SK8222003A3

SK8222003A3 - Use of a biological material containing three-dimensional scaffolds of hyaluronic acid derivatives for the preparation of implants in arthroscopy and kit for instruments for implanting said biological material by arthroscopy

Info

Publication number: SK8222003A3
Application number: SK822-2003A
Authority: SK
Inventors: Lanfranco Callegaro; Maurilio Marcacci; Fede Sergio Di
Original assignee: Fidia Advanced Biopolymers Srl
Priority date: 2000-12-28
Filing date: 2001-12-27
Publication date: 2003-10-07
Also published as: BR0116641A; NO20032977D0; US7722616B2; JP3839777B2; NO20032977L; CA2433131A1; ATE455565T1; EP1355684B1; ES2340141T3; AU2002219226B2; CZ20031828A3; US20040044416A1; CA2433131C; WO2002053201A1; EP1355684A1; JP2004516892A; DE60141166D1; PL361732A1

Description

Oblasť techniky ' ,

Predložený vynález sa týka použitia biologického materiálu obsahujúceho bunky nesené na trojrozmerných skeletoch, ktoré obsahujú aspoň jeden derivát kyseliny hyalurónovej, na prípravu štepov vhodných na aplikáciu prostredníctvom artroskopie, a súpravy chirurgických nástrojov na implantovanie uvedeného biologického materiálu prostredníctvom artroskopie.

Doterajší stav techniky

Cieľom opravy kĺbovej chrupavky je obnovenie integrity povrchu kĺbu, zníženie bolesti a predchádzanie akémukoľvek ďalšiemu zhoršeniu tkanív.

Kĺbová chrupavka je tkanivo, ktoré umožňuje virtuálny pohyb kĺbu bez trenia. Jej konkrétne biologické vlastnosti umožňujú kĺbu absorbovať sily, ktoré sú aspoň päťkrát väčšie ako telesná hmotnosť. Kĺbová chrupavka, alebo hyalín, má veľmi obmedzenú schopnosť samostatnej opravy, takže typ chrupavky, ktorý sa spontánne regeneruje po poškodení, nemá rovnaké vlastnosti ako pôvodné tkanivo. Je známe ako fibrochrupavka a nemá schopnosť lubrikácie alebo absorpcie mechanického šoku. Finálna fáza degenerácie hyalínovej chrupavky je sprevádzaná bolesťou a obmedzenou mobilitou, ktorá môže spôsobiť zablokovanie kĺbu. Dlhodobo môže degeneratívny proces spôsobiť aj nástup komplikácii, ako napríklad osteoartritídy. V najzávažnejších prípadoch sa musí kĺb, zvyčajne kolenný, nahradiť kovovou protézou. Toto je nákladná procedúra a nie je ani permanentná, keďže mnohé protézy sa musia vymeniť po približne 10 až 15 rokoch. Z tohto dôvodu sa kolenné náhrady uskutočňujú len ako posledná možnosť pre pacientov mladších ako 50 rokov. Lézie kĺbovej chrupavky sa v súčasnosti ošetrujú prostredníctvom artroskopických chirurgických techník, pričom hlavným cieľom je zníženie bolesti, spomalenie degeneračného procesu a, ak je to možné, oprava poškodenia.

-2Na liečenie defektov chrupavky boli doteraz aplikované mnohé spôsoby, a každý z nich má určité výhody (T. Minas a ďalší, „Current concepts in the treatment of articular cartilage defects“, Orthopedics, Jún 1997, zv. 20, č. 6). Jedna takáto technika zahŕňa úpravu okrajov chrupavkového defektu, inými slovami odstránenie poškodení okrajov lézie odstránením akéhokoľvek nekrotického alebo chorého tkaniva. Technika stimulácie drene spočíva v dosiahnutí oblastí subchondriálneho kostréno tkaniva prostredníctvom abrázie alebo perforácie, a tým v simulácii vytvárania fibrínového chuchvalca obsahujúceho pluripotentné kmeňové bunky. Chuchvalec sa potom diferencuje a zaujíma formu, čím vzniká fibrochrupavkové opravené tkanivo. Avšak výsledné tkanivo nemá mechanické vlastnosti, ani fyziologické, ani štrukturálne vlastnosti zdravej, pretrvávajúcej kĺbovej chrupavky.

Iná technika spočíva v implantovaní kúska periostea alebo perichondriového tkaniva, odobratého z rebrovej chrupavky, do defektu. Najprv toto ošetrenie spúšťa vývoj hyalínovej chrupavky, ale opravené tkanivo sa neprichytáva ľahko na okolité zdravé tkanivá a následne osifikuje.

V súčasnosti tím švédskych výskumníkov navrhol ex-vivo techniku štepových autológnych chondrocytov, pri ktorej sa chondrogénne bunky izolujú z malých biopsií chrupavky, pestujú sa in vitro a potom sa opätovne naštepia rovnakému subjektu (M. Brittberg, A. Lindahl, A. Nilsson: „Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplatation“, N. Eng. J. Med: 1994, 331, 889-895). Podľa autorov sa v kultivačnej fáze chondrocyty prechodne de-diferencujú a zmnožia prostredníctvom stimulácie vhodnými rastovými faktormi. Po ich transplantácii do poškodenej oblasti sa obnoví ich fenotypová pamäť a následne sa re-diferencujú na chondrocyty schopné produkovať chrupavkovú matricu hyalínového typu. Chirurgický postup je v skutočnosti dosť zložitý. Predovšetkým, operácia vyžaduje otvorený chirurgický zákrok. Okrem toho musí byť poškodenie chrupavky dobre lokalizované a pokryté krytom s periostea (uskutočňované v priebehu rovnakej operácie). Toto musí byť fixované na chrupavkové tkanivo s vodou nepriepustným utesnením zošitia a fibrínu (autológneho alebo alogénneho), aby sa vytvorila komora, do ktorej môže byť injektovaná autológna bunková

-3suspenzia. V skutočnosti, ak komora nie je perfektne utesnená, bunky budú znova unikať mimo a operácia zlyhá.

Možno zhrnúť, že hlavnými nevýhodami tohto postupu je to, že operácia je náročná na uskutočnenie, technika je invazívna a implantované bunky nie sú perfektne diferencované. Autológe a homológne osteochondrálne štepy zahŕňajú techniky, ktoré sú chirurgicky invazívne a zložité a existuje riziko prenosu vírusu.

Iné pokusy rekonštrukcie kĺbovej chrupavky spočívajú v implantovaní syntetických skeletov obsahujúcich alogénne chondrocyty a rastové faktory schopné stimulovať proliferáciu chondrocytov.

Najčastejšie používanými syntetickými skeletmi sú kolagénový gél, polyanhydrid, polyortoester, kyselina polyglykolová a ich kopolyméry. Hlavnou nevýhodou použitia uvedených skeletov je imunitná odpoveď nasmerovaná proti implantovanému materiálu.

Existujú známe chondrocytové kultúry v gólových skeletoch tvorených agarózou, kyselinou hyalurónovou, fibrínovým lepidlom, kolagénom a alginátom.

Avšak uvedené kultúry v géli neposkytujú vhodnú mechanickú stabilitu, aby ostali adherované na mieste a umožňujú rekonštrukciu chrupavkovej štruktúry. Navyše, chondrocytové kultúry sa v látkach, akou je napríklad fibrín, de-diferencujú na bunky, ktoré sú zjavne podobné s fibroblastami.

Nakoniec, hoci gély tvorené látkami, ako je napríklad agaróza, indukujú chondrocytovú re-diferenciáciu, použitie tejto zlúčeniny nebolo schválené pre vnútorné aplikácie u ľudí.

Ako bolo predtým opísané, defekty kĺbovej chrupavky sa liečili aj so suspenziami izolovaných chondrocytov bez podporných skeletov. Avšak myslí sa, ' . t .

že chondrocyty strácajú svoju životaschopnosť a/alebo neostávajú v defekte, a že môžu tvoriť fibrochrupavku alebo ostrovy chrupavky ponorené do fibrózneho tkaniva (US patent č. 5,723,331).

Na prekonanie tohto problému prihlasovateľ navrhol injektovateľné prostriedky obsahujúce chondrocyty alebo bunky kostnej dreňovej stromy dispergované v matrici obsahujúcej aspoň jeden derivát kyseliny hyalurónovej (PCT prihláška vynálezu č. WO 00/37124).

-4Ako je známe, kyselina hyalurónová hrá vitálnu úlohu v mnohých biologických procesoch, akými sú napríklad hydratácia tkaniva, organizácia proteoglykánu, bunková diferenciácia, proliferácia a angiogenéza (J. Aigner a ďalší, L. Biomed. Mater. Res. 1998, 42,172-181).

Známe je aj použitie derivátov kyseliny hyalurónovej, ako je opísané v EP patente č. 0216453 B1, na prípravu trojrozmerných skeletov vo forme neviazaných tkanín, membrán, špongii, granúl, mikrosfér, rúrok, gáz na in vitro pestovanie kmeňových a mezenchymálnych buniek (zverejnená PCT prihláška vynálezu č. WO 97/18842), vo forme netkanej tkaniny spojenej s perforovanou membránou na in vitro pestovanie fibroblastov a keratinocytov (zverejnená PCT prihláška vynálezu č. WO 96/33750) a vo forme netkanej tkaniny na pestovanie chondrocytov (J. Aigner a ďalší, L. Biomed. Mater Res. 1998,42,172-181).

Podstata vynálezu

Teraz sa prekvapujúco zistilo, že je možné použiť trojrozmerné matrice na báze derivátov kyseliny hyalurónovej ako skelety pre bunkový materiál na implantáciu pacientom pri artroskopii, a že použitie takýchto matríc rieši vyššie uvedené problémy vyskytujúce sa pri artroskopických technikách.

Použitie biologicky kompatibilných a biologicky resorbovateľných trojrozmerných matríc na báze kyseline hyalurónovej, na ktorých rastú bunky, predstavuje veľký krok vpred v artroskopických technikách. V skutočnosti sa bunky začínajú diferencovať na chondrocyty, pričom stále rastú na matrici, vďaka trojrozmernej stimulácii a prítomnosti vhodných rastových faktorov. Bunková diferenciácia s produkciou veľkého množstva hyalínovej matrice potom pokračuje v lézii po zaštepení.

Skutočnosť, že bunky sú už pred implantáciou začlenené do trojrozmerného skeletu so známymi vlastnosťami kyseliny hyalurónovej, ktorými sú biologická kompatibilita a bioresorpcia, eliminuje potrebu periosteálneho poklopu na utesnenie nad defektom, aby sa vytvorilo vodonepriepustné veko, pretože jediným prekrytím defektu, ktoré je potrebné, je také prekrytie, ktoré bude držať štep na mieste pokiaľ sa nezapustí do okolitého chrupavkového tkaniva. Preto všetko čo je potrebné je

-5fibrínové utesňovadlo (autológne alebo alogénne) alebo iné biologické lepidlo počas limitovaného časového úseku. Skutočnosť, že už nie je potrebný poklop peristea, predstavuje inú hlavnú výhodu: artrotómna technika používaná v švédskom modeli môže byť nahradená menej invazívnou a ekonomickejšou artroskopiou.

Podstatou vynálezu je preto použitie biologického materiálu obsahujúceho bunky rastúce na trojrozmerných matriciach obsahujúcich aspoň jeden derivát kyseliny hyalurónovej na prípravu implantátov vhodných na aplikáciu prostredníctvom artroskopickej techniky.

Predložený vynález sa ďalej týka súpravy chirurgických nástrojov na implantáciu vyššie uvedeného materiálu, ktorá obsahuje:

a) sterilizačný podnos;

b) kanylu s relatívne sterilnými ventilmi na použitie v priebehu artroskopie ako vedenie na poskytnutie prístupu k nižšie uvedenej sade nástrojov;

c) mapovač-odoberač vzoriek, ktorý je tvorený dutou, valcovou rúrkou používanou na ohraničenie chrupavkovej lézie vytvorením kruhového otlačku a na odobratie chrupavkového tkaniva v rovnakej kruhovej forme a s rovnakými rozmermi ako otlačok;

d) vodiaci drôt, ktorý sa fixuje pomocou vŕtania do centra lézie, aby sa garantovala stabilita rezača v priebehu použitia;

e) konkávny, dutý rezač-obrusovač používaný na vytvorenie, v rámci okrajov otlačku vyrobeného mapovačom-odoberačom vzoriek, miesta, do ktorého sa bude následne implantovať bunkový podklad skonštruovaný využitím bio-inžinierstva;

f) dutý piest na začlenenie do mapovača-odoberača vzoriek na tlačenie bunkového podkladu skonštruovaného využitím bio-inžinierstva do predtým pripraveného léziového miesta.

Zo všetkých derivátov kyseliny hyalurónovej, ktoré môžu byť použité v trojrozmerných skeletoch podľa predloženého vynálezu, sa zvolili nasledujúce:

estery kyseliny hyalurónovej, v ktorých je časť alebo sú všetky karboxylové funkčné skupiny esterifikované s alkoholmi alifatickej, aromatickej, arylalifatickej, cykloalifatickej alebo heterocyklickej série (EP 0216453 B1);

-6zosieťované estery kyseliny hyalurónovej, v ktorých je časť alebo sú všetky karboxylové funkčné skupiny esterifikované s alkoholovými funkčnými skupinami rovnakého polysacharidového reťazca alebo iných reťazcov (EP 0341745 B1);

zosieťované estery kyseliny hyalurónovej, v ktorých je časť alebo sú všetky karboxylové funkčné skupiny esterifikované s polyalkoholmi alifatickej, aromatickej, arylalifatickej, cykloalifatickej, heterocyklickej série, generujúc zosieťovanie prostredníctvom medzerníkových reťazcov (EP 0265116 B1);

poloestery kyseliny jantárovej alebo soli ťažkých kovov a poloesterov kyseliny jantárovej s kyselinou hyalurónovou alebo s čiastočnými alebo úplnými estermi kyseliny hyalurónovej (WO 96/357207);

O-sulfatované deriváty kyseliny hyalurónovej (WO 95/25751) alebo Nsulfatované deriváty kyseliny hyalurónovej (WO 98/01973);

kvartérne amóniové soli, napríklad soli s tetrabutylamóniom a fenyľtrimetylamóniom kyseliny hyalurónovej alebo jej derivátov vybraných zo skupiny, ktorá obsahuje /V-sulfatovanú kyselinu hyalurónovú, O-sulfatovanú kyselinu hyalurónovú, poloestery kyseliny jantárovej s kyselinou hyalurónovou, ktoré môžu čiastočne tvoriť soli s ťažkými kovmi;

O-sulfatovanú alebo /V-sulfatovanú kyselinu hyalurónovú a jej deriváty, kovalentne naviazané na polyuretán (WO 99/43728).

Predložené trojrozmerné skelety môžu obsahovať aj spojenie niekoľkých druhov derivátov kyseliny hyalurónovej a môžu byť v rôznych formách, ako napríklad vo forme netkanej tkaniny, ako je opísané v US 5520916, sietí podľa patentu č. EP 216453 B1, perforovaných membrán ako je opísané v EP 462426 B1, neperforovaných membrán, ako v EP 216453 B1 a špongii, ako je opísané v EP 216453 B1.

Takéto matrice môžu zahŕňať aj zoskupenie s prírodnými, polosyntetickými alebo syntetickými polymérmi.

Prírodnými polymérmi, ktoré môžu byť použité v súlade s predloženým vynálezom, sú napríklad kolagén, koprecipitáty kolagénu a glykozaminoglykánov, celulóza, polysacharidy vo forme gélov, ako napríklad chitín, chitosan, pektín alebo pektínová kyselina, agar, agaróza, xantán, gelán, alginová kyselina alebo algináty, polymanán alebo polyglykány, škrob, prírodné gumy.

-7Polosyntetické polyméry môžu byť zvolené napríklad zo skupiny, ktorá obsahuje kolagén zosieťovaný s činidlami, akými sú aldehydy alebo ich prekurzory, dikarboxylové kyseliny alebo ich halogenidy, diamíny, deriváty celulózy, kyselina hyalurónová, chitín alebo chitosan, gelán, xantán, pektín alebo pektínová kyselina, polyglykány, polymanán, agar, agaróza, prírodná guma a glykozaminoglykány.

Nakoniec, príkladmi syntetických polymérov, ktoré môžu byť použité, sú polymliečna kyselina, polyglykolová kyselina, ich kopolyméry alebo deriváty, polydioxány, polyfosfazény, polysulfónové živice, polyuretány a PTFE.

Predložené trojrozmerné skelety môžu zahŕňať aj farmaceutický alebo biologicky aktívne zložky, ako napríklad protizápalové činidlá, antibiotiká, rastové faktory, antimikotiká, antimikrobiálne a antivírusové činidlá.

Bunky použité na prípravu predloženého biologického materiálu boli zvolené z chondrocytov, osteocytov, mezenchymálnych buniek a kmeňových buniek.

Bunkový kultivačný proces použitý na výrobu biologického materiálu podľa vynálezu je opísaný v Aigner a ďalší, „Cartilage tissue engineering with novel unwoven structured biomaterial based on hyaluronic acid benzyl ester“, J. Biomed. Mat. Res. 1998, 42(2), 172-181.

Od siedmeho dňa po nasadení na trojrozmerný skelet založený na derivátoch kyseliny hyalurónovej, a výhodne po štrnástom dni, je biologický materiál pripravený na zaštepenie.

Predložený biologický materiál môže byť redukovaný na veľkosť chrupavkového defektu s baličom, ako sa používa v mozaikplastike v priebehu procesu zaštepovania, teda v priebehu chirurgického zákroku, tesne pred zavedením chirurgického nástroja. Alternatívne môže materiál prechádzať cez kanylu, nástroj, ktorý sa bežne používa v artroskopii, alebo použitím chirurgických nástrojov súpravy na artroskopiu, ktorá je ďalším predmetom predloženého vynálezu.

Biologický materiál podľa vynálezu môže byť používaný aj na prípravu tak autológnych, ako aj alogénnych štepov vhodných na aplikáciu prostredníctvom artroskopických techník.

Iná výhoda predloženého vynálezu spočíva v skutočnosti, že uvedený biologický materiál sa môže zachovávať pri nízkych teplotách, aby sa zachovali jeho

-8vlastnosti bunkovej životaschopnosti, pripravený na implantáciu, ktorá sa uskutoční v budúcnosti.

Súpravové nástroje na implantáciu biologického materiálu, ktorý sa má použiť v artroskopii podľa predloženého vynálezu, bol skonštruovaný použitím materiálov s výhodnými vlastnosťami, sú uvedené nižšie:

Kanyla vyššie opísaná ako položka (b) používaná ako vedenie na poskytnutie prístupu v artroskopii k sade nižšie uvedených nástrojov a znázornená na obrázkoch 6(1), 6(11), 8 (označená vzťahovou značkou 5), je z Aise 316 ocele a má vnútorný priemer 11,5 mm a dĺžku 111 mm. Na vyššie uvedených obrázkoch nie sú znázornené sterilné ventily.

Mapovač-odoberač vzoriek, predtým uvedený ako položka (c), sa používa na ohraničenie chrupavkovej lézie vytvorením kruhového otlačku a na vyrezanie a odobratie kúska chrupavkového tkaniva s rovnakým tvarom a veľkosťou, a je znázornený na obrázkoch 3, 6(l), 6(ll) a 8 (označený vzťahovou značkou 1), je kanylou z Aise 316 medicínskej ocele, s dĺžkou 155 mm, s vonkajším priemerom

10.5 mm a vnútorným priemerom 9 mm. Mapovač-odoberaz vzoriek 1 v súprave podľa predloženého vynálezu je dutým valcom, ktorý je dostatočne veľkým na to, aby pojal piest a okrem toho je charakteristický tým, že má konkávnu špičku, ako mapovač-odoberač vzoriek a kontrolný systém, ktorým je možné prerušiť tlak vyvíjaný postupujúcim piestom.

Vodiaci drôt, predtým uvedený ako položka (d), fixovaný pomocou vŕtania do centra lézie, aby sa stabilizoval rezač pri použití, a znázornený na obrázku 7(1) (označený vzťahovou značkou 3), má priemer 1 mm.

Konkávny dutý rezač-obrusovač, predtým uvedený ako položka (e), používaný na vytvorenie miesta, do ktorého sa umiestni biologický materiál na použitie v artroskopii podľa predloženého vynálezu na následné zaštepenie, v rámci okrajov otlačku zanechaného mapovačom 1, a znázornený na obrázkoch 5 a 7(1) a 7(11) (označený vzťahovou značkou 4) je z Aise 316 medicínskej ocele, má dĺžku

162.5 mm s vnútorným priemerom 1,2 mm a vonkajším priemerom 9,5 mm.

Lopatky rezača 4 sú konkávne tak, aby vytvárali konvexné povrchy. Dutý piest predtým uvedený ako položka (e), ktorý sa zavádza do mapovača-odoberača 1 vzoriek, tlačí biologický materiál na použitie v artroskopii podľa predloženého

-9vynálezu do predtým pripraveného léziového miesta, a je znázornený na obrázkoch 4, 6(1), 6(11) a 8 (označený vzťahovou značkou 2), má priemer 5 mm a dutý valec je dostatočne veľký na to, aby pojal vodiaci drôt, a zahŕňa konkávnu špičku ako mapovač.

Použitie uvedených nástrojov umožňuje uskutočňovanie nasledujúcej operatívnej techniky:

a) pneumatický turniket sa umiestni okolo proximálnej oblasti končatiny, kde sa artroskopiou identifikuje léziová oblasť,

b) ihla sa použije na identifikáciu miesta vstupu priamo nad léziou,

c) koža sa rozreže skalpelom a do miesta vstupu sa zavedie kanyla 5, cez ktorú sa bude zavádzať mapovač-rezač 1, aby sa vytvoril kruhový otlačok vo vnútri lézie, s priemerom 9 mm (mapovacia operácia);

d) cez mapovač 1 prechádza konkávny, dutý piest 2 a cez tento sa zase zavádza vodiaci drôt s priemerom 1 mm, fixovaný pomocou vŕtania do centra otlačku. Tento vodiaci drôt bude slúžiť na stabilizáciu následnej rezacej operácie;

e) tak mapovač 1, ako aj piest 2 sa odstránia a zavedie sa konkávny rezač 4 s rovnakou veľkosťou ako skôr použitý mapovač J. Držaním rezača kolmo na léziu, tá sa vyformuje, a zostane na distálnom bode označenom na rezači;

f) použitím mapovača-odoberača vzoriek 1 sa biologický materiál, ktorého rozmery boli „zmapované predtým, obsahujúci bunky rastúce na trojrozmernom skelete skonštruovanom bio-inžinierstvom, pripraví a zavedie cez kanylu 1 spolu s konkávnym piestom 2, čo umožňuje, aby bol biologický materiál aplikovaný do lézie;

g) dutý konkávny piest 2 vytlačí skelet z mapovača 1 do konvexnej dutiny lézie;

i) kĺb je opätovne ohnutý a narovnaný, aby sa skontrolovala stabilita štepu;

j) pneumatický turniket sa uvoľní a artroskopické zariadenie (optika a kanyla 5) sa odstráni.

Súprava podľa predloženého vynálezu sa môže použiť aj na implantáciu trojrozmerných skeletov obsahujúcich autológne a/alebo alogénne bunky, ktoré môžu byť tvorené prírodnými, polosyntetickými alebo syntetickými polymérmi bez derivátov kyseliny hyalurónovej.

-10Prírodné polyméry sú zvolené zo skupiny, ktorá obsahuje kolagén, koprecipitáty kolagénu a glykozaminoglykánov, celulózu, polysacharidy vo forme gélov, ako napríklad chitín, chitosan, pektín alebo pektínovú kyselinu, agar, agarózu, xantán, gelán, alginovú kyselinu alebo algináty, polymanany alebo polyglykány, škrob, prírodné gumy.

Zvolené môžu byť nasledujúce polosyntetické polyméry: kolagén zosieťovaný s činidlami, akými sú aldehydy alebo ich prekurzory, dikarboxylové kyseliny alebo ich halogenidy, diamíny, deriváty celulózy, kyselina hyalurónová, chitín alebo chitosan, gelán, xantán, pektín alebo pektínová kyselina, polyglykány, polymanán, agar, agaróza, prírodná guma a glykozaminoglykány.

Syntetické polyméry sú volené zo skupiny, ktorá obsahuje polymliečnu kyselinu, polyglykolovú kyselinu, ich kopolyméry alebo deriváty, polydioxány, polyfosfazény, polysulfónové živice, polyuretány a PTFE.

Navyše, trojrozmerné skelety podľa predloženého vynálezu môžu okrem buniek obsahovať farmaceutický alebo biologicky aktívne látky, ako napríklad protizápalové činidlá, antibiotiká, rastové faktory, antimikotické alebo antivírusové činidlá, a môžu byť uchovávané zamrazením, aby sa zachovali ich vlastnosti bunkovej životaschopnosti pripravené na následne zaštepovanie artroskopiou použitím sady nástrojov nárokovaných nižšie.

Účel nasledujúcich príkladov je ilustračný a príklady neobmedzujú rozsah predloženého vynálezu.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázky 1 a 2 znázorňujú výsledky príkladov 3 a 4 pokiaľ sa týkajú obnovenia bunkovej životaschopnosti vyjadrenej ako optická hustota, respektíve vo forme stĺpcových grafov, kde optická hustota je uvedená na koordináte pri 470 nm, vyjadrená v absolútnych jednotkách meraných s prietokovým spektrofotometrom.

Obrázok 3(l) znázorňuje schematický bočný pohľad a obrázok 3(ll) schematický pohľad v priereze pozdĺž osi A-A na mapovač-odoberač vzoriek.

Obrázok 4(l) znázorňuje schematický bočný pohľad a obrázok 4(ll) schematický pohľad v priereze pozdĺž osi B-B na dutý piest.

-11 Obrázok 5(l) znázorňuje schematický bočný pohľad, obrázok 5(l I) znázorňuje schematický pohľad v priereze pozdĺž osi A-A, obrázok 5(lll) znázorňuje pohľad spredu a obrázok 5(IV) znázorňuje schematický a predĺžený (3:1) pohľad spredu na konkávny dutý rezač-obrusovač.

Obrázky 6(l) a 6(ll) schematicky znázorňujú mapovač-odoberač vzoriek pri vytváraní otlačku okolo lézie.

Obrázky 7(l) a 7(ll) predstavujú schematické znázornenie rezača stabilizovaného vodiacim drôtom fixovaným v centre lézie v akcii.

Obrázok 8 ukazuje schematické znázornenie mapovača-odoberača vzoriek kompletne s piestom ako umiestňuje biologický materiál obsahujúci bunky rastúce na trojrozmernom skelete, ktorý bol predtým odrezaný rezacom.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Príprava biologického materiálu

Proces kultivácie buniek je opísaný v Brun a ďalší, „Chondrocyte aggregation and reorganisation into three dimensional scaffolds“, J. Biomed. Mater. Res. 1998, 46, 337-346. Chrupavkové tkanivo z nepostihnutej oblasti na okraji lézie sa odpojí ošetrením s kolagenázou typu II a takto získané bunky sa vysejú na misky obsahujúce HAM F12 médium doplnené fetálnym teľacím sérom, 1% streptomycínom-penicilinom, 1% glutamínom a s nasledujúcimi faktormi, pričom množstvo každého z nich je v rozsahu medzi 1 a 10 ng/ml: TGF β1, rekombinantný ľudský EGF, rekombinantný ľudský inzulín a rekombinantný ľudský bFGF.

Bunky sa pestujú in vitro jednu až štyri sériové pasáže, potom sa presadia na HYALOGRAFT®C (netkaná tkanina založená na HYAFF®11t - celkový benzylester kyseliny hyalurónovej) s hustotou buniek 0,5x10⁶ až 4x10⁶ buniek/cm², a v kultivačnom médiu opísanom vyššie. Pri každej výmene média (2 až 10 ml každých 48 až 72 hodín) sa pridáva 50 μρ/ηηΙ kyseliny askorbovej.

-12Príklad 2

Hodnotenie životaschopnosti buniek MTT testom

Životaschopnosť buniek biologického materiálu sa determinuje prostredníctvom inkorporácie vírusovej MTT farbičky (F. Dezinot, R. Lang „Rapid colorimetric assay for celí growth and survival. Modification to the tetrazolium dye procedúre giving improved sensitivity and reliability“ J. Immunol. Methods, 1986, 22(89), 271-277). Roztok pripravený rozpustením 0,5 mg/ml MTT vo fosfátovom tlmivom roztoku, pH 7,2 (PBS) sa pridal k testovanému materiálu a umiestni sa do inkubátorového setu pri 37 °C na 4 hodiny. Po ukončení inkubácie sa MTT roztok odsaje, materiál sa niekoľkokrát premyje s PBS, a potom sa pridá 5 ml extrakčný roztok tvorený 10% dimetylsulfoxidom v izopropylalkohole. Po centrifugácii sa determinuje absorbancia supernatantu spektrofotometrickým odčítaním pri 470 nm.

Príklad 3

Verifikácia obnovenia bunkovej životaschopnosti po prechode cez kanylu

MTT test ako je opísaný v príklade 2 sa použije na overenie obnovenia bunkovej životaschopnosti po prechode cez kanylu, nástroj bežne používaný v artroskopii a tu používaný na umiestnenie biologického materiálu.

Výsledky sú uvedené na obrázku 1, ktorý znázorňuje obnovenie bunkovej životaschopnosti vo vzťahu k chrupavkovému konštruktu skonštruovanému prostredníctvom bio-inžinierstva (Hyalograft®C, rozmery 2x2 cm), pripravenom ako je opísané v príklade 1. Po 72 hodinách od jeho zbalenia, teda v podmienkach maximálneho metabolického stresu, sa biomateriál jemne extrudoval cez kanylu s priemerom 9 mm. Zistilo sa, že prechod cez dutinu kanyly nemodifikuje bunkovú životaschopnosť predloženého materiálu.

Príklad 4

Verifikácia obnovenia bunkovej životaschopnosti po zbalení s mozaikplastikovým baličom

-13Znova použitím MTT testu opísaného vyššie v príklade 2 sa uskutočňuje verifikácia životaschopnosti konštruktu navrhnutého bio-inžinierstvom, ktorý je zmenšený na požadované rozmery s baliacim nástrojom používaným v mozaikplastike, čím sa napodobujú podmienky, pri ktorých sa zmenšuje prostredníctvom bio-inžinierstva skonštruovaný materiál na veľkosť, ktorá súhlasí s poškodenou chrupavkou určenou na zaštepovanie, teda v priebehu chirugického zákroku, hneď pred jeho zavedením s chirurgickým nástrojom.

V tomto experimente sa bunkový konštrukt udržiaval zabalený až do dátumu expirácie produktu (72 hodín), potom sa rozdelil na rezy s priemerom 9 mm s baličom používaným v mozaikplastike. Životaschopnosť jednotlivých kúskov bola normalizovaná prostredníctvom povrchovej jednotky a porovnávaná so zvyšným biologickým materiálom.

Obrázok 2 znázorňuje výsledky experimentu.

Vyššie opísané testy bunkovej životaschopnosti demonštrovali, že aplikácia predloženého materiálu prostredníctvom artroskopie, to znamená biologických konštruktov, ktoré dosiahli svoj dátum expirácie (72 hodín) v podmienkach maximálneho metabolického stresu, neovplyvňuje ich biologické kvality. A to bez ohľadu na typ chirurgického nástroja použitého na zmenšenie materiálu a bez ohľadu na podmienky balenia produktu.

Pri takto opísanom vynáleze je zrejmé, že použité materiály a metódy môžu byť modifikované rôznymi spôsobmi. Takéto modifikácie nie sú považované za vybočenia z ducha a účelu vynálezu a akákoľvek takáto modifikácia, ktorá by bola evidentná pre odborníka v oblasti, spadá do rozsahu nasledujúcich nárokov.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použitie biologického materiálu obsahujúceho bunky na podklade trojrozmerných skeletov, ktoré obsahujú aspoň jeden derivát kyseliny hyalurónovej, na prípravu autológnych a/alebo alogénnych štepov vhodných na implantáciu prostredníctvom artroskopických techník.
2. Použitie podľa nároku 1, kde sú autológne a/alebo alogénne bunky zvolené zo skupiny, ktorá zahrnuje chondrocyty, osteocyty, mezenchymálne a kmeňové bunky.
3. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 alebo 2, kde trojrozmerné sklelety ďalej obsahujú prírodné, polosyntetické alebo syntetické polyméry.
4. Použitie podľa nároku 3, kde sú prírodné polyméry zvolené zo skupiny, ktorá zahrnuje kolagén, koprecipitáty kolagénu a glykozaminoglykánov, celulózu, polysacharidy vo forme gélov, ako napríklad chitín, chitosan, pektín alebo pektínovú kyselinu, agar, agarózu, xantán, gelán, alginovú kyselinu alebo algináty, polymanán alebo polyglykány, škrob a prírodné gumy.
5. Použitie podľa nároku 3, kde sú polosyntetické polyméry zvolené zo skupiny, ktorá zahrnuje kolagén zosieťovaný s činidlami, akými sú aldehydy alebo ich prekurzory, dikarboxylové kyseliny alebo ich halogenidy, diamíny, deriváty celulózy, kyselina hyalurónová, chitín alebo chitosan, gelán, xantán, pektín alebo pektínová kyselina, polyglykány, polymanán, agar, agaróza, prírodná guma a glykozaminoglykány.
6. Použitie podľa nároku 3, kde sú syntetické polyméry zvolené zo skupiny, ktorá zahrnuje polymliečnu kyselinu, polyglykolovú kyselinu, ich kopolyméry alebo deriváty, polydioxány, polyfosfazény, polysulfónové živice, polyuretány a PTFE.
7. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 6, kde sú deriváty kyseliny hyalurónovej vybrané zo skupiny, ktorá zahrnuje:

i) estery kyseliny hyalurónovej, v ktorých je časť alebo sú všetky karboxylové funkčné skupiny esterifikované s alkoholmi alifatickej, aromatickej, arylalifatickej, cykloalifatickej alebo heterocyklickej série;

ii) zosieťované estery kyseliny hyalurónovej, v ktorých je časť alebo sú všetky karboxylové funkčné skupiny esterifikované s alkoholovými funkčnými skupinami rovnakého polysacharidového reťazca alebo iných reťazcov;

iii) zosieťované estery kyseliny hyalurónovej, v ktorých je časť alebo sú všetky karboxylové funkčné skupiny esterifikované s polyalkoholmi alifatickej, aromatickej, arylalifatickej, cykloalifatickej, heterocyklickej série, generujúc zosieťovanie prostredníctvom medzerníkových reťazcov;

iv) poloestery kyseliny jantárovej alebo soli ťažkých kovov a poloesterov kyseliny jantárovej s kyselinou hyalurónovou alebo s čiastočnými alebo úplnými estermi kyseliny hyalurónovej;

v) O-sulfatované alebo /V-sulfatované deriváty kyseliny hyalurónovej;

vi) kvartérne amóniové soli, napríklad soli s tetrabutylamóniom a fenyltrimetylamóniom kyseliny hyalurónovej alebo jej derivátov vybraných zo skupiny, ktorá zahrnuje N-sulfatovanú kyselinu hyalurónovú, O-sulfatovanú kyselinu hyalurónovú, poloestery kyseliny jantárovej s kyselinou hyalurónovou, ktoré môžu čiastočne tvoriť soli s ťažkými kovmi;

vii) O-sulfatovanú alebo A/-sulfatovanú kyselinu hyalurónovú a jej deriváty, kovalentne naviazané na polyuretán.
8. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 7, kde trojrozmerné skelety pozostávajú z najmenej jedného derivátu kyseliny hyalurónovej.
9. Použitie podľa nároku 8, kde sú skelety vo forme netkanej tkaniny.
10. Použitie podľa nároku 8, kde sú skelety vo forme sít.
11. Použitie podľa nároku 8, kde sú skelety vo forme neperforovaných membrán.
12. Použitie podľa nároku 8, kde sú skelety vo forme perforovaných membrán.
13. Použitie podľa nároku 8, kde sú skelety vo forme špongií.
14. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 13 v spojení s farmaceutický alebo biologicky aktívnymi zložkami.
15. Použitie biologického materiálu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3, kde biologicky materiál sa predtým zakonzervuje mrazením, aby sa zachovali charakteristiky bunkovej životaschopnosti pripravené pre štepy, ktoré sa majú aplikovať v budúcnosti.
16. Súprava chirurgických nástrojov na implantáciu prostredníctvom artroskopického chirurgického zákroku pozostávajúca z:

a) biologického materiálu obsahujúceho bunky na podklade trojrozmerných skeletov, ktoré obsahujú aspoň jeden derivát kyseliny hyalurónovej, alebo

β) biologického materiálu obsahujúci bunky rastúce na trojrozmerných skeletoch skonštruovaných prostredníctvom bio-inžinierstva, ktoré sú bez derivátov kyseliny hyalurónovej, vyznačujúca sa tým, že obsahuje:

a) sterilizačný podnos;

b) kanylu (5) s relatívne sterilnými ventilmi na použitie v priebehu artroskopie ako vedenie na poskytnutie prístupu k nižšie uvedenej sade nástrojov;

c) mapovač-odoberač (1) vzoriek, ktorý je tvorený dutou, valcovou rúrkou používanou na ohraničenie chrupavkovej lézie vytvorením kruhového otlačku a zároveň na odobratie chrupavkového tkaniva v rovnakej kruhovej forme a s rovnakými rozmermi ako otlačok;

d) vodiaci drôt (3), ktorý sa fixuje pomocou vŕtania do centra lezie na garantovanie stability rezača-obrusovača (4) v priebehu použitia;

e) rezač-obrusovač (4) na vytvorenie, v rámci okrajov otlačku vyrobeného mapovačom-odoberačom (1) vzoriek, miesta, do ktorého sa bude následne implantovať biologický materiál (a) alebo biologický materiál (β);

f) dutý piest (2) na zasunutie dovnútra mapovača (1) na zatlačenie biologického materiálu, biologického materiálu (a) alebo biologického materiálu (β), do predtým pripraveného léziového miesta.
17. Súprava podľa nároku 16, vyznačujúca sa t ý m , že mapovačodoberač (1) vzoriek je dutý, aby sa piest mohol doňho zasunúť, a má konkávnu špičku, ktorá adheruje na kruhový povrch kĺba, a má kontrolný systém, ktorým je možné prerušiť tlak vyvíjaný postupujúcim piestom.
18. Súprava podľa nároku 16, vyznačujúca sa t ý m, že piest (2) je dutý valec dostatočne veľký na to, aby v ňom bol umiestnený vodiaci drôt, a že má konkávnu špičku ako mapovač.
19. Súprava podľa nároku 16, vyznačujúca sa tým, že lopatky rezača (4) sú konkávne, aby produkovali konvexné povrchy.
20. Súprava podľa ktoréhokoľvek z nárokov 16 až 19, vyznačujúca sa tým, že bunky biologického materiálu (β) sú autológne a/alebo alogénne a sú zvolené zo skupiny, ktorá zahrnuje chondrocyty, osteocyty, mezenchymálne a kmeňové bunky. '
21. Súprava podľa ktoréhokoľvek z nárokov 16 až 19, vyznačujúca sa tým, že trojrozmerný skelet biologického materiálu (β) obsahuje prírodné, polosyntetické alebo syntetické polyméry.
22. Súprava podľa nároku 21, vyznačujúca sa tým, že prírodné polyméry sú zvolené zo skupiny, ktorá zahrnuje kolagén, koprecipitáty kolagénu a glykozaminoglykánov, celulózu, polysacharidy vo forme gélov, ako napríklad chitín, chitosan, pektín alebo pektínovú kyselinu, agar, agaróza, xantán, gelán, alginovú kyselinu alebo algináty, polymanán alebo polyglykány, škrob a prírodné gumy.
23. Súprava podľa nároku 21, vyznačujúca sa tým, že polosyntetické polyméry sú zvolené zo skupiny, ktorá zahrnuje kolagén zosieťovaný s činidlami, akými sú aldehydy alebo ich prekurzory, dikarboxylové kyseliny alebo ich halogenidy, diamíny, deriváty celulózy, kyselina hyalurónová, chitín alebo chitosan, gelán, xantán, pektín alebo pektínová kyselina, polyglykány, polymanán, agar, agaróza, prírodná guma a glykozaminoglykány.
24. Súprava podľa nároku 21, vyzn a čuj ú ca sa t ý m , že syntetické polyméry sú zvolené zo skupiny, ktorá zahrnuje polymliečnu kyselinu, polyglykolovú kyselinu, ich kopolyméry alebo deriváty, polydioxány, polyfosfazény, polysulfónové živice, polyuretány a PTFE.
25. Súprava podľa ktoréhokoľvek z nárokov 16 až 24,vyznačujúca sa tým, že biologický materiál (β) ďalej obsahuje farmaceutický alebo biologicky aktívne zložky.
26. Súprava podľa nároku 25, vyznačujúca sa tým, že farmaceutický alebo biologicky aktívne zložky sú zvolené zo skupiny, ktorá obsahuje protizápalové činidlá, antibiotiká, rastové faktory, antimikotiká a antivírusové činidlá.
27. Súprava podľa ktoréhokoľvek z nárokov 16 až 26, vyznačujúca sa tým, že biologický materiál (β) sa zakonzervuje zmrazením, aby sa zachovali charakteristiky bunkovej životaschopnosti pre budúce štepy aplikované artroskopiou.