SK51102005A3 - Umelá tkaninová štruktúra obsahujúca embryonálne kmeňové bunky a spôsob jej prípravy - Google Patents

Umelá tkaninová štruktúra obsahujúca embryonálne kmeňové bunky a spôsob jej prípravy Download PDF

Info

Publication number
SK51102005A3
SK51102005A3 SK5110-2005A SK51102005A SK51102005A3 SK 51102005 A3 SK51102005 A3 SK 51102005A3 SK 51102005 A SK51102005 A SK 51102005A SK 51102005 A3 SK51102005 A3 SK 51102005A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
stem cells
embryonic stem
cell
matrix
cells
Prior art date
Application number
SK5110-2005A
Other languages
English (en)
Inventor
Shulamit Levenberg
Ngan F. Huang
Erin B. Lavik
Joseph Itskovitz-Eldor
Robert S. Langer
Original Assignee
Massachusetts Institute Of Technology
Technion Research And Development Foundation Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Massachusetts Institute Of Technology, Technion Research And Development Foundation Ltd. filed Critical Massachusetts Institute Of Technology
Publication of SK51102005A3 publication Critical patent/SK51102005A3/sk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • A61L27/3834—Cells able to produce different cell types, e.g. hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, marrow stromal cells, embryonic stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/18—Macromolecular materials obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
    • A61L27/22—Polypeptides or derivatives thereof, e.g. degradation products
    • A61L27/227—Other specific proteins or polypeptides not covered by A61L27/222, A61L27/225 or A61L27/24
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3839—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by the site of application in the body
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3895—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells using specific culture conditions, e.g. stimulating differentiation of stem cells, pulsatile flow conditions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0068—General culture methods using substrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/30—Synthetic polymers
    • C12N2533/40—Polyhydroxyacids, e.g. polymers of glycolic or lactic acid (PGA, PLA, PLGA); Bioresorbable polymers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)

Description

Umelá tkanivová štruktúra obsahujúca embryonálne kmeňové bunky a spôsob jej prípravy
Táto prihláška požaduje prioritu z dočasnej patentovej prihlášky USA č. 60/432,228, podanej 10. decembra 2002, dočasnej patentovej prihlášky č. 60/443,926, podanej 31. januára 2003 a patentovej prihlášky č. 10/731,672, podanej 9. decembra 2003.
Oblasť techniky
Predložený vynález sa týka trojrozmernej tkanivovej štruktúry obsahujúcej diferencované embryonálne kmeňové bunky.
Doterajší stav techniky
Embryonálne kmeňové (ES) bunky, vrátane humánnych ES(hES) buniek, sú sľubným zdrojom pre bunkové transplantácie vzhľadom k svojej jedinečnej schopnosti vyvíjať sa na akýkoľvek druh somatickej bunkovej línie, keď podstúpia diferenciáciu1'3,4. Diferenciácia ES buniek môže byť indukovaná napríklad odstránením buniek z vrstvy vyživujúcich podkladových buniek a ich ďalšou kultiváciou v suspenzii, čo vedie k agregácii buniek a vytváraniu tzv. embryonálnych teliesok (EB) , v ktorých následne dochádza k postupným krokom diferenciácie5. Niekoľko štúdií ukázalo, že chemické podnety, poskytované priamo rastovými faktormi alebo nepriamo vyživujúcimi bunkami, môžu indukovať diferenciáciu ES buniek smerom k špecifickým líniám6'3. Napriek tomu žiadna z týchto štúdií nebola úspešná pri riadení diferenciácie ES buniek k tomu, aby sa vytvorili komplexné tkanivá. Pri niektorých typoch buniek fyzikálne podnety, ako sú napríklad povrchové interakcie, stres spôsobený rezom a mechanický stres, indukovali diferenciáciu10'13.
Preto sa javí ako potrebné vyvinúť spôsoby, ako stimulovať diferenciáciu ES buniek na trojrozmerné tkanivové štruktúry.
Podstata vynálezu
V jednom aspekte vynález poskytuje umelú tkanivovú štruktúru, ktorá obsahuje embryonálne kmeňové bunky, trojrozmernú podpornú matricu pre bunky, ktorá je odolná voči kontraktilným (sťahujúcim) silám kmeňových buniek, a najmenej jeden rastový faktor zvolený tak, že podporuje diferenciáciu kmeňových buniek smerom k vopred určenej bunkovej línii alebo k špecifickému bunkovému typu. Kmeňovými bunkami môžu byt cicavčie embryonálne kmeňové bunky, napríklad humánne embryonálne kmeňové bunky. Podporná matrica pre bunky môže napríklad obsahovať zmes kyseliny polymliečnej a kopolyméru kyseliny mliečnej a kyseliny glykolovej, napríklad zmes 50/50 kyseliny polymliečnej a kopolyméru kyseliny mliečnej a kyseliny glykolovej.
Plocha priečneho rezu matrice môže byť vplyvom kontraktiIných síl embryonálnych kmeňových buniek redukovaná nanajvýš o 50 %, napríklad nanajvýš o 40 %, 30 %, 20 %, 10 % alebo 1 %. Podporná matrica pre bunky môže ďalej obsahovať povlak obsahujúci činidlo, ktoré podporuje bunkovú adhéziu, ako je napríklad fibronektín, integríny alebo oligonukleotidy podporujúce bunkovú adhéziu. Podporná matrica pre bunky môže byť biologicky degradovateľná alebo biologicky nedegradovateľná.
Umelá tkanivová štruktúra môže ďalej obsahovať jednu alebo viac biomolekúl, malých molekúl alebo bioaktívnych činidiel deponovaných v podpornej matrici. Umelá tkanivová štruktúra môže ďalej obsahovať gél, ktorý pokrýva vnútorné a vonkajšie povrchy podpornej matrice pre bunky. Príkladom takéhoto gélu je kolagénový gél, alginát, agar a „Growth Factor Reduced Matrigel. Gél môže ďalej obsahovať jednu alebo viac látok z nasledujúcich: laminín, fibrín, fibronektín, proteoglykány, glykoproteíny, glykozaminoglykány, chemotaktické činidlá alebo rastové faktory, napríklad cytokíny, eikozanoidy alebo diferenciačné faktory.
V ďalšom aspekte predložený vynález poskytuje spôsob prípravy umelej tkanivovej štruktúry. Spôsob zahrnuje poskytnutie populácie embryonálnych kmeňových buniek, osadenie podpornej matrice pre bunky embryonálnymi kmeňovými bunkami a vystavenie týchto embryonálnych kmeňových buniek pôsobeniu najmenej jedného činidla, zvoleného tak, že podporuje diferenciáciu kmeňových buniek smerom k predurčenej línii alebo špecifickému bunkovému typu. Krok vystavenia pôsobeniu (expozícia) sa môže uskutočňovať pred alebo po kroku osadenia a uskutočňuje sa v médiu bez séra. Podporná matrica pre bunky je trojrozmerná a je potiahnutá činidlom, ktoré podporuje bunkovú adhéziu. Embryonálne kmeňové bunky sú vnesené do gélu a osadenie podpornej matrice pre bunky embryonálnymi kmeňovými bunkami zahrnuje nanesenie gélu na vnútorné i vonkajšie povrchy podpornej matrice.
Činidlom môže byt rastový faktor, mechanická sila alebo elektrické napätie, bioaktívne činidlo, biomolekula, malá molekula alebo akákoľvek ich kombinácia. Mechanická sila môže zahrnovať tangenciálny stres, namáhanie v strihu, hydrostatický stres, namáhanie tlakom, namáhanie ťahom alebo akúkoľvek ich kombináciu.
Embryonálne kmeňové bunky sa môžu kultivovať v prítomnosti rastového faktora ako súčasť kroku poskytnutia buniek.
Definície „Biomolekuly: Termín „biomolekuly, tak ako sa používa v tomto texte, sa týka molekúl (ako sú napríklad proteíny, aminokyseliny, peptidy, polynukleotidy, nukleotidy, karbohydráty, sacharidy, lipidy, nukleoproteíny, glykoproteíny, lipoproteíny, steroidy a podobne) prirodzene sa vyskytujúcich alebo umelo vytvorených (napríklad syntézou alebo metódami rekombinácie), ktoré sa bežne vyskytujú v bunkách a tkanivách. K špecifickým triedam biomolekúl patria, bez toho, že by tento výpočet bol obmedzujúci, enzýmy, receptory, neurotransmitery, hormóny, cytokíny, modifikátory bunkovej odozvy ako napríklad rastové faktory a chemotaktické faktory, protilátky, vakcíny, haptény, toxíny, interferón, ribozýmy, anti-sense činidlá, plazmidy, DNA a RNA.
„Biologicky kompatibilný: Termín „biologicky kompatibilný, tak ako sa používa v tomto texte, opisuje materiály, ktoré nevyvolajú nežiaduce škodlivé reakcie in vivo.
„Biologicky rozložiteľný: Tak ako sa používa v tomto texte, termín „biologicky rozložiteľné, polyméry, zameniteľné s termínom „biologicky degradovateľné polyméry, sú také polyméry, ktoré sa rozkladajú úplne (t.j. až na monoméry) pri fyziologických alebo endozomálnych podmienkach. Vo výhodných uskutočneniach sú polyméry a vedľajšie produkty biodegradácie biologicky kompatibilné. Biologicky rozložiteľné polyméry nie sú nevyhnutne hydrolyticky rozložiteľné a na úplné rozloženie môžu vyžadovať enzymatickú činnosť.
„Rastové faktory: Tak ako sa používa v tomto texte rastové faktory sú zlúčeniny, ktoré regulujú bunkové metabolické pochody, ktoré zahrnujú disociáciu, proliferáciu, syntézu rôznych bunkových produktov a ďalšie metabolické aktivity, pričom tento výpočet nie je obmedzujúci. Rastové faktory zahrnujú niekoľko rodín chemických zlúčenín, ako sú cytokíny, eikozanoidy a diferenciačné faktory, pričom tento výpočet nie je obmedzujúci.
„Polynukleotid, „nukleová kyselina a „oligonukleotid: Termíny „polynukleotid, „nukleová kyselina a „oligonukleotid sa týkajú polymérnych nukleotidov. Termíny „polynukleotid, „nukleová kyselina alebo „oligonukleotid sa môžu použiť zameniteľné. Typicky polynukleotid obsahuje najmenej tri nukleotidy. DNA a RNA sú polynukleotidy. Polymér môže obsahovať prírodné nukleozidy (t.j. adenozín, tymidín, guanozín, cytidín, uridín, deoxyadenozín, deoxytymidín, deoxyguanozín a deoxycytidín), nukleozidové analógy (napríklad 2-aminoadenozín, 2-tiotymidín, inozín, pyrolpyrimidín, 3metyladenozín, C5-propinylcytidín, C5-propinyluridín, C5-bromouridín, C5-fluorouridín, C5-jodouridín, C5-metylcytidín, 7-deazaadenozín, 7deazaguanozín, 8-oxoadenozín, 8-oxoguanozín, 0(6)-metylguanín a 2tiocytidín), chemicky modifikované zásady, biologicky modifikované zásady (napríklad metylované zásady), vmedzerené zásady, modifikované sacharidy (ako je 2'-fluororibóza, ribóza, 2'-deoxyribóza, arabinóza a hexóza) alebo modifikované fosfátové skupiny (ako je napríklad fosforotioátová a 5'-N-fosforamiditovä väzba).
„Polypeptid, „peptid alebo „proteín: Podľa predloženého vynálezu „polypeptid, „peptid alebo „protein obsahuje reťazec najmenej troch aminokyselín spojených peptidovou väzbou. Termíny „polypeptid, „peptid a „proteín sa môžu používať zameniteľné. Termín peptid môže označovať individuálny peptid alebo súbor peptidov. Peptidy podľa vynálezu výhodne obsahujú len prírodné aminokyseliny, hoci aj „neprírodné aminokyseliny (t.j. zlúčeniny, ktoré sa nevyskytujú v prírode, ale sa môžu vložiť do polypeptidového reťazca; pozri napríklad informácie na webových stránkach Http://www.cco.caltech.edu/-dadgrp/Unnatstruct.gif), ktoré uvádzajú štruktúry „neprirodných aminokyselín, ktoré už boli úspešne vnesené do funkčných iónových kanálov) a/alebo analógy aminokyselín, ktoré sú v odbore známe, sa môžu alternatívne použit. Jedna alebo viac aminokyselín v peptide podľa vynálezu sa môže modifikovať, napríklad adíciou chemickej skupiny, ako je napríklad sacharidová skupina, fosfátová skupina, farnezylová skupina, izofarnezylová skupina, skupina mastných kyselín, spojovacia skupina (linker) na kondenzáciu, funkcionalizovaná alebo inak modifikovaná. Vo výhodnom uskutočnení modifikácia peptidu poskytuje stabilnejší peptid (napríklad s väčším polčasom in vivo). Tieto modifikácie zahrnujú cyklizáciu peptidu, inkorporáciu D-aminokyselín a podobne. Žiadna modifikácia by nemala podstatne narušiť požadovanú biologickú aktivitu peptidu.
„Polysacharid, „sacharid alebo „oligosacharid: Termíny „polysacharid, „karbohydrát alebo „oligosacharid sa .týkajú polymérnych sacharidov (cukrov). termíny „polysacharid, „karbohydrát alebo „oligosacharid sa môžu použiť zameniteľné. Typicky polysacharid obsahuje najmenej tri sacharidy. Polymér môže obsahovať prírodné sacharidy (ako je napríklad glukóza, fruktóza, galaktóza, -manóza, arabinóza, ribóza a xylóza) a/alebo modifikované sacharidy (ako je napríklad 2'-fluororibóza, 2'-deoxyribóza a hexóza).
„Malá molekula: tak ako sa používa v tomto texte, termín „malá molekula označuje molekuly, či už prirodzene sa vyskytujúce alebo umelo vytvorené (napríklad prostredníctvom chemickej syntézy), ktoré majú relatívne nízku molekulovú hmotnosť. Typicky sú malé molekuly monomérne a majú molekulovú hmotnosť menšiu ako približne 1500 g/mol. Výhodné malé molekuly sú biologicky účinné, takže vyvolajú lokálny alebo systémový účinok u zvierat, výhodne cicavcov, výhodnejšie u ľudí. V určitých výhodných uskutočneniach je malá molekula liečivo. Výhodne, hoci nie nevyhnutne, liečivo patrí k účinným a bezpečným liečivám, ktoré už boli schválené príslušným zodpovedným .úradom. Napríklad liečivá na humánne použitie v USA uvedené v FDA zákone C.F.R. 21, §§ 330.5, 331 až 361 a 440 až 460; liečivá na veterinárne použitie v USA uvedené v FDA zákone C.F.R. 21, §§ 500 až 589, ktoré sú zahrnuté v tomto texte formou odkazu, sú všetky považované za vhodné na použitie podľa predloženého vynálezu.
„Bioaktívne činidlá: tak ako sa používa v tomto texte, termín „bioaktívne činidlá sa používa na označenie zlúčenín alebo látok, ktoré menia, inhibujú, aktivujú alebo inak ovplyvňujú biologické alebo chemické deje. Napríklad biologické činidlá zahrnujú, bez toho aby enzýmov, mastivá, však bol výpočet obmedzujúci, anti-AIDS činidlá, protinádorové činidlá, antibiotiká, imunosupresíva, antivírusové činidlá, inhibítory neurotoxíny, opioidy, hypnotiká, antihistamínové činidlá, trankvilizéry, antikonvulzívne činidlá, svalové relaxans a antiparkinzonovské činidlá, antispazmotiká a svalové kontrakčné činidlá, vrátane blokátorov kanálov, myotiká, anticholínergné.činidlá, antiglaukómové zlúčeniny, antiparazitiká a/alebo antiprotozoálne činidlá, modulátory interakcie bunky - extracelulárny matrix vrátane inhibítorov bunkového rastu, antiadhezívne molekuly, vazodilatačné DNA, RNA alebo proteínov, 'činidlá analgetiká, antipyretiká, steroidné a nesteroidné činidlá s protizápalovým účinkom, antiangiogénne faktory, antisekrečné faktory, antikoagulačné činidlá a/alebo antitrombotiká, lokálne anestetiká, oftalmiká, prostaglandíny, antidepresíva, antipsychotiká, antiemetiká a zobrazovacie činidlá. V určitých uskutočneniach je bioaktívnym činidlom liečivo.
činidlá, inhibítory syntézy s antihypertenzným účinkom,
Komplexnejší zoznam bioaktívnych činidiel a špecifických liečiv vhodných na použitie podľa predloženého vynálezu možno nájsť, v publikácii „Pharmaceutical Substances: Syntheses, Patents, Applications, autori Axel Kleeman a Jurgen Engel, Thieme Medical Publishing, 1999: ďalej v „Merck Index: An Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biologicals, Ed. Susan Budavari et al. , CRC Press, 1996, a tiež v Liekopise USA (United States Pharmacopeia-25 National Forraulary-20), vydanom United States Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville MD, 2001. Všetky tieto publikácie sú zahrnuté formou odkazu v tomto texte.
„Tkanivo: tak ako sa používa v tomto texte, termín „tkanivo označuje súbor buniek jedného alebo viacerých typov združených na vykonávanie špecifickej funkcie, a akákoľvek extracelulárna ' matrix obklopujúca bunky.
Opis obrázkov
Vynález je opísaný s odkazom na niekoľko obrázkov na pripojených výkresoch.
Obrázok 1 obsahuje mikrografie zo svetelného mikroskopu kontrolných tkanív zafarbených protilátkami proti ich charakteristickým proteínom alebo histologickým farbením na určenie presnosti a optimálneho riedenia. (A a B) nestín, myšací embryonálny mozog (17. embryonálny deň); (C) pm-tubulín, myšacie subkutánne tkanivá; (D) cytokeratín-7, ľudské pľúca; (E) inzulín, ľudská podžalúdková žľaza; (F) Pm-tubulín, myšací mozog; (G) vimentín, ľudská tonzila; (H) aktín hladkého svalstva, ľudská tonzila,- (I) CD34, ľudská tonzila; (J) CD31, ľudská tonzila; (K) albumín, pečeň; (L) afetoproteín (AFP), pečeň dospelého (človeka); (M) safranín-O, vláknitá chrupavka.
Obrázok 2A obsahuje mikrografie zo svetelného mikroskopu diferencujúcich sa hES buniek (8. EB deň) zmiešaných s Matrigelom a kultivovaných počas dvoch týždňov v prítomnosti transformačného rastového faktora beta (TGF), aktivínu-A (ACT), kyseliny retinovej (RA) a rastového faktora (IGF) podobného inzulínu alebo bez rastového faktora (CON). Úavý panel: zobrazenie vytvorených „gulí v tmavom poli (merítko = 1 mm). Stredné a pravé panely: histologické rezy vzoriek vyfarbených H-E (hematoxylínom-eozínom). Spodná časť: histochemické a imunochemické farbenie priečnych rezov „gulí vytvorených v Matrigele so Safranínom-0 (SafO), protilátkami anti-AFP a antinestin (merítko = 100 μτη) .
Obrázky 2B-D ukazujú výsledky mechanického testovania skeletov PLGA/PLA s Matrigelom alebo bez neho. Výsledky testov pevnosti v ťahu (B) a kompresie (C) sú zosumarizované a porovnané s Matrigelom (D).
Obrázok 3 je fotografiou gélu znázorňujúcej produkty RT-PCR s použitím primérov pre keratín s vysokým obsahom síry (keratín), ťažký reťazec neurofilament (NFH), proteín základnej hmoty (matrix) chrupavky (CMP), α-fetoproteín (AFP), PDX-1 a GAPDH na RNA izolovanej z 8-denných trypsinizovaných embryonálnych teliesok (EB), nasadených na doštičkách potiahnutých fibronektínom a kultivovaných počas 2 týždňov v prítomnosti transformačného rastového faktora β '(TGF) , aktivínu-A (ACT), kyseliny retinovej (RA), rastového faktora (IGF) podobného inzulínu, vaskulárneho endotelového rastového faktora (VEGF) alebo kontrolného média (CON).
Obrázok 4 znázorňuje mikrografie zo svetelného mikroskopu rezov s hrúbkou 5 μτη odobratých z hEB (8. deň), inkubovaných ďalšie 2 týždne s kontrolným médiom (CON) alebo médiom doplneným kyselinou retinovou (RA) alebo rastovým faktorom (IGF) podobným inzulínu a zafarbených protilátkami proti ľudskému cytokeratínu, α-fetoproteínu a nestinu (merítko = 200 pm).
Obrázky 5A-D sú mikrografie z rastrovacieho elektrónového mikroskopu skeletov PLLA/PLGA bez diferencujúcich sa buniek hES (A) a s nimi (B- D) , znázorňujúce prichytenie buniek ku skeletom v rôznych zväčšeniach (merítko: A,B = 1 mm, C = 50 pm, D = 200 pm).
Obrázky 5E-H znázorňujú mikrografie zo svetelného mikroskopu skeletov PLLA/PLGA zafarbených hematoxylínom a oezínom (H-E). Bunky hES sa nasadili na skelet (E, G) nanesením buniek na 'skelet s Matrigelom alebo (F, H) potiahnutím skeletu fibronektínom (merítko = 50 pm).
Obrázky 5I-K znázorňujú proliferáciu buniek hES na skeletoch PLLA/PLGA po dvoch týždňoch kultivácie, inkubácie s BrdUrd a po farbení protilátkami anti-BrdUrd (hnedo) [(I) nízke (x 100)a (J-K) vysoké (x 1000) zväčšenie] (merítko = 50 pm).
Obrázok 6 znázorňuje mikrografie nediferencovaných (undiff) alebo diferencujúcich sa buniek hES [embryonálne teliesko (EB) 8.deň] (diff), zmiešaných s Matrigelom, nasadených na skeletoch PLLA/PLGA, kultivovaných počas 2 týždňov a zafarbených H-E alebo protilátkami proti ľudskému a-f etoproteínu (AFP) , nestinu alebo pm-tubulínu (pôvodné zväčšenie, x 200, s výnimkou uvedeného zväčšenia x 400).’
Obrázok 7A znázorňuje mikrografie zo svetelného mikroskopu umelých tkanivových štruktúr skeletov-buniek hES kultivovaných počas dvoch týždňov v kontrolnom médiu (CON) alebo v prítomnosti rastového faktora (IGF) podobného inzulínu alebo kyseliny retinovej (RA) , narezaných s vyfarbených anti-cytokeratínovými protilátkami (červeno), anti-vimentínovými protilátkami (zeleno) a DAPI na farbenie jadier (modro) (merítko = 100 pm).
Obrázok 7B znázorňuje mikrografie zo svetelného mikroskopu umelých tkanivových štruktúr skeletov-buniek hES kultivovaných'' počas dvoch týždňov v kontrolnom médiu (CON) alebo v prítomnosti transformačného rastového faktora β (ΙΘΡβ) alebo kyseliny retinovej (RA) , narezaných s vyfarbených trichrómom na kolagén (modro) (merítko = 100 gm).
Obrázok 7C predstavuje graf porovnávajúci priemery lúmen tubulocystických štruktúr vystlaných cytokeratín-pozitívnym epitelom v umelých tkanivových štruktúrach kultivovaných počas dvoch, týždňov v kontrolnom médiu alebo v prítomnosti IGF alebo RA.
Obrázok 7D je graf ilustrujúci percento oblasti pozitívne vyfarbenej (percento pozitívneho farbenia) anti-cytokeratínovými protilátkami v tkanivových rezoch zo vzoriek získaných v dvoch rozličných experimentoch uskutočňovaných v dvojitom opakovaní a rezoch normálneho tkaniva ľudských pľúc (epitelové bunky) (stĺpec znázorňuje priemernú hodnotu +/- SD).
Obrázok 8A znázorňuje imunochemické farbenie tkanivových rezov odobratých z umelých tkanivových štruktúr hES inkubovaných počas dvoch týždňov s kontrolným médiom (CON) alebo médiom doplneným TGF-β (TGF), aktivínom-A (ACT), kyselinou retinovou (RA), rastovým faktorom (IGF) podobným inzulínu alebo kombináciou TGF-β a aktivínu-A (TGF/ACT) a vyfarbených Safranínom O (Saf O) alebo protilátkami proti 'ľudskému AFP, albumínu, nestínu, tubulínu a S-100 (merítko = 50 gm) .
Obrázok 8B je graf znázorňujúci percento oblasti pozitívne vyfarbenej (percento pozitívneho farbenia) uvedeným farbením alebo protilátkami v tkanivových rezoch zo vzoriek získaných v troch rozličných experimentoch uskutočňovaných dvojmo (stĺpec znázorňuje priemernú hodnotu +/- SD).
Obrázok 9A predstavuje fotografiu gélu znázorňujúcej výsledky RT-PCR s použitím primérov pre keratín s vysokým obsahom síry (keratín), ťažký reťazec neurofilament (NFH), proteín základnej hmoty (matrix) chrupavky (CMP), α-fetoproteín (AFP), CD34 a GAPDH na RNA izolovanej z tkanivových štruktúr kultivovaných počas dvoch týždňov v prítomnosti TGF-β (TGF), aktivínu-A (ACT), RA, IGF alebo s kontrolným médiom (CON).
Obrázok 9A predstavuje schematické znázornenie účinkov rôznych rastových faktorov na expresiu tkanivovo špecifických génov v 3D štruktúrach založené na semikvantitatívnej analýze génovej expresie (+ = nízka expresia, ++++ = najvyššia expresia).
Obrázok 10A predstavuje série mikrografií zo svetelného mikroskopu diferencujúcich sa buniek hES (EB 0. deň) nasadených na skeletoch PLLA/PLGA s Matrigelom (s+m) alebo po potiahnutí skeletu fibronektínom (s+fn), inkubovaných v kontrolnom médiu (CON) alebo médiu doplnenom TGF-β (TGF), aktivínom-A (ACT), RA alebo IGF a po dvoch týždňoch inkubácie, fixovaných, narezaných a imunochemicky vyfarbených s použitím protilátok anti-CD31, anti-CD34 alebo proti aktínu hladkého svalstva (SMA) (merítko = 50 pm).
Obrázok 10B znázorňuje graf ilustrujúci percento pozitívneho farbenia (oblasť, buniek pozitívnych na protilátky v tkanivových rezoch) v umelých tkanivových štruktúrach uvedených na obrázku 10A (hodnoty vyjadrujú priemerné hodnoty (+ SD) z 5 rozličných rezov zo vzoriek).
Obrázok 11 znázorňuje mikrografie zo svetelného mikroskopu dva týždne starých umelých tkanivových štruktúr hES-skeletov implantovaných do myšacích SCID a vyfarbených H-E alebo protilátkami proti ľudskému CD31, cytokeratínu, AFP alebo pm-tubul£nu (merítko = 50 μπι) .
Obrázok 12A znázorňuje mikrografie rezov zo vzoriek (po 2 týždňoch) skeletov PLLA/PGLA osadených diferencujúcimi sa humánnymi embryonálnymi kmeňovými bunkami (hES) [enťbryoidné teliesko (EB) 8. deň] a Marigelom, vyfarbených protilátkami proti ľudskému desmínu, myogenínu a inzulínu. V umelých tkanivových štruktúrach boli· nájdené desmín-pozitívne bunky, pričom niektoré bunky mali podlhovastý tvar. V umelých tkanivových štruktúrach neboli zistené bunky s myogeňínom. Inzulín-pozitívne bunky boli mimoriadne vzácne.
Obrázok 12B zobrazuje mikrografie dva týždeň starých umelých tkanivových štruktúr implantovaných subkutánne do dorzálnej ' oblasti myší s ťažkou kombinovanou imunodeficienciou (SCID) a vyfarbených protilátkami proti Tra 1-60 a SSEA-4 po 14 dňoch in vivo, pričom ako kontrola slúžili nediferencované bunky hES nasadené na skeletoch počas doby 1 dňa (ES 1. deň).
Podrobný opis vynálezu
V jednom uskutočnení vynález poskytuje spôsob prípravy umelej tkanivovej štruktúry. Populácia hES buniek je vysadená na' podpornú matricu pred tým alebo po tom, ako bola vystavená pôsobeniu činidla, ktoré stimuluje požadovanú diferenciačnú dráhu. Podporná matrica by mala mať dostatočne vysoký súčiniteľ pevnosti, aby odolala kolapsu vplyvom kontraktiIných síl uplatňovaných pôsobením buniek.
Pôvodcovia vynálezu neočakávane objavili, že kombináciou vhodných chemických a fyzikálnych podnetov je možné vytvoriť podporné prostredie, ktoré smeruje k diferenciácii a organizácii hES buniek do trojrozmernej (3D) tkanivovej štruktúry. Takto bola vytvorená séria 3D kultivačných podmienok s využitím Matrigelu a biologicky rozložiteľných skeletov a zistilo sa, že fyzikálne podnety poskytované biologicky rozložiteľným skeletom podporili tvorbu štruktúry podobnej tkanivu. Špecificky polymérne skelety navrhnuté tak, aby vydržali kontrakciu pod tlakom, ktorý vyvíjajú diferencujúce sa bunky, stimulovali proliferáciu, diferenciáciu a organizáciu hES buniek na 3D štruktúry. Okrem toho variácia podmienok rastových faktorov indukovala tvorbu štruktúr podobných humánnemu tkanivu, ako je napríklad chrupavka, pečeň a nervové tkanivo. A napokon hES bunky kultivované na polymérnom skelete sa organizovali do siete endotelových trubíc, vaskularizujúcich tkanivo in vitro. Fyzikálne prostredie je teda významným parametrom pri diferenciácii hES buniek na 3D tkanivá.
Bunky sa kultivujú v neprítomnosti LIF a bFGF, aby sa indukovala tvorba embryoidných teliesok a potom sa ošetria trypsínom (trypsinizujú). Bunky môžu byť priamo vysadené do trojrozmernej matrice alebo vmiešané do gélu na osadenie matrice. Príkladom gélu je Growth-Factor Reduced Martigel™ (Matrigel), komerčne dostupný od spoločností Becton-Dickinson. Nemodifikovaný Matrigel je solubilizovaná matrix bazálnej membrány extrahovaná z myšacieho nádoru EHS (Kleinman, H.K., et al., Biochem. 25:321, 1986) . Primárnymi zložkami matrice sú laminin, kolagén I, entaktín a heparansulfát proteoglykánu (perlecan) (Vuldcevic, S., et al., Exp. Celí Res. 202:1, 1992). Growth-Factor Reduced Martigel™ sa pripravuje tak, že väčšina rastových faktorov sa z matrix odstráni (pozri Tauba, et al·., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1990), 87(10):4002-6). Alternatívne môže byť gél z kolagénu I. Ďalšie gély, ktoré sa môžu použiť pri realizácii vynálezu zahrnujú, ale bez obmedzenia na, alginát, fibrín, agar a kolagén IV. . ·
Ak sa použije gél, môže tiež obsahovať iné zložky extracelulárnej matrice, ako napríklad glykozaminoglykány, fibrín, fibronektín, proteoglykány a glykoproteíny. Gél môže tiež obsahovať zložky bazálnej membrány, ako je napríklad kolagén IV aýlaminín. V jednom uskutočnení sa môžu pridať do gélu zložky extracelulárnej matrix zistené v tkanivách obsahujúcich rovnaký typ buniek ako je typ, na ktorý sa majú diferencovať kmeňové bunky. Enzýmy, ako je napríklad proteináza a kolagenáza, sa taktiež môžu pridať do gélu, rovnako ako modifikátory bunkovej odozvy, ako sú napríklad rastové faktory a chemotaktické činidlá.
Gél sa absorbuje na vnútorné a vonkajšie povrchy matrice a prípadne vypĺňa póry v poréznej matrici. Kapilárne sily udržia gél na matrici pred stuhnutím gélu, prípadne gél stuhne na matrici a stane sa aspoň sčasti samonosný.
Trojrozmerná matrica je výhodne dostatočne tuhá, takže sa nezrúti pod vplyvom kontraktiIných síl spôsobených diferencujúcimi sa bunkami. Priemerná hodnota asymptotickej sily na jednu bunku (Fcell) bola vypočítaná ako približne 3 nN pre fibroblasty, nezávisle od tuhosti skeletu/matrice38. Pretože ide o hrubý predpoklad, ak sa táto hodnota použije na vyjadrenie sily (σ) , ktorú prejavuje priemerná bunka, potom platí nasledujúce:
σ = (FCeii x počet buniek) /plocha buniek
Ak toto platí, potom je možné určiť počet buniek na ploche
priečneho rezu tak, že celková plocha priečneho rezu (t.j·. plocha
buniek) sa delí plochou rezu jednej bunky (Acell) Potom sa vyššie
uvedená rovnica môže upraviť na nasledujúcu: •
σ - Fce±i/Aceii
Ak sa predpokladá prierez bunky približne 6 μτη, potom Acell je približne (za predpokladu kruhového prierezu) 2B μιη. Dosadením týchto hodnôt do vyššie uvedenej rovnice sa získa nasledujúci výsledok: bunky uplatňujú „stres (tlak) na skelete (matrici) silou približne 110 Pa. Tento odhad je samozrejme len veľmi všeobecný a nepresný.
V jednom uskutočnení sú embryonálne kmeňové bunky schopné udržiavať trojrozmernú štruktúru po osadení na matrici, a súčasne plocha priečneho rezu matrice nie je redukovaná viac ako o 50 %, napríklad menej ako o 40 %, v porovnaní s prázdnou matricou bez buniek, zatiaľ čo bunky vykonávajú rôzne bunkové funkcie (napríklad metabolické funkcie, proliferácie, diferenciácie). V niektorých uskutočneniach je plocha priečneho rezu matrice redukovaná o menej ako 30 % alebo ešte menej, napríklad menej ako 20 %, menej ako 10. % alebo menej ako 1 % vplyvom mechanických síl vyvolaných nasadenými bunkami. Pre odborníka je známe, ako zvoliť polyméry a nastaviť ich súčinitele (pevnosti), napríklad tým, že sa zvolí molekulová hmotnosť, a'hustota zosieťovania, aby sa optimalizovala miera kontrakcie.
V niektorých uskutočneniach môže byť matrica vytvorená pomocou mikroštruktúry podobnej takej extracelulárnej matrici, ktorá sa má nahradiť. Molekulová hmotnost, taktilita a hustota zosieťovania matrice sa tiež môžu regulovať, aby bolo možné regulovať mechanické vlastnosti matrice a rýchlosť jej degradácie (v prípade degradovateľného skeletu). Mechanické vlastnosti sa taktiež môžu optimalizovať, aby napodobnili vlastnosti tkanív, ktoré sa majú implantovať. Tvar a veľkosť výsledného implantátu by mali byt prispôsobené miestu implantácie a typu tkaniva. Matrica môže slúžiť jednak ako prostý nosič na podanie kmeňových buniek alebo môže mat aj štrukturálne alebo mechanické funkcie. Matrica môže byť vytvorená v ľubovoľnom tvare, napríklad časticovom, vo forme huby, rúrky, gule, reťazca, stočeného (závitnicového) reťazca, kapilárnej siete, fólie, vlákna, mriežky (sitka) alebo listu.
Pórovitosť matrice sa môže regulovať rozličnými spôsobmi, ktoré sú pre odborníka známe. Minimálna veľkosť pórov a stupeň pórovitosti sú dané potrebou poskytnúť dostatok priestoru pre bunky a pre živiny, ktoré sa bunkám filtrujú matricou. Maximálna veľkosť pórov a pórovitosť sú limitované schopnosťou matrice zachovať vlastnú mechanickú stabilitu po osadení bunkami. Keď sa zvyšuje pórovitosť je potrebné použiť polyméry, ktoré majú vyšší súčiniteľ pevnosti, pridať tuhšie polyméry, ako sú napríklad kopolyméry alebo zmesi, alebo zvýšiť hustotu zosieťovania polyméru, na zvýšenie stability matrice vo vzťahu k bunkovej kontrakcii.
Matrice môžu byť vytvorené ktorýmkoľvek z mnohých spôsobov, ktoré sú pre odborníkov známe. Na prípravu poréznej matrice· sa môžu použiť spôsoby, ako je napríklad vylúhovanie solí, použitie pórogénov, fázová separácia tuhá látka-kvapalina (niekedy nazývaná lyofilizácia, freeze-drying) a fázová inverzia. Ťahanie a tkanie vlákna- (pozri napríklad Vacanti, et al., (1988) Journal of Pediatrie Surgery 23:3-9) sa môže použiť na prípravu matrice, ktorá má niekoľko súbežných polymérnych vlákien. Odborník si ľahko zvolí niektorú zo· známych štandardných techník spracovania na vytvorenie polymérnych matríc s rôznou pórovitosťou a mikroštruktúrami.
Polymérna matrica je výhodne biologicky rozložiteľná (biodegradovateľná). Vhodné biologicky rozložiteľné polyméry na použitie pri realizácii predloženého vynálezu sú v odbore dobre známe a patria k nim napríklad polymliečna kyselina (PLA), polyglykolová kyselina (PGA) a kopolyméry PLA-PGA (PLGA). Ďalšie biologicky rozložiteľné látky zahrnujú PLA, polyanhydridy, polyhydroxykyseliny, polyortoestery, polypropy1fumaráty, polykaprolaktóny, polyamidy, polyaminokyseliny, polyacetály, polykyanoakryláty, biologicky a polysacharidy. Môžu sa tiež použiť polyméry, ktoré nie sú biologicky rozložiteľné. K takýmto biologicky nerozložiteľným polymérom, ktoré sú napriek tomu biologicky kompatibilné, patria napríklad polypyroly, polyanilíny, polytiofény, polystyrén, polyestery, biologicky polyuretány, polymočoviny, polyetylvinylacetát, polymetakrylát, polyetylén, polykarbonáty, polyetylénoxid. Pritom pre odborníka je zrejmé, že ide o vymenovanie príkladov, nie o vyčerpávajúci zoznam polymérov vhodných na účely podľa predloženého vynálezu.
rozložiteľné polyuretány biologicky rozložiteľné nerozložiteľné polypropylén,
Kopolyméry, zmesi a adičné produkty vyššie uvedených polymérov sa pri realizácii vynálezu taktiež môžu použiť. Práve kopolyméry môžu byť predovšetkým užitočné pri optimalizácii mechanických a chemických vlastností matrice. Tak napríklad, polymér s vysokou afinitou pre kmeňové bunky sa môže kombinovať s tuhším polymérom za vzniku matrice, ktorá má požadovanú tuhosť, aby odolala zrúteniu. Napríklad PLA sa môže kombinovať s polykaprolaktónom alebo PLGA a vytvorí sa tak zmes. Ako výber polyméru tak aj pomer polymérov v kopolymére sa môže upraviť a zvoliť tak, aby sa optimalizovala tuhosť matrice. ·.
Kopolyméry PLA a PLA/PGA sú predovšetkým vhodné na prípravu biologicky rozložiteľných matríc. Erózia polyesterovej matrice závisí od molekulovej hmotnosti a kryštalinity polyméru. Vyššie molekulové hmotnosti, napríklad priemerná molekulová hmotnosť 90 000 alebo vyššia, vedú k polymérnym matriciam, ktoré si uchovávajú štruktúrnu integritu počas dlhšieho časového obdobia, zatial čo nižšie molekulové hmotnosti, napríklad priemerné molekulové hmotnosti 30 000 . alebo nižšie, poskytujú matrice s kratšou životnosťou. Molekulová hmotnosť a kryštalinita taktiež ovplyvňujú tuhosť polymérnej matrice. Taktilita polyméru tiež ovplyvňuje modul (pružnosti, pevnosti). Kyselina poly-Lmliečna (PLLA) je izotaktilná, zvyšuje kryštalinitu a modul polyméru, v ktorom je pridaná. Odborník si je vedomý toho, že molekulová hmotnosť a kryštalinita ktoréhokoľvek z vyššie uvedených polymérov sa môže optimalizovať tak, aby sa upravila tuhosť matrice. Podobne, tiež podiel polymérov v kopolymére alebo zmesi sa môže upraviť tak, aby sa dosiahla požadovaná tuhosť.
V príkladnom uskutočnení sa môže do polymérnej matrice pridať modifikátor bunkovej odozvy, ako napríklad rastový faktor alebo chemotaktické činidlo. Takýto modifikátor sa môže použiť na to, aby stimuloval diferenciáciu embryonálnych kmeňových buniek na požadované cieľové bunky. Alternatívne, alebo okrem toho, sa modifikátor môže zvoliť tak, aby pritiahol bunky do matrice alebo stimuloval alebo obmedzoval špecifické metabolické aktivity buniek usadených v matrici. K príkladom rastových faktorov patri, bez toho, aby bol tento výpočet obmedzujúci, aktivín-A (ACT), kyselina retinová (RA), epidermálny rastový faktor, kostný morfogenetický proteín, TGF-β, rastový faktor hepatocytov, rastový faktor pochádzajúci z doštičiek, TGF-α, IGF^I a II, hemopoetické rastové faktory, rastový faktor viažuci heparín, peptidové rastové faktory, erytropoetín, interleukíny, nádorové nekrotické faktory, interferón, faktory stimulujúce kolónie, fibroblastové rastové faktory, nervový rastový faktor (NGF) a svalový morfogenetický faktor (MMF). Použitý konkrétny rastový faktor by sa mal vhodne zvoliť vzhľadom k požadovanej bunkovej aktivite a diferenciačnej dráhe. Regulačné účinky veľkej rodiny rastových faktorov pre odborníkov dostatočne známe.
Embryonálne kmeňové bunky sa môžu tiež kultivovať s rastovými faktormi alebo inými modifikátormi bunkovej odozvy pre tým, ako sa osadia na polymérnu matricu. Tieto bunky sa teda začnú diferencovať už pred tým, než sú kombinované s polymérom. Alternatívne, rôzne populácie buniek, ktoré boli exponované rôznym modifikátorom bunkovej odozvy, sa môžu osadiť na rôzne miesta trojrozmerného polymérneho skeletu.
Ďalšie bioaktívne činidlá, biomolekuly a malé molekuly sa taktiež môžu pridať do polymérnej matrice alebo kultivačného. média pred osadením buniek. Do polymérnej matrice sa napríklad môže pridať fibronektín, integríny alebo oligonukleotidy, ktoré podporujú bunkovú adhéziu, ako je napríklad RGD. Do matrice sa môžu pridať chemotaktické alebo protizápalové činidlá, aby takto ovplyvňovali chovanie buniek v tkanive obklopujúcom implantovanú matricu.
Polymérna matrica osadená bunkami, či už s gélom alebo bez neho, sa môže implantovať do akéhokoľvek tkaniva, ako je napríklad spojívové tkanivo, sval, nervové tkanivo a tkanivá orgánov. Spôsoby podľa vynálezu sa môžu použiť na prípravu tkaniva pôvodu ektodérmálneho, mezodermálneho i endodermálneho. Vo výhodnom uskutočnení sú zvolené rastové faktory, ktoré stimulujú diferenciáciu ES buniek a. tvorbu predurčeného tkanivového typu. Napríklad pridanie TGF-β k hES bunkám osadeným na trojrozmernej matrici indukuje tvorbu extracelulárnej matrix charakteristickej pre chrupavkovité tkanivo. Ako aktivín-A tak aj IGF indukujú ES bunky k tvorbe proteínov charakteristických pre vyvíjajúcu sa pečeň. RA indukuje hES bunky k tomu, že sa organizujú na ektodermálne štruktúry podobné nervovému tkanivu. Expozícia ES buniek kostnému morfogenetickému proteínu, kolónie stimulujúcemu faktoru špecifickému pre kosť a/alebo PDGF podporuje tvorbu kolagénu a iných proteínov ECM kosti.
Tak ako sa ďalej diferencujú, bunky produkujú chemotaktické činidlá, ktoré priťahujú bunky z tkaniva obklopujúceho matricu osadenú bunkami. Kmeňové bunky implantované s umelou tkanivovou štruktúrou tiež migrujú z matrice. Migrácia buniek pomáha začleniť implantovanú umelú tkanivovú štruktúru do tkaniva, ktoré ju obklopuje. Endotelové bunky migrujú z obklopujúcich krvných ciev a vytvárajú vaskulärizáciu implantovanej matrice, čím poskytujú živiny diferencujúcim sa bunkám.
Kmeňové bunky exprimujú gény a produkujú proteíny charakteristické pre cieľové bunky už dlho pred tým, než sú úplne diferencované. Tak napríklad v kmeňových bunkách exponovaných aktivínu-A alebo IGF sa exprimujú gény špecifické pre pečeň pred tým, ako sa bunky úplne diferencujú na hepatocyty a iné bunky vyskytujúce sa v pečeni. Avšak nie všetky kmeňové bunky v populácii kmeňových buniek exponovaných špecifickému modifikátoru bunkovej odozvy sa budú diferencovať rovnakou cestou. Napríklad niektoré bunky exponované aktivínu-A alebo IGF exprimujú neurónové markéry alebo endotelové markéry. Tieto bunky môžu napomáhať pri vyvinutí nervovej siete a cievneho zásobenia pre vyvíjajúce sa tkanivo pečene.
Ďalej, mechanické interakcie buniek a ich extracelulárna matrix ovplyvňujú bunkové procesy. Na ďalšiu podporu diferenciácie smerom k požadovanej dráhe sa môžu použiť exogénne mechanické sily ako modifikátory bunkovej odozvy na napodobnenie mechanických vplyvov vykonávaných tkanivami. Napríklad endotelové bunky sú vystavené strižným silám, keď krv preteká tepnami a žilami. Sval, pretože je ukotvený ku kosti aspoň na svojich koncoch, je vystavený ako uniformným tak neuniformným ťažným silám. Kosť je podrobená pôsobeniu kompresívnych a ohybových síl v priebehu normálneho pohybu. Orgánové tkanivá sú vystavené hydrostatickým tlakom a iným tlakovým stresom. Rozloženie mechanických síl na matricu osadenú bunkami in vitro bude ovplyvňovať produkciu aktínu nasadenými kmeňovými bunkami, a tá zase spätne ovplyvňuje stupeň a druh metabolickej aktivity buniek a mikroštruktúry extracelulárnej matrice, ktoré sú ' bunkami produkované.
Podobne sa môže použiť elektrická stimulácia na ovplyvnenie bunkovej diferenciácie a metabolizmu. Napríklad, kosť je piezoelektrická a sval sa skracuje a uvoľňuje ako reakcia na elektrické signály, ktoré sú vedené nervami. Elektrická stimulácia in vitro napodobňujúca elektrickú aktivitu požadovaného tkaniva môže ovplyvniť ES bunky osadené na trojrozmernej matrici tak, že vytvorí tkanivo, ktoré má elektrické charakteristiky tohto požadovaného tkaniva.
Tvar a mikroštruktúry polymérnej matrice a exogénne' sily pôsobiace na osadený polymér sa môžu pre špecifické tkanivo optimalizovať. Tak napríklad médium môže cirkulovať pulzným spôsobom v osadenej štruktúre vo forme trubice (t.j. vytvára tangenciálnu silu) na stimuláciu sily pôsobiacej na tepnu alebo sa médium môže použiť tak, že pôsobí strižnými silami na kmeňové bunky, ktoré tvoria výstelku vo vnútri trubicovej štruktúry (Niklason, et al. , (1999)
Science 284, 489-93; Kaushall, et al., (2001) Nat. Med. 7, 1035-1040).
Polymérové vlákna v matrici môžu byt spojené do zväzku, aby tak napodobnili tkanivovú štruktúru svalu, šľachy alebo väziva, alebo sformované do rúrkovitých sietí, aby podporovali tvorbu vaskulatúry.
Dokonca ešte pred tým, než sú osadené ES bunky úplne diferencované, môžu sa samé zorganizovať na trojrozmernú štruktúru s vlastnosťami takmer všetkých zvieracích tkanív potom, ako boli exponované príslušnému modifikátoru bunkovej odozvy. Po osadení na matrice, ktoré môžu poskytovať fyziologickú reakciu na mechanické vplyvy spôsobené kmeňovými bunkami, sú kmeňové bunky schopné diferencovať sa v podmienkach, ktoré sú podobnejšie fyziologickému prostrediu než v podstate dvojrozmerná Petriho miska. A skutočne, integrácia implantátu do miesta v tkanive môže pokračovať rýchlejšie alebo účinnejšie pred tým, než sú ES bunky definitívne diferencované.
Príklady uskutočnenia vynálezu
PROTOKOL EXPERIMENTOV
Tkanivová kultúra
Bunky hES (kloň H9) sa kultivovali na myšacích embryonálnych fibroblastoch (Celí Essential, Boston, MA) v médiu KnockOut Médium (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD), modifikovanej verzii Dulbecem modifikovaného Eaglovho média optimalizovaného pre bunky ES, ako bolo opísané5. Aby sa indukovala tvorba EB, kolónie buniek hES sa disociovali kolagenázou typu IV v koncentrácii 1 mg/ml a suspendovali sa v diferenciačných médiách bez LIF a bFGF na Petriho miskách.
Príprava skeletu
Skelet sa skladal zo zmesi 50/50 kopolyméru kyseliny mliečnej a glykolovej (Boehring Ingelheim Resomer 503H, Ingelheim, Nemecko, Mn ~ 25 000) a kyseliny poly-L-mliečnej (Polysciences, Warrington, PA, Mn ~ 300 000). Hubovité skelety sa vyrobili vysoľovacím („saltleaching) postupom, ako bolo opísané15. Pre pokusy týkajúce sa diferenciácie buniek sa hubovité skelety narezali na · kusy obdĺžnikového tvaru s veľkosťou približne 5x4x1 mm3. Pred nasadením buniek sa cez noc sterilizovali v 70 % (objem/objem) etanolu a trikrát sa premyli v PBS.
Mechanické testovanie
Pre testy ťahu samotných hubovitých skeletov sa suché hubovité skelety rozrezali na rozmery 0,4 mm x 5 mm x 11 mm a testovali sa pri rýchlosti deformácie 0,05 mm/sekunda až do poškodenia, s použitím prístroja Instron 5542. Testovanie kompresie sa uskutočňovalo na hubovitých skeletoch samotných a na hubovitých skeletoch s GrowthFactor Reduced Matrigel™, s Matrigelom so zníženým obsahom rastových faktorov, pri paralelnom nasadení buniek na doštičku pomocou prístroja Instron 5542. Hubovité skelety boli v tvare poréznych diskov s priemerom 17 mm a s hrúbkou 0,8 mm. So vzorkami sa najskôr uskutočnil jeden cyklus s použitím 5 % deformácie pri rýchlosti deformácie 0,1 mm/mm/sekunda pred testovaním pri rovnakej rýchlosti deformácie.
Bunková diferenciácia na Matrigele a skeletoch
Pre nasadenie na Matrigel sa 8-9 dní staré EB trypsini-zovali a 0,8 x 106 buniek sa zmiešalo v 25 μΐ 50 % (objem/objem) média a Matrigelu (so zníženým obsahom rastových faktorov, BD Biosciences, Bedford, MA). Médiá EB sa doplnili nasledujúcimi rastovými 'faktormi: TGF-βΐ (2 ng/ml), aktivín-A (20 ng/ml) a IGF-I (10 ng/ml), (R&D Systems, Minneapolis, MN) a RA (300 ng/ml) (Sigma). Zmes sa nechala stuhnúť na 5-jamkových Petriho miskách pri 37 °C a potom sa oddelila od misky sterilnou čepieľkou. Pridali sa 4 ml každého príslušného média EB. Pre nasadenie na skelety sa 0,8 x 106 buniek nanieslo na každý skelet s použitím 25 μΐ zmesi obsahujúcej 50 % (obj.em/objem) Matrigelu so zníženým obsahom rastových faktorov a príslušné médiá EB. Po nanesení buniek sa skelety suspendovali v 6-jamkových Petriho miskách vo svojich príslušných médiách. Pri niektorých experimentoch sa skelety namočili do fibronektínu s koncentráciou 50 μ9/πι1 (Sigma) počas jednej hodiny a premyli sa v PBS pred priamym nanesením buniek (bez Matrigelu) do 25 μΐ médií EB.
Spracovanie tkanív a imunohistochemické vyfarbenie
Tkanivové konštrukty sa fixovali počas 6 hodín v 10 % neutrálnom pufrovanom formalíne, rutinne sa spracovali a zaliali sa parafínom. Priečne rezy s hrúbkou 5 μπι sa umiestnili na silanizované sklíčka na imunohistochemické vyšetrenie alebo farbenie hematoxylínom a eozínom (H-E), trichrómom alebo Safranínom O. Imunohistochemické farbenie sa uskutočňovalo s použitím súpravy Biocare Medical Universal - HRP-DAB (Biocare Medical·, Walnut Creek, CA) podlá inštrukcií výrobcu, s predchádzajúcim ošetrením teplom pri 90 °C počas 20 minút v pufre ReVeal (Biocare Medical) s cieľom objavenia epitopu. Primárnymi protilátkami boli myšacie anti-humánne protilátky: desmín (1 : 150) , alfa-fetoproteín (1 : 2500), cytokeratin 7 (1 : 25), CD31 (1 : 20), albumín (1 .- 100), vimentín (1 : 50), S100 (1 : 100) (všetky od firmy Dáko) , antihumánna Pm-tubulín (Sigma, 1 : 500) , nestín (Transduction Laboratories, San Diego, CA, 1 : 1000), CD34 (Labvísion, Fremont, CA, 1 : 20), SSEA4 (Hybridoma Bank, University of Iowa, Ames, 1 :.4) a Tra 1-60 (dar od Petera Andrewsa, University of Sheffield, Sheffield, U.K., 1 : 10). Humánne a myšacie tkanivá (Daks) sa použili ako kontroly na zabezpečenie protilátkovej špecifickosti (obr. 1). Na proliferačné štúdie sa kultivačné médium inkubovalo s 10 pm 5-bróm2'-deoxyuridínu (BrdUrd) (Sigma) počas 3 hodín pred fixáciou. Tkanivové rezy sa vyfarbili s použitím myšacích protilátok anti-BrdUrd (1 : 1000) .
Porovnanie priemerov lúmen tubulocystických štruktúr vyst-laných cytokeratín-pozitívnym epitelom
Konštrukty kultivované počas dvoch týždňov v kontrolnom médiu alebo v prítomnosti IGF alebo RA sa spracovali a vyfarbili' anticytokeratínovými protilátkami tak, ako bolo opísané vyššie. Tubulocystické štruktúry sa spočítali a priemery lúmen sa zmerali a zoskupili (veľký > 200 pm, stredný (Med) > 40 μπι, malý < 40 μτη, uzatvorená a viacvrstvová lúmen). Výsledky, priemerné hodnoty (± SD) vzoriek získaných v dvoch rozličných experimentoch uskutočňovaných v dvojitom opakovaní, sa zaznamenali ako percentá lúmen v každej skupine z celkového počtu lúmen v každej vzorke.
Analýza PCR s reverznou transkripciou (RT)-PCR
Celková RNA sa izolovala s pomocou súpravy RNEasy Mini Kit (Qiagen, Chatsworth, CA) . RT-PCR sa uskutočnila s použitím súpravy Qiagen OneStep RT-PCR s 10 jednotkami inhibítora RNázy (GibcoJ a 40 ng RNA. Sekvencie primérov, reakčné podmienky a počty cyklov boli také, ako už bolo opísané15. Amplif ikované produkty sa separovali na 1,2 % agarózových géloch s etídiumbromidom (E-Gel, Invitrogen, Gaithersburg, MA). Na niektorých géloch obsahujúcich RNA amplifikovanú s použitím priméru GADPH sa uskutočnila semikvantitatívna analýza meraním priemernej intenzity pixelov každého pásu a normalizáciou nameranej intenzity na priemernú intenzitu pixelov pásu GADPH.
Transplantácia do myší SCID
Diferencujúce sa bunky hES, ktoré sa kultivovali na skeletoch počas 2 týždňov in vitro sa implantovali subkutánne do dorzálnej oblasti 4 týždne starých myší SCID (CB.17 SCID, Taconic Farms). Ako kontroly sa použili skelety implantované bez buniek. Štrnásť dní po transplantácii sa implantáty znova získali, cez noc sa fixovali v 10 % pufrovanom normalíne pri 4 ’C, zaliali sa do parafínu a narezali sa na histologické vyšetrenie.
VÝSLEDKY
Matrigel samotný neposkytuje dostatočnú podporu pre trojrozmernú diferenciáciu buniek hES
Diferencujúce sa bunky hBS (EB 8. deň) sa kultivovali v Matrigele, pre ktorý sa najskôr preukázalo, že podporuje bunkovú organizáciu14'15, v prítomnosti média s doplnkom reprezentatívnych rastových faktorov, o ktorých je známe, že indukujú diferenciáciu ES buniek: kyselina retinová (RA), aktivín-A, transformačný rastový faktor beta (TGF-β) a rastový faktor (IGF) podobný inzulínu. Zo začiatku sa zmes buniek a Matrigelu formovala na tvar disku), ale po dvoch týždňoch kultivácie v suspenzii sa štruktúra zmenila na tvar „gule, čo svedčí o kontrakcii Matrigelu s bunkami. Vzorky ošetrené buď aktivínom-A alebo RA (a do určitej miery TGF-β) vytvárali malé, kondenzované gule, zatial čo vzorky ošetrené IGF alebo kontrolným médiom bez rastových faktorov boli väčšie a menej kondenzované (obr. 2A) .
Histologické vyšetrenie gulí inkubovaných v IGF alebo kontrolnom médiu preukázalo prítomnosť príležitostných tubulárnych . alebo cystických štruktúr vystlaných epitelom. Na rozdiel od toho; vzorky ošetrené TGF-β, aktivínom-A alebo RA neobsahovali žiadne takéto štruktúry, jednotlivé bunky boli menšie a bolo vytvorené všeobecne menej celkovej extracelulárnej matrix (obr. 2A) . Pri guliach v druhej uvedenej skupine došlo k deteriorizácii, pričom najmenšia životaschopnosť buniek bola vo vzorkách ošetrených aktivínom-A. Hoci Matrigel podporoval tvorbu niektorých tubulárnych alebo cystických štruktúr s otvorenými lúmen pre ošetrenie IGF alebo kontrolným médiom, degenerácia buniek, deformácia tvaru a variácia veľkosti gúľ svedčili o tom, že samotný Matrigel bol nedostačujúcim na podporu rastu buniek hBS a ich 3D organizáciu.
Skelety poskytujúce mechanickú podporu pre odolávanie kontrakcii spôsobenej bunkami hES
Na vytvorenie 3D podporného prostredia na riadenie diferenciácie a organizácie buniek hES na štruktúry podobné tkanivám sa použili biologicky degradovateľné skelety. Skelety boli vytvorené zo zmesi 50 % kopolyméru kyseliny mliečnej a glykolovej (PLGA) a 50 % kyseliny poly-L-mliečnej (PLLA). PLGA bola zvolená na rýchlu degradáciu (približne 3 týždne), aby sa uľahčilo vrastanie buniek, zatiaľ čo PLLA bola zvolená na poskytnutie mechanickej tuhosti, aby odolávala kontraktílným silám buniek. Na uľahčenie nasadenia a vrastania bola zvolená veľkosť pórov 250-500 gm.
Na stanovenie, či by skelet odolal mechanickým silám, ktorými bunky pôsobia, uskutočňovali pôvodcovia testy kompresia a pevnosti uskutočňovali na skeletoch PLLA/PLGA zníženým obsahom rastových v ťahu. Testy kompresie sa samotných a s Matrigelom so a výsledky sú zosumarizované na obr.
faktorov 2B-C. Tieto údaje ša potom porovnali s publikovanými hodnotami pre samotný Matrigel (obr. 2D)
Skelet vykazoval mechanické vlastnosti, ktoré boli konzistentné s prv publikovanými hodnotami pre PLLA skelety s vysokou molekulovou hmotnosťou (obr. 2B, D)17. Pri kompresii mal polymérový skelet modul kompresie približne 65 kPa. Pridanie Matrigelu nezmenilo modul kompresie, ako sa stanovilo štatistickou analýzou s použitím.' ANOVA (obr. 2C, D) . Súhrnná tabuľka (obr. 2D) ukazuje, že; skelet a Matrigel/skelet vykazujú modul kompresie o tri rády vyšší ako je modul samotného Matrigelu. Tento rozdiel ovplyvňuje výkonnosť skeletu s bunkami. Pri odhadovanom bunkovom napätí v tlaku 110 Pa -sa. bude skelet kontrahovať o 0,2 percenta, čo znamená, že bude v podstate kontrakcii odolávať.
Skelety podporujú prichytenie, rast, diferenciáciu a 3D organizáciu buniek hES
Na stanovenie, či mal skelet účinok na diferenciáciu a 3D organizáciu buniek hES, porovnávali pôvodcovia dvojtýždňovú inkubáciu diferencujúcich sa buniek hES kultivovaných na doštičkách potiahnutých fibronektínom oproti skeletom potiahnutým fibronektínom a tiež diferenciáciu v samotnom Matrigele oproti Matrigelu so skeletom. Dvojrozmerná miska potiahnutá fibronektínom podporovala diferenciáciu niektorých buniek (obr. 3), ale nemohla podporovať tvorbu 3D štruktúry. Samotný Matrigel mohol vytvoriť 3D prostredie, ale nedokázal podporovať rast buniek hES a 3D organizáciu (obr. 2). Jednou možnosťou je, že rozdiely dosiahnuté medzi samotným Matrigelom a skeletmi a Matrigelom mohli byt čiastočne spôsobené mechanickou pevnosťou skeletov, ktorá je nevyhnutná pri odolávaní silám bunkovej kontrakcie.
Pri porovnávaní diferenciácie a organizácie umelých tkanivových štruktúr kultivovaných na skelete oproti EB pôvodcovia zistili' vyššiu expresiu proteínov združených s diferenciáciu, ako je ‘napríklad cytokeratín, AFP a nestín, na skeletoch, čo korelovalo s väčšou organizáciou na definované epitelové tubulárne štruktúry a rozety podobné nervovej trubici (obr. 4). Pokiaľ ide o tvorbu extracelulárnej matrix, v EB kondicionovaných s TGF-β sa nepozorovalo žiadne farbenie Safranínom-0. Populácia EB bola veľmi heterogénna, pokiaľ ide o štruktúry a hladiny expresie proteínov. V dôsledku toho sa polymérové skelety javili ako vhodnejšie než EB pri podpore diferenciácie a homogenity buniek.
Ako Matrigel (obr. 5E, G), tak aj fibronektín (obr. 5F, H) podporovali uchytenie diferencujúcich sa buniek hES (EB 8. deň) na skelety, rast a životaschopnosť buniek. Bunky sa prichytili na celom vnútornom a vonkajšom povrchu skeletu a vyplnili póry, ako sa preukázalo vyšetrením v rastrovacom elektrónovom mikroskope (obr. 5AD) a rutinným histologickým vyšetrením tkanivových rezov odobratých v rozličných hĺbkach (obr. 5E-H). Po dvojtýždňovom období vykazovali umelé tkanivové štruktúry inkubované s BrdUrd vysoký stupeň proliferácie a životaschopnosti v celom skelete (obr. 51-K). -Namiesto nediferencovaných buniek hES sa použili diferencujúce sa bunky hES, čo bolo založené na pozorovaní, že skelety osídlené nediferencovanými bunkami hES prejavovali jasnú perforáciu vonkajších povrchov a menej jednotný rast a prežívanie v centre skeletov v porovnaní s diferencujúcimi sa bunkami hES (EB 8. deň) (obr. 6, pozri tiež obr. 12A) .
Po inkubačnom období sa vzorky organizovali na 3D sústavy, ktoré sa podobali tkanivovým štruktúram. Po vyhodnotení týchto štruktúr analyzovali pôvodcovia tvorbu a organizáciu epitelových mezenchymálnych štruktúr a extracelulárnej matrix (obr. 7). Pridanie IGF malo za následok tvorbu relatívne veľkých tubulocystických štruktúr (84 % ± 6 > 40 pm, 10 % ± 3 > 200 pm) vystlaných cytok'eratínpozitívnymi epitelovými bunkami hranolovitého až valcovitého .tvaru v porovnaní s kontrolným médiom bez doplnených rastových faktorov (65 % ± 4 > 40 pm) (P < 0,01). Na rozdiel od toho, RA indukovala tvorbu štruktúr s lúmen, ktoré boli menšie ako štruktúry kontrolných vzoriek (25 % ± 12 > 40 pm) (P < 0,01) a často vytvárali cirkulárne viacvrstvové alebo uzatvorené telieska (obr. 7A, C). Ošetrenie RA malo za následok ~ 4-násobné zvýšenie celkového percenta cytokeratínpozitívnych oblastí v tkanive (P < 0,01), čo sa približovalo stupňu zistenému v testovaných dospelých epitelových tkanivách (obr. 7D) . Bunkové štruktúry secernovali zložky extracelulárnej matrix do -svojho okolia, ako sa preukázalo farbením trichrómom na kolagén (ôbr. 7B) . Tvorba kolagénu v matrix a organizácia matrix medzi bunkami bola dramaticky ovplyvnená pridaním rastových faktorov (obr. 7B). Novo vytvorený zle organizovaný kolagén v kontrolnom médiu je· slabo fibrilárny a slabo sa farbí. Pridanie TGF-β k médiu indukovalo'tvorbu zrelého kolagénu so silnými, silno sfarbenými pásmi, zatiaľ čo RA inhibovala tvorbu kolagénu. Bez ohľadu na podmienky, tubulocýstické štruktúry a tvorba extracelulárnej matrix v kultivačných systémoch podporovaných skeletmi boli väčšie a lepšie diferencované, než štruktúry v systémoch rovnako ošetrených ale len so samotným Matrigelom.
Príprava 3D mezodermálnych, ektodermálnych a endodermálnych tkanivových štruktúr pomocou biologicky rozložiteľných polymérnych skeletov
Ďalej sa vyšetrovala úloha chemických podnetov spojených s fyzikálnymi podnetmi pri stimulácii diferenciácie na špecifické mezodermálne, ektodermálne a endodermálne tkanivové štruktúry. Na základe štúdie diferenciácie myšacích a humánnych ES buniek . v EB modeloch a monovrstvách6'8 sa zvolili rastové faktory známe tým, že indukujú diferenciáciu na špecifické zárodočné vrstvy.
Na indukciu tvorby mezodermálneho tkaniva sa bunky inkubovali počas dvoch týždňov s TGF-β, aktivínom-A alebo kombináciou TGF-β a aktivínu-A. Pridanie TGF-β do média indukovalo ' tvorbu chrupavkovitého tkaniva v celej štruktúre, ako ukazujú vysoké hladiny farbenia pomocou Safranínu-0 na glykozaminoglykány (GAG), ktoré sú charakteristické pre extracelulárnu- matrix chrupavky18 (obr. 8) . Na rozdiel od toho, pridanie iných rastových faktorov, ako -napríklad aktivínu-A (dokonca i keď sa pridal spolu s TGF-β) , IGF alebo RA, neviedlo k indukcii tvorby matrix pozitívnej na Safranín-0 (obr. 8) . RT-PCR analýzy RNA extrahovanej z rozličných umelých tkanivových štruktúr ukázala vyššie hladiny expresie proteínu matrix chrupavky (CMP) vo vzorke ošetrenej TGF-β v porovnaní s ostatnými vzorkami (obr. 9A) . Podľa našich znalostí tieto výsledky demonštrujú po prvý raz vytvorenie 3D tkaniva podobného chrupavke pri použití diferencujúcich sa hES buniek.
Pridanie aktivínu-A alebo IGF indukovalo tvorbu štruktúr s biochemickými vlastnosťami vyvíjajúcej sa pečene. V porovnaní s kontrolou aktivín-A indukoval vysoké hladiny alfa fetoproteínu. (AFP) a albumínu v tejto vzorke. IGF indukoval vysoké hladiny AFP a albumínu v prísnejšie vymedzených oblastiach umelej štruktúry (obr. 8), zatial čo žiadne farbenie sa nepozorovalo po pridaní RA. Tieto .výsledky svedčia o tom, že v 3D štruktúrach podporovaných skeletmi s bunkami hES môže aktivín-A a IGF indukovať endodermálnu diferenciáciu·'a tvorbu tkaniva s biochemickým profilom, ktorý zodpovedá vyvíjajúcej sa pečeni. Analýze génovej expresie ukázala vyššie hladiny pankreatického génu PDX-1 v tkanivových štruktúrach, ktoré boli ošetrené akťivínom-A, v porovnaní s ostatnými rastovými faktormi (obr. 9B) , čo' ďálej podporuje úlohu aktivínu-A pri indukcii diferenciácie hES buniek na tkanivá endodermálneho pôvodu na polymérnych skeletoch.
Pre ektodermálne štruktúry sa pridala RA do média pre štruktúry 7'8,19. V porovnaní s ostatnými rastovými faktormi, dodanie RA viedlo k prednostnému rozvoju pevných a trubicovitých štruktúr s epitelovou výstelkou (obr. 7) . Navyše, farbenie na nervové markéry ukázalo, že bunky organizované na jednoduché alebo veľké viacvrstvové rozetové štruktúry podobné nervovej trubici boli pozitívne na nestín a βΙΠtubulín. Rozsiahle oblasti bez vlastností roziet sa taktiež pozitívne farbili na nestín a pm-tubulin (obr. 8). Bunky farbené na S-100, markér pre gliové a iné neuroektodermálne bunky, obklopovali niektoré trubice, čo poukazuje na ich podporný alebo migračný fenotyp. Analýza génovej expresie vzoriek ošetrených RA ukázala vysoké hladiny keratínu a neurofilamentovej RNA a veľmi nízku expresiu mezodermálnych a endodermálnych génov, na rozdiel od iných vzoriek (obr. 9) .. Tieto výsledky ukazujú, že RA indukuje ektodermálnu diferenciáciu hES buniek kultivovaných na polymérnych skeletoch, a prednostne rozvoj vysoko organizovaných štruktúr morfologicky a biochemický zhodných s nervovým tkanivom.
Analýza tkanivových štruktúr vytvorených v samotnom Matrígele ukázala, že chemické faktory neindukujú diferenciáciu, tak ako sa pozorovala na skeletoch. Namiesto vytvárania trubipk’gvitých a rozetovitých štruktúr v prítomnosti RA, bunky na Matrígele; sa organizovali na malé zhluky, ktoré mali veľmi nízku expresiu («ak vôbec nejakú) nestínu. Žiadna expresia AFP sa nepozorovala pri vzorkách Matrigelu ošetreného aktivínom-A. Pri IGF a kontrolných vzorkách sa pozorovalo určité AFP farbenie. Žiadne Safranín-0 farbenie z chrupavky pochádzajúceho GAG sa nepozorovalo pri vzorkách ošetrených TGF-β (obr.
2) . Tieto výsledky ukazujú, že skelet je významný pri stimulácií in vitro tvorby trojrozmernej chrupavky, pečene a tkaniva podobného nervovému tkanivu.
Vaskularizácia trojrozmerných tkanivových štruktúr in vitro
Pretože krvné cievy podporujú tvorbu komplexných tkanivových štruktúr20’22, analyzovali sme, či hES bunky boli schopné sa diferencovať a organizovať na krvné cievy vo vnútri tkanivovej štruktúry vytvorenej na skelete. Farbenie protilátkami proti- CD34 a CD31 ukázalo, že po dvojtýždňovej inkubácii so skeletmi sa bunky diferencovali na endotelové bunky a dokonca sa vo vnútri tkaniva organizovali na štruktúry podobné cievam.
3D kultúra buniek podporovala tvorbu masívnych 30 cievnych sietí, ktoré silne interagovali so susednými tkanivami (obr. 10). Porovnanie vaskularizácie v skeletoch v prítomnosti a/alebo neprítomnosti Matrigelu ukázalo, že Matrigel sa nepožadoval, pretože vzorky osadené na skelety potiahnuté fibronektínom (bez Matrigelu) viedli k vyššej miere endotelovej diferenciácie a vaskularizápie (obr. 10). Je zaujímavé, že vzorky, ktoré boli ošetrené RA, ani nevytvorili cievy (ako ukázalo imunofarbenie na CD34 a CD31) ani neexprimovali gény CD34 alebo CD31, ako ukázala analýza RA (obr. 9, 10).Boli tiež detegované pretiahnuté bunky podobné bunkám hladkého svalstvá. Tieto bunky boli organizované v okolí lúmen vo vnútri tkaniva, ale neboli vo vzorkách ošetrených RA (obr. 10) . Tieto výsledky ukazujú, že diferencujúce sa hES bunky kultivované na polymérnych skeletoch sa môžu diferencovať a vytvárať vaskularizované komplexné tkanivové štruktúry. Okrem toho, tento in vitro proces vaskularizácie, podporovaný fyzickým vedením skeletu, môže byť riadený pridaním rastových faktorov do kultivačného média.
Hodnotenie trojrozmernej umelej tkanivovej štruktúry po dvoch týždňoch in vivo
Pre analýzu terapeutického potenciálu tkanivových štruktúr hES s polymérnym skeletom boli chirurgicky implantované štruktúry 2 týždne staré do s.c. tkanív SCID myší. V dobe vybratia implantátu (14 dní po implantácii) boli bunky v tkanivovej štruktúre životaschopné a neboli detegované žiadne príznaky infekcie. Implantáty boli neúplne opuzdrené voľným fibrogranulomatóznym spojívovým tkanivom a prestúpené krvnými cievami príjemcu. Imunohistochemické farbenie s použitím protilátky špecifickej pre humánne CD31 preukázalo prítomnosť', ako imunoreaktívnych (štruktúra, obr. 11, šípky) a neimunoreaktívnych (príjemca, obr. 11, vrcholy šipiek) ciev vo vnútri tejto štruktúry. Navyše, cievy pochádzajúce z umelej tkanivovej štruktúry obsahovali intraluminálne červené krvinky, čo predpokladá cievne spojky medzi umelou štruktúrou a príjemcom. Imunofarbenie protilátkami proti cytokeratínu, Pm-tubulínu a AFP ukázalo, že implantované umelé tkanivové štruktúry pokračovali v expresii týchto humánnych bielkovín v definovaných štruktúrach vo vnútri oblasti skeletu (Obr. 11). V určitých prípadoch to vyzeralo tak, že diferenciácia a usporiadavanie štruktúry pokračovalo aj po implantácii (obr. - 11), čo bolo spôsobené ošetrením špecifickým cytokínom pred implantáciou...
Po pokračujúcom vyzrievaní umelej štruktúry in vivo, RAkondiciované štruktúry vykazovali rozsiahlejšie a lepšie organizované nervové štruktúry než pri podmienkach in vitro (alebo s kontrolným médiom in vitro alebo in vivo) , vrátane trubicovitých štruktúr vystlaných vysokým stĺpcovitým epitelom s dlhými riasinkami podobajúcimi sa ependymálnym bunkám a roziet s hojnými melanínovými granulami (hnedá/čierna na H-E rezoch, potvrdené farbením manganistanom draselným, údaje nie sú zobrazené). Protilátky prpti Pmtubulínu farbili neuroektodermálne štruktúry v implantáte rovnako ako myšacie periférne nervové vlákna v okolí spojivového tkaniva (obr. 11, hviezdička). farbenie pomocou SSEA-4 a Tra 1-60 protilátok indikovalo, že žiadne bunky nezostali nediferencované (obr. 12B).
DISKUSIA tkanivá s morfologickými a s vyvíjajúcou sa .humánnou
Ako fyzikálne prostredie tak podanie vhodného rastového faktore sú dôležité pre tvorbu humánnych 3D štruktúr podobných tkanivám Pôvodcovia vynálezu preukázali, že biochemickými vlastnosťami zhodnými chrupavkou, pečeňou, nervami a krvnými cievami, sa môžu tvoriť ii vitro pri použití hES buniek kultivovaných na polymérnom .skelete Pôvodcovia zistili, že skelet podporoval tvorbu diferencovanýcl tkanív. Použitím kontraktilných síl fibroblastov na modelovani< bunkového správania na skelete bol odhadnutý tlak buniek na· 110 Pa
Pri tomto tlaku matrigel kontrahuje o 700 %, zatiaľ čo skelet sa kontrahuje len o 0,2 % čo znamená, že skelet prakticky .zostáva nedeformovaný. V závislosti od bunkového typu však môžu bunky prejavovať rôzne kontraktilné sily. Okrem toho i chemické prostredie hrá úlohu pri mechanickom chovaní buniek. Ukázalo sa, že rastové faktory ovplyvňujú mechanické správanie buniek, vrátane kmeňových buniek23’26. Týmto sa môže vysvetliť, prečo sa Matrigel menej kontrahuje v podmienkach s niektorými rastovými faktormi (IGF alebo kontrolné médium), ale zase sa úplne zrúti s iným rastovým faktorom (aktivín-A, RA) (Obr. 2) . Keď sa bunky kultivovali na skeletoch pri dodaní rovnakého rastového faktora, indukovala sa ďalšia diferenciácia na rôzne špecifické bunkové typy (ako napríklad endotel, neurón, hepatocyt a podobne), s organizáciou na 3D tkanivovú štruktúru (ako je napríklad cievna sieť, štruktúry podobné neutrálnej trubici a podobne) (Obr. 8-10). Tieto zistenia svedčia o tom, že ako chemické tak aj fyzikálne podnety (napr. mechanická podpora poskytnutá skeletom) ovplyvňujú diferenciáciu ES buniek na komplexné tkanivá.
Účinky rastových faktorov môžu vyplývať z priamej diferenciácie alebo bunkovej selekcie buď stimuláciou alebo inhibíciou proliferácie alebo indukciou apoptózy špecifických bunkových typov. Napríklad, ak boli bunky osadené na skelety, ošetrenie RA indukovalo špecifickú diferenciáciu na epitelové štruktúry a štruktúry podobné neurálnym inhibovalo mezodermálnu
Pridanie aktivínu-A k skeletoch indukovalo významnú endodermálnu diferenciáciu, ako ukázalo imunofarbenie s AFP a albumínom, dvomi hlavnými proteínovými markérmi hepatickej diferenciácie2’1’28, a expresia pankreatického génu PDX-1 štruktúram a (Obr. 8-10) .
a endodermálnu diferenciáciu hES bunkám kultivovaným na
6,30 (Obr. 8, 9). Aktivín-A je známy hlavne ako mezodermálny faktor1 a preukázalo sa, že v systéme monovrstvy hES buniek indukuje hlavne mezodermálnu (predovšetkým svalovú) diferenciáciu bez expresie ktoréhokoľvek z testovaných endodermálnych (zahrnovali AFP a albumín) alebo ektodermálnych génov. Napriek tomu existujú správy,· ktoré ukazujú, že aktivín-A môže indukovať endodermálnu diferenciáciu31 33. Je možné, že načasovanie aplikácie (EB 8. deň oproti 5. dňu) alebo trojrozmernosť hrajú svoju úlohu pri účinku aktivínu-A na diferenciáciu hES buniek. Ďalším vysvetlením pre rozdiely medzi dvomi systémami v účinku aktivínu-A by mohla byť skutočnosť, že 3D štruktúry podporujú vaskularizáciu tkanív (v podmienkach, ktoré umožňujú mezodermálnu diferenciáciu). Pred nedávnom sa ukázalo, že endotelové bunky a vznikajúce cievy (dokonca predtým, než sú funkčné ako cievy) poskytujú indukčné signály, ktoré sú dôležité pre vývoj pečene a pankreasu34,35 . Preto by vytváranie cievnych sietí na skeletoch mohlo podporovať indukčný účinok akt ivínu-A smerom k endodermálnej diferenciácii.
Tieto výsledky ukazujú, že zložité štruktúry s vlastnosťami rôzne nasmerovaných embryonálnych tkanív sa môžu vytvárať in vitro z diferencujúcich sa hES buniek a ich ďalšia diferenciácia sa môže indukovať v podpornom 3D prostredí, ako je napríklad skelet z PLLA/PLGA polyméru. Výsledky in vivo ukazujú, že umelé štruktúry s hES na skeletoch zostávajú životaschopné najmenej 2 týždne, že tieto umelé štruktúry môžu priťahovať ďalšie bunky a vytvárať spojenie (anastomózy) s cievnym systémom príjemcu, a že diferenciačný vzorec indukovaný in vitro zostáva neporušený alebo sa ďalej rozvíja in vivo. Rast humánneho tkaniva in vitro predstavuje prísľub riešenia problémov nedostatku orgánov a rizika infekčných ochorení, ktoré predstavujú vážne problémy súčasnej transplantológie. Okrem potenciálnych klinických aplikácií môže vytváranie tkanív in vitro poskytnúť dôležitý prostriedok pri výskume raných fáz vývoja ľudského tela a organogenéze.
Pre odborníka v odbore budú zrejmé í ďalšie možné uskutočnenia vynálezu na základe tu uvedeného opisu. Uskutočnenia opísané v opisu a v príkladoch slúžia ako príklady na demonštráciu vynálezu a žiadnym spôsobom neobmedzujú rozsah vynálezu, ktorý je vymedzený pripojenými patentovými nárokmi.
Zoznam citovanej literatúry·.
1. Dushnik-Levinson, M. & Benvenisty, N. Embryogenesis in vitro: study of differentiation of embryonic stem cells. Biol Neonate 67, 77-83 (1995) .
2. Thompson, J.A, et al. Embryonic stem celí lines from human blastocysts. Science 2
3. Wobus, A.M. Potential of embryonic stem cells. Mol Aspects Med 22, 149-164 (2001).
4. Stocum, D. L. Stem cells in regenerative biology and medicíne. Wound Repair Regen 9, 429-442 (2001).
5. Itskovitz-Eldor, J. et al. Differentiation of human embryonic stem celí into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med 6, 88-95 (2000) .
6. Johansson, B.M. & Wiles, M.V. Evidence for involvement of activin A and bone morphogenetic protein 4 in mammalian mesoderm and hematopoetic development. Mol Celí Biol 15, 141-151 (1995).
7. Schuldiner, M., Yanuka, O., Itskovitz-Eldor, J., Melton, D.A. & Benvenisty, N. From the cover: Effects of eight growth factors on the differentiation of cells derived from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 97,11307-11312 (2000) .
8. Guán, K., Chang, H., Rolletschek, A. & Wobus, A.M. Embryonic stem celí-derived neurogenesis. Retinoic acid induction and lineage selection of neuronal cells. Celí Tissue Res 305, 171-176 (2001).
9. Kaufman, D.S., Hanson, E.T., Lewis, R.L., Auerbach, R. & Thompson, J. A. Hematopoietic colony-forming cells derived from human
embryonic stem cells. Proc Natl (2001). Acad Sci USA 98, 10716-10721
10. Ito, Y. Surface micropattering to regulate celí functions.
Biomaterials 20,2333-2342 (1999) .
11. Ballermann, B.J., Dardik, A., Eng, B. & Liu, A. Shear stress and the endothelium. Kidney
12. Carter, D.R., Beaupre, G.S., Giori, N. J. & Helms, J. A.
Mechanobiology of skeletal regeneration. Clin Orthop, S41-55 (1998) .
13. Ingber, D.E. & Folkman, J. Mechanochemical switching between growth and differentiation fibroblast growth factor-stimulated angiogenesis in vitro: role of extracellular matrix. J Celí Biol 109, 317-330 (1989) .
14. Darland, C. D. & D'Amor e, P. A. TGF beta is reqiured for the formation of capillary-like structures in three-dimensional cocultures of IOTI/2 and endothelial cells. Angiogenesis, 4, 11-20 (2001).
15. Levenberg, S., Golub, J.S., Amit, M., Itskovitz-Eldor, J. & Langer, R. Endothelial cells derived from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 99, 4391-4396 (2002).
16. Semler, E.J., Rannucci, C.S. & Moghe, P.V. Mechanochemical manipulation of hepatocyte aggregation can selectively induce or repress liver-specific function. Biotechnol Bioeng 69, 359-369 (2000) .
17. Pegoretti, A. Fambri, L. & Migliaresi, C. In vitro degradation of poly(L-lactic acid)fibres produced by melt spinning. J Appl Polym Sci 64, 213-223 (1996).
18. Naumann, A. et al. , Immunochemical and mechanical characterisation of cartilage subtypes in rabbit. J. Histochem Cytochem 50, 10491058 (2002) .
19. Dinsmore, J. et al., Embryonic stem cells differentiation in vitro as a novel source of cells for transplantation. Celí Transplant 5, 131-143 (1996) .
20. Risau, W. & Flamme, I. Vasculogenesis. Annu Rev Celí Dev Biol 11, 73-91 (1995) .
21. Folkman, J. & D'Amorc, P.A. Blood vessel formation: what is its molecular basis? Celí 87, 1153-1155 (1996) .
22. Nomi, M., Atala, A., Coppi, P.D. & Soker, S. Principals of neovascularisation for tissue engineering. Mol Aspects Med 23, 463 (2002).
23. Alien, F.D et al., Epidermal growth factor induces acute matrix contraction and subsequent calpain-modulated relaxation. Wound Repair Regen 10, 67-76 (2002).
24. Kinner, B. Zaleskas, J.M. & Spector, M. Regulation of smooth muscle actin expression and contraction in adult human mesenchymal stem cells. Exp Celí Res 278, 72-83 (2002).
25. Semler, E.J. & Moghe, P.V. Engineering hepatocyte functional fate through growth factor dynamics·. the role of celí morphologic priming. Biotechnol Bioeng 75, 510-520 (2001).
26. Zaleskas, J.M. et al., Growth factor regulation of smooth muscle actin expression and contraction of human articular chondrocytes and meniscal cells in a collagen-GAG matrix. Exp Celí Res 270, 2131 (2001).
27. Abe, K. et al. , Endoderm-specific gene expression in embryonic cells differentiated to embryoid bodies. Exp Celí Res 229, 27-34 (1996) .
28. Hamazaki, T. et al., Hepatic maturation in differentiating embryonic stem cells in vitro. FEBS Lett 497, 15-19 (2001).
29. Offield, M.F. et al. , PDX-1 is required for pancreatic outgrowth and differentiation of the rostral duodenum. Development 122, 983995 (1996) .
30. Smith, J.C., Price, B.M., Van Nimmen, K. & Huylebroeck, D.
Identification of a potent Xenopus mesoderm-inducing factor as a homoloque of activin A. Náture 345, 729-731 (1990).
31. Manova, K., Paynton, B.V. & Bachvarova, R. F. Expression of activins and TGF beta 1 and beta 2 RNAs in early postimplantation mouse embryos and uterine decidua. Mech Dev 36, 141-152 (1992).
32. Ninomiya, H., Takahashi, S., Tanegashima, K., Yokota, C. & Asashima, M. Endoderm differentiation and inductive effect of activin-treated ectoderm in Xenopus. Dev Growth Differ 41, 391-400 (1999) .
33. Teidemann, H., Asashima, M., Grunz, H. & Knochel, W. Pluripotent cells (stem cells) and their determination and differentiation in early vertebrate embryogenesis. Dev Growth Differ 43, 469-502 (2001).
34. Lammert, E., Cleaver, 0. & Melton, D. Induction of. pancreatic differentiation by signals from blood vessels. Science 294, 564567 (2001).
35. Matsumoto, K., Yoshitomi, H., Rossant, J. & Zaret, K.S: Liver organogenesis promoted by endothelial cells prior to vascular function. Science 294, 559-563 (2001).
36. Donovan, P. J. & Gerhart, J. The end of the beginning for plutipotent stem cells. Náture 414, 92-97 (2001).
37. Odorico, J.S., Kaufman, D.S. & Thompson, J.A. Multilineage differentiation from human embryonic stem celí lines. Stem Cells 19, 193-204 (2001) .
38. Freyman, T.M. Yannas, L.V., Yokoo, R. & Gibson, L.J. Fibroblast contractile force is independent of the stiffness which resist the contraction. Exp Celí Res 272, 153-162 (2002) .

Claims (63)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Umelá tkanivová štruktúra, ktorá obsahuje:
    embryonálne kmeňové bunky, trojrozmernú podpornú matricu pre bunky, pričom táto matrica je odolná voči kontraktilným silám uplatňovaným kmeňovými bunkami, a najmenej jeden rastový faktor zvolený z faktorov podporujúcich diferenciáciu kmeňových buniek na vopred určenú bunkovú líniu alebo špecifický bunkový typ.
  2. 2. Umelá tkanivová štruktúra podlá nároku 1, kde kmeňovými bunkami sú cicavčie embryonálne kmeňové bunky.
  3. 3. Umelá tkanivová štruktúra podlá nároku 2, kde bunkami sú humánne embryonálne kmeňové bunky.
  4. 4. Umelá tkanivová štruktúra podlá nároku 1, kde podporná matrica pre bunky obsahuje zmes kyseliny polymliečnej a kopolyméru kyseliny mliečnej a kyseliny glykolovej.
  5. 5. Umelá tkanivová štruktúra podlá nároku 4, kde podporná matrica pre bunky obsahuje 50/50 zmes kyseliny polymliečnej a kopolyméru kyseliny mliečnej a kyseliny glykolové.
  6. 6. Umelá tkanivová štruktúra podlá nároku 1, kde plocha priečneho rezu matrice je vplyvom kontraktiIných síl uplatňovaných embryonálnymi kmeňovými bunkami redukovaná najviac o 50 %.
  7. 7. Umelá tkanivová štruktúra podlá nároku 6, kde plocha priečneho rezu matrice je vplyvom kontraktiIných síl uplatňovaných embryonálnymi kmeňovými bunkami redukovaná najviac o 40 %.
  8. 8. Umelá tkanivová štruktúra podlá nároku Ί, kde plocha priečneho rezu matrice je vplyvom kontraktiIných síl uplatňovaných embryonálnymi kmeňovými bunkami redukovaná najviac o 30 %.
  9. 9. Umelá tkanivová štruktúra podlá nároku 8, kde plocha priečneho rezu matrice je vplyvom kontraktiIných síl uplatňovaných embryonálnymi kmeňovými bunkami redukovaná najviac o 20 %.
  10. 10. Umelá tkanivová štruktúra podlá nároku 9, kde plocha priečneho rezu matrice je vplyvom kontraktilných síl uplatňovaných embryonálnymi kmeňovými bunkami redukovaná najviac o 10 %.
  11. 11. Umelá tkanivová štruktúra podľa nároku 10, kde plocha priečneho rezu matrice je vplyvom kontraktilných síl uplatňovaných embryonálnymi kmeňovými bunkami redukovaná najviac o 1 %.
  12. 12. Umelá tkanivová štruktúra podľa nároku 1, kde podporná matrica buniek ďalej obsahuje povlak obsahujúci činidlá, ktoré podporujú bunkovú adhéziu.
  13. 13. Umelá tkanivová štruktúra podľa nároku 12, kde činidlo, ktoré podporuje bunkovú adhéziu, je zvolené zo skupiny, ktorú tvorí fibronektín, integríny a oligonukleotidy podporujúce bunkovú adhéziu.
  14. 14. Umelá tkanivová štruktúra podľa nároku 1, kde podporná matrica buniek je biologicky rozložiteľná alebo nerozložiteľná.
  15. 15. Umelá tkanivová štruktúra podľa nároku 1, kde podporná matrica buniek je z materiálu, ktorý je zvolený zo skupiny, ktorú tvorí: PLA, PGA, PLGA, polyanhydridy, polyhydroxykyseliny, polyortoestery, polypropylfumaršty, polykaprolaktóny, polyamidy, polyaminokyseliny, polyacetály, biologicky rozložiteľné polykyanoakryláty, biologicky rozložiteľné polyuretány, polysacharidy, polypyrol, polyanilíny, polystyrén, polyestery, biologicky nerozložiteľné polymočoviny, polyetylénvinylacetát, polypropylén, polymetakrylát, polyetylén, polykarbonáty, polyetylénoxid, kopolyméry ktorýchkoľvek z vyššie uvedených zlúčenín, adičné produkty ktorýchkoľvek z vyššie uvedených zlúčenín a zmesi ktorýchkoľvek z vyššie uvedených polymérov, kopolymérov a adičných produktov.
    polytíofén, polyuretány,
  16. 16. Umelá tkanivová štruktúra podlá nároku 1, ktorá ďalej obsahuje jednu nebo viacej biomolekúl, malých molekúl alebo bioaktívnych činidiel uložených v podpornej matrici pre bunky.
  17. 17. Umelá tkanivová štruktúra podlá nároku 1, ktorá ďalej obsahuje gél, ktorým sú potiahnuté vnútorné a vonkajšie povrchy podpornej matrice buniek.
  18. 18. Umelá tkanivová štruktúra podlá nároku 17, kde gél je zvolený zo skupiny, ktorú tvorí kolagénový gél, alginát, agar a Growth Factor Reduced Matrigel.
  19. 19. Umelá tkanivová štruktúra podlá nároku 18, kde gél ďalej obsahuje jednu nebo viac zlúčenín zvolených zo skupiny, ktorú tvorí: laminín fibrín, fibronektín, proteoglykány, glykoproteíny, glykozaminoglykány, chemotaktické činidlá a rastové faktory.
  20. 20. Umelá tkanivová štruktúra podľa nároku 1, kde rastový faktor je zvolený spomedzi cytokínov, eikozanoidov a diferenciačných faktorov.
  21. 21. Umelá tkanivová štruktúra podľa nároku 20, kde rastový faktor je zvolený zo skupiny, ktorú tvorí aktivín-A (ACT), kyselina retinová (RA) , epidermálny rastový faktor, kostný morfogenetický proteín, TGF-β, hepatocytový rastový faktor, rastový faktor krvných doštičiek, TGF-α, IGF-I a -II, hematopoetické rastové faktory, rastový faktor viažuci heparín, peptidové rastové faktory, erytropoetín, interleukíny, nádorové nekrotické faktory, interferón, faktory stimulujúce kolónie, fibroblastové rastové faktory, nervový rastový faktor (NGF) a svalový morfogenetický faktor (MMF).
  22. 22. Umelá tkanivová štruktúra podľa nároku 1, kde podporná matrica buniek má formu zvolenú zo skupiny, ktorú tvoria častice, trubice, huba, guľa, reťazec, zvinutý reťazec, kapilárna sieť, fólia, vlákno, mriežka a list.
  23. 23. Spôsob prípravy umelej tkanivovej štruktúry vyznačujúci sa t ý m, že zahrnuje kroky, kedy sa:
    poskytne populácia embryonálnych kmeňových buniek, podporná matrica pre bunky sa osadí embryonálnymi kmeňovými bunkami, a embryonálne kmeňové bunky sa vystavia pôsobeniu najmenej jedného činidla zvoleného z činidiel podporujúcich diferenciáciu kmeňových buniek na vopred určenú bunkovú liniu alebo špecifický bunkový typ,
    pričom krok vystavenia pôsobeniu najmenej uskutočňuje pred alebo po kroku osadenia matrice j edného bunkami. činidla sa 24 . Spôsob podľa nároku 23, vyznačujúci sa kmeňovými bunkami sú cicavčie embryonálne kmeňové bunky. tým, že 25. Spôsob podľa nároku 24, vyznačujúc bunkami sú humánne embryonálne kmeňové bunky. i sa tým, že 26 . Spôsob podľa nároku 23, vyznačujúc podporná matrica pre bunky je trojrozmerná. i sa tým, že 27 . Spôsob podľa nároku 23, vyznačujúc i sa tým, že plocha priečneho rezu matrice sa vplyvom kontraktilných síl
    uplatňovaných embryonálnymi kmeňovými bunkami redukuje najviac o 50 %.
  24. 28. Spôsob podľa nároku 27, vyznačujúci sa tým, že plocha priečneho rezu matrice sa vplyvom kontraktiIných síl uplatňovaných embryonálnymi kmeňovými bunkami redukuje najviac o 40 %.
  25. 29. Spôsob podľa nároku 28, vyznačujúci sa tým, že plocha priečneho rezu matrice sa vplyvom kontraktilných síl uplatňovaných embryonálnymi kmeňovými bunkami redukuje najviac O 3 0 %.
  26. 30. Spôsob podľa nároku 29, vyznačujúci sa tým, že plocha priečneho rezu matrice sa vplyvom kontraktilných síl uplatňovaných embryonálnymi kmeňovými bunkami redukuje najviac o 20 %.
  27. 31. Spôsob podľa nároku 30, vyznačujúci sa tým, že plocha priečneho rezu matrice sa vplyvom kontraktilných síl uplatňovaných embryonálnymi kmeňovými bunkami redukuje najviac o 10 %.
  28. 32. Spôsob podľa nároku 31, vyznačujúci sa tým, že plocha priečneho rezu matrice sa vplyvom kontraktilných síl uplatňovaných embryonálnymi kmeňovými bunkami redukuje najviac o 1 %.
  29. 33. Spôsob podľa nároku 23, vyznačujúci sa tým, že podporná matrica pre bunky obsahuje zmes kyseliny polymliečnej a kopolyméru kyseliny mliečnej a kyseliny glykolovej.
  30. 34. Spôsob podľa nároku 33, vyznačujúci sa tým, že podporná matrica pre bunky obsahuje 50/50 zmesi kyseliny polymliečnej a kopolyméru kyseliny mliečnej a kyseliny glykolovej.
  31. 35. Spôsob podľa nároku 23, vyznačujúci sa tým, že podporná matrica buniek ďalej obsahuje povlak obsahujúci činidlá, ktoré podporujú bunkovú adhéziu.
  32. 36. Spôsob podľa nároku 35, vyznačujúci sa tým, že činidlo, ktoré podporuje bunkovú adhéziu, je zvolené zo skupiny, ktorú tvorí fibronektín, integríny a oligonukleotidy podporujúce bunkovú adhéziu.
  33. 37. Spôsob podľa nároku 23, vyznačujúci sa tým, že podporná matrica buniek je biologicky rozložiteľná alebo nerozložiteľná.
  34. 38. Spôsob podľa nároku 23, vyznačujúci sa tým, že podporná matrica buniek je z materiálu, ktorý je zvolený zo skupiny, ktorú tvorí: PLA, PGA, PLGA, polyanhydridy, polyhydroxykyseliny, polykaprolaktóny, polyamidy, biologicky rozložiteľné rozložiteľné polyuretány, polystyrén, polyortoestery, polypropylfumaráty, polyaminokyseliny, polyacetály, polykyanoakryláty, biologicky polysacharidy, polypyrol, polyanilíny, polytiofén, polyestery, biologicky nerozložiteľné polyuretány, polymočoviny, polyetylénvinylacetát, polypropylén, polymetakrylát, polyetylén, polykarbonáty, polyetylénoxid, kopolyméry ktorýchkolvek z vyššie uvedených zlúčenín, adičné produkty ktorýchkolvek z vyššie uvedených zlúčenín a zmesi ktorýchkoľvek z vyššie uvedených polymérov, kopolymérov a adičných produktov.
  35. 39. Spôsob podľa nároku 23, vyznačujúci sa tým, že ďalej zahrnuje krok pridania jednej nebo viacerých biomolekúl, malých molekúl nebo bioaktívnych činidiel do podpornej matrice pre bunky.
  36. 40. Spôsob podľa nároku 23, vyznačujúci sa tým, že ďalej zahrnuje krok, kedy sa embryonálne kmeňové bunky pridajú do gélu, a osadenie embryonálnych kmeňových buniek na podpornú matricu pre bunky zahrnuje potiahnutie vnútorných a vonkajších povrchov podpornej matrice gélom.
  37. 41. Spôsob podľa nároku 40, vyznačujúci sa tým, že gél je zvolený zo skupiny, ktorú tvorí kolagénový gél, alginát, agar a Growth Factor Reduced Matrigel.
  38. 42. Spôsob podľa nároku 41, vyznačujúci sa tým, že gél ďalej obsahuje jednu nebo viac zlúčenín zvolených zo skupiny, ktorú tvorí: laminín fibrín, fibronektín, proteoglykány, glykoproteíny, glykozaminoglykány, chemotaktické činidlá a rastové faktory.
  39. 43. Spôsob podľa nároku 23, vyznačujúci sa tým, že kultivácia sa uskutočňuje v médiu bez séra.
  40. 44. Spôsob podľa nároku 23, vyznačujúci sa tým, že činidlo je zvolené zo skupiny, ktorú tvoria rastové faktory, mechanická sila, elektrické napätie, bioaktívne činidlo, biomolekula a malá molekula.
  41. 45. Spôsob podľa nároku 44, vyznačujúci sa tým, že rastový faktor je zvolený spomedzi cytokínov, eikozanoidov a diferenciačných faktorov.
  42. 46. Spôsob podľa nároku 45, vyznačujúci sa tým, že rastový faktor je zvolený zo skupiny, ktorú tvorí aktivín-A (ACT), kyselina retinová (RA), epidermálny rastový faktor, kostný morfogenetický proteín, TGF-β, hepatocytový rastový faktor, rastový faktor krvných doštičiek, TGFa, IGF-I a -XI, hematopoetické rastové faktory, rastový faktor viažuci heparín, peptidové rastové faktory, erytropoetín, interleukíny, nádorové nekrotické faktory, interferón, faktory stimulujúce kolónie, fibroblastové rastové faktory, nervový rastový faktor (NGF) a svalový morfogenetický faktor (MMF).
  43. 47. Spôsob podľa nároku 44, vyznačujúci sa tým, že mechanická sila je zvolená zo skupiny, ktorú tvorí tangenciálna sila, namáhanie v strihu, hydrostatická sila, namáhanie tlakom, namáhanie ťahom alebo akákoľvek ich kombinácia.
  44. 48. Spôsob podľa nároku 23, vyznačujúci sa tým, že podporná matrica buniek má formu vybranú zo skupiny, ktorú tvoria častice, trubice, huba, guľa, reťazec, zvinutý reťazec, kapilárne sieť, fólia, vlákno, mriežka a list.
  45. 49. Spôsob podľa nároku 23,vyznačujúci sa tým, že krok poskytnutia embryonálnych kmeňových buniek zahrnuje kultiváciu embryonálnych kmeňových buniek v prítomnosti rastového faktora.
  46. 50. Spôsob podľa nároku 49, vyznačujúci sa tým, že kultivácia sa uskutočňuje v médiu bez séra.
  47. 51. Umelá tkanivová štruktúra, ktorá obsahuje:
    embryonálne kmeňové bunky, trojrozmernú podpornú matricu pre bunky obsahujúce 50/50 zmes kyseliny polymliečnej a kopolyméru kyseliny mliečnej a kyseliny glykolovej, a
    TGF-β.
  48. 52. Umelá tkanivová štruktúra, ktorá obsahuje:
    embryonálne kmeňové bunky, trojrozmernú podpornú matricu pre bunky obsahujúce 50/50 zmes kyseliny polymliečnej a kopolyméru kyseliny mliečnej a kyseliny glykolovej, a zlúčeninu zvolenú zo skupiny, ktorú tvorí aktivín A, IGF a akákoľvek ich kombinácia.
  49. 53. Umelá tkanivová štruktúra, ktorá obsahuje:
    embryonálne kmeňové bunky, trojrozmernú podpornú matricu pre bunky obsahujúce 50/50 zmes kyseliny polymliečnej a kopolyméru kyseliny mliečnej a kyseliny glykolovej, a kyselinu retínovú.
  50. 54. Umelá tkanivová štruktúra podľa nároku 51, 52 alebo 53, kde podporná matrica pre bunky ďalej obsahuje jednu nebo viac zlúčenín zvolených zo skupiny, ktorú tvorí fibronektín alebo Growth Factor Reduced Matrigel.
  51. 55. Spôsob stimulácie vývoja tkaniva, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje kroky:
    poskytnutia populácie embryonálnych kmeňových buniek, osadenia podpornej matrice pre bunky obsahujúce 50/50 zmes kyseliny polymliečnej a kopolyméru kyseliny mliečnej a kyseliny glykolovej embryonálnymi kmeňovými bunkami, a vystavenia embryonálnych kmeňových buniek pôsobeniu TGF-β, pričom bunky vytvárajú chrupavkovité tkanivo.
    55. Spôsob stimulácie vývoja tkaniva, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje kroky:
    poskytnutia populácie embryonálnych kmeňových buniek, osadenia podpornej matrice pre bunky obsahujúce 50/50 zmes kyseliny polymliečnej a kopolyméru kyseliny mliečnej a kyseliny glykolovej embryonálnymi kmeňovými bunkami, a vystavenia embryonálnych kmeňových buniek pôsobeniu jednej alebo viacerých zlúčenín zvolených zo skupiny pozostávajúcej z aktivínu A a IGF, pričom bunky produkujú alfa fetoproteín a albumín.
  52. 57. Spôsob stimulácie vývoja tkaniva, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje kroky:
    poskytnutia populácie embryonálnych kmeňových buniek, osadenia podpornej matrice pre bunky obsahujúce 50/50 zmes kyseliny polymliečnej a kopolyméru kyseliny mliečnej a kyseliny glykolovej embryonálnymi kmeňovými bunkami, a vystavenia embryonálnych kmeňových buniek pôsobeniu kyseliny retinovej, pričom bunky vytvárajú neurónové štruktúry.
  53. 58. Spôsob podľa nároku 55, 56 alebo 57, vyznačujúci sa t ý m, že podporná matrice pre bunky ďalej obsahuje jednu nebo viac zlúčenín zvolených zo skupiny, ktorú tvorí fibronektin alebo Growth Factor Reduced Matrigel.
  54. 59. Spôsob podľa nároku 55, 56 alebo 57, vyznačujúci sa tým, že krok vystavenia zahrnuje kultiváciu osadenej podpornej matrice in vitro po dobu dvoch týždňov a ďalej zahrnuje krok implantácie osadenej podpornej matrice do zvieraťa.
  55. 60. Spôsob stimulácie vývoja tkaniva, vyznačujúci satým, že zahrnuje kroky:
    poskytnutia populácie embryonálnych kmeňových buniek, osadenia podpornej matrice pre bunky embryonálnymi kmeňovými bunkami, kultivácie osadenej podpornej matrice v prítomnosti rastového faktora počas vopred určenej doby, a implantáciu kultivovanej podpornej matrice do zvieraťa.
  56. 61. Spôsob podľa nároku 60, vyznačujúci sa tým, že podporná matrica buniek je z materiálu, ktorý je zvolený zo skupiny, ktorú tvorí: PLA, PGA, PLGA, polyanhydridy, polyhydroxykyseliny, polyortoestery, polypropylfumaráty, polykaprolaktóny, polyamidy, polyaminokyseliny, polyacetály, biologicky rozložiteľné polykyanoakryláty, biologicky rozložiteľné polyuretány, polysacharidy, polypyrol, polyanilíny, polytiofén, polystyrén, polyestery, biologicky nerozložiteľné polyuretány, polymočoviny, polyetylénvinylacetát, polypropylén, polymetakrylát, polyetylén, polykarbonáty, polyetylénoxid, kopolyméry ktorýchkolvek z vyššie uvedených zlúčenín, adičné produkty ktorýchkolvek z vyššie uvedených zlúčenín a zmesi ktorýchkolvek z vyššie uvedených polymérov, kopolymérov a adičných produktov.
  57. 62. Spôsob podľa nároku 60, vyznačujúci sa tým, že trojrozmerná podporná matrica buniek obsahuje 50/50 zmes kyseliny polymliečnej a kopolyméru kyseliny mliečnej a kyseliny glykolovej.
    63 . Spôsob podľa nároku 60, vyznačuj ú c i s a tým, že d'a 1 e j obsahuje krok potiahnutia podpornej matrice buniek činidlom, ktoré stimuluje bunkovú adhéziu. 64. Spôsob podľa nároku 63, vyznačuj ú c i s a tým, že
    činidlo, ktoré podporuje bunkovú adhéziu, je zvolené zo skupiny, ktorú tvorí fibronektín, integríny a oligonukleotidy podporujúce bunkovú adhéziu.
  58. 65. Spôsob podľa nároku 60, vyznačujúci sa tým, že ďalej zahrnuje krok, kedy sa embryonálne kmeňové bunky vmiešajú do gélu, pričom osadenie embryonálnych kmeňových buniek na podpornú matricu pre bunky zahrnuje nanesenie gélu na vnútorné a vonkajšie povrchy podpornej matrice.
  59. 66. Spôsob podľa nároku 65, vyznačujúci sa tým, že gél je zvolený zo skupiny, ktorú tvorí kolagénový gél, alginát, agar a Growth Factor Reduced Matrigel.
  60. 67. Spôsob podľa nároku 65, vyznačujúci sa tým, že gél ďalej obsahuje jednu nebo viac zlúčenín zvolených zo skupiny, ktorú tvorí laminín fibrín, fibronektín, proteoglykány, glykoproteíny, glykozaminoglykány, chemotaktické činidlá a rastové faktory.
  61. 68. Spôsob podľa nároku 60, vyznačujúci sa tým, že rastový faktor je zvolený zo skupiny, ktorú tvorí aktivín-A (ACT), kyselina retinová (RA), epidermálny rastový faktor, kostný morfogenetický proteín, TGF-β, hepatocytový rastový faktor, rastový faktor krvných doštičiek, TGF-α, IGF-I a -II, hematopoetické rastové faktory, rastový faktor viažuci heparín, peptidové rastové faktory, erytropoetín, interleukíny, nádorové nekrotické faktory, interferón, faktory stimulujúce kolónie, fíbroblastové rastové faktory, nervový rastový faktor (NGF) a svalový morfogenetický faktor (MMF).
  62. 69. Spôsob podľa nároku 60, vyznačujúci sa tým, že vopred určenou dobou je doba dvoch týždňov.
  63. 70. Spôsob podľa nároku 60, vyznačujúci sa tým, že kultivácia sa uskutočňuje v médiu bez séra.
SK5110-2005A 2002-12-10 2003-12-10 Umelá tkaninová štruktúra obsahujúca embryonálne kmeňové bunky a spôsob jej prípravy SK51102005A3 (sk)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US43222802P 2002-12-10 2002-12-10
US44392603P 2003-01-31 2003-01-31
US10/731,672 US20050031598A1 (en) 2002-12-10 2003-12-09 Engineering three-dimensional tissue structures using differentiating embryonic stem cells
PCT/US2003/039301 WO2004053096A2 (en) 2002-12-10 2003-12-10 Engineering three-dimensional tissue structures using differentiating embryonic stem cells

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK51102005A3 true SK51102005A3 (sk) 2006-06-01

Family

ID=32512335

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK5110-2005A SK51102005A3 (sk) 2002-12-10 2003-12-10 Umelá tkaninová štruktúra obsahujúca embryonálne kmeňové bunky a spôsob jej prípravy

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20050031598A1 (sk)
JP (1) JP2006518993A (sk)
KR (1) KR20050103270A (sk)
AU (1) AU2003297839A1 (sk)
CA (1) CA2508850A1 (sk)
CZ (1) CZ2005753A3 (sk)
GB (1) GB0519352D0 (sk)
HU (1) HUP0500979A3 (sk)
IL (1) IL169100A (sk)
SK (1) SK51102005A3 (sk)
WO (1) WO2004053096A2 (sk)

Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPWO2004084967A1 (ja) * 2003-03-25 2006-06-29 真一郎 林 三次元マトリゲル層上における胚性幹細胞から血管特異的器官形成
TW200506345A (en) * 2003-08-14 2005-02-16 Au Optronics Corp Water quality analysis method using potassium permanganate
AU2005272681B2 (en) * 2004-08-13 2009-11-19 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Compositions and methods for self-renewal and differentiation in human embryonic stem cells
EP1784481A1 (en) * 2004-08-25 2007-05-16 Technion Research And Development Foundation, Ltd. Methods of generating embryoid bodies using three dimensional scaffolds
US20070020243A1 (en) * 2005-01-12 2007-01-25 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions related to modulating the extracellular stem cell environment
WO2006104901A2 (en) * 2005-03-28 2006-10-05 University Of Florida Research Foundation, Inc. Materials and methods for improved tissue engineering
KR101529317B1 (ko) 2005-06-22 2015-06-16 아스테리아스 바이오세라퓨틱스, 인크. 영장류 다능성 줄기 세포의 심근세포 계통 세포로의 분화
US8979921B2 (en) * 2006-02-07 2015-03-17 Tepha, Inc. Polymeric, degradable drug-eluting stents and coatings
US9592325B2 (en) * 2006-02-07 2017-03-14 Tepha, Inc. Polymeric, degradable drug-eluting stents and coatings
DK2420565T3 (en) * 2006-02-23 2017-12-04 Viacyte Inc APPLICABLE COMPOSITIONS AND METHODS FOR CULTIVATING DIFFERENTIBLE CELLS
US20090061517A1 (en) * 2007-05-31 2009-03-05 Kisaalita William S Cell culture apparatus and methods of making and using same
WO2008152640A2 (en) * 2007-06-13 2008-12-18 Pluristem Ltd. Three dimensional biocompatible scaffolds for ex-vivo expansion and transplantation of stem cells
US8642333B2 (en) * 2008-02-04 2014-02-04 Massachusetts Institute Of Technology Particulate delivery vehicles for embryoid bodies
AU2009228215B2 (en) 2008-03-27 2015-12-10 Asterias Biotherapeutics, Inc. Differentiation of primate pluripotent stem cells to hematopoietic lineage cells
US8648170B2 (en) 2008-09-19 2014-02-11 Wisconsin Alumni Research Foundation Peptide-presenting surfaces for long-term culture of pluripotent cells
US20100143313A1 (en) * 2008-12-10 2010-06-10 The General Hospital Corporation Homogeneous differentiation of hepatocyte-like cells from embryonic stem cells
US20120195862A1 (en) * 2009-04-17 2012-08-02 Children's Medical Center Corporation Biomechanical induction of hematopoiesis
US8895291B2 (en) 2010-10-08 2014-11-25 Terumo Bct, Inc. Methods and systems of growing and harvesting cells in a hollow fiber bioreactor system with control conditions
US8673323B2 (en) 2011-01-07 2014-03-18 Washington University Polymer nanofiber scaffold for a heparin / fibrin based growth factor delivery system
US11045500B2 (en) 2011-02-14 2021-06-29 Technion Research Development Foundation Ltd. Tissue engineering construct comprising fibrin
US20140329314A1 (en) 2011-03-29 2014-11-06 Christopher O'Sullivan Enriched populations of cardiomyocyte lineage cells from pluripotent stem cells
EP2743345A1 (en) 2012-12-13 2014-06-18 IMBA-Institut für Molekulare Biotechnologie GmbH Three dimensional heterogeneously differentiated tissue culture
CN105992816B (zh) 2013-11-16 2018-04-17 泰尔茂比司特公司 生物反应器中的细胞扩增
EP3613841B1 (en) 2014-03-25 2022-04-20 Terumo BCT, Inc. Passive replacement of media
JP6830059B2 (ja) 2014-09-26 2021-02-17 テルモ ビーシーティー、インコーポレーテッド スケジュール化された細胞フィーディング
US11214768B2 (en) * 2015-03-03 2022-01-04 President And Fellows Of Harvard College Methods of generating functional human tissue
JP6533104B2 (ja) * 2015-06-18 2019-06-19 株式会社ジーシー 細胞工学用支持体の製造方法
WO2017004592A1 (en) 2015-07-02 2017-01-05 Terumo Bct, Inc. Cell growth with mechanical stimuli
JP6699044B2 (ja) * 2016-03-15 2020-05-27 国立大学法人山梨大学 染色方法および観察方法
EP3436567A4 (en) 2016-03-30 2019-10-30 Asterias Biotherapeutics, Inc. OLIGODENDROCYTE PROGENITOR CELL COMPOSITIONS
WO2017205667A1 (en) 2016-05-25 2017-11-30 Terumo Bct, Inc. Cell expansion
US11685883B2 (en) 2016-06-07 2023-06-27 Terumo Bct, Inc. Methods and systems for coating a cell growth surface
US11104874B2 (en) 2016-06-07 2021-08-31 Terumo Bct, Inc. Coating a bioreactor
CN109913402B (zh) * 2016-09-14 2023-02-21 四川蓝光英诺生物科技股份有限公司 人工组织前体及制备其的方法
US10767164B2 (en) 2017-03-30 2020-09-08 The Research Foundation For The State University Of New York Microenvironments for self-assembly of islet organoids from stem cells differentiation
US11624046B2 (en) 2017-03-31 2023-04-11 Terumo Bct, Inc. Cell expansion
CN117247899A (zh) 2017-03-31 2023-12-19 泰尔茂比司特公司 细胞扩增
SG11202107732XA (en) 2019-01-23 2021-08-30 Asterias Biotherapeutics Inc Dorsally-derived oligodendrocyte progenitor cells from human pluripotent stem cells

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5902741A (en) * 1986-04-18 1999-05-11 Advanced Tissue Sciences, Inc. Three-dimensional cartilage cultures
US6835377B2 (en) * 1998-05-13 2004-12-28 Osiris Therapeutics, Inc. Osteoarthritis cartilage regeneration
WO2001012785A1 (en) * 1999-08-13 2001-02-22 University Of Rochester Ex vivo generation of functional osteoclasts from bone marrow in a three-dimensional bioreactor
US7045353B2 (en) * 2000-08-01 2006-05-16 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Directed differentiation of human embryonic cells
AU2002239810A1 (en) * 2001-01-02 2002-07-16 The Charles Stark Draper Laboratory, Inc. Tissue engineering of three-dimensional vascularized using microfabricated polymer assembly technology
CN1543500B (zh) * 2001-07-12 2014-04-09 杰龙公司 从人多能干细胞产生心肌细胞系细胞
NZ536564A (en) * 2002-05-02 2008-05-30 Purdue Research Foundation Vascularization enhanced graft constructs which comprise a matrix composition consisting of liver basement membrane

Also Published As

Publication number Publication date
WO2004053096A2 (en) 2004-06-24
HUP0500979A2 (en) 2007-07-30
US20050031598A1 (en) 2005-02-10
IL169100A (en) 2011-11-30
WO2004053096A3 (en) 2004-09-10
CA2508850A1 (en) 2004-06-24
CZ2005753A3 (cs) 2006-05-17
HUP0500979A3 (en) 2010-01-28
KR20050103270A (ko) 2005-10-28
JP2006518993A (ja) 2006-08-24
AU2003297839A1 (en) 2004-06-30
GB0519352D0 (en) 2005-11-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK51102005A3 (sk) Umelá tkaninová štruktúra obsahujúca embryonálne kmeňové bunky a spôsob jej prípravy
Levenberg et al. 5 Advances in Tissue Engineering
JP2006518993A5 (sk)
Dawson et al. Biomaterials for stem cell differentiation
Fitzpatrick et al. Cell-derived matrices for tissue engineering and regenerative medicine applications
US9301925B2 (en) Inkjet printing of tissues and cells
US20060198827A1 (en) Engineering vascularized muscle tissue
Laurencin et al. Nanotechnology and tissue engineering: the scaffold
EP1835949B1 (en) Tissue engineering devices for the repair and regeneration of tissue
JP2018161130A (ja) 組織製造方法
US20060153815A1 (en) Tissue engineering devices for the repair and regeneration of tissue
Jukes et al. Critical steps toward a tissue-engineered cartilage implant using embryonic stem cells
Furth et al. Tissue engineering: future perspectives
US20230098674A1 (en) Engineered tissue constructs
US20100233132A1 (en) Formation of vascular networks using embryonic stem cells
Yang et al. Tissue engineering: the therapeutic strategy of the twenty-first century
Kuo et al. Guided differentiation and tissue regeneration of induced pluripotent stem cells using biomaterials
Bosch et al. Design of functional biomaterials as substrates for corneal endothelium tissue engineering
Muniyandi et al. Direct Cardiac Reprogramming with Engineered miRNA Scaffolds
Levenberg et al. Embryonic stem cells in tissue engineering
US20110076254A1 (en) Porous scaffolds for stem cell renewal
CN1744823A (zh) 使用分化胚胎干细胞构建三维组织结构
Lazarovici et al. Intelligent Biomatrices and Engineered Tissue Constructs: In‐Vitro Models for Drug Discovery and Toxicity Testing
US20230287318A1 (en) Methods for producing mature adipocytes and methods of use thereof
Cano Torres Cell derived-extracellular matrix scaffolds with polylactic acid microcarriers for tissue engineering and cell therapy

Legal Events

Date Code Title Description
FC9A Refused patent application