SK71696A3

SK71696A3 - A method of microbiological production of heteroaromatic carboxylic acids by using microorganizms of genus alcaligenes

Info

Publication number: SK71696A3
Application number: SK716-96A
Authority: SK
Inventors: Andreas Kiener; Jean-Paul Roduit; Rainer Gloeckler
Original assignee: Lonza Ag
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-04
Publication date: 1997-01-08
Also published as: NO319146B1; EP0747486B1; CA2177651A1; SK281873B6; HUP9601582A2; JPH08332094A; CN1127573C; DK0747486T3; US5702930A; HU9601582D0; KR970001546A; ATE186328T1; CZ163696A3; PT747486E; KR100471703B1; HUP9601582A3; NO962389L; JP3810860B2; DE59603534D1; EP0747486A1

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka nového mikrobiologického spôsobu výroby heteroaromatických karboxylových kyselín alebo ich fyziologicky znesiteľných solí všeobecných vzorcov

COOH

kde R\ r2 sú rovnaké alebo rozdielne a znamenajú atóm vodíka alebo atóm halogénu a X znamená atóm dusíka alebo —CH—.

Doterajší stav techniky

Heteroaromatické karboxylové kyseliny ako napríklad kyselina 6hydroxypikolínová sú dôležitými medziproduktami na výrobu farmaceutík, ako napríklad na výrobu 2-oxypyrimidínu (Berichte der Deutschen Chemischen Gesellschaft 1912, 45, str. 2456—2467) alebo na výrobu herbicídov (EP-A 0 447 004).

Všeobecne je známe, že mikroorganizmy, ktoré obsahujú nitrilhydratázy a amidázy alebo nitrilázy, menia nitrily na zodpovedajúce kyseliny.

Napríklad EP-A-0 187 680 popisuje mikrobiolgický spôsob výroby organických kyselín ako napríklad kyseliny nikotínovej pomocou mikroorganizmov rodu Corynebacterium, Nocardia, Bacillus, Bacteridium, Micrococcus a Brevibacterium. Táto reakcia sa musí uskutočňovať v prítomnosti svetelnej energie. Z EP-A 0 444 640 je známy mikrobiologický spôsob výroby organických kyselín ako napríklad kyseliny nikotínovej pomocou mikroorganizmov rodu Rhodococcus. Táto reakcia sa musí uskutočňovať v prítomnosti laktámu.

Ďalej je známe, že mikroorganizmy druhu Rhodococcus rhodochrous J1 napríklad menia 2-kyanpyrazín na kyselinu pyrazínkarboxylovú (Kobayashi a spol., J. of Antibiotics, zv. 43, č. 10, 1990, str. 1316—1320).

Tieto mikroorganizmy však nemôžu premeniť 2-kyanpyridín na kyselinu pikolínovú (Mathew a spol., Appl. Environmental Microbiology, zv. 54, č. 4, 1988, str. 1030—1032).

Je tiež známe, že mikroorganizmy zužitkujúce 2-kyanpyridín rodu Alcaligenes premieňajú 2-kyanpyridín na kyselinu 6-hydroxypikolínovú (EP-A 0 504 818). Pri tomto spôsobe je nevýhodou, že sa kyselina 6hydroxypikolínová tvorí len v nepatrných výťažkoch.

Podstata vynálezu

Úlohou predloženého vynálezu je dať na použitie hospodárny mikrobiologický spôsob výroby heteroaromatických karboxylových kyselín alebo ich fyziologicky znesiteľných solí ako je kyselina pyrazínkarboxylová, kyselina pikolípová alebo chrompikolinát pomocou mikroorganizmov rodu Alcaligenes, pričom sa vytvorené karboxylové^-kyseliny alebo ich fyziologicky znesiteľné soli vytvoria v dobrom výťažku.

Táto úloha sa vyriešila spôsobom podľa patentového nároku 1.

Podľa vynálezu sa spôsob uskutočňuje tak, že sa ako substrát premieňa heteroaromatický nitril všeobecných vzorcov

kde X, R1 a R2 majú uvedený význam pomocou mikroorganizmov zužitkujúcich 2-kyanpyridín rodu Alcaligenes, ktoré sa pred biotransformáciou pestovali v prítomnosti kyseliny dikarboxylovej, kyseliny trikarboxylovej alebo cukru, na heteroaromatické karboxylové kyseliny vzorca I alebo II. Heteroaromatické karboxylové kyseliny sa potom prípadne menia na fyziologicky znesiteľné soli. Ako fyziologicky znesiteľné soli týchto karboxylových kyselín sa v nasledujúcom texte rozumejú napríklad soli chrómu, vápnika alebo amonné soli.

Pred vlastnou biotransformáciou sa obyčajne mikroorganizmy rodu Alcaligenes používané pre spôsob kultivujú (pestujú) a ich účinné enzýmy sa účelne indukujú s 2-kyanpyridínom.

Na pestovanie a indukciu sa môže 2-kyanpyridín použiť v koncentrácii od 0,01 do 20 % hmotn., výhodne v koncentrácii od 0,1 do 1 % hmotn.

Pod kyselinou dikarboxylovou sa v nasledujúcom rozumejú kyselina fumarová, kyselina jantárová, kyselina jablčná, kyselina glutarová, kyselina malonová, prípadne ich soli a deriváty ako je ester.

Pod kyselinou trikarboxylovou sa v nasledujúcom rozumejú kyselina citrónová, kyselina izocitrónová, prípadne ich soli a deriváty ako je ester. Ako soli a deriváty týchto dikarboxylových a trikarboxylových kyselín sa môžu použiť fumarát, malát, malonát, oxalacetát, citrát, akonitát, izocitrát, 2-oxoglutarát, sukcinát alebo sukcinyl-CoA. Výhodne sa používa fumarát, malonát alebo sukcinát.

Ako cukry sa v nasledujúcom rozumejú monosacharidy ako glukóza, disacharidy ako sacharóza, trehalóza alebo maltóza, trisacharidy ako rafinóza, cukrové alkoholy ako glycerín, výhodne sa ako cukor použije glycerín.

Účelne sa dikarboxylová, kyselina, trikarboxylová kyselina, prípadne cukor použije v koncentrácii od 0,1 do 20 % hmotn., výhodne v koncentrácii od 0,5 do 5 % hmotn.

Ako rastové médium sa môžu použiť média bežne používané v odbore, ako napríklad médium obsahujúce minerálne soli podľa Kulla a spol. (Árch. Microbiol., 135, 1-7, 1983), nízkomolárne fosfátové tlmivé roztoky alebo médium podľa tabuľky 1. Výhodne sa používa médium popísané v tabuľke 1.

Po fáze pestovania, prípadne pred vlastným pridaním substrátu, sa mikroorganizmy získajú (zbierajú) pomocou bežných deliacich postupov alebo sa substrát pridá priamo k mikroorganizmom.

Substráty, ktoré sa použijú na biotransformáciu, heteroaromatické nitrily vzorcov III a IV, ako je napríklad 2-kyanpyridín, sú komerčne dostupné zlúčeniny.

Vo všeobecných vzorcoch I až IV znamená X atóm dusíka alebo — CH—, výhodne —CH—. Zvyšky R¹ a R² sú rovnaké alebo rozdielne a znamenajú vodík alebo halogén ako je fluór, chlór, bróm alebo jód.

Možné substráty sú teda 2-kyanpyridín, 6-chlór-2-kyanpyridín, 5,6-dichlór-2kyanpyridín, 2-kyanpyrazín, 6-chlór-2-kyanpyrazín, 5-bróm-6-chlór-2-kyanpyrazín. Účelne sa ako substráty používajú 2-kyanpyridín, 2-kyanpyrazín, alebo

6-chlór-2-kyanpyridín.

Substrát sa na biotransformáciu môže pridávať jednorázovo alebo kontinuálne. Účelne sa substrát pridáva tak, že koncentrácia substrátu v médiu nepresiahne 20 % hmotn., výhodne tak, že koncentrácia substrátu nepresiahne 10 % hmotn.

Biotransformácia, ktorá sa zvyčajne uskutočňuje s bunkami v kľude, sa účelne uskutočňuje s mikroorganizmami druhu Alcaligenes s označením DSM 6335 ako i sich funkčne ekvivalentnými variantami a mutantami, ktoré zužitkujú

2-kyanpyridín a sú známe z EP-A 0 504 818. Tieto mikroorganizmy boli uložené 03.01.1991 v Nemeckej zbierke mikroorganizmov a bunkových kultúr s. r, o., Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, podľa Budapeštianskej zmluvy.

Pod pojmom funkčne ekvivalentnými variantami a mutantami sa rozumejú mikroorganizmy, ktoré majú v podstate rovnaké vlastnosti a funkcie ako pôvodné mikroorganizmy. Takéto varianty a mutanty sa môžu náhodne vytvoriť UV-ožiarením.

Na biotransformáciu sa môžu použiť rovnaké médiá ako na pestovanie mikroorganizmov.

Biotransformácia sa môže tiež uskutočniť v alebo bez prítomnosti skôr popísaných dikarboxylových kyselín, trikarboxylových kyselín, prípadne cukrov.

Hodnota pH leží účelne v rozsahu od 4 do 10, výhodne v rozmedzí od 5 do 9. Biotransformácia sa môže uskutočniť pri teplote od 10 do 50 °C, výhodne pri teplote od 20 do 40 °C.

Po zvyčajnej reakčnej dobe od 6 do 100 hodín sa môžu potom získať zodpovedajúce karboxylové kyseliny vzorca I alebo II zvyčajnými postupmi spracovania, ako napríklad okyselením. Karboxylové kyseliny sa môžu tiež izolovať vo forme solí, ako napríklad amonná soľ alebo soľ chrómu.

Ak sa ako heteroaromatické karboxylové kyseliny vyrábajú heteroaromatické karboxylové kyseliny hydroxylované v polohe 6 (všeobecný vzorec II), biotransformácia sa účelne uskutočňuje za aerobných podmienok.

Ak sa však vyrába nehydroxylovaná heteroaromatická karboxylová kyselina ako napríklad kyselina pikolínová, účelne sa biotransformácia uskutočňuje za anaerobných podmienok.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Výroba kyseliny 6-hydroxypikolínovej

Na výrobu kyseliny 6-hydroxypikolínovej pomocou kmeňa Alcaligenes faecalis DSM 6335 sa zvolili nasledujúce podmienky. Použil sa 7,5 I fermentor s 5 I pracovným objemom. Alcaligenes faecalis DSM 6335 sa pestoval v médiu obsahujúcom minerálne soli (tabuľka 1) s nátriumfumarátom ako jediným zdrojom uhlíka a energie a 2-kyanpyridínom ako induktorom pri 30 ’C, 600 otáčkach za min. a pH 7,0. Prevzdušňovanie bolo pri tom ca 3 l/min. Pridávanie nátriumfumarátu sa uskutočnilo pri tom za riadenia ρθ£ pri pC>2 > 30 %. Použil sa 20 %-ný zásobný roztok nátriumfumarátu s 0,5 % 2kyanpyridínu. Bunky sa pestovali až k optickej hustote, merané pri 650 nm (OD₆₅₀), hodnoty 16 v priebehu 23 hodín, ako sa zahájila biotransformácia. Pre rastovú fázu sa použilo ca. 160 g nátriumfumarátu v 20 %-nom roztoku (ca. 800 ml).

V priebehu aerobnej biotransformácie 2-kyanpyrídínu na kyselinu 6hydroxypikoiínovú sa nepridáva zdroj uhlíka á energie. Biotransformácia sa uskutočnila s bunkami v kľude.

Pridanie 2-kyanpyridínu sa uskutočnilo obmedzovane pomocou čerpadla. Rýchlosť čerpania sa riadila online pomocou HPLC (vysokotlaková kvapalná chromatografia). Koncentrácia medziproduktu kyseliny pikolínovej, ktorého rýchlosť tvorby je ca. 2,5-krát vyššia ako rýchlosť premeny kyseliny pikolínovej na kyselinu 6-hydroxypikolínovú (10 g/l.h ku 4 g/l.h), sa obmedzila na hodnoty < 2 g/l, ináč by bola premena kyseliny pikolínovej na kyselinu 6hydroxypikolínovú inhibovaná.

Pretože je 2-kyanpyridín pevná látka pri teplote miestnosti, bolo treba nádobu predlohy obsahujúcu 2-kyanpyridín zohriať na 50 °C, aby sa mohol 2kyanpyridín pridávať v kvapalnom stave.

Týmto postupom bolo možné vyrobiť 75 g/l kyseliny 6-hydroxypikolínovej v priebehu 31 hodín.

Medziprodukt kyselina pikolínová sa na konci biotransformácie nedal už dokázať.

Na izoláciu kyseliny 6-hydroxypikolínovej sa bunky oddelili pomocou filtrácie. Potom sa bezbunkový roztok zahrial na 60 °C a okyselil koncentrovanou, kyselinou sírovou na pH 2—2,5. Pri tomto pH sa z roztoku vyzrážala kyselina 6-hydroxypikolínová. Potom sa za miešania pomaly ochladila na 4 °C, filtrovala, zvyšok sa premyl vodou bez minerálov a sušil (10 kPa, 55 °C). V matečnom lúhu zostali pritom ca. 2 g/l kyseliny 6-hydroxypikolínovej. Výťažok bol 87 % vztiahnuté na vnesený 2-kyanpyridín.

Tabuľka 1:

Zloženie: dvojsodná soľ kyseliny fumarovej extrakt kvasníc

MgCl2 6 H2O

Na2SO4 (NH4)2SO4

NH4CI

NaCI

CaCl2 · 2 H₂O

MnSC>4

H3BO3

NiCI₂

Na₂MoO4

FeSO₄.7 H₂O

Na₂EDTA.2 H₂O

2-kyanpyridín

KH₂PO₄

Na₂HPO₄

Koncentrácia (g/l):

0,8

0,25

1,0

2,33

0,2

0,16

1,8.10'²

3.10'²

2.10‘³

3.10'³

0,3

0,75

0,4

0,96

Príklad 2

Výroba kyseliny pikolínovej

Pestovanie biomasy sa uskutočnilo podľa príkladu 1. Tvorba kyseliny pikolínovej sa uskutočnila za prísne anaerobných podmienok.

Na biotransformáciu sa použila 500 ml sklenená fľaša s gumovou zátkou, naplnená 400 ml biomasy s ODg₅Q = 20. Inkubovalo sa pri 30 °C.

Pred zahájením biotransformácie sa násada upravila do anaerobného stavu pomocou čistého dusíka. Na tento účel sa do násady zavádzal dusík (pretlak 5 kPa) počas ca. 30 minút cez kanyly za miešania, aby sa kyslík kvantitatívne vypudil. Na vylúčenie prístupu kyslíka počas biotransformácie alebo pri pridávaní 2-kyanpyridínu, udržoval sa prívod plynu počas biotransformácie (pretlak ca. 1 kPa).

Pridávanie 2-kyanpyridínu sa uskutočnilo v 12 krokoch vždy k 10 g/l vždy po uplynutí jednej hodiny. Pridanie sa však môže uskutočniť tiež kontinuálne. Pomocou HPLC sa zisťovalo, či sa 2-kyanpyridín pred pridaním ďalšej dávky celkom premenil na kyselinu pikolínovú. Počas biotransformácie sa nemohla dokázať tvorba amidu kyseliny pikolínovej.

Týmto postupom bolo možné vyrobiť ca. 150 g/l kyseliny pikolínovej v priebehu 26 hodín. Kyselina 6-hydroxypikolínová sa pri tom netvorila.

Na izoláciu sa vyzrážal bezbunkový roztok kyseliny pikolínovej s CaCÍ2/H2SO4. Na tento účel sa bezbunkový roztok kyseliny pikolínovej z príkladu 2 zriedil 3-krát a za miešania sa pridalo 0,5 ekvivalentov CaCl2 na jeden ekvivalent kyseliny pikolínovej, potom sa bezbunkový' fermentačný roztok predohrial na 90 °C. Vzniknutý komplex vápnik - kyselina pikolínová sa pri tom okamžite vyzrážal. Vzniknutý komplex sa za miešania ochladil na 4 °C, filtroval cez sklenenú fritu (poréznosť 3) a premyl sa vodou zbavenou minerálov.

Filtračný koláč sa suspendoval demineralizovanou vodou a okyselil sa koncentrovanou kyselinou sírovou na pH 2,5. Pri tom sa z komplexu uvoľnila kyselina pikolínová a súčasne sa utvoril nerozpustný síran vápenatý. Pretože je voľná kyselina pikolínová veľmi dobre rozpustná vo vode, mohol sa síran vápenatý oddeliť filtráciou. Roztok kyseliny pikolínovej sa zahustil do sucha a analyzoval. Surový výťažok bol ca. 70 % s čistotou 86 % po titrácii. Obsah vody bol asi 0,7 %, stanovený Karl-Fischerovou metódou.

Príklad 3

Výroba pikolinátu chromitého

K roztoku pikolinátu amonného (271,4 g; 0,325 mol; 16,8 %) pH 7,1, v 500 ml banke, sa pri 73 °C prikvapkával vodný roztok hexahydrátu chloridu chromitého (23,95 g, 0,09 mol Cr v 63 ml vody) v časovom rozmedzí 3,5 hodiny. Získaný fialový roztok sa miešal ešte 1 hodinu, potom sa pomaly ochladil na 3 °C. Po usadení vytvorenej červenej pevnej látky sa vrchná modrá fáza dekantovala. Pevná látka sa suspendovala 100 ml vody v priebehu 30 minút a potom zase dekantovala. Po druhom suspendovaní s 50 ml vody (30 minút) sa pevná látka odsala a sušila pod vákuom pri 50 ‘’C.

Získalo sa 33,64 g tmavočervených kryštálov (90 % výťažok).

Príklad 4

Pestovanie Alcaligenes faecalis DSM 6335 s rozdielnymi zdrojmi uhlíka

Na pestovanie Alcaligenes faecalis (DSM 6335) sa použili 300 ml Erlenmeyerove banky so 100 ml A+N-média (tabuľka 1 bez dvojsodnej soli kyseliny fumarovej). K médiu sa dodatočne pridalo 2 gM 2-kyanpyridínu a 10 gM nasledujúcich zdrojov uhlíka:

dvojsodná soľ kyseliny fumarovej glycerín dvojsodná soľ kyseliny malonovej dvojsodná soľ kyseliny jantárovej

Inkubovalo sa na trepačke pri 30 °C. Po 16 hodinách rastu sa bunky odstredili a resuspendovali v čerstvom A+N-médiu (bez zdroja uhlíka) obsahujúcom 10 gľ¹ 2-kyanpyridínu. Optická hustota bunkovej suspenzie meraná pri 650 nm (OD₆₅₀) bola 10. Potom sa bunkové suspenzie (celkový objem 10—20 ml) znova inkubovali pri 30 °C. Tvorba kyseliny 6hydroxypikolínovej sa sledovala špektrofotometricky meraním absorpcie bezbunkového roztoku pri 308 nm. Stanovili sa nasledujúce priemerné produktivity na tvorbu kyseliny 6-hydroxypikolínovej:

Zdroj uhlíka Produktivita (v gHh~1)

dvojsodná soľ kyseliny fumarovej	2,4
glycerín	2,0
dvojsodná soľ kyseliny malonovej	4,2
dvojsodná soľ kyseliny jantárovej	0,14

Príklad 5

Výroba kyseliny 6-hydroxypyrazinkarboxylovej

Pestovanie Alcaligenes faecalis (DSM 6335) sa uskutočnilo ako v príklade -4 s kyselinou fumarovou ako zdroj uhlíka. Premyté bunky sa resuspendovali v A+N-médiu obsahujúcom 10gH 2-kyanpyrazínu (OD₆₅₀ = 10) a inkubovali pri 30 °C. Tvorba kyseliny 6-hydroxypyrazínkarboxylovej sa sledovala spektrofotometricky meraním absorpcie bezbunkového roztoku pri 320 nm. Úbytok koncentrácie 2-kyanpyrazínu (substrát) sa mohol stanoviť meraním absorpcie pri 270 nm. Po 7 hodinách sa použité množstvo 2kyanpyrazínu premenilo na kyselinu 6-hydroxypyrazínkarboxylovú.

Príklad 6

Výroba kyseliny chlórpikolínovej a pyrazínkarboxylovej

Pestovanie Alcaligenes faecalis (DSM 6335) sa uskutočnilo ako v príklade 4 s kyselinou fumarovou ako zdrojom uhlíka. Premyté bunky sa resuspendovali v A+N-médiu v sklenených nádobách (OD₆₅₀ = 10), ktoré sa mohli uzavrieť gumovými zátkami a pomocou kanyl sa zavádzal dusík, aby sa odstránil rozpustený kyslík. Potom sa k bunkovým suspenziám pridal 2 kyanpyrazín, resp. 6-chlór-2-kyanpyridín ako substrát až do konečnej koncentrácie 10 gľ¹ a tie sa inkubovali pri 30 °C. Po 3 hodinách sa východiskové látky kvantitatívne premenili na zodpovedajúce kyseliny [dôkaz chromatografiou na tenkej vrstve; silikagél 60 s fluorescenčným indikátorom, premývací prostriedok: chloroform 30 / etanol 55 / NH4OH (25 %)10 / H2O 5],

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Spôsob mikrobiologickej výroby heteroaromatických karboxylových kyselín alebo ich fyziologicky znesiteľných solí všeobecných vzorcov

COOH kde R1, r2 sú rovnaké alebo rozdielne a znamenajú atóm vodíka alebo atóm halogénu a X znamená atóm dusíka alebo —CH—, vyznačujúci sa tým, že sa ako substrát premieňajú Iheteroaromat nitrily všeobecných vzorcov

CN

IV kde R1, a X majú uvedený význam, pomocou mikroorganizmov rodu Alcaligenes zužitkujúcich 2-kyanpyridín, ktoré sa pred biotransformáciou pestovali v prítomnosti kyseliny dikarboxylovej, kyseliny trikarboxylovej alebo cukru, na zodpovedajúcu karboxylovú kyselinu a posledný sa prípadne prevedie na fyziologicky znesiteľné soli.
2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa biotransformácia uskutočňuje s mikroorganizmami druhu Alcaligenes faecalis s označením DSM 6335 ako i s ich funkčne ekvivalentnými variantami a mutantami.
3. Spôsob podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúci sa tým, že sa biotransformácia uskutočňuje pri pH od 4 do 10 a teplote od 10 do 50 °C.
4. Spôsob výroby kyseliny pikolínovej alebo jej fyziologicky znesiteľnej soli, vyznačujúci sa tým, že sa ako substrát 2-kyanpyridín premieňa pomocou mikroorganizmov rodu Alcaligenes zužitkujúcich 2-kyanpyridín, ktoré boli pred biotransformáciou pestované v prítomnosti kyseliny dikarboxylovej, za anaerobných podmienok, na kyselinu pikolínovú a posledný sa prípadne premení na fyziologicky znesiteľnú soľ.