нецелесообразно , поскольку при этом не наблюдаетс роста активности иммобилизованного фермента. Иммобилизаци фермента на волокнистом носителе непосредственно из культурального фильтрата базидиальных грибов экономически нецелесообразна , во-первых, из-за исключени таких стадий выделени и очистки фермента, как осаждение и фильтраци . Во-вторых, стоимость культурального фильтрата невелика по сравнению с чистым ферментом и составл ет около 30 руб/т. Иммобилизации непосредственно из культурального фильтрата позвол ет снизить расход на получение фермента в 200 раз. Активность иммобилизованной на волокне полифенолоксидазы составл ет 80-90% от исходной , что на 55-65% выше по сравнению с известным способом. Эти свойства позвол ют рекомендовать ферментсодержащие волокна в качестве биокатализатора , волокниста форма которого облегчает возможность проведени ферментативных реакций по непрерывной схеме.

Claims

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ МОНОФЕНОЛ-МОНООКСИГЕНАЗЫ путем обработки органического носителя раствором, содержащим монофенол-монооксигеназу, отличающийся тем, что, с целью сохранения активности фермента при иммобилизации и упрощения процесса, в качестве носителя используют аминосодержащее полиакрилонитрильное волокно с обменной емкостью 2-3 ммоль/г, а в качестве раствора, содержащего фермент, используют культуральный фильтрат базидиального гриба Corio)us hirsutus.